CN102464709B - 与植物抗盐性相关的蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents
与植物抗盐性相关的蛋白及其编码基因与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102464709B CN102464709B CN201010548661XA CN201010548661A CN102464709B CN 102464709 B CN102464709 B CN 102464709B CN 201010548661X A CN201010548661X A CN 201010548661XA CN 201010548661 A CN201010548661 A CN 201010548661A CN 102464709 B CN102464709 B CN 102464709B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sequence
- gene
- plant
- carrier
- lcdreb21
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 93
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 23
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 30
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 20
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 17
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 17
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 11
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 9
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 7
- 101150054900 gus gene Proteins 0.000 claims description 6
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 claims description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 4
- 230000008676 import Effects 0.000 claims description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 abstract description 58
- 241000511730 Leymus chinensis Species 0.000 abstract description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 abstract description 5
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 abstract 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 abstract 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 16
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- 230000008859 change Effects 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 6
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 3
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 229940027138 cambia Drugs 0.000 description 3
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- KXZOIWWTXOCYKR-UHFFFAOYSA-M diclofenac potassium Chemical compound [K+].[O-]C(=O)CC1=CC=CC=C1NC1=C(Cl)C=CC=C1Cl KXZOIWWTXOCYKR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N glufosinate-P Chemical compound CP(O)(=O)CC[C@H](N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 2
- 108010072454 CTGCAG-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 2
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 2
- 230000029279 positive regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 2
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 108020004463 18S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 108020005096 28S Ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000209202 Bromus secalinus Species 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 description 1
