CN101381697A - 利用卡那霉素抗性基因启动子表达的重组克雷伯氏菌及其应用 - Google Patents
利用卡那霉素抗性基因启动子表达的重组克雷伯氏菌及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
利用卡那霉素抗性基因启动子表达的重组克雷伯氏菌及其应用，属于基因工程技术领域。本发明提供一株提高1，3－丙二醇产量的重组克雷伯氏杆菌，其分类命名为克雷伯氏杆菌(Klebsiella sp.)pETPkan－dhaT，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 208134。将来自克雷伯氏杆菌1，3－丙二醇氧化还原酶的基因dhaT，构建克雷伯氏杆菌表达载体pETPkan－dhaT；将该表达载体转入克雷伯氏杆菌中，获得了重组克雷伯氏杆菌pETPkan－dhaT；加强dhaT基因的表达，得到的重组克雷伯氏菌在以甘油为底物的发酵过程中，中间产物3－羟基丙醛积累量明显降低，1，3－丙二醇产量比对照提高16.9％；为构建高产1，3－丙二醇或利用葡萄糖为底物产1，3－丙二醇克雷伯氏基因工程菌打下基础。
Description
技术领域
利用卡那霉素抗性基因启动子表达的重组克雷伯氏菌及其应用，涉及卡那霉素抗性基因启动子在提高克雷伯氏菌1，3-丙二醇产量中的应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
1，3-丙二醇(1，3-Propanediol，1，3-PD)是一种重要的化工原料，作为医药和有机合成的中间体用于食品、化妆品和制药等行业，1，3-丙二醇最重要的用途就是作为合成新型聚酯如聚对苯二甲酸-1，3-丙二醇酯(PTT)的单体，因而1，3-PD在纺织、地毯以及工程塑料领域也具有非常广阔的应用前景。1，3-丙二醇生产主要采用化学方法，但因环境污染、石油资源紧张等，使其进一步发展受到限制。欧美国家积极开展用肠道细菌和梭状芽孢将甘油转化为1，3-PD的研究，Dupont公司开发的由葡萄糖合成1，3-PD，进而合成PTT的工艺，被授予2003年美国总统绿色化学奖。
目前，应用自然菌株发酵生产1，3-丙二醇得到了广泛的关注，其能以甘油作为唯一的碳源和能源发酵生产1，3-PD。自然菌株主要集中在克雷伯氏杆菌属、弗氏柠檬杆菌属和梭状芽孢杆菌属。人们对克雷伯氏菌研究较早，对其代谢途径认识比较清楚，有研究表明，克雷伯氏菌以甘油为底物生产1，3-PD，经过以下两步反应，即甘油在甘油脱水酶(GDHt)的作用下生成中间产物3-羟基丙醛；3-羟基丙醛在1，3-丙二醇氧化还原酶(PDOR)的催化下生成1，3-PD。
从目前研究的现状看，克雷伯氏杆菌(Klebsiella.sp)发酵甘油的底物转化率、产物浓度和生产强度都比较高，因此是一种有希望实现工业化的方法。然而相比化学法合成1，3-PD的价格，微生物发酵法目前没有明显的成本优势，其主要的原因是发酵液中产品的浓度和发酵强度低，从而使生产成本相对较高，为取得更大的经济效益尚存障碍，因此，为进一步降低生产成本，开发提高1，3-PD发酵液中产品浓度及生产强度的克雷伯氏基因工程菌成为研究的重点。如利用分子生物学技术将甘油合成1，3-PD关键酶基因转入克雷伯氏菌内，增强甘油合成1，3-PD代谢流通量，从而提高克雷伯氏菌的生产强度；或将葡萄糖合成甘油关键酶基因导入克雷伯氏菌中，扩大克雷伯氏菌的底物利用范围，即能以廉价的碳水化合物如葡萄糖为底物直接生产1，3-PD，以降低生产成本，提高产品的竞争力。
然而，构建一种高效的表达系统是利用途径工程改造克雷伯氏菌的前提和基础。本发明将利用分子生物学技术构建了一种新型表达载体，该载体能在克雷伯氏菌中复制和启动外源基因的表达。为进一步利用代谢工程手段改造克雷伯氏菌，开发更具生产潜力的克雷伯氏基因工程菌打下坚实的基础。
发明内容
本发明的目的是构建一种新型的表达载体为进一步对克雷伯氏菌进行改造奠定基础。本发明的新型表达载体能在克雷伯氏菌中复制和启动外源基因的表达。为进一步利用代谢工程手段改造克雷伯氏菌，开发更具生产潜力的克雷伯氏基因工程菌打下坚实的基础。
