CN101397331A - 酶抑制剂及其制法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物学或药学领域，公开了一种具有抗HIV－1病毒复制作用的Furin酶多肽抑制剂及其制法，本发明还公开了含有所述多肽的组合物。本发明的多肽利用常规的合成方法即可方便地获得，并且具有分子量小、活性高且稳定性好的优点，因而较之一般的药物，其使用剂量可大大降低。

Description

酶抑制剂及其制法和用途

技术领域

本发明涉及生物学或药学领域；更具体的，本发明涉及一种新的Furin酶抑制剂。

背景技术

艾滋病全称为获得性免疫缺陷综合征(Acquired ImmunoDeficiencySyndrome，AIDS)，该病由人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV，艾滋病病毒)感染所引起，可导致被感染者免疫功能的部份或完全丧失，CD4⁺细胞数目减少，继而发生随机性感染、肿瘤等，其临床表症多种多样。该疾病传播速度快、死亡率高，且目前无法治愈，引起了各国政府和社会的高度关注。

HIV的感染是由病毒外膜前体蛋白gp160的加工开始的，gp160经过前体加工酶(例如Furin酶)加工后变为两个片段：表面糖蛋白(surfaceglycoprotein，SU)gp120和跨膜蛋白(transmembrane protein，TM)gp41。HIV-1首先通过gp120与靶细胞上的受体CD4结合，使得gp120的构象发生改变，并继而与靶细胞上的辅受体CXCR4或CCR5结合，导致gp41的构象改变，暴露出其融合肽并插入到宿主细胞膜，从而启动病毒膜与细胞膜的融合，完成病毒进入宿主细胞的感染过程。

gp160前体的加工是入侵过程的第一步，若能抑制此步就可阻止病毒的入侵，因而是重要的药物作用靶点。gp160的加工主要是依赖宿主细胞中前体加工酶Furin的作用。在Thomas Gary等人的专利(Gary Thomas et al，UnitedStates Patent：5604201，February 18，1997)中指出，Furin对切割位点的要求是必需含有RXXR的序列(P₁和P₄位点为Arg，而P₂和P₃位点则为任意氨基酸)，而近年来的研究表明HIV-1外膜糖蛋白gp160中就含有这样的切割位点：Arg508-Glu-Lys-Arg511，证明了Furin对HIV-1病毒中外壳糖蛋白加工的重要意义，进一步提示，抑制Furin酶的作用就能抑制HIV-1病毒入侵人体宿主细胞。

目前针对Furin酶抑制剂的研究主要有两种：化学计量的不可逆多肽抑制剂(癸酰基-Arg-Val-Lys-Arg-CH₂Cl)和大蛋白的α 1-抗胰蛋白酶Portland(α 1-PDX，由394个氨基酸残基组成)。前者由于毒性大而限制了其应用。α 1-PDX是通过对α 1抗胰蛋白酶的反应活性位点进行点突变，使其包含最小的Furin切割位点-Arg-Ile-Pro-Arg-。在体外试验中α 1-PDX对Furin具有高选择性，但当抑制剂浓度提高时也将抑制其它的蛋白前体加工酶。在细胞和动物研究当中，α 1-PDX是有效的Furin酶抑制剂，但它的分子量很大，基因工程表达困难，成本过高，不切合实际应用。此外，仅具有Furin切割位点Arg-Ile-Pro-Arg结构的小肽作为Furin酶抑制剂则具有不稳定的缺陷，无法实际应用。

在以往的研究中，本发明人以绿豆胰蛋白酶抑制剂片断为支架，设计了一条具有21个氨基酸的多肽，该多肽的氨基酸序列如下：

该多肽的分子量较小，具有较为理想的Furin酶抑制活性。然而，由于存在两个二硫键结构，因此该多肽在空间结构上具有一定的折叠形式，且二硫键之间极易于发生错配，造成该多肽发生折叠错误，因此该多肽的合成条件复杂，可控性差，稳定性也不够理想，这在实际的生产应用(特别是规模化生产)上具有一定的限制。