- 235000010799 Cucumis sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 241000219146 Gossypium Species 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 description 1
- 235000010624 Medicago sativa Nutrition 0.000 description 1
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 101100285000 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) his-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000124033 Salix Species 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000007622 bioinformatic analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000015784 hyperosmotic salinity response Effects 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000006241 metabolic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 230000008723 osmotic stress Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 239000005418 vegetable material Substances 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/13—Abiotic stress
- Y02A40/135—Plants tolerant to salinity
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明公开了与植物抗盐性相关的蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的与植物抗盐性相关的蛋白是如下(a)或(b)的蛋白质:(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质;(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗盐性相关的由(a)衍生的蛋白质。本发明所提供的与植物抗盐性相关蛋白的编码基因LcDREB21受高盐诱导,具有激活下游基因的能力,可作为植物抗盐基因工程的候选基因,用来改良植物的抗盐能力,对于培育抗逆性提高的羊草及其他植物新品种具有重要的理论和实际意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域中与植物抗盐性相关的蛋白及其编码基因与应用。
背景技术
盐胁迫破坏植物体内的离子平衡,造成渗透胁迫,进而引起植物体内发生一系列的生理和代谢反应,影响植物的生长发育。今天全世界20%的农田受到高盐胁迫的影响,高盐胁迫使作物产量降低,极大地影响了农业生产。由于植物的耐盐的复杂性,由多基因控制,利用传统育种的方法来提高作物的抗盐能力十分困难。利用基因工程手段改良作物的耐高盐能力,是我国以及世界农业急需解决的重大课题,也是当前生物和现代农业技术领域的研究热点。近些年来,人们在生理、生化、分子和遗传等层面上对植物耐盐机理做了大量工作。当前的研究认为,要达到离子平衡,植物必须要进行三方面的相互联系的调节。首先必须防止植物受到毒害,其次植物在逆境下要重建一个平衡的体内环境,最后生长必须可以恢复。因此,挖掘与这三方面相关的基因资源,筛选出有显著作用的基因,通过转基因来提高作物的抗盐能力,成为我们工作的重点。
由于植物的抗盐能力是由多基因控制,单个功能基因的作用是十分有限的。转录因子能够调控下游一系列基因的表达,通过导入转录因子可以使作物的综合性状得到改良。
发明内容
本发明的一个目的是提供与植物抗盐性相关的蛋白及其编码基因。
本发明所提供的与植物抗盐性相关的蛋白,名称为LcDREB21,来源于羊草(Leymus chinensis),是如下(a)或(b)的蛋白质:
(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质;
(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与抗逆性相关的由(a)衍生的蛋白质。
所述与植物抗盐性相关蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。
所述与植物抗盐性相关蛋白的编码基因为如下1)-4)中任一所述的基因:
1)序列表中序列2自5’末端起第47位到第883位核苷酸所示的DNA分子;
2)序列表中序列2所示的DNA分子;
3)在严格条件下与1)或2)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白的基因;
4)与1)或2)或3)的基因具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的基因。
上述严格条件可为用6×SSC,0.5%SDS的溶液,在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1%SDS和1×SSC,0.1%SDS各洗膜一次。
