CN101386645A - 一种植物耐盐蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

一种植物耐盐蛋白及其编码基因与应用 Download PDF

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CN101386645A CN 200810225316 CN200810225316A CN101386645A CN 101386645 A CN101386645 A CN 101386645A CN 200810225316 CN200810225316 CN 200810225316 CN 200810225316 A CN200810225316 A CN 200810225316A CN 101386645 A CN101386645 A CN 101386645A
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Abstract

本发明公开了一种植物耐盐蛋白及其编码基因与应用。该植物耐盐蛋白,是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质:1)序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列;2)将序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有植物耐盐功能的蛋白质。实验表明,该蛋白具有很高的耐盐性,将该蛋白的编码基因转入植物中,可提高植物的耐盐性。

Description

一种植物耐盐蛋白及其编码基因与应用
技术领域
本发明涉及一种植物耐盐蛋白及其编码基因与应用。
背景技术
土壤盐渍化对农业的威胁是一个全球性的问题,据统计全球盐碱土约有10亿公顷,占世界陆地面积近7.6%。我国是一个发展中的农业大国,全国盐碱土约有0.2亿多公顷占全国耕地面积的1/3。盐分胁迫能显著的抑制植物的生长,甚至导致植物的死亡。在长期的进化过程中,不同植物形成了不同的机制来适应盐分的胁迫,同时其抗盐能力也各不相同。大多数农作物都对盐分非常敏感,而盐生植物虽然能在高盐条件下生存,但它们的经济价值往往非常有限,提高作物的抗盐能力已经成为我国农业生产和科研中的重要内容。
植物对盐分的抗性是一个多基因控制的复杂性状。盐分对植物的影响涉及到植物体内的各个方面和代谢过程。包括离子毒害,渗透胁迫和氧化胁迫以及光合作用。因此,对抗盐、耐盐相关基因及其蛋白的研究具有重要的意义。
Apse等(Apse M P,Aharon G S,Snedden W A,et al.,Salt tolerance conferredby overexpression of a vacuolar Na+/H+ antiporter in Arabidopsis.Science,1999,285:1256-1258)对转AtNHX1基因的拟南芥植株进行了分析,过量表达Na+/H+逆向转运蛋白的转基因拟南芥植株在200mmol/L NaCl中能正常生长发育。免疫印迹表明,从转化植株叶片提纯液泡比从野生型提纯具有更多的AtNHX1的产物,液泡上Na+/H+逆向转运蛋白活力增强。Fukuda等(Fukuda A,Nakamura A.,Tagin A.,et.al.Function,intracellular localization and the importance in salt tolerance of a vacuolarNa+/H+ antiporter from rice.Plant & Cell Physiology,2004,45:146)将液泡膜逆向转运蛋白基因OsNHX1转入到水稻中过量表达也可以提高转基因植株的耐盐性。将拟南芥的AtNHX1基因转入番茄中,过量表达液泡Na+/H+逆向转运蛋白的转基因番茄在200mmol/L NaCl胁迫下能够正常生长、开花和结实,尽管叶片中Na+浓度高,但番茄果实中Na+浓度很低(Zhang H X,Blumward E,Transgenic salt-tolerant tomato plantsaccumulate salt in foliage but not in fruit.Nature Biotechnology,2001,19:765~768)。Shi等(Shi H,Byeong-ha L,et al,Overexpression of a plasma membrane Na+/H+antiporter gene improve salt tolerance in Arabidopsis thaliana.Nature Biotechnology,2002,1-5)将拟南芥质膜Na+/H+逆向转运蛋白基因SOS1转入到拟南芥中,转基因植株可以在150mM NaCl胁迫下开花结实,并且提高了转基因植株在盐胁迫下的SOS1的转录水平。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物耐盐蛋白及其编码基因与应用。
本发明所提供的植物耐盐蛋白,名称为GmNHX2,来源于大豆属大豆(Glycinemax(Linn.)Merr),是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质:
1)序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列;
2)将序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有植物耐盐功能的蛋白质。