因此，本领域迫切需要寻找一种分子更小、更易于合成、稳定性良好、活性高且无毒性的多肽Furin酶抑制剂，从而将之开发成为有效的抗HIV-1的新型药物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种合成方便、分子量小且活性高的Furin酶多肽抑制剂。

本发明的另一目在于是提供所述Furin酶多肽抑制剂的用途，以及含有该Furin酶多肽抑制剂的组合物。

在本发明第一方面，提供一种多肽，所述的多肽具有式(I)所示的氨基酸序列：

G K Y P R X K R A     (I)

其中，X表示任意氨基酸；

      Y表示R或K。

在另一优选例中，在式(I)所示氨基酸中，

氨基端还包含一乙酰基(Ac)；和

羧基端还包含一酰胺基(NH₂)。

在另一优选例中，在式(I)所示氨基酸中，X选自：A，或P。

在另一优选例中，在式(I)所示氨基酸中，Y表示R。

在本发明的第二方面，提供所述的多肽的用途，用于制备抑制Furin酶的组合物。

在另一优选例中，所述的组合物还用于阻止HIV-1病毒入侵细胞。

在本发明的第三方面，提供一种组合物，所述的组合物含有：

(a)所述的多肽；以及

(b)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述多肽的氨基端还包含一乙酰基(Ac)；和羧基端还包含一酰胺基(NH₂)。

在本发明的第四方面，提供一种制备所述的多肽的方法，所述的方法包括步骤：

(1)根据式(I)所示的氨基酸序列，化学合成粗肽；和

(2)对步骤(1)获得的粗肽进行纯化，获得所述的多肽。

在另一优选例中，在所述的多肽的氨基端还设置一乙酰基(Ac)保护基团；和在所述多肽的羧基端设置一酰胺基(NH₂)保护基团。

在本发明的第五方面，提供一种体外抑制细胞中Furin酶活性的方法(优选非治疗性的方法)，所述的方法包括：给予所述细胞有效量的本发明所述的多肽。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示了纯化的本发明的多肽的HPLC图谱，C18柱(Agilent，9.4×250mm)，流动相B为含0.1％TFA的乙腈，流动相A为含0.1％TFA的水，梯度(0-30％B，5-30min)，流速为2ml/min.主峰为合成产物。横坐标为流出时间，纵坐标为A_230nm。

图2显示了纯化的本发明的多肽的质谱图谱。

图3显示了多肽抑制剂对Furin的抑制常数Dixon作图。横坐标为浓度(单位：nM)，纵坐标为水解荧光底物初速度倒数(单位：(OD/min)^-1)。

图4显示了多肽抑制剂稳定性试验结果，以孵育0小时时的多肽的抑制活性为100％。

具体实施方式

针对目前现有技术中的Furin酶抑制剂分子量大导致难以进入细胞膜而大大影响活性，合成困难等缺陷，本发明人经过广泛而深入的研究，首次揭示一种新的具有Furin酶抑制活性的多肽，该多肽易于进入细胞，利用常规的合成方法即可方便地规模化合成、并且具有分子量小且活性高、无毒性的优点。在此基础上完成了本发明。

基本原理

Gp160前体被加工成gp120是HIV-1病毒入侵细胞过程的第一步，而Furin酶是将gp160前体加工成gp120的酶。本发明提供的Furin酶多肽抑制剂能够作为Furin酶强有力的竞争性底物，可作为抑制剂与gp160竞争性地争夺Furin酶，有效降低Furin加工gp160形成gp120的几率，从而可降低HIV进入细胞内的几率。

根据竞争机制，在宿主细胞内具越高活力的Furin酶多肽抑制剂，则Furin酶加工gp160的机会就越少。此外，分子量小、易于进入细胞、在细胞中稳定的多肽的抑制效果将会更好。

Furin酶多肽抑制剂

本发明的Furin酶多肽抑制剂是基于对组蛋白H1.2(由213个氨基酸残基所组成，Genebank登录号：DQ060698)的研究而获得的。本发明人发现，组蛋白H1.2是Furin酶的天然抑制剂，并推测出其活性位点，然后进一步根据推定的活性位点设计了许多种的肽段，以筛选具有良好抑制活性的Furin酶抑制肽。筛选和优化设计的原则是：Furin酶抑制活性良好，易于进入细胞，生物利用度好，肽段短，易于合成。经过大量试验，最终确定本发明的多肽具有最优异的Furin酶抑制活性。