本发明的技术方案：一株提高1，3-丙二醇产量的重组克雷伯氏杆菌，其分类命名为克雷伯氏杆菌(Klebsiella sp.)pETPkan-dhaT，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 208134。
所述的重组克雷伯氏杆菌，其构建所用的表达载体pETPkan-dhaT，采用卡那霉素抗性基因启动子Pkan。
所述的重组克雷伯氏杆菌，其扩增了来自克雷伯氏杆菌1，3-丙二醇氧化还原酶的基因dhaT。
所述的重组克雷伯氏杆菌，达到克雷伯氏杆菌自身的1，3-丙二醇氧化还原酶加强表达，来提高发酵法生产1，3-丙二醇的产量。
所述重组克雷伯氏杆菌的构建方法，将来自克雷伯氏杆菌1，3-丙二醇氧化还原酶的基因dhaT，构建克雷伯氏杆菌表达载体pETPkan-dhaT；将该表达载体pETPkan-dhaT转入克雷伯氏杆菌中，获得了重组克雷伯氏杆菌(Klebsiella sp.)pETPkan-dhaT；
(1)质粒pETPkan的构建：
以质粒pET28a为模板，进行PCR扩增，所用引物如下：
P1：5’-cgc aga tct GTA TCT CAG TTC GGT GTA GG-3’
P2：5’-cgc gaa ttc AAC ACC CCT TGT ATT ACT G-3’
PCR方法如下：50μL反应体系中加入：10mmol/L的引物P1和P2各1.5μL，2mmol/L的dNTP 5μL，10×ExTaq Buffer 5μL，5U/μL的ExTaq DNA聚合酶0.5μL，模板1μg，加双蒸水补齐50μL；PCR条件为：95℃变性5分钟；94℃变性1分钟、54℃ 1分钟、72℃延伸2分钟，循环30次；
通过琼脂糖凝胶电泳分析纯化反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段回收试剂盒回收0.5kb的目标片段；纯化好的目标片段经Bgl II和EcoR I双酶切，用PCR片段回收试剂盒回收；载体pET28a经过BamH I和EcoR I双酶切，用PCR片段胶回收试剂盒纯化；用T4连接酶连接两酶切纯化好的片段，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，转化物涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；提取质粒，分别用Bgl II和EcoR I双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冷冻保存于-80℃；重组质粒命名为pETPkan，阳性重组子命名为JM109/pETPkan；
(2)质粒pETPkan-CMcds的构建：
以质粒pACYCDuet为模板进行PCR扩增氯霉素编码结构基因CMcds，所用引物如下：
P3：5’-cgc gaa ttc ATG GAG AAA AAA ATC ACT GG-3’
P4：5’-cgc aag ctt tta cgc ccc gcc ctg cca ctc-3’
PCR方法如下：50μL反应体系中加入：10mmol/L的引物P3和P4各1.5μL，2mmol/L的dNTP 5μL，10×ExTaq Buffer 5μL，5U/μL的ExTaq DNA聚合酶0.5μL，模板1μg，加双蒸水补齐50μL；PCR条件为：95℃变性5分钟；94℃变性1分钟、54℃ 1分钟、72℃延伸2分钟，循环35次；
用试剂盒回收0.7kb的目标片段；纯化好的目标片段经EcoR I和Hind III双酶切，回收；同时提取质粒pETPkan，并用EcoR I和Hind III双酶切，回收纯化；用T4连接酶连接两酶切纯化好的片段，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，转化物涂布于含有50μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；提取质粒，分别用EcoR I和Hind III双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冷冻保存于-80℃；重组质粒命名为pETPkan-CMcds，阳性重组子命名为JM109/pETPkan-CMcds。