其中,序列表中的序列2由534个氨基酸残基组成。GmNHX2为一类Na+/H+逆向转运蛋白基因,主要功能是在胁迫下调整植物体内的离子平衡。疏水性分析结果表明,在GmNHX2的N-端是高度疏水性的并预测到10跨膜结构域,具有序列表中序列2的氨基端的第25—432位氨基酸残基序列;在GmNHX2的C-端有一小段高度亲水性的尾巴,具有序列表中序列2的氨基端的第433—534位氨基酸残基序列,预测其位于细胞质内。GmNHX2与番茄的Na+/H+逆向转运蛋白具有高度的氨基酸序列相似性,序列一致性为80%,序列相似性为88%。
所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
为了使(a)中的GmNHX2便于纯化,可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的N端或C端连接上如表1所示的标签。
表1.标签的序列
 
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述(b)中的GmNHX2可人工合成,也可先合成其编码基因,再进行生物表达得到。上述(b)中的GmNHX2的编码基因可通过将序列表中SEQ ID №:1的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子,和/或进行一个或几个碱基对的错义突变,和/或在其5
Figure A200810225316D0004164129QIETU
端和/或3端连上表1所示的标签的编码序列得到。
为了便于蛋白的分泌表达,还可在所述GmNHX2的氨基末端添加上信号肽序列。
上述植物耐盐蛋白的编码基因(GmNHX2)也属于本发明的保护范围。
上述植物耐盐蛋白的cDNA基因,可具有下述核苷酸序列之一:
1)自序列表中SEQ ID №:1的5’端的第117至1718位核苷酸;
2)序列表中SEQ ID №:1的核苷酸序列;
3)编码序列表中SEQ ID №:2蛋白质序列的多核苷酸;
4)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №:1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
上述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC),0.1% SDS的溶液中,在65℃下杂交并洗膜。
其中,序列表中的SEQ ID №:1由2152个脱氧核苷酸组成,自序列1的5’端的第117至1718位核苷酸为GmNHX2的编码序列,序列表中序列1编码序列表中序列2的氨基酸残基序列。
含有本发明基因的重组表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。
实验表明,该蛋白具有很高的耐盐性,将该蛋白的编码基因转入植物中,可提高植物的耐盐性。本发明蛋白和其编码基因通过调节植物体内的Na+离子平衡以提高植物的耐盐性,具有很高的应用价值。
附图说明
图1为过表达GmNHX2基因的拟南芥转基因植株(转pBI121-GmNHX2拟南芥)的耐盐性鉴定(处理的NaCl浓度为200mM)。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法,如无特别说明,均为常规方法。
下述实施例中的百分含量,如无特别说明,均为质量百分含量。
实施例1、植物耐盐蛋白及其编码基因的获得
分析大豆品种绥农14的叶片为材料构建的cDNA文库中获得的ESTs,发现一个EST与Na+/H+逆向转运蛋白类基因有很高的同源性。用RT-PCR和3’RACE从盐处理6h的文丰7号(统一编号:ZDD02611;中国国家种质资源库)中获得该基因的全长cDNA序列,具体方法为:
用200mM NaCl溶液浸泡萌发后生长2周的大豆品种文丰7号的幼苗的根部6小时,收获叶片提取RNA并反转录成cDNA第一链,cDNA第一链合成按ReverseTranscription System Kit(Promega)试剂盒说明书进行,以该cDNA为模板,用引物N21F(5′-CAGTTGTGTTGAGGGACACA-3′)和N21R(5′-GCACTCGACAAAAGGTAGCC-3′)进行PCR扩增。
PCR反应体系为:10×Buffer 2.5μl,dNTP 2.5mM,N21F 5μM,N21R 5μM,cDNA20ng,Taq酶1U,加去离子水至25μl。
PCR反应程序:先94℃ 5min;然后94℃ 30S,60℃ 30s,72℃ 1min,扩增35个循环;最后72℃延伸8min。
PCR扩增得到650bp左右的EST片段。
由于获得的EST片段不含有完整的编码区,含有完整的编码区的cDNA用3’RACE的方法获得。
3’RACE的cDNA第一链合成的方法为,用200mM NaCl溶液浸泡萌发后生长2周的大豆品种文丰7号的幼苗的根部6小时,收获叶片提取RNA并反转录成cDNA第一链,3’RACE的cDNA第一链合成按Reverse Transcription System Kit(Promega)试剂盒说明书进行,但用3CDS:5′-ggatcctaatacgactcactagcttttttttttttttt(a/g/c)-3′引物替代了试剂盒中的Oligo(dT)16引物。根据获得的EST序列设计两条基因特异性引物:GSP1:5′-CAGGGCGTGGTTCAATTTTCACG-3′和GSP2:5′-CAGGGCGTGGTTCAATTTTCACG-3′;接头引物为3RAC:5′-ggatcctaatacgactcactagc-3′。
以3’RACE cDNA为模板,以GSP1和3RAC引物进行第一轮PCR扩增,再以1μl第一轮PCR产物为模板,以GSP2和3RAC为引物进行第二轮PCR扩增。
3’RACE的反应体系:10×LA Buffer(Takara)2.5μl,10mM dNTP 0.5μl,GSP1或GSP20.5μM,3RAC 0.5μM,第一链cDNA(20ng)或第一轮PCR产物0.5μl,LA Taq 1U(Takara),加水至终体积25μl。
PCR反应程序:94℃预变性3min;94℃ 30s,72℃ 2min30s扩增5个循环;94℃30s,70℃ 30s,72℃ 2min30s扩增5个循环;94℃ 30s,68℃ 30s,72℃ 2min30S扩增27个循环。
结果表明上述3’RACE PCR扩增得到2047bp的cDNA片段,将RT-PCR和3’RACE得到的片段组装拼接获得长度为2152bp的全长cDNA命名为GmNHX2。经过测序表明,GmNHX2长2152bp,具有序列表中序列1的核苷酸序列,自序列1的5’端的第117至1718位核苷酸为GmNHX2的编码序列,编码一条长534个氨基酸的蛋白GmNHX2,该蛋白GmNHX2的序列是序列表中序列2的氨基酸残基序列。疏水性分析结果表明,在GmNHX2的N-端是高度疏水性的并预测到10跨膜结构域,具有序列表中序列2的氨基端的第25—432位氨基酸残基序列;在GmNHX2的C-端有一小段高度亲水性的尾巴,具有序列表中序列2的氨基端的第433—534位氨基酸残基序列,预测其位于细胞质内。GmNHX2与番茄的Na+H+逆向转运蛋白具有高度的氨基酸序列相似性,序列一致性为80%,序列相似性为88%。
实施例2、植物耐盐蛋白及其编码基因的功能验证
1、在拟南芥中过表达载体的构建
将GmNHX2的ORF克隆到pBI121载体并置于35S启动子控制下。具体方法为:
根据上述GmNHX2cDNA序列设计引物,序列如下所示:
BamN2:5’-GCCGGATCCATGGCCTCGGAATTAGAAATTTC-3’(下划线标注的是BamH I酶识别位点);
SacN2:5′-GCGGAGCTCTCATGATGAATAGTGGTTCTGGC-3′(下划线标注的是Sac I酶识别位点)。
用200mM NaCl溶液浸泡萌发后生长2周的大豆品种文丰7号的幼苗的根部6小时,取叶片提取RNA并反转录得到cDNA,作为模板,以BamN2和SacN2为引物进行PCR扩增。
PCR扩增得到1605bp的片段,测序表明,该片段具有自序列1的5’端的第117至1718位核苷酸序列(GmNHX2的ORF)。
将扩增得到的片段用BamH I和Sac I双酶切,将得到的片段插入到pBI121载体的BamH I和Sac I酶识别位点之间,得到重组载体。将该重组载体进行酶切和测序鉴定。将经过测序表明含有GmNHX2的ORF的重组载体命名为pBI121-GmNHX2。
2、转pBI121-GmNHX2拟南芥的获得
用农杆菌介导法获得转pBI121-GmNHX2拟南芥,具体方法为:将重组载体pBI121-GmNHX2转入农杆菌菌株GV3101获得重组菌,将该重组菌利用PCR方法验证。利用以根癌农杆菌介导的蘸花法转化(Clough SJ Bent AF,Floral dip:asimplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsisthaliana,The Plant Journal,1998/16/P735-743.[4]),通过鉴定正确的含有pBI121-GmNHX2的重组农杆菌菌株GV3101,将pBI121-GmNHX2转入拟南芥(Columbia生态型)获得T0代转pBI121-GmNHX2拟南芥。
将获得的T0代转pBI121-GmNHX2拟南芥种子种植在含有50mg/L卡那霉素的MS培养基上筛选,获得阳性植株,将获得的阳性植株逐代在含有50mg/L卡那霉素的MS培养基上筛选获得纯合体的转基因株系。筛选获得的纯合的株系用RT-PCR验证,验证方法:提取12个正常条件下生长的转pBI121-GmNHX2拟南芥株系和野生型(Columbia生态型)的RNA并反转录成第一链cDNA,以该cDNA为模板,用引物N25F:5′-GCAGGTGTTGGAGTTGGATT-3′,N25R:5′-TGACCAGCTATGTTGCTCCA-3′进行PCR扩增,转入了pBI121-GmNHX2的阳性转基因拟南芥应扩增得到410bp的片段。结果表明获得12个RT-PCR鉴定阳性的转pBI121-GmNHX2拟南芥株系,选择其中三个株系(L1、L4和L6)作为其耐盐性鉴定的材料。
3、转pBI121-GmNHX2拟南芥的耐盐性鉴定
将野生型拟南芥(Columbia生态型)和转pBI121-GmNHX2拟南芥的3个株系(L1、L4和L6)的种子均匀的播种于MS培养基上,于4℃放置3天后,转移至培养室于22℃,16h光照/8h黑暗条件下生长1周后,移入含有200mM NaCl的MS固体培养基上,继续在该温度和光照条件下进行胁迫处理7天。盐处理7天后保持大于75%的绿色叶片面积的植株计为存活,存活率为存活的植株数占处理的总植株数的百分数。实验重复三次,每次每个株系至少60粒种子。
结果如图1所示,结果表明在200mM处理下,野生型和转pBI121-GmNHX2拟南芥的生长和根长都受到抑制,但转pBI121-GmNHX2拟南芥的生长表现要明显好于野生型,转pBI121-GmNHX2拟南芥能维持绿色的叶片并继续生长,而野生型植株则逐渐白化死亡。过表达GmNHX2基因的拟南芥植株(转pBI121-GmNHX2拟南芥)株系L1、L4和L6在200mM NaCl处理下,转基因植株的存活率分别为46.34%、70.59%%、65.06%,而野生型的存活率为24.36%,表明GmNHX2基因在拟南芥中过表达可以提高转基因植株的耐盐性。图1中,wt表示野生型;L1、L4和L6表示3个独立的转pBI121-GmNHX2拟南芥株系。