因此，本发明提供了一种多肽(Furin酶多肽抑制剂)，所述的多肽具有式(I)所示的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)：

其中，X表示任意氨基酸

Y表示R或K。

所述的多肽中，含有Furin酶的最佳切割位点-R-X-K-R-结构，其中R、K均是碱性氨基酸。更特别的是，在P₆位点是碱性氨基酸R或K，R或K可起到增强抑制活性的作用。

作为本发明的优选方式，P₆位点是R。本发明人在研究中发现，该位点为R时其Furin酶抑制活性最强。

作为本发明的优选方式，在式(I)所示氨基酸中，氨基端还包含一乙酰基(Ac)；和羧基端还包含一酰胺基(NH₂)。在氨基端和羧基端设置基团保护可进一步提高本发明的多肽的稳定性，防止其在进入细胞后被细胞内相应的氨肽酶和羧肽酶的降解。

本发明中，X可以是任意的氨基酸，优选的氨基酸是A或P。

经过本发明人试验论证发现，该Furin酶多肽抑制剂较之天然的HistoneH1.2抑制活力提高5-10倍(天然的Histone H1.2的抑制常数约为4.6×10^-7M，参见文献Jinbo Han，Ling Zhang，Xiaoxia Shao，Jiahao Shi & ChengwuChi(2006)The potent inhibitory activity of histone H1.2 C-terminalfragments on furin.FEBS J 273，4459-4469)。

Furin酶多肽抑制剂的制备方法

按本发明所提供的Furin酶多肽抑制剂的结构，可采用多种方法来制备。所述的方法包括但不限于：化学合成法，重组法。考虑到多肽的长度较短，优选的是化学合成方法。

因此，本发明提供了一种制备所述的Furin酶多肽抑制剂的方法，所述的方法包括步骤：

(1)根据式(I)所示的氨基酸序列，通过化学合成法合成粗肽；和

(2)对步骤(1)获得的粗肽进行纯化，从而获得所述的多肽。

更优选的，在制备所述的Furin酶多肽抑制剂时，在多肽的氨基端还设置一乙酰基(Ac)保护基团，在多肽的羧基端设置一酰胺基(NH₂)保护基团，以防止所述多肽在进入细胞后被细胞内的一些降解物质所降解。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明的多肽通过化学合成方法得到，所述的方法包括：在Rink Amide-MBHA Resin树脂上，按所述多肽的序列由C端逐个向N端延伸，在合成过程中利用适当的保护基以保护氨基酸。所合成的多肽两端分别带有一乙酰基和一酰胺基保护基团，以防止宿主细胞内外肽酶如氨肽酶和羧肽酶的降解。合成的产物可采用HPLC进行分离纯化，从而得到高纯度的Furin酶多肽抑制剂。

Furin酶多肽抑制剂的用途

本发明还提供了所述的多肽的用途，用于制备抑制Furin酶的组合物。通过抑制Furin酶，从而阻止HIV-1病毒入侵到细胞中。

经过本发明人的试验，所述的Furin酶多肽抑制剂对Furin酶的抑制活性非常高，抑制常数Ki值达到了10^-8M数量级，而已有的一些Furin酶抑制剂的抑制常数通常为10^-7M-10^-5M数量级。

本发明人的试验还证明，本发明的Furin酶多肽抑制剂具有良好的稳定性，其在与Furin酶共孵育后，可在相当长的时间里保持稳定的抑制活性。

由于Furin酶在HIV-1复制时对gp160加工成gp120和gp41起至关重要的作用，因而对Furin酶专一的多肽抑制剂，可被制成抗HIV-1的药物，为艾滋病的防治提供新的途径。

组合物

本发明还提供了一种可抑制Furin酶活性的组合物，所述的组合物含有：(a)有效量(如0.0001-50wt％)的本发明所述的Furin酶多肽抑制剂；以及(b)药学上可接受的载体。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。

