CN101397571A - 双启动子DNA防龋疫苗pCN-SSIE的制备 - Google Patents

Abstract

本发明提供双启动子DNA防龋疫苗质粒pCN－SSIE的构建，以及用质粒pCN－SSIE制备防龋疫苗。利用分子克隆技术在载体pCMVnir中插入抗原基因SBR，在SBR下游添加绿色荧光蛋白报告基因，两者通过核糖体内部进入位点基因连接，以防止两者融合表达；最后在SBR的5’端融合一段信号肽序列。本发明提高了防龋疫苗的免疫原性，增强了免疫效果。免疫方法简便、有效、经济、持续时间长，并且可多次免疫、副作用小。

Description

双启动子DNA防龋疫苗pCN-SSIE的制备

技术领域

本发明利用了现代分子生物学知识和基因工程技术构建一种新型的防龋DNA疫苗质粒pCN-SSIE，用于人类龋病防治，属于生物疫苗技术领域。

背景技术

龋病是全人类最普遍的疾病之一，发病率高，危害性大，已被世界卫生组织列为继冠心病、癌症之后的第三大重点防治的疾病。从上世纪60年代发现某些链球菌与龋病的密切关系以来，国内外学者在龋病的病因和发病机理方面作了大量的研究，现已表明龋病是一种细菌感染性疾病，其中变形链球菌是公认的重要致龋菌。它在细菌的粘附、聚集和菌斑形成中起到重要的作用，目前已弄清楚与变形链球菌在牙面的最初粘附有关的重要毒力因子是变形链球菌表面蛋白(surface protein antigen of S.mutans，PAc)；并通过对编码变形链球菌表面蛋白基因的克隆、测序阐明了变形链球菌PAc(AgI/II，SR或者MSL-1)的分子结构，并已确定了PAc分子上的功能结构域，即唾液结合区的部位，是位于AgI/II分子的N-末端1/3，此区为唾液结合区(Saliva-binding region，SBR)，含有富含丙氨酸的重复区，是与牙面唾液蛋白受体结合的活性部位，并且证实它在变形链球菌与唾液包被的牙齿表面的最初结合过程中及其随后的龋病发生过程中起重要的作用。已有实验证实封闭此区域可抑制变形链球菌与唾液凝集素包被的羟基磷灰石的粘附，减少并预防龋病的发生。但由于龋病发病部位的特殊性以及口腔特殊的生理环境和免疫防御，迄今尚未有很好的免疫预防方法，因此，选择适合口腔环境，行之有效的免疫途径和方法成为目前预防龋病的当务之急。

随着现代分子生物学、分子免疫学和基因工程技术的进步和发展，基因疫苗越来越受到人们的关注。它克服了以往传统疫苗的缺点，具有传统疫苗不可比拟的优越性，有着广阔的发展前景，并已逐渐应用于各个相关领域。

根据口腔部位的免疫特点，结合当今免疫学的最新成就，本发明构建了双启动子DNA防龋疫苗质粒pCN-SSIE。它与其他的疫苗相比具有如下优势：目前所用的基因免疫载体大都是真核表达质粒，不能在原核细胞中表达抗原。而本发明的防龋疫苗质粒pCN-SSIE含有双启动子，即人巨细胞病毒CMV/IE真核启动子和大肠杆菌硝酸盐还原酶基因B启动子(nirB)。所以pCN-SSIE既可以在真核细胞又可以在原核细胞中表达抗原蛋白。且NirB是一种厌氧诱导启动子，与其它常用的原核启动子相比，它不需要化学诱导剂的诱导，而是在厌氧环境下被激活启动抗原基因的表达。NirB与宿主菌-减毒沙门氏菌SL3261有很好的兼容性，所以特别适合于以胞内寄生菌作为载体工具的体内接种。当沙门氏菌携带质粒pCN-SSIE进入宿主肠道后，受厌氧环境的调节启动外源基因的表达，使外源基因从一进入机体就开始进行表达，并且一直持续到侵入宿主体内。双启动子使外源基因不但能从细菌中表达，而且使质粒在进入到宿主细胞之后继续进行表达，这样就延长了外源基因在体内的表达时间，提高了抗原蛋白的表达量，同时又可以通过不同的途径激发机体的免疫反应，从而提高了疫苗的免疫活性，增强了免疫效果。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供双启动子DNA防龋疫苗质粒pCN-SSIE的构建，以及用质粒pCN-SSIE制备防龋疫苗。