(3)质粒pETPkan-CMcds转化克雷伯氏菌：
质粒pETPkan-CMcds用氯化钙法转化克雷伯氏菌感受态细胞，转化物涂布于含有50μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素LB琼脂平板，37℃培养过夜；发现有大量单菌落生成；
(4)质粒pETPkan-dhaT的构建：
以克雷伯氏菌染色体DNA为模板，进行PCR扩增1，3-丙二醇氧化还原酶编码基因dhaT，引物序列如下：
P5：5’-ACCGGAATTCATGAGCTATCGTATGTTTG-3’
P6：5’-ACC GAAGCTTTC AGA ATG CCT GGC G-3’
PCR方法如下：50μL反应体系中加入：10mmol/L的引物P5和P6各1.5μL，2mmol/L的dNTP 5μL，10×ExTaq Buffer 5μL，5U/μL的ExTaq DNA聚合酶0.5μL，模板1μg，加双蒸水补齐50μL；PCR条件为：95℃变性5分钟；94℃变性1分钟、54℃ 1.5分钟、72℃延伸2分钟，循环35次；
通过琼脂糖凝胶电泳分析纯化反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段回收试剂盒回收1.2kb的目标片段；纯化好的目标片段经EcoR I和Hind III双酶切，用PCR片段回收试剂盒回收；载体pETPkan经过EcoR I和Hind III双酶切，用PCR片段胶回收试剂盒纯化；用T4连接酶连接两酶切纯化好的片段，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，转化物涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；提取质粒，分别用EcoR I和Hind III双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冷冻保存于-80℃；重组质粒命名为pETPkan-dhaT，阳性重组子命名为JM109/pETPkan-dhaT；
(5)重组克雷伯氏杆菌pETPkan-dhaT的构建：
取一支冷冻保存的JM109/pETPkan-dhaT，接种于20mL含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，提取质粒pETPkan-dhaT，用氯化钙法转化克雷伯氏杆菌感受态细胞，转化物涂布于含有50μg/mL卡那霉素LB琼脂平板，37℃培养过夜；有大量单菌落生成，即为重组克雷伯氏杆菌pETPkan-dhaT。
用所述重组克雷伯氏杆菌发酵生产1，3-丙二醇的方法：
出发菌株：重组克雷伯氏杆菌pETPkan-dhaT；
培养基组成：种子培养基以g/L计：蛋白胨10，酵母膏5，氯化钠10；
发酵培养基以g/L计：甘油50，酵母膏5，KH2PO4 5，(NH4)2SO4 0.1，柠檬酸4，微量元素溶液60mL，维生素B12的添加量为发酵培养基中维生素B12终浓度15mg/L，初始pH7.0；
所述微量元素溶液每升含有：0.68g ZnCl2，2.0g MnCl2·4H2O，60mg H3BO3，0.47g CoCl2·6H2O，5mg Na2MoO4·2H2O，17g CuCl2·2H2O，5.4g FeCl3·6H2O，10ml HCl(37％)；
培养条件：从新鲜的LB培养基斜面上挑取一环菌株接入装液量为50mL的250mL摇瓶中，于旋转式摇床中37℃、140r/min培养20h得到种子液，按照5％接种量接入装液量为50mL发酵培养基的250mL摇瓶中，发酵30h。