术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的载体的充分说明。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。

所述的组合物可用于哺乳动物。可将所述的组合物制成各种适合于哺乳动物给药的剂型，所述剂型包括(但不限于)：注射剂、胶囊剂、片剂、乳剂、缓释剂。

本发明的组合物可直接用于抑制体内Furin酶活性。此外，还可同时与其它治疗剂或辅剂联合使用。

任何可促进本发明的多肽进入细胞且不影响本发明的多肽的活性、不产生毒性的物质也可用于与本发明的多肽联合使用。任何可增强本发明的多肽的活性或稳定性的物质或载体也可用于本发明。

本发明还提供了一种抑制细胞中Furin酶活性的方法，所述的方法包括：给予细胞有效量的本发明所述的多肽。

应理解，当用于抑制体内Furin酶活性时，所用的本发明的多肽的有效剂量可随待治疗的对象的严重程度而变化。具体情况根据受试者的个体情况来决定，这些因素均在熟练医师或营养师可以判断的范围内。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明的Furin酶多肽抑制剂具有分子量小(仅含有9个氨基酸)，稳定性好，碱性高易于进入细胞，且生物活性高的特点，从而更有利于发挥抑制作用。

(2)本发明的Furin酶多肽抑制剂结构简单，从而具有成本低廉、易于合成和操作的优点。

(3)由于本发明的Furin酶多肽抑制剂属于内源性肽段，没有毒性和副作用，生物利用度高。

(4)由于本发明的Furin酶多肽抑制剂稳定性好且活性高，因此与一般的药物相比，其剂量可低百倍以上，具有非常好的药物开发前景。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1

Furin酶多肽抑制剂肽段的合成

抑制剂肽段的合成可采用常规的方法，合成的肽段序列如下：

G K R P R A K R A(SEQ ID NO：2)；

并且，氨基端设置乙酰基(Ac)保护，羧基端设置酰胺基(NH₂)保护。

取Rink Amide-MBHA Resin树脂(0.55mmol/g，购自GL Biochem)，按肽的序列(从C端第1个氨基酸起)，首先将氨基酸Ala连接到树脂上，然后依次连接后续的氨基酸(每个氨基酸带有保护基Fmoc)。每轮循环(每轮循环连接上一个氨基酸)后以20％六氢吡啶去除保护基Fmoc，再以10％ DIEA中和HBTU(苯并三唑四甲基脲六氟磷酸酯)作活化剂，一轮循环结束后用茚三酮反应检测反应是否完全。在K和R上携带侧链保护基如下：K(Boc)、R(Pbf)。由于肽段的羧基端与Rink Amide-MBHA Resin树脂连接，从而可使得肽段的羧基端带有酰氨基保护；并且在合成最后一个氨基酸Gly时，采用的Gly为带有乙酰基保护的氨基酸(购自GL Biochem)。

实施例2

抑制剂粗产品的制备

在100mg前述实施例1制备肽树脂中加入1.8ml三氟乙酸(TFA)和0.2ml捕获剂(含40ul水、80ul三乙基硅烷和80ul茴香硫醚)，室温反应1.5小时，将多肽链从树脂上酸解下来。

裂解完成后以干燥的无水乙醚洗涤、常规方法抽提粗肽，合并抽提液并冷冻干燥，得粗肽。

实施例3

抑制剂的纯化

采用常规的方法，将冻干的粗肽经Sephadex G15柱(购自Pharmacia)脱盐后冻干，再经HPLC C₁₈半制备柱(购自Agilent)纯化，冻干得到纯度大于95％的本发明的多肽。

纯化的本发明的多肽的HPLC图谱如图1所示，其中20.5分钟的流出峰为本发明的多肽。

纯化的本发明的多肽的质谱图谱如图2所示。

实施例4

抑制活性的测定

1.酶活力的测定

采用的Furin酶的荧光底物为pGlu-Arg-Thr-Lys-Arg-MCA(参见JinboHan，Ling Zhang，Xiaoxia Shao，Jiahao Shi & Chengwu Chi(2006)The potentinhibitory activity of histone H1.2 C-terminal fragments on furin.FEBSJ273，4459-4469)，Furin酶对荧光底物的水解活力通过荧光分光光度仪测定。