本发明的技术方案如下：

一种双启动子DNA防龋疫苗质粒pCN-SSIE，其中SSIE的DNA序列如序列表中SEQ.1所示。

一种双启动子DNA防龋疫苗质粒pCN-SSIE的构建方法，利用分子克隆技术在载体pCMVnir中插入抗原基因SBR，在SBR下游添加绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因，两者通过核糖体内部进入位点(IRES)基因连接，以防止两者融合表达；最后在SBR的5’端融合一段信号肽序列，以提高SBR的分泌效率。

以上所述的载体pCMVnir是双链闭环DNA分子，是一种基因克隆和表达的载体，长度为5.1Kb，含有两种启动子，一种是真核启动子，即人巨细胞病毒早期启动子CMV/IE，另一种为大肠杆菌硝酸盐还原酶基因启动子nirB，分别在真核细胞和原核细胞中启动外源基因的表达，pCMVnir含有多克隆位点，用以插入外源基因。参见CN1544624A(200310105516.4)。

抗原基因SBR是变链菌表面蛋白的功能结构域，即唾液结合区的编码基因。以质粒pcDNA3.1-SBR为模板通过PCR扩增获得，扩增产物大小为1192bp，pcDNA3.1-SBR质粒由山东大学口腔医学院杨小青硕士构建(参见北京口腔医学 2002年 第10卷 第3期《通过T-A克隆技术构建含免疫刺激序列CpG基序的抗SBR DNA疫苗》姜广水，刘贤锡，杨小青等(CONSTRUCTION OF ANTI-SBR DNA VACCINE FLANKED WITH IMMUNOSTIMULATORYSEQUENCE Cp G MOTIF THROUGH T-A CLONING JIANG Guangshui，LIU Xianxi，YANG Xiaoqing，YANGPishan，BIAN Jifeng，LI Jing，GENG Zhao)。

绿色荧光蛋白EGFP报告基因pEGFP-N1和核糖体内部进入位点基因pIRES都是美国BD Biosciences Clontech产品。

信号肽序列是一段69bp的编码组织型纤溶酶原(tPA)信号肽的双链DNA片段，由上海Sangon生物工程技术服务有限公司产售。

一种双启动子DNA防龋疫苗质粒pCN-SSIE的构建方法，具体步骤如下：

1.PCR扩增EGFP、SBR片段

以质粒pEGFP-N1为模板，设计引物用PCR的方法从质粒pEGFP-N1中扩增得到EGFP片段，并在片段的两端分别添加上合适的酶切位点，上游添加的是SalI位点，下游添加的是NotI位点。引物设计如下：

上游  5’-GTCGACATGGTGAGCAAGGGCGA-3’     带有Sal I酶切位点

下游  5’-GCGGCCGCTTACTTGTACAGCTCGT-3’   带有Not I酶切位点

最后获得两端带有酶切位点的编码EGFP的基因

以pcDNA3.1-SBR为模板，设计引物用PCR的方法从pcDNA3.1-SBR中扩增得到SBR片段，并在片段的两端分别添加上合适的酶切位点，上游添加的是Nco I位点，下游添加EcoR I位点。引物设计如下：

上游  5’-TACCATGGCCGAGGTTGAACGCA-3’     带有Nco I酶切位点

下游  5’-CGGAATTCGCCTTAACCAAAATTCCC-3’  带有EcoR I酶切位点

最后获得两端带酶切位点的编码抗原SBR的基因

将以上所获得的两种基因片段分别连于克隆载体pMD18-T，获得质粒pMD18-T-EGFP和pMD18-T-SBR。

2.在pIRES中插入EGFP片段

将步骤1扩增获得的质粒pMD18-T-EGFP和质粒pIRES进行Sal I和Not I双酶切，获得目的基因片段EGFP和pIRES载体大片段，将两者在连接体系中进行连接，获得pIRES-EGFP。

3.在pCMVnir中插入IRES、EGFP片段

将载体pCMVnir和步骤2得到的pIRES-EGFP分别用限制性内切酶EcoRI和NotI进行双酶切。利用琼脂糖凝胶电泳回收酶切产物中的pCMVnir载体大片段和pIRES-EGFP中的IRES-EGFP小片段进行连接，获得质粒pCN-IE。

4.质粒pCN-IE中插入抗原基因SBA

将步骤3获得的质粒pCN-IE和步骤1中获得的pMD18-T-SBR，分别用限制性内切酶NcoI和EcoRI酶切，回收目的基因片段SBR和pCN-IE质粒大片段后进行连接，构建质粒pCN-SIE。

5.在pCN-SIE中插入tPA信号肽：

选择适合SBR蛋白胞外分泌的组织型纤溶酶原(tPA)信号肽序列，设计信号肽序列为消除NcoI酶切位点的双粘末端：上游5′端为5′-CATG，下游5′端为5′-CATG。