由于克雷伯氏菌对卡那霉素和氯霉素较为敏感，因此选用其作为筛选标记。首先，利用常规的原核表达载体pET28a转化克雷伯氏菌得到阳性转化子，其次，PCR扩增获得氯霉素抗性结构基因CMcds，插入pET28a多克隆位点即T7启动子下游，构建了重组载体pET28a-CMcds，具备氯霉素抗性，将pET28a-CMcds转入克雷伯氏菌中，重组克雷伯氏菌对氯霉素仍然敏感。进一步PCR扩增获得卡那霉素抗性基因启动子Pkan，构建了新型载体pETPkan，并将CMcds置于Pkan下游，构建了重组载体pETPkan-CMcds，重组大肠杆菌JM109/pETPkan-CMcds不经过诱导直接具备氯霉素抗性，同时将质粒pETPkan-CMcds导入克雷伯氏菌中，重组克雷伯氏菌具备氯霉素抗性。
载体pET28a是一种常用的原核表达载体，带有卡那霉素抗性基因Kan、ori等元件，本发明选择的宿主克雷伯氏菌，其具有氨苄抗性但对卡那霉素较为敏感，故优先选择pET28a作为原始出发质粒。
本发明并没有选用载体pET28a上的T7启动子，因为克雷伯氏菌本身不能合成T7聚合酶，故T7启动子在其体内不能启动外源基因的表达，由于pET28a转入克雷伯氏后使其具备卡那抗性，说明该质粒能在其中复制且卡那启动子能成功启动基因的表达，本发明选用了来源于表达载体pET28a上卡那霉素抗性基因(Kan)的启动子，该启动子是组成型的启动子，可以不需要诱导直接启动目的基因的表达。
为分析Pkan在克雷伯氏菌中的功能，且其对氯霉素较为敏感，故将氯霉素抗性结构基因置于Pkan下游，
带有异源基因的游离型表达载体可以通过CaCl2法、原生质体融合法或电穿孔法转化宿主系统。成功转化的细胞，即含有本发明构建的游离型表达载体的细胞，可以通过本领域熟知的方法加以鉴定，如收集细胞，裂解后提取质粒，然后进行酶切和PCR鉴定。
本发明选择的宿主系统是克雷伯氏菌(Klebsiella.pneumoniae)，其能以甘油作为唯一的碳源和能源发酵生产1，3-PD，国内外对其认识较早，研究较多。为进一步降低生产成本，提高克雷伯氏菌的发酵强度和生产能力，开发具有竞争力的克雷伯氏基因工程菌，因此本发明选择克雷伯氏菌作为宿主，构建适用于其的新型表达系统，为基因工程改造克雷伯氏菌打下基础。
本发明的有益效果：由于克雷伯氏菌对氨苄霉素具有一定的抗性，利用载体pET28a转化克雷伯氏菌获得成功，保证该载体能在其中进行复制以及卡那霉素抗性基因得到表达；由于克雷伯氏菌不能合成T7聚合酶，故原核生物中常用T7强表达启动子在其中不能启动外源基因的表达，由于卡那霉素抗性基因在其中能正常表达，说明卡那霉素抗性基因启动子Pkan能正常转录，且不受诱导属组成型表达。通过PCR扩增获得了Pkan，构建了新型载体pETPkan，有利于外源基因在克雷伯氏菌中的组成型表达。
利用氯霉素抗性平板检测本发明构建的新型载体在克雷伯氏菌中的表达情况，即验证Pkan在克雷伯氏菌中启动外源基因的表达情况。构建了重组表达载体pETPkan-CMcds，导入克雷伯氏菌中，重组克雷伯氏菌具有较高的氯霉素抗性。
3-羟基丙醛(3-HPA)是1，3-PD合成途径中间代谢产物，当3-HPA含量过高时，会影响菌体的生长以及中断1，3-PD的合成。因此，利用新型构建的表达载体过量表达编码PDOR基因dhaT，以期降低发酵过程中3-HPA对细胞的毒性。进一步构建了克雷伯氏基因工程菌K.p/pETPkan-dhaT，发现PDOR酶活与对照相比有显著提高，甘油生成1，3-PD途径中的中间代谢产物3-HPA含量明显降低。证明Pkan能在克雷伯氏菌中启动外源基因的有效表达，且属组成型表达不需IPTG诱导，成功构建了适用于克雷伯氏菌的新型表达系统。
附图说明
图1质粒pET28a-CMcds。
图2质粒pETPkan。
图3质粒pETPkan-CMcds。
图4质粒pETPkan-dhaT。
图5重组质粒酶切验证Lane 1 DNA分子量标准；Lane 2载体pET28aEcoR I酶切；Lane 3载体pET28a-CMcds/EcoR I和Hind III双酶切；Lane 4载体pETPkan Bgl II和EcoR I双酶切；Lane 5载体pETPkan EcoR I酶切；Lane6载体pETPkan-CMcds/EcoR I和Hind III双酶切；Lane 7载体pETPkan-dhaT/EcoR I和Hind III双酶切；Lane 8 DNA分子量标准。