将适量的Furin酶和前述制备的Furin酶多肽抑制剂(多肽抑制剂终浓度分别为0，10，50，75，100nM)加入1ml测活缓冲液(100mM Hepes，pH 7.5，1mM CaCl₂，0.5％ Triton X-100，1mMβ-巯基乙醇)，37℃保温3分钟后，再加入上述荧光底物(终浓度分别为1μM和1.5μM)。

测活时荧光仪的激发波长和发射波长分别为370nm和460nm，狭缝宽度均为10nm。

2.抑制剂动力学常数的测定

使用Dixon作图(1/v对I)(Dixon.(1953)The determination of enzymeinhibitor constants，BiochemJ.55，170-1)得到不同的Furin酶多肽抑制剂的K_i常数。

针对Furin酶的测定中，使用的底物pGlu-Arg-Thr-Lys-Arg-MCA浓度分别为1μM、1.5μM。

结果如图3所示(图中，实心黑点代表的直线是1μM底物浓度下Furin酶多肽抑制剂的抑制曲线，空心点代表的直线是1.5μM底物浓度下Furin酶多肽抑制剂的抑制曲线)，获得的抑制常数K_i＝2.3×10^-8M，优于已经报导的一些Furin酶抑制剂的抑制效果(通常K_i为10^-7量级)。

实施例5

多肽抑制剂的稳定性测定

本发明人还测定了不同孵育时间下本发明的Furin酶多肽抑制剂的稳定性，将所述的多肽(终浓度1μM)与适量Furin酶共同孵育0.5-3小时，再加入1μM荧光底物pGlu-Arg-Thr-Lys-Arg-MCA测活。观察期间所述多肽的活性情况，并且以孵育0小时时的多肽的抑制活性为100％。

如图4所示，结果发现，在0-2.5小时的时间里，所述的的Furin酶多肽抑制剂均保持稳定的抑制活性，在孵育时间超过2.5小时后，其抑制活性才有明显的下降。

实施例6

含有Furin酶多肽抑制剂的组合物

配制含有本发明所述Furin酶多肽抑制剂的组合物，该组合物的配方如表1所示：

表1

 

实施例1-3制备和纯化后的Furin酶多肽抑制剂	1.08mg
		含有0.9％ NaCl的生理盐水	1ml

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>酶抑制剂及其制法和用途

<130>074502

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>多肽

<220>

<221>misc_feature

<222>(3)..(3)

<223>Xaa代表Arg或Lys

<220>

<221>misc_feature

<222>(6)..(6)

<223>Xaa代表任何天然存在的氨基酸

<400>1

<210>2

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>多肽

<400>2

Claims (10)

1.一种多肽，其特征在于，所述的多肽具有式(I)所示的氨基酸序列：

G K Y P R X K R A                 (I)

其中，X表示任意氨基酸；

Y表示R或K。

2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，在式(I)所示氨基酸中，氨基端还包含一乙酰基；和

羧基端还包含一酰胺基。

3.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，X选自：A，或P。

4.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，Y表示R。

5.权利要求1所述的多肽的用途，其特征在于，用于制备抑制Furin酶的组合物。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的组合物还用于阻止HIV-1病毒入侵细胞。

7.一种组合物，其特征在于，所述的组合物含有：

(a)权利要求1所述的多肽；以及

(b)药学上可接受的载体。

8.一种制备权利要求1所述的多肽的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：

(1)根据式(I)所示的氨基酸序列，化学合成粗肽；和

(2)对步骤(1)获得的粗肽进行纯化，获得权利要求1所述的多肽。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，

在所述的多肽的氨基端还设置一乙酰基保护基团；和

在所述多肽的羧基端设置一酰胺基保护基团。

10.一种体外抑制细胞中Furin酶活性的方法，其特征在于，所述的方法包括：给予细胞有效量的权利要求1所述的多肽。

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