将步骤4获得的pCN-SIE经NcoI酶切与步骤5合成的信号肽序列于连接体系中由T4连接酶连接过夜，最后构建成质粒pCN-SSIE。

以上构建过程的各步骤，都要经大肠杆菌DH5α的转化、筛选扩增和酶切鉴定，这对于本领域的技术人员是熟知的。

最后对构建的质粒pCN-SSIE进行序列检测，测序工作由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。所构建的SSIE的DNA序列如序列表中SEQ.1所示。

质粒pCN-SSIE用于制备防龋疫苗，步骤如下：用质粒pCN-SSIE转化减毒沙门氏菌SL3261，经LA筛选和酶切鉴定后，选取阳性克隆，37℃通气增菌培养14小时，通气量20m³/h，将培养的菌液4℃ 4000rpm离心10分钟，弃上清用适当体积的无菌PBS重悬沉淀，同样条件离心10分钟，将沉淀经冷冻真空干燥等生产工艺制得冻干疫苗。

本发明的pCN-SSIE防龋疫苗可以是口服肠溶胶囊，或是粉剂；每份的沙门氏菌含量不少于10亿。粉剂使用前须用冷开水稀释。不用时储存于2-8℃，有效期10个月。

构建完成后的pCN-SSIE分别转化原核细胞减毒沙门氏菌SL3261和真核细胞中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，以检测质粒pCN-SSIE在其中的表达；并用pCN-SSIE免疫小鼠以检测其在动物体内的免疫活性。

1.利用质粒的报告基因EGFP观测pCN-SSIE在减毒沙门氏菌SL3261和CHO细胞中的表达，参见图1—图3。

将转化有质粒pCN-SSIE的减毒沙门氏菌在LA液体培养基中37℃200rpm振荡培养过夜，次日低速离心浓缩细菌，滴在载玻片上置于荧光显微镜下观察，可见有强烈的绿色荧光表达(图1)。将质粒pCN-SSIE瞬转中国仓鼠卵巢细胞(CHO)48小时后置于倒置荧光显微镜下观察，与未转染的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)(图2)相比，转染后的CHO观测到了明显的报告基因的表达(图3)。由于SBR基因与EGFP基因通过IRES连锁转录，所以证明SBR基因也可以正常转录。

2.以减毒沙门氏菌为载体经灌胃的方法免疫小鼠ELISA检测结果，参见图4。

经过以减毒沙门氏菌为载体通过灌胃免疫的小鼠，在血清、唾液和阴道分泌物中均检测到了明显高于对照组的高水平的抗SBR的IgA抗体；在血清中的抗SBR的IgG水平也有升高。

本发明的技术特点和优良效果如下：

本发明根据口腔粘膜免疫的特点，利用双启动子表达载体构建了适于粘膜免疫的双启动子DNA防龋疫苗质粒pCN-SSIE。本发明构建的是一个可以表达变形链球菌表面蛋白唾液结合区段的双启动子防龋DNA疫苗质粒pCN-SSIE。用于制备和生产防龋DNA疫苗，该疫苗质粒pCN-SSIE含有双启动子即人巨细胞病毒CMV/IE真核启动子和nirB原核启动子，nirB是受氧压调节的原核启动子，以减毒沙门氏菌作为载体，在肠道厌氧的环境和宿主细胞中，nirB启动子被激活，转录下游基因，这样nirB启动子使外源基因从一进入机体就开始表达抗原蛋白，并且一直持续到侵入宿主体内，这样就保证了外源基因在体内的充分表达。同时双启动子使外源基因既可在真核又可在原核细胞中表达，这样就延长了外源基因在体内的表达时间，提高了抗原蛋白的表达量，并且可以通过不同的途径激发全身性的免疫反应，从而提高了疫苗的免疫原性，增强了免疫效果。同时以减毒沙门氏菌作为质粒pCN-SSIE的载体，通过肠道粘膜途径，可获得口腔部位良好的粘膜免疫效果。免疫方法简便、有效、经济、持续时间长，并且可多次免疫、副作用小。

附图说明

图1是转化有质粒pCN-SSIE的减毒沙门氏菌SL3261，在荧光显微镜下观察到有绿色荧光蛋白的高表达。放大倍数为10×25。

图2未转染质粒pCN-SSIE的正常中国仓鼠卵巢细胞(CHO)。相差显微镜10×25。

图3用FuGENE6将质粒pCN-SSIE转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，转染48小时后置于倒置荧光显微镜下，观察到有绿色荧光蛋白的表达。放大倍数为10×40。