序列表中的序列2由949个碱基组成,其开放阅读框架(ORF)为自5′末端第47位-第880位碱基,编码氨基酸序列是序列表中序列1所示的蛋白。
含有所述与植物抗盐性相关蛋白的编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。
所述重组表达载体是在p3301-121载体的多克隆位点间插入所述与植物抗盐性相关蛋白的编码基因得到的重组表达载体;
所述p3301-121载体是通过包括如下步骤的方法得到的:
(1)将pCAMBIA3301载体经过HindIII和EcoRI双酶切,回收载体大片段;
(2)将pBI121载体经过HindIII和EcoRI双酶切,回收包含GUS基因的片段;
(3)将步骤(1)中回收的载体大片段与步骤(2)中回收的包含GUS基因的片段连接,得到重组载体p3301-121。
所述pCAMBIA3301载体购自CAMBIA公司;所述pBI121载体购自Clontech公司。
所述重组菌为重组酵母菌。
扩增所述与植物抗盐性相关蛋白的编码基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。
所述引物对中,一条引物序列如序列表中序列3所示,另一条引物序列如序列表中序列4所示。
本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。
本发明所提供的培育转基因植物的方法,是将所述与植物抗盐性相关蛋白的编码基因导入目的植物中,得到抗盐性增强的转基因植物。
所述与植物抗盐性相关蛋白的编码基因是通过所述重组表达载体导入目的植物中。
所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物;所述双子叶植物为拟南芥。
可用现有的植物表达载体构建含有LcDREB21基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等,如pCAMBIA1302、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。携带有本发明的与植物抗盐性相关蛋白的编码基因LcDREB21的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。被转化的植物宿主既可以是小麦、水稻、玉米、短柄草等单子叶植物,也可以是拟南芥、烟草、大豆、黄瓜、番茄、棉花、杨树、苜宿等双子叶植物。
本发明所提供的与植物抗盐性相关蛋白的编码基因LcDREB21受高盐诱导,具有激活下游基因的能力,可作为植物抗盐基因工程的候选基因,用来改良植物的抗盐能力,对于培育抗逆性提高的羊草及其他植物新品种具有重要的理论和实际意义,可用于农牧业和生态环境治理所需的抗性植物品种的培育与鉴定,具有较高的实际应用价值,在农业、畜牧业领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为经400mM NaCl处理的羊草幼苗总RNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果。
图2为5′RACE产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果。
图3为LcDREB21基因的组织特异性表达分析结果。
图4为LcDREB21基因在400mM NaCl处理不同时间下的表达结果。
图5为pBridge-BD-LcDREB21的PCR鉴定结果。
图6为pBridge-BD-LcDREB21的双酶切鉴定结果。
图7为转LcDREB21基因的酵母菌株及转空载体对照酵母菌株在不含His和Trp的SD培养基上的生长情况。
图8重组表达载体p3301-121-LcDREB21的构建过程图。
图9为盐胁迫处理条件下转LcDREB21基因拟南芥抗盐性分析。
图10为p3301-121载体的构建过程。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1、与植物抗盐性相关的蛋白及其编码基因的获得和功能验证
一、与植物抗盐性相关的蛋白及其编码基因的获得
1、植物材料处理及总RNA的提取
以羊草(吉生一号,购自吉林省吉生羊草良种站)幼苗为材料,400mMNaCl处理10小时后提取其总RNA,进行1%琼脂糖凝胶电泳检测,结果如图1所示。结果表明,所提取的RNA有两条明显的电泳条带,从上到下依次为28S RNA和18S RNA,表明获得了纯度较高、较完整的总RNA。
2、利用454技术对羊草转录组进行测序
首先利用MACSTMmRNA分离试剂盒(购自美天旎公司)处理上述步骤1提取的RNA得到mRNA,然后反转录得到cDNA,将得到的cDNA插入λ-FLC-III载体然后包装,得到1.1×106个噬菌斑。噬菌体经过离体处理得到的质体转化大肠杆菌感受态细胞DH10B(购自杰美公司),然后用包装机器(Genetix公司)包装。包装完毕后转移到384微孔板,DNA测序模板用RCA方法,使用TempliPhi DNA扩增试剂盒(通用生物公司)得到。最后测序用Terminator v3.1Cycle Sequencing Kit,在ABI 3700(应用生物系统公司)测序仪上完成。得到的序列经拼接后用BLAST程序分析,发现经拼接后的DNA片段所在基因可能属于DREB转录因子。
3、LcDREB21基因5′端序列的克隆
根据步骤2中454测序得到的序列设计引物,具体的引物序列如下:
LcDREB21R:5′-TGAAGTTATCCCTATTGCTCCGCATGAC-3′。
以步骤1提取的经400mM NaCl处理的羊草幼苗的总RNA为模板,采用Clontech公司的5RACE试剂盒并参照试剂盒说明书,反转录合成其第一链cDNA。反应体系为:1μL RNA,1μL 5′-CDS primerA,1μL SMART II A oligo,1μL DTT(20mM),1μL dNTPMix(10mM),1μL MMLV ReverseTranscriptase,2μL 5X First-Strand Buffer,2μL sterileH2O。反应条件为:70℃2min,冰上2min,42℃1.5h,72℃7min。