<160>2
<210>1
<211>2152
<212>DNA
<213>大豆属大豆(Glycine max(Linn.)Merr)
<400>1
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<211>534
<212>PRT
<213>大豆属大豆(Glycinemax(Linn.)Merr)
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Met Ala Ser Glu Leu Glu Ile Ser Pro Ala Asp Ala Arg Lys Ala Pro
1              5                  10                15
Gly Lys Glu Gln Gln Ala Ala Gly Val Gly Ile Leu Leu Gln Ile Met
           20                25                30
Met Leu Val Leu Ser Phe Val Leu Gly His Val Leu Arg Arg Lys Lys
       35                40                 45
Val Tyr Ile Ile Pro Glu Ala Ser Ala Ser Leu Leu Ile Gly Leu Ile
   50                 55                60
Val Gly Ile Leu Ala Asn Ile Ser Asp Thr Glu Thr Asn Ile Arg Ala
65                70                 75                80
Trp Phe Asn Phe His Glu Glu Phe Phe Phe Leu Phe Leu Leu Pro Pro
               85                90                 95
Ile Ile Phe Gln Ser Gly Phe Ser Leu Ala Pro Lys Pro Phe Phe Ser
           100               105               110
Asn Phe Gly Ala Ile ValThr Phe Ala Ile Phe Gly Thr Phe Ile Ala
       115                120               125
Ser Ile Val Thr Gly Ile Leu Val Tyr Leu Gly Gly Leu Leu Phe Leu
    130               135               140
Met Tyr Arg Leu Pro Phe Val Glu Cys Leu Met Phe Gly Ala Leu Ile
145                150               155                160
Ser Ala Thr Asp Pro Val Thr Val Leu SerIle Phe Gln Glu Leu Gly
               165               170                   175
Thr Asp Ala Asn Leu Tyr Ala Leu Val Phe Gly Glu Ser Val Leu Asn
           180                185               190
Asp Ala Met Ala Ile Ser Leu Tyr Arg Thr Met Ser Ser Val Arg Ala
       195                200                205
Asp Pro Ser Gly Gln Asn Leu Phe Met Val Val Val Arg Phe Leu Glu
    210               215                220
Thr Phe Val Gly Ser Met Ser Ala Gly Val Gly Val Gly Phe Ile Ser
225               230                235               240
Ala Leu Leu Phe Lys Tyr Ala Gly Leu Asp Ile Asp Asn Leu Gln Asn
               245               250                255
Leu Glu Ser Cys Leu Phe Val Leu Phe Pro Tyr Phe Ser Tyr Met Leu
           260                265                270
Ala Glu Gly Leu Gly Leu Ser Gly Ile Val Ser Ile Leu Phe Thr Gly
       275                280               285
Ile Val Met Lys His Tyr Thr Tyr Ser Asn Leu Ser Gln Ser Ser Gln
    290               295                300
Arg Phe Ala Ser Ala Phe Phe Glu Leu Ile Ser Ser Leu Ala Glu Thr
305               310                315                320
Phe Val Phe Ile Tyr Met Gly Phe AspIle Ala Met Glu Gln His Ser
               325               330               335
Trp Ser His Val Gly Phe Ile Phe Phe Ser Ile Ile Phe Ile Gly Ile
           340            345                    350
Ala Arg Ala Ala Asn Val Phe Ser Cys Ala Tyr Leu Val Asn Leu Val
       355                360               365
Arg Pro Thr His Arg Lys Ile Pro Ser Lys His Gln Lys Ala Leu Trp
    370                375               380
Tyr Ser Gly Leu Arg Gly Ala Met Ala Phe Ala Leu Ala Leu Gln Ser
385                390               395               400
Ile His Asp Leu Pro Glu Gly His Gly Gln Thr Ile Phe Thr Ala Thr
               405               410               415
Thr Ala Ile Val Val Leu Thr Val Leu Leu Ile Gly Gly Ser Thr Gly
           420               425                430
Ser Met Leu Glu Ala Leu Asp Val Val Gly Gly Asp Asn Asp Ser Pro
        435               440               445
Leu Ala Ser Val Gly Thr Ile Thr Asn Phe Asp Gly Asn Asn Gly Tyr
    450               455                460
Ile Ala Pro His Tyr Asn Glu Glu Ser Ser Ser Gly Asn Lys Ile Lys
465               470            475                   480
Met Lys Leu Lys Glu Phe His Lys Thr Ala Ala Ser Phe Thr Ala Leu
               485                490               495
Asp Lys Asn Tyr Leu Thr Pro Phe Phe Thr Ser Gln Asn Gly Asp Glu
           500            505                    510
Asp Asp Glu Ala Glu Pro Phe Thr Ser Thr Arg Ser Gly Phe His Gly
        515               520                525
Gln Asn His Tyr Ser Ser
    530

Claims (8)

1、一种植物耐盐蛋白,是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质:
1)序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列;
2)将序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有植物耐盐功能的蛋白质。
2、权利要求1所述的植物耐盐蛋白的编码基因。
3、根据权利要求2所述的编码基因,其特征在于:所述植物耐盐蛋白的cDNA基因具有下述核苷酸序列之一:
1)自序列表中SEQ ID №:1的5’端的第117至1718位核苷酸;
2)序列表中SEQ ID №:1的核苷酸序列;
3)编码序列表中SEQ ID №:2蛋白质序列的多核苷酸;
4)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №:1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
4、含有权利要求2或3所述的植物耐盐蛋白的编码基因的重组表达载体。
5、含有权利要求2或3所述的植物耐盐蛋白的编码基因的转基因细胞系。
6、含有权利要求2或3所述的植物耐盐蛋白的编码基因的宿主菌。
7、权利要求1所述的植物耐盐蛋白的编码基因在提高植物耐盐性中的应用。
8、根据权利要求7所述的应用,其特征在于:所述植物为水稻、小麦、玉米、大豆、棉花、马铃薯、油菜、甘薯、绿豆、红小豆、橡胶、香蕉、西红柿、黄瓜、苜蓿或拟南芥。
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