图4质粒pCN-SSIE以减毒沙门氏菌为载体经灌胃的方法免疫小鼠，ELISA的检测结果：在血清、唾液和阴道分泌物中均检测到了明显高于对照组的高水平的抗SBR的IgA抗体，在血清中也检测到了抗SBR的IgG抗体水平的升高。

具体实施方式

实施例1：质粒pCN-SSIE的构建

质粒pCN-SSIE的构建流程和具体步骤如下：

1.PCR扩增EGFP、SBR片段

以质粒pEGFP-N1为模板，设计引物用PCR的方法从质粒pEGFP-N1中扩增得到EGFP片段，并在片段的两端分别添加上合适的酶切位点，上游添加的是SalI位点，下游添加的是NotI位点。引物设计如下：

上游  5’-GTCGACATGGTGAGCAAGGGCGA-3’       带有Sal I酶切位点

下游  5’-GCGGCCGCTTACTTGTACAGCTCGT-3’     带有Not I酶切位点

最后获得两端带有酶切位点的编码EGFP的基因。

以pcDNA3.1-SBR为模板，设计引物用PCR的方法从pcDNA3.1-SBR中扩增得到SBR片段，并在片段的两端分别添加上合适的酶切位点，上游添加的是Nco I位点，下游添加EcoR I位点。引物设计如下：

上游 5’-TACCATGGCCGAGGTTGAACGCA-3’     带有Nco I酶切位点

下游 5’-CGGAATTCGCCTTAACCAAAATTCCC-3’  带有EcoR I酶切位点

最后获得两端带酶切位点的编码抗原SBR的基因。

将以上所获得的两种基因片段分别连于克隆载体pMD18-T，获得质粒pMD18-T-EGFP和pMD18-T-SBR。

2.在pIRES中插入EGFP片段

将步骤1扩增获得的质粒pMD18-T-EGFP和质粒pIRES进行Sal I和Not I双酶切，获得目的基因片段EGFP和pIRES载体大片段，将两者在连接体系中进行连接，获得pIRES-EGFP。

3.在pCMVnir中插入IRES、EGFP片段

将载体pCMVnir和步骤2得到的pIRES-EGFP质粒分别用限制性内切酶EcoRI和NotI进行双酶切。利用琼脂糖凝胶电泳回收酶切产物中的pCMVnir载体大片段和pIRES-EGFP中的IRES-EGFP小片段进行连接，获得质粒pCN-IE。

4.质粒pCN-IE中插入抗原基因SBA

将步骤3获得的质粒pCN-IE和步骤1中获得的pMD18-T-SBR，分别用限制性内切酶NcoI和EcoRI酶切，回收目的基因片段SBR和pCN-IE质粒大片段后进行连接，构建质粒pCN-SIE。

5.在pCN-SIE中插入tPA信号肽

选择适合SBR蛋白胞外分泌的组织型纤溶酶原(tPA)信号肽序列，设计信号肽序列为消除NcoI酶切位点的双粘末端：上游5′端为5′-CATG，下游5′端为5′-CATG。

将步骤4获得的pCN-SIE经NcoI酶切与上述合成的信号肽序列于连接体系中由T4连接酶连接过夜，最后构建成质粒pCN-SSIE。

以上构建过程的各步骤，都要经大肠杆菌DH5α的转化、筛选扩增和酶切鉴定，最后构建的质粒pCN-SSIE由上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定，如序列表中SEQ.1所示。

实施例2：用质粒pCN-SSIE制备防龋疫苗

1.用质粒pCN-SSIE转化减毒沙门氏菌SL3261，经LA筛选和酶切鉴定后，选取阳性克隆。

2.37℃通气增菌培养16小时，通气量25m³/h，使细菌浓度和质粒pCN-SSIE的拷贝数达到适宜。

3.将培养的菌液4℃ 4000rpm离心10分钟，弃上清用适当体积的无菌PBS重悬沉淀，同样条件下离心10分钟，将沉淀经冷冻真空干燥制得冻干疫苗。

本疫苗可以是口服肠溶胶囊，或是粉剂；每份的沙门氏菌含量为30亿。粉剂使用前须用冷开水稀释，于进食前1小时首先口服5％小苏打300-500毫升，半小时后服用一个剂量。

上述制得的pCN-SSIE防龋疫苗可用于奶牛的免疫来获取含有大量保护性抗体的牛奶，人们可以通过饮用此种牛奶这种主动免疫的方法来减少和预防龋病的发生。奶牛免疫一次的有效性可维持10-11个月。有效期过后可同样方法再次免疫。注意服用疫苗的前后3天，应禁用氯胍或抗生素。此种牛奶适用于任何年龄段的人群。

序列表

<110>济南登益得科贸有限公司

<120>双启动子DNA防龋疫苗pCN-SSIE的制备

<160>1

<170>Patent In3.1

<210>1

<211>2631

<212>DNA

SEQ.1

Claims (5)

1.一种双启动子DNA防龋疫苗质粒pCN-SSIE，其中SSIE具有如SEQ.1所示序列。

2.一种双启动子DNA防龋疫苗质粒pCN-SSIE的构建方法，其特征在于利用分子克隆技术在载体pCMVnir中插入抗原基因SBR，在SBR下游添加绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因，两者通过核糖体内部进入位点(IRES)基因连接，以防止两者融合表达；最后在SBR的5’端融合一段信号肽序列。

3.如权利要求2所述的双启动子DNA防龋疫苗质粒pCN-SSIE的构建方法，其特征在于具体步骤如下：

(1)PCR扩增EGFP、SBR片段

以质粒pEGFP-N1为模板，设计引物用PCR的方法从质粒pEGFP-N1中扩增得到EGFP片段，并在片段的两端分别添加上合适的酶切位点，上游添加的是SalI位点，下游添加的是NotI位点。引物设计如下：

上游5’-GTCGACATGGTGAGCAAGGGCGA-3’　　带有Sal I酶切位点

下游5’-GCGGCCGCTTACTTGTACAGCTCGT-3’　带有Not I酶切位点

最后获得两端带有酶切位点的编码EGFP的基因；

以pcDNA3.1-SBR为模板，设计引物用PCR的方法从pcDNA3.1-SBR中扩增得到SBR片段，并在片段的两端分别添加上合适的酶切位点，上游添加的是Nco I位点，下游添加EcoR I位点；引物设计如下：

上游5’-TACCATGGCCGAGGTTGAACGCA-3’    带有Nco I酶切位点

下游5’-CGGAATTCGCCTTAACCAAAATTCCC-3’ 带有EcoR I酶切位点

最后获得两端带酶切位点的编码抗原SBR的基因；

将以上所获得的两种基因片段分别连于克隆载体pMD18-T，获得质粒pMD18-T-EGFP和pMD18-T-SBR；

(2)在pIRES中插入EGFP片段

将步骤1扩增获得的质粒pMD18-T-EGFP和质粒pIRES进行Sal I和Not I双酶切，获得目的基因片段EGFP和pIRES载体大片段，将两者在连接体系中进行连接，获得pIRES-EGFP；

(3)在pCMVnir中插入IRES、EGFP片段

将载体pCMVnir和步骤2得到的pIRES-EGFP分别用限制性内切酶EcoRI和NotI进行双酶切。利用琼脂糖凝胶电泳回收酶切产物中的pCMVnir载体大片段和pIRES-EGFP中的IRES-EGFP小片段进行连接，获得质粒pCN-IE；

(4)质粒pCN-IE中插入抗原基因SBA

将步骤3获得的质粒pCN-IE和步骤1中获得的pMD18-T-SBR，分别用限制性内切酶NcoI和EcoRI酶切，回收目的基因片段SBR和pCN-IE质粒大片段后进行连接，构建质粒pCN-SIE；

(5)在pCN-SIE中插入tPA信号肽：

选择适合SBR蛋白胞外分泌的组织型纤溶酶原(tPA)信号肽序列，设计信号肽序列为消除NcoI酶切位点的双粘末端：上游5′端为5′-CATG，下游5′端为5′-CATG；

将步骤(4)获得的pCN-SIE经NcoI酶切与步骤(5)合成的信号肽序列于连接体系中由T4连接酶连接过夜，最后构建成质粒pCN-SSIE。

4.如权利要求1方法构建的质粒pCN-SSIE用于制备防龋疫苗，其特征在于步骤如下：用质粒pCN-SSIE转化减毒沙门氏菌SL3261，经LA筛选和酶切鉴定后，选取阳性克隆，37℃通气增菌培养14小时，通气量20m³/h，将培养的菌液4℃4000rpm离心10分钟，弃上清用适当体积的无菌PBS重悬沉淀，同样条件离心10分钟，将沉淀经冷冻真空干燥等生产工艺制得冻干疫苗。

5.如权利要求4所述质粒pCN-SSIE用于制备防龋疫苗，其特征在于pCN-SSIE防龋疫苗是口服肠溶胶囊，或是粉剂；每份的沙门氏菌含量不少于10亿。

Images