以获得的第一链cDNA为模板,引物LcDREB21R与引物UPM(Clontech公司,序列:5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′)配对进行PCR扩增;PCR反应体系为:5′-Race-Ready cDNA 0.5μL,10×UPM 1μL,10μM的LcDREB21R 0.2μl,Master Mix 8.3μl。反应条件为:先94℃30s、72℃3min,5个循环;然后94℃30s、70℃30s、72℃3min,5个循环;最后94℃30s、68℃30s、72℃3min,25个循环。
反应结束后,对PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测,结果如图2所示。其中,泳道M 2k为DL2000Plus DNA Marker(北京全式金生物技术有限公司)的DNA分子量标准,泳道1为5′RACE PCR扩增产物,结果表明,经PCR扩增获得了长度约为1000bp的目的片段。回收并纯化5′RACE产物,将其连接到PMD-18T载体(购自TaKaRa公司)上,连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司),筛选阳性克隆进行菌液PCR鉴定,提取阳性克隆的质粒进行测序。结果表明,该片段的长度为949bp,其脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列2所示。
3、LcDREB21基因全长cDNA序列的获得及PCR检测
利用DNAMAN和OMIGA软件对步骤2获得的DNA片段进行生物信息学分析,该片段序列全长949bp,自5′末端第47位到第880位为ORF,编码序列如序列表中序列1所示的蛋白质,该蛋白质由278个氨基酸残基组成,将该蛋白命名为LcDREB21。
二、LcDREB21基因的组织特异性表达分析
分别提取步骤一中经400mM NaCl处理的羊草(吉生一号,吉林省吉生羊草良种站)幼苗的叶鞘、茎、叶、根、根茎芽、穗和根茎七种组织的总RNA。设计了LcDREB21的RT-PCR一对引物LcDREB21RT1和LcDREB21RT2,序列如下:
LcDREB21RT 1:5′-GTCCAGAGAATTCAAACTGC-3′和
LcDREB21RT2:5′-TGAGAAAAGACTAAACCCGT-3′。
利用LcDREB21RT1和LcDREB21RT2进行RT-PCR分析,同时以Actin基因作为内标。反应结束后,对PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测,结果如图3所示。电泳结果表明LcDREB21在叶中表达最强,在根茎和穗中表达较弱。
三、LcDREB21在高盐胁迫条件下的表达模式分析
将正常生长8周的羊草(吉生一号,吉林省吉生羊草良种站)幼苗浸泡在高盐(400mM NaCl)溶液中,分别在0、1、3、8、12和24小时取材。分别提取上述不同处理时间的羊草幼苗的总RNA,并进行RT-PCR分析,结果如图4所示。结果表明,400mMNaCl处理后,LcDREB21基因在1、3和8小时的转录水平明显得到提高,说明LcDREB21表达受到高盐诱导。
四、LcDREB21转录激活功能验证
根据上述实施例1扩增得到的LcDREB21基因设计引物,加入SalI和PstI酶切位点,引物序列如下:
引物1:GTCGACTGATGGAGACCGGGGGTAGCAA(下划线部分为SalI酶切位点),
引物2:CTGCAGCTAATATGAGAAAAGACTAA(下划线部分为PstI酶切位点),
以人工合成的序列表中序列2所示的LcDREB21基因为模板,进行PCR扩增,将扩增产物经SalI和PstI酶切,回收酶切后的LcDREB21基因片段;同时,用SalI和PstI酶切酵母表达载体pBridge(购自CAMBIA公司),回收载体大片段;将回收的载体大片段与回收的酶切后的LcDREB21基因片段连接,得到目的质粒。用引物LcDREB21RT1和LcDREB21RT2对目的质粒进行PCR鉴定,结果如图5所示,泳道2为DL2000DNA分子量标准(北京全式金生物技术有限公司)。泳道1为PCR产物,长度约为830bp的扩增片段。用SalI和PstI对目的质粒进行双酶切鉴定,结果如图6所示,其中,泳道1为15K DNA分子量标准(北京全式金生物技术有限公司),泳道2为酶切产物的PCR扩增结果,获得了长度分别为6500bp和834bp的酶切产物。表明重组载体构建正确,将得到的重组载体命名为pBridge-BD-LcDREB21。将重组载体pBridge-BD-LcDREB21导入到含有His3和LacZ报道子的酵母AH109株系(购自美国Clontech公司,商品目录号K1612-1)中,同时将酵母表达载体pBridge转入酵母AH109株系作为空载体对照,将pGAL4(购自美国Clontech公司)转入酵母AH109株系作为正对照。将三种转基因酵母菌在不含His和Trp的SD培养基(SD/-His-Trp)上进行培养,结果分别如图7中a和b所示。图7中a表示上述三种转基因酵母在SD培养基(SD/-His-Trp)上的生长情况,图7中b为将图7中a的酵母用含有X-gal的Z-buffer显色后的情况。在图7中a和图7中b中,1为转LcDREB21基因的酵母菌株,2为转入pGAL4作为正对照的酵母菌株,3为转空载体对照酵母菌株。结果表明,转空载体对照酵母菌株在不含His和Trp的SD培养基上不能生长,而转LcDREB21基因的酵母菌株和转入pGAL4作为正对照的酵母菌株能够在不含His和Trp的SD培养基上生长并显蓝色。结果表明,LcDREB21基因具有转录激活活性。
实施例2、转LcDREB21基因拟南芥植株的抗逆性分析
一、获得转LcDREB21基因拟南芥植株
根据上述实施例1扩增得到的LcDREB21基因设计引物,加入BamHI和XbaI酶切位点,引物序列如下:
引物3:ATGGATCCATGGAGACCGGGGGTAGCAAGC(下划线部分为BamHI位点)(序列表中序列3),
引物4:GTCTAGACTAATATGAGAAAAGACTAAACCCG(下划线部分为XbaI位点)(序列表中序列4),