图6重组克雷伯氏菌和对照菌株发酵过程中3-HPA含量的变化K.p/pETPkan-dhaT(△)和K.pneumoniae(▲)。
图7重组克雷伯氏菌和对照菌株发酵过程中甘油和1，3-丙二醇含量的变化及生长曲线K.p/pETPkan-dhaT甘油含量(□)和K.pneumoniae甘油含量(■)；K.p/pETPkan-dhaT1，3-丙二醇含量(△)和K.pneumoniae1，3-丙二醇含量(▲)；K.p/pETPkan-dhaT生长曲线(○)和K.pneumoniae生长曲线(●)。
生物材料样品保藏
一株提高1，3-丙二醇产量的重组克雷伯氏杆菌，其分类命名为克雷伯氏杆菌(Klebsiella sp.)pETPkan-dhaT，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2008年9月22日，保藏编号为CCTCC NO：M 208134。
具体实施方式
实施例1：质粒pETPkan的构建：
以质粒pET28a为模板，进行PCR扩增，所用引物如下：
P1：5’-cgc aga tct GTA TCT CAG TTC GGT GTA GG-3’
P2：5’-cgc gaa ttc AAC ACC CCT TGT ATT ACT G-3’
PCR方法如下：50μL反应体系中加入：10mol/L的引物P1和P2各1.5μL，2mmol/L的dNTP 5μL，10×ExTaq Buffer 5μL，5U/μL的ExTaq DNA聚合酶0.5μL，模板1μg，加双蒸水补齐50μL；PCR条件为：95℃变性5分钟，54℃ 1分钟，72℃延伸2分钟，94℃变性1分钟，循环30次；
通过琼脂糖凝胶电泳分析纯化反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段回收试剂盒回收约0.5kb的目标片段；纯化好的目标片段经Bgl II和EcoR I双酶切，用PCR片段回收试剂盒回收；载体pET28a经过BamH I和EcoR I双酶切，用PCR片段胶回收试剂盒纯化；用T4连接酶连接两酶切纯化好的片段，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，转化物涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；提取质粒，分别用Bgl II和EcoR I双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冷冻保存于-80℃；重组质粒命名为pETPkan，阳性重组子命名为JM109/pETPkan。
实施例2：质粒pETPkan-CMcds的构建：
取一支冷冻保存的BL21/pET28a-CMcds，接种于20mL含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒pET28a-CMcds，用EcoR I和Hind III进行双酶切，胶回收试剂盒回收约为0.7kb大小的目的片段，同时提取质粒pETPkan，并用EcoR I和Hind III双酶切，回收纯化。用T4连接酶连接两酶切纯化好的片段，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，转化物涂布于含有50μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；提取质粒，分别用EcoR I和Hind III双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冷冻保存于-80℃；重组质粒命名为pETPkan-CMcds，阳性重组子命名为JM109/pETPkan-CMcds。
实施例3：质粒pETPkan-CMcds转化克雷伯氏菌：
质粒pETPkan-CMcds转化克雷伯氏菌感受态细胞，转化物涂布于含有50μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素LB琼脂平板，37℃培养过夜；发现有大量单菌落生成。
实施例4：质粒pETPkan-dhaT的构建：
以克雷伯氏菌染色体DNA为模板，进行PCR扩增，引物序列如下：
P5：5’-ACCGGAATTCATGAGCTATCGTATGTTTG-3’
P6：5’-ACC GAAGCTTTC AGA ATG CCT GGC G-3’
PCR方法如下：50μL反应体系中加入：10mmol/L的引物P5和P6各1.5μL，2mmol/L的dNTP 5μL，10×ExTaq Buffer 5μL，5U/μL的ExTaq DNA聚合酶0.5μL，模板1μg，加双蒸水补齐50μL；PCR条件为：95℃变性5分钟；94℃变性1分钟、54℃ 1.5分钟、72℃延伸2分钟，循环35次；
通过琼脂糖凝胶电泳分析纯化反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段回收试剂盒回收约1.2kb的目标片段；纯化好的目标片段经EcoR I和HindIII双酶切，用PCR片段回收试剂盒回收；载体pETPkan经过EcoR I和Hind III双酶切，用PCR片段胶回收试剂盒纯化；用T4连接酶连接两酶切纯化好的片段，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，转化物涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；提取质粒，分别用EcoR I和Hind III双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冷冻保存于-80℃；重组质粒命名为pETPkan-dhaT，阳性重组子命名为JM109/pETPkan-dhaT。
实施例5：克雷伯氏基因工程菌K.p/pETPkan-dhaT的构建：
取一支冷冻保存的JM109/pETPkan-dhaT，接种于20mL含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒pETPkan-dhaT，转化克雷伯氏菌感受态细胞，转化物涂布于含有50μg/mL卡那霉素LB琼脂平板，37℃培养过夜；发现有大量单菌落生成。
实施例6：克雷伯氏基因工程菌PDOR酶活、3-HPA和1，3-PD检测：
PDOR酶活性根据25℃下NAD+还原成NADH的速率来测定。总反应体积2mL含0.6mM NAD，30mM(NH4)2SO4，100mM 1，3-PD，K2CO3-KHCO3缓冲液(pH9.0)，加入酶液起始反应，340nm下测定三分钟吸光值的变化。酶活单位定义为1国际单位(1U)等于每分种还原1μmol底物或生成1μmol产物的酶量。
3-羟基丙醛(3-HPA)含量采用比色法测定。3-HPA在浓酸条件下脱水生成丙烯醛，后者与色氨酸试剂反应生成紫色物质，在560nm有最大光吸收。由于难以获得3-HPA纯品，以丙烯醛代替作为标准品，因为1mol 3-HPA脱水生成1mol丙烯醛。检测系统中含1mL样品，0.75mL色氨酸试剂及3mL 37％的浓盐酸，在37℃水浴20min显色。560nm检测吸光值，根据丙烯醛的标准曲线计算出发酵液中3-羟基丙醛的浓度。色氨酸试剂配制：D，L-色氨酸2.04g、浓盐酸4.16ml以蒸馏水定容至1L。
发酵液中1，3-丙二醇及甘油的含量采用气相色谱测定。安捷伦1490型气相色谱仪，2m不锈钢柱(
)，国产高分子微球GDX-401(110目)为固定相。柱温：250℃，进样温度：260℃，检测温度：260℃，氮气作为载气，使用氢火焰检测器，进样5μL，1，3-丙二醇的保留时间为2.6min，用外标法计算发酵液中1，3-丙二醇的含量。
实施例7：用所述重组克雷伯氏杆菌发酵生产1，3-丙二醇：
发酵条件如上本发明的技术方案所述。结果测得重组克雷伯氏菌的PDOR酶活力为1.64U/mg，对照为0.85U/mg；同时检测中间产物3-羟基丙醛(3-HPA)的含量明显降低；在甘油发酵生成1，3-丙二醇的过程中，对照3-HPA的最大值为8.2mmol/L，重组克雷伯氏菌的3-HPA的最大值为2.9mmol/L，重组菌1，3-PD的产量与对照相比提高16.9％，分别为33.2g/L和28.4g/L，且重组菌生长情况比对照要好。
Claims (6)
1、一株提高1，3-丙二醇产量的重组克雷伯氏杆菌，其分类命名为克雷伯氏杆菌(Klebsiella sp.)pETPkan-dhaT，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 208134。
2、根据权利要求1所述的重组克雷伯氏杆菌，其特征是构建所用的表达载体pETPkan-dhaT，采用卡那霉素抗性基因启动子Pkan。
3、根据权利要求1所述的重组克雷伯氏杆菌，其特征是扩增了来自克雷伯氏杆菌1，3-丙二醇氧化还原酶的基因dhaT。
4、根据权利要求1所述的重组克雷伯氏杆菌，其特征是达到克雷伯氏杆菌自身的1，3-丙二醇氧化还原酶加强表达，来提高发酵法生产1，3-丙二醇的产量。
5、权利要求1所述重组克雷伯氏杆菌的构建方法，其特征是将来自克雷伯氏杆菌1，3-丙二醇氧化还原酶的基因dhaT，构建克雷伯氏杆菌表达载体pETPkan-dhaT；将该表达载体pETPkan-dhaT转入克雷伯氏杆菌中，获得了重组克雷伯氏杆菌(Klebsiella sp.)pETPkan-dhaT；
(1)质粒pETPkan的构建：
以质粒pET28a为模板，进行PCR扩增，所用引物如下：
P1:5’-cgc aga tct GTA TCT CAG TTC GGT GTA GG-3’
P2：5’-cgc gaa ttc AAC ACC CCT TGT ATT ACT G-3’
PCR方法如下：50μL反应体系中加入：10mmol/L的引物P1和P2各1.5μL，2mmol/L的dNTP 5μL，10×ExTaq Buffer 5μL，5U/μL的ExTaq DNA聚合酶0.5μL，模板1μg，加双蒸水补齐50μL；PCR条件为：95℃变性5分钟；94℃变性1分钟、54℃1分钟、72℃延伸2分钟，循环30次；
通过琼脂糖凝胶电泳分析纯化反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段回收试剂盒回收0.5kb的目标片段；纯化好的目标片段经Bgl II和EcoR I双酶切，用PCR片段回收试剂盒回收；载体pET28a经过BamH I和EcoR I双酶切，用PCR片段回收试剂盒纯化；用T4连接酶连接两酶切纯化好的片段，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，转化物涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；提取质粒，分别用Bgl II和EcoR I双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冷冻保存于-80℃；重组质粒命名为pETPkan，阳性重组子命名为JM109/pETPkan；
(2)质粒pETPkan-CMcds的构建：
以质粒pACYCDuet为模板进行PCR扩增氯霉素编码结构基因CMcds，所用引物如下：
P3：5’-cgc gaa ttc ATGGAG AAA AAA ATC ACT GG-3’
P4：5’-cgc aag ctt tta cgc ccc gcc ctg cca ctc-3’
PCR方法如下：50μL反应体系中加入：10mmol/L的引物P3和P4各1.5μL，2mmol/L的dNTP 5μL，10×ExTaq Buffer 5μL，5U/μL的ExTaq DNA聚合酶0.5μL，模板1μg，加双蒸水补齐50μL；PCR条件为：95℃变性5分钟；94℃变性1分钟、54℃ 1分钟、72℃延伸2分钟，循环35次；
用试剂盒回收0.7kb的目标片段；纯化好的目标片段经EcoR I和Hind III双酶切，回收；同时提取质粒pETPkan，并用EcoR I和Hind III双酶切，回收纯化；用T4连接酶连接两酶切纯化好的片段，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，转化物涂布于含有50μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；提取质粒，分别用EcoR I和Hind III双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冷冻保存于-80℃；重组质粒命名为pETPkan-CMcds，阳性重组子命名为JM109/pETPkan-CMcds；
(3)质粒pETPkan-CMcds转化克雷伯氏菌：
质粒pETPkan-CMcds用氯化钙法转化克雷伯氏菌感受态细胞，转化物涂布于含有50μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；发现有大量单菌落生成；
(4)质粒pETPkan-dhaT的构建：
以克雷伯氏菌染色体DNA为模板，进行PCR扩增1，3-丙二醇氧化还原酶编码基因dhaT，引物序列如下：
P5：5’-ACCGGAATTCATGAGCTATCGTATGTTTG-3’
P6：5’-ACC GAAGCTTTC AGA ATG CCT GGC G-3’
PCR方法如下：50μL反应体系中加入：10mmol/L的引物P5和P6各1.5μL，2mmol/L的dNTP 5μL，10×ExTaq Buffer 5μL，5U/μL的ExTaq DNA聚合酶0.5μL，模板1μg，加双蒸水补齐50μL；PCR条件为：95℃变性5分钟；94℃变性1分钟、54℃1.5分钟、72℃延伸2分钟，循环35次；
通过琼脂糖凝胶电泳分析纯化反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段回收试剂盒回收1.2kb的目标片段；纯化好的目标片段经EcoR I和Hind III双酶切，用PCR片段回收试剂盒回收；载体pETPkan经过EcoR I和Hind III双酶切，用PCR片段回收试剂盒纯化；用T4连接酶连接两酶切纯化好的片段，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，转化物涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；提取质粒，分别用EcoR I和Hind III双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冷冻保存于-80℃；重组质粒命名为pETPkan-dhaT，阳性重组子命名为JM109/pETPkan-dhaT；
(5)重组克雷伯氏杆菌pETPkan-dhaT的构建：
取一支冷冻保存的JM109/pETPkan-dhaT，接种于20mL含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，提取质粒pETPkan-dhaT，用氯化钙法转化克雷伯氏杆菌感受态细胞，转化物涂布于含有50μg/mL卡那霉素LB琼脂平板，37℃培养过夜；有大量单菌落生成，即为重组克雷伯氏杆菌pETPkan-dhaT。
6、用权利要求1所述重组克雷伯氏杆菌发酵生产1，3-丙二醇的方法，其特征是：
出发菌株：重组克雷伯氏杆菌pETPkan-dhaT；
培养基组成：种子培养基以g/L计：蛋白胨10，酵母膏5，氯化钠10；
发酵培养基以g/L计：甘油50，酵母膏5，KH2PO4 5，(NH4)2SO4 0.1，柠檬酸4，微量元素溶液60mL，维生素B12的添加量为发酵培养基中维生素B12终浓度15mg/L，初始pH7.0；
所述微量元素溶液每升含有：0.68g ZnCl2，2.0g MnCl2·4H2O，60mg H3BO3，0.47g CoCl2·6H2O，5mg Na2MoO4·2H2O，17g CuCl2·2H2O，5.4g FeCl3·6H2O和质量浓度37％的HCl 10mL；
培养条件：从新鲜的LB培养基斜面上挑取一环菌株接入装液量为50mL的250mL摇瓶中，于旋转式摇床中37℃、140r/min培养20h得到种子液，按照5％接种量接入装液量为50mL发酵培养基的250mL摇瓶中，发酵30h。
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