以人工合成的序列表中序列2所示的LcDREB21基因为模板,用引物3和引物4进行PCR扩增,将扩增得到的含BamHI和XbaI酶切位点PCR产物克隆入pMD18Simple-T载体(TaKaRa公司),命名为pMD18-LcDREB21。将pMD18-LcDREB21利用BamHI和XbaI进行双酶切,回收约840bp的LcDREB21基因片段,同时用BamHI和XbaI双酶切p3301-121载体,回收约14200bp的载体大片段,将回收的载体大片段与回收的约840bp的LcDREB21基因片段连接,得到目的质粒。将目的质粒转入大肠杆菌中,抗性筛选,挑取阳性克隆,将阳性克隆进行液体培养,提取阳性克隆质粒进行测序验证,测序结果表明在载体p3301-121的BamHI和XbaI酶切位点间插入了序列表中序列2第47bp到883bp所示的LcDREB21基因片段,证明质粒构建正确。将获得含有LcDREB21完整阅读框的植物双元表达载体命名为p3301-121-LcDREB21,构建过程如图8所示。构建好的植物表达载体p3301-121-LcDREB21通过冻融法转入农杆菌EHA105(购自北京拜尔迪生物技术有限公司),进行除草剂抗性筛选,挑取阳性克隆,将阳性克隆进行液体培养,用阳性克隆菌液浸染拟南芥花序的方法进行拟南芥转化,转化后暗培养2天,进行第二次浸染,然后正常培养到收获种子。收获的种子在含除草剂抗性的平板(1/2MS+10mg/L草胺磷)上进行抗性筛选,筛选为阳性的苗,收获种子(T1),收获的种子在含除草剂的平板(1/2MS+10mg/L草胺磷)上种植,筛选后代分离比为3∶1的株系,收获其种子(T2),用其小苗(T3)来做抗逆实验。按照获得转LcDREB21基因拟南芥的方法,将空载体p3301-121转化拟南芥植株,得到转空载体对照拟南芥植株。
所述p3301-121载体是通过包括如下步骤的方法得到的:
(1)将pCAMBIA3301载体(购自CAMBIA公司)经过Hind III和EcoR I双酶切,回收11246bp的载体大片段;
(2)将pBI121载体(购自Clontech公司)(含35S启动子,GUS报告基因,Tnos)也经过Hind III和EcoR I双酶切,回收包含GUS基因的2942bp的片段;
(3)将步骤(1)中回收的载体大片段与步骤(2)中回收的包含GUS基因的片段经T4DNA酶连接,得到重组载体p3301-121(图10)。
二、转LcDREB21基因拟南芥植株的抗逆性分析
将上述步骤一获得的转LcDREB21基因拟南芥植株的种子、转空载体对照拟南芥植株的种子和野生型拟南芥种子分别种于含除草剂培养基(1/2MS+10mg/L草胺磷)上,萌发生长(萌发生长条件为:温度为22-24℃,16小时光照-8小时黑暗的光周期,空气湿度为60%-80%)一周后,移栽到土中,在培养室培养(培养室培养的条件:温度为22-24℃,16小时光照8小时黑暗的光周期,空气湿度为50-60%)一周后进行400mM的NaCl胁迫处理(将拟南芥苗浸入400mM的NaCl溶液中)。。胁迫处理12小时观察表型,观察到胁迫处理第7天。
结果显示,转LcDREB21基因拟南芥苗在胁迫处理第7天有96%的植株没有明显的表型变化,而转空载体对照拟南芥苗全都出现了萎蔫变黄的盐害症状(图9,图中A为转空载体对照拟南芥苗,B为转LcDREB21基因拟南芥苗)。野生型拟南芥苗的表型与转空载体对照拟南芥苗表型一致。该实验结果表明本发明的LcDREB21基因可以增强转基因植物的抗盐能力。
Claims (8)
1.一种蛋白,是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因,其特征在于:所述蛋白的编码基因为如1)或2)所述的基因:
1)序列表中序列2自5’末端起第47位到第883位核苷酸所示的DNA分子;
2)序列表中序列2所示的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述编码基因的表达盒、重组表达载体或重组菌。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体,其特征在于:所述重组表达载体是在p3301-121载体的多克隆位点间插入所述编码基因得到的重组表达载体;
所述p3301-121载体是通过包括如下步骤的方法得到的:
(1)将pCAMBIA3301载体经过HindIII和EcoRI双酶切,回收载体大片段;
(2)将pBI121载体经过HindIII和EcoRI双酶切,回收包含GUS基因的片段;
(3)将步骤(1)中回收的载体大片段与步骤(2)中回收的包含GUS基因的片段连接,得到重组载体p3301-121。
6.根据权利要求4所述的重组菌,其特征在于:所述重组菌为重组酵母菌。
7.扩增权利要求2所述编码基因的引物对,所述引物对中,一条引物序列如序列表中序列3所示,另一条引物序列如序列表中序列4所示。
8.一种培育转基因植物的方法,是将权利要求2或3所述的编码基因导入目的植物中,得到抗盐性高于所述目的植物的转基因植物;
权利要求2或3所述的编码基因是通过权利要求4或5所述的重组表达载体导入目的植物中;
所述目的植物为拟南芥。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201010548661XA CN102464709B (zh) | 2010-11-17 | 2010-11-17 | 与植物抗盐性相关的蛋白及其编码基因与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201010548661XA CN102464709B (zh) | 2010-11-17 | 2010-11-17 | 与植物抗盐性相关的蛋白及其编码基因与应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN102464709A CN102464709A (zh) | 2012-05-23 |
CN102464709B true CN102464709B (zh) | 2013-09-04 |
Family
ID=46068866
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201010548661XA Expired - Fee Related CN102464709B (zh) | 2010-11-17 | 2010-11-17 | 与植物抗盐性相关的蛋白及其编码基因与应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN102464709B (zh) |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101386646A (zh) * | 2008-10-29 | 2009-03-18 | 中国农业科学院作物科学研究所 | 一种植物耐逆性蛋白及其编码基因与应用 |
CN101386645A (zh) * | 2008-10-29 | 2009-03-18 | 中国农业科学院作物科学研究所 | 一种植物耐盐蛋白及其编码基因与应用 |
CN101508727A (zh) * | 2009-04-02 | 2009-08-19 | 中国农业大学 | 植物响应低磷和高盐胁迫的蛋白及其编码基因与应用 |
CN101747419A (zh) * | 2008-12-08 | 2010-06-23 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 耐盐相关蛋白及其编码基因与应用 |
-
2010
- 2010-11-17 CN CN201010548661XA patent/CN102464709B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101386646A (zh) * | 2008-10-29 | 2009-03-18 | 中国农业科学院作物科学研究所 | 一种植物耐逆性蛋白及其编码基因与应用 |
CN101386645A (zh) * | 2008-10-29 | 2009-03-18 | 中国农业科学院作物科学研究所 | 一种植物耐盐蛋白及其编码基因与应用 |
CN101747419A (zh) * | 2008-12-08 | 2010-06-23 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 耐盐相关蛋白及其编码基因与应用 |
CN101508727A (zh) * | 2009-04-02 | 2009-08-19 | 中国农业大学 | 植物响应低磷和高盐胁迫的蛋白及其编码基因与应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN102464709A (zh) | 2012-05-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US9809827B2 (en) | Transgenic maize | |
CN102532287B (zh) | 苔藓植物耐逆蛋白PpLEA3-17及其编码基因与应用 | |
Zhou et al. | Genome-wide analysis of the MYB gene family in physic nut (Jatropha curcas L.) | |
Zhang et al. | PhePLATZ1, a PLATZ transcription factor in moso bamboo (Phyllostachys edulis), improves drought resistance of transgenic Arabidopsis thaliana | |
CN102584965B (zh) | 苔藓植物耐逆蛋白PpLEA3-20及其编码基因与应用 | |
CN102399268B (zh) | 植物耐逆性相关转录因子GmNAC11及其编码基因与应用 | |
CN102924581B (zh) | 水稻抗白叶枯病相关蛋白及其编码基因与应用 | |
CN102464708B (zh) | 与植物抗逆性相关的蛋白及其编码基因与应用 | |
CN103102400B (zh) | 大豆转录活性蛋白GmPHD6及其编码基因与应用 | |
CN101250220A (zh) | 一种植物抗逆相关蛋白及其编码基因与应用 | |
CN100587070C (zh) | 一个麻疯树盐诱导基因与应用 | |
CN104017061A (zh) | 转录因子ZmbZIP17及编码基因与其在响应逆境中的应用 | |
CN103588867B (zh) | 大豆转录因子GmMYB174a及其编码基因与应用 | |
CN103570812B (zh) | 来源于羊草与耐低温相关的转录因子及其编码基因与应用 | |
CN103626857B (zh) | 一种与植物抗盐相关的蛋白及其编码基因与应用 | |
CN102464709B (zh) | 与植物抗盐性相关的蛋白及其编码基因与应用 | |
CN102477088B (zh) | 与植物抗盐性相关的蛋白及其编码基因与应用 | |
CN105237631A (zh) | 一种来源于羊草与抗寒相关的蛋白及其编码基因与应用 | |
CN104140462A (zh) | 植物耐盐性相关蛋白GhSnRK2-6及其编码基因与应用 | |
CN102477089B (zh) | 与植物耐低温性相关的蛋白及其编码基因与应用 | |
CN102659936B (zh) | 植物耐逆性相关蛋白及其编码基因与应用 | |
CN104844699B (zh) | 大豆GmNEK1蛋白及其编码基因与应用 | |
CN100357319C (zh) | 一个麻疯树冷诱导转录因子及其编码基因与应用 | |
CN102250946A (zh) | 玉米转录因子ZmWRKY33基因的应用 | |
CN103374061B (zh) | 一种来源于羊草与抗盐相关的蛋白及其编码基因与应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20130904 Termination date: 20161117 |
|
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |