CN101376628A - 一种新的酚酸类化合物、制备方法及其药物组合物和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种新的酚酸类化合物及其制备方法、用途和药物组合物。该化合物通过降解丹参多酚酸制备而成，该化合物在肝脏疾病、心脑血管疾病和痴呆疾病方面均有较好的效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种新的酚酸类化合物、制备方法及其含有该化合物的药物组合物和在制备治疗肝脏疾病、心脑血管疾病、痴呆疾病的药物中的应用。
背景技术
丹参(Radix Salviae Miltiorrhizae)为唇型科植物丹参(Radix Salviae MiltiorrhizaeBunge)的干燥根及根茎，丹参的化学成分主要分为以丹参酚酸B为主的酚酸类水溶性成分，以及以丹参酮IIA为主的酯溶性成分。李向军报道了丹参水溶性成分提取工艺研究【中国中医药信息杂志2005，12(12)49-50】，叶勇研究了不同大孔树脂分离丹参酚酸B【时珍国医国药2006，6(17)973-974】，中国专利CN1247855提供了一种采用热水提取，用大孔树脂分离精制丹参多酚酸盐的方法。
本发明人对丹参进行了深入的研究，经过了大量的实验研究，提供了一种新的化合物，同时提供了该新化合物的制备方法、含有该化合物的药物组合物以及该化合物和组合物在制备治疗肝脏疾病、心脑血管疾病、痴呆疾病的药物中的应用。
发明内容
本发明提供了式I所式化合物：
式I
其化学名称为：(2E)-2-{6-[(E)-2-羧基乙烯基]-2，3-二羟基苯基}-3-(3，4-二羟基苯基)丙烯酸，通用名为双咖酚酸。
本发明提供了该化合物的制备方法。
本发明提供了含有该化合物的药物组合物。
本发明提供了该化合物和药物组合物在制备治疗或预防肝脏疾病、心脑血管疾病、痴呆疾病的药物中的应用。
本发明提供的化合物的制备方法为：(1)制备丹参多酚酸；(2)碱性条件下降解丹参多酚酸：取丹参多酚酸，加入碱和极性溶剂，回流降解；(3)纯化：取降解液，减压回收乙醇，过滤，用大孔吸附树脂，收集洗脱液，浓缩近干，有黄色沉淀析出，过滤，干燥滤饼，即得。其中丹参多酚酸可以采用文献报道的方法制备；碱选自常用的金属氢氧化物或碱式盐，可以是氢氧化钠、氢氧化钾或碳酸钠，优选为氢氧化钠；极性溶剂可以是水、甲醇溶液、乙醇溶液或丙酮溶液，优选为50％乙醇溶液。
本发明所述化合物的制备方法为：(1)取丹参生药粉碎，30倍量水渗漉提取，过滤，用大孔吸附树脂进行吸附(提取液与树脂的体积比3：1)，用纯化水洗脱3—5柱体积，再用30％的乙醇溶液洗脱5个柱体积，收集洗脱液，调节pH值为2-5，浓缩乙醇，冻干，得丹参多酚酸；(2)取丹参多酚酸，按重量比2：1加入氢氧化钠，加入50倍量50％乙醇溶液，回流降解；(3)取降解液，减压回收乙醇，过滤，滤液上AB-8大孔树脂层析柱，水洗5体积，15％乙醇洗脱4体积，收集该部分洗脱液，浓缩近干，放冷，有黄色沉淀析出，干燥即得。
本发明提供的药物组合物，均采用药学常规方法制备而成；可以通过注射、口服、鼻吸入、直肠或肠胃外给药等途径给药，可以以注射剂、片剂、丸剂、颗粒剂、胶囊、糖浆等形式存在，优选为冻干粉针和胶囊。
本发明提供了化合物和药物组合物在制备治疗或预防急慢性肝损伤及肝纤维化、缺血性脑中风、脑缺血/再灌注损伤、冠心病、心绞痛、老年性痴呆、血管性痴呆的药物中的应用。
本发明提供的化合物和药物组合物在用于上述疾病时，其注射给药剂量范围是25mg～2000mg；优选25～1000mg，口服给药剂量范围是50mg～4000mg；优选50～2000mg。
附图说明
图1化合物IR图谱； 图2化合物NOESY图谱DMSO；
图3化合物HNMR图谱DMSO； 图4化合物CNMR图谱DMSO；
图5化合物cosy图谱DMSO； 图6化合物HSQC图谱DMSO；
图7化合物HMBC图谱DMSO；
具体实施方式
制备例1 双咖酚酸的制备
取丹参生药粉1kg，30倍量水渗漉提取，过滤，用大孔吸附树脂进行吸附(提取液与树脂的体积比3：1)，用纯化水洗脱5个柱体积，再用30％的乙醇溶液洗脱5个柱体积，收集洗脱液，调节pH值为2，浓缩，冻干，得丹参多酚酸；将丹参多酚酸，按重量比2：1加入氢氧化钠，加入50倍量50％乙醇溶液，回流降解；取降解液，减压回收乙醇，过滤，滤液上AB-8大孔树脂层析柱，水洗5个柱体积，15％乙醇洗脱4个柱体积，收集该部分洗脱液，浓缩近干，放冷，有黄色沉淀析出，干燥得30g该化合物。
结构鉴定：本品为淡黄色无规则结晶性粉末，C18H14O8，熔点为255-258℃，IR见图1，ESI图谱分子离子峰357(M-H)-，由化合物HNMR图谱、CNMR图谱、cosy图谱、HSQC图谱、物HMBC图谱归属见表1，NOESY谱中7位与7’位氢无相关峰，说明双键为反式。
表1 化合物碳氢谱峰归属
| 编号 | CNMR δ(ppm) | HNMR δ(ppm) | 类型 | J(Hz) |
| 1 | 126.12 | |||
| 2 | 122.92 | 6.45 | m | |
| 3 | 115.29 | |||
| 4 | 147.27* | |||
| 5 | 144.87 | 6.45 | m | |
| 6 | 117.36 | 6.56 | d | 8.7 |
| 7 | 141.08 | 7.68 | s | |
| 8 | 123.40 | |||
| 9 | 168.40 | |||
| 1’ | 124.18 | |||
| 2’ | 118.12 | 7.24 | d | 8.4 |
| 3’ | 115.02 | 6.85 | d | 8.4 |
| 4’ | 147.24* | |||
| 5’ | 142.94 | |||
| 6’ | 126.01 | |||
| 7’ | 142.38 | 7.32 | d | 15.8 |
| 8’ | 115.98 | 6.17 | d | 15.8 |
| 9’ | 167.84 |
制备例2 制备双咖酚酸冻干粉针
取双咖酚酸100g，用NaOH溶液调pH值至7，制成1000瓶，按冻干工艺冻干即得。
制备例3 制备双咖酚酸胶囊
取双咖酚酸100g，加辅料适量，制成1000粒，即得。
试验例1：双咖酚酸对四氯化碳引起小鼠急性肝损伤的影响
1.1材料
双咖酚酸：按制备例1制备
四氯化碳(分析纯，烟台三和化学试剂公司，批号：050122)；联苯双酯(滴丸，北京协和制药厂，规格：1.5mg，批号：050512)；ALT/GPT试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司，批号060281)；ASP/GOT试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司，批号060201)
全自动生化分析仪(意大利)
清洁级昆明种小鼠，体重18g～22g，雌雄各半，山东绿叶制药股份有限公司实验动物中心提供，合格证号：SYXK(鲁)20030020。
1.2方法
小鼠130只，随机分为13组，即正常对照组、模型组、联苯双酯灌胃10mg/kg组、双咖酚酸静脉注射2.5mg/kg组、双咖酚酸静脉注射5mg/kg组、双咖酚酸静脉注射25mg/kg组、双咖酚酸静脉注射100mg/kg组、双咖酚酸静脉注射200mg/kg组、双咖酚酸灌胃5mg/kg组、双咖酚酸灌胃10mg/kg组、双咖酚酸灌胃50mg/kg组、双咖酚酸灌胃200mg/kg组、双咖酚酸灌胃400mg/kg组，各静脉给药组连续给药3天，各灌胃给药组连续给药7天，末次给药前16小时除对照组外各组用0.2％的四氯化碳油溶液腹腔注射，注射体积：0.25ml/只，随即禁食16小时，末次给药1小时后眼眶采血，离心(4000rpm，10min)，收集血清，用药盒检测ALT/GPT、ASP/GOT活性。数据以数据用X±s表示，以组间t检验进行统计学处理。
1.3结果
结果如表2所示，双咖酚酸静脉注射5mg/kg组、双咖酚酸静脉注射25mg/kg组、双咖酚酸静脉注射100mg/kg组、双咖酚酸静脉注射200mg/kg组、双咖酚酸灌胃10mg/kg组、双咖酚酸灌胃50mg/kg组、双咖酚酸灌胃200mg/kg组、双咖酚酸灌胃400mg/kg组明显降低GPT、GOT水平(与模型对照组比较，p<0.05或0.01)。双咖酚酸灌胃200mg/kg组降低GPT、GOT水平与双咖酚酸灌胃400mg/kg组比较，无显著性差异；双咖酚酸静脉注射100mg/kg组降低GPT、GOT水平与双咖酚酸静脉注射200mg/kg组比较，无显著性差异。
表2 双咖酚酸对CCL4肝损伤小鼠的GOT、GPT的影响
与模型组比较*P<0.05，**P<0.01，
试验例2 双咖酚酸对大鼠慢性肝损伤的影响
2.1药品与试剂
双咖酚酸：按制备例1制备
联苯双酯(滴丸，北京协和制药厂，规格：1.5mg，批号：050512)；ALT/GPT试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司，批号060281)；ASP/GOT试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司，批号060201)；乙醇(分析纯，烟台三和化学试剂公司，批号：050325)。
实验动物 普通级Wistar大鼠，雄性，体重150-200g，SD大鼠，山东绿叶天然药物研究开发公司实验动物中心提供，合格号：SYXK(鲁)20030020。
2.2实验方法：
大鼠130只，随机分为13组，即正常对照组、模型组、联苯双酯组灌胃10mg/kg组、双咖酚酸静脉注射2.5mg/kg组、双咖酚酸静脉注射5mg/kg组、双咖酚酸静脉注射25mg/kg组、双咖酚酸静脉注射50mg/kg组、双咖酚酸静脉注射100mg/kg组、双咖酚酸灌胃5mg/kg组、双咖酚酸灌胃10mg/kg组、双咖酚酸灌胃50mg/kg组、双咖酚酸灌胃100mg/kg组、双咖酚酸灌胃200mg/kg组，每组10只。除正常组外，各组首次给予sc四氯化碳原液5ml/kg体重，以后每周2次sc 25％四氯化碳溶液(橄榄油释释)2ml/kg体重，连续20周。除正常对照组外，其余按上述方法制备慢性肝损伤模型，于实验第8周时，开始给药，连续给药12周，给药结束后用20％乌拉坦溶液腹腔注射麻醉，解剖，腹主动脉采血，留取肝组织，部分用10％中性福尔马林溶液固定，24—48h内制石蜡块。肝组织病理学检查采用HE染色，对慢性肝损伤大鼠病理组织学改变进行评分，肝细胞浆疏松化分为0-3级，肝细胞脂肪变分为0-3级，肝细胞坏死分为0-3级，肝间质纤维增生分为0-3级，对大鼠病理组织学改变分数进行秩和检验。血样离心(4000rpm，10min)，收集血清，用药盒检测ALT/GPT、ASP/GOT活性。数据以数据用X±s表示，以组间t检验进行统计学处理。
2.3实验结果
如表3所示，双咖酚酸静脉注射5mg/kg组、双咖酚酸静脉注射25mg/kg组、双咖酚酸静脉注射50mg/kg组、双咖酚酸静脉注射100mg/kg组、双咖酚酸灌胃10mg/kg组、双咖酚酸灌胃50mg/kg组、双咖酚酸灌胃100mg/kg组、双咖酚酸灌胃200mg/kg组明显降低GOT、GPT水平及肝指数(与模型对照组比较，p<0.05或0.01)。双咖酚酸灌胃100mg/kg组降低GOT、GPT水平及肝指数与双咖酚酸灌胃200mg/kg组比较，无显著性差异；双咖酚酸静脉注射50mg/kg组降低GOT、GPT水平及肝指数与双咖酚酸静脉注射100mg/kg组比较，无显著性差异。
肝组织病理变化：结果显示，CCl4慢性肝损组大鼠，正常肝小叶结构破坏，有广泛的脂肪变性，肝细胞坏死及不同程度的间质纤维增生，而经双咖酚酸治疗的大鼠，损伤性病理变化明显减轻。
如表4所示，双咖酚酸静脉注射5mg/kg组、双咖酚酸静脉注射25mg/kg组、双咖酚酸静脉注射50mg/kg组、双咖酚酸静脉注射100mg/kg组、双咖酚酸灌胃10mg/kg组、双咖酚酸灌胃50mg/kg组、双咖酚酸灌胃100mg/kg组、双咖酚酸灌胃200mg/kg组明显降低肝细胞浆疏松化、肝细胞脂肪变、肝细胞坏死及肝间质纤维增生(与模型对照组比较，p<0.05或0.01)。双咖酚酸灌胃100mg/kg组降低肝细胞浆疏松化、肝细胞脂肪变、肝细胞坏死及肝间质纤维增生与双咖酚酸灌胃200mg/kg组比较，无显著性差异；双咖酚酸静脉注射50mg/kg组肝细胞浆疏松化、肝细胞脂肪变、肝细胞坏死及肝间质纤维增生与双咖酚酸静脉注射100mg/kg组比较，无显著性差异。
表3 双咖酚酸对慢性肝损伤的大鼠GOT、GPT水平及肝指数影响
与模型组比较*P<0.05，**P<0.01
表4 双咖酚酸对慢性肝损伤的大鼠病理组织学改变的影响
与模型组比较*P<0.05，**P<0.01
试验例3 双咖酚酸对肝纤维化的影响
3.1药品与试剂：
双咖酚酸：按制备例1制备；文迪雅(马来酸罗格列酮片，Glaxo SmithKline公司，批号051023)HA(透明质酸)、LN(层粘连蛋白)及PcIII(III型胶原)试剂盒购买于上海海研医学中心。
羟脯氨酸检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
实验动物 普通级Wistar大鼠，雄性，体重150-200g，SD大鼠，山东绿叶天然药物研究开发公司实验动物中心提供，合格号：SYXK(鲁)20030020。
3.2实验方法：
大鼠130只，随机分为13组，即正常对照组、模型组、罗格列酮组灌胃8mg/kg组、双咖酚酸静脉注射2.5mg/kg组、双咖酚酸静脉注射5mg/kg组、双咖酚酸静脉注射25mg/kg组、双咖酚酸静脉注射50mg/kg组、双咖酚酸静脉注射100mg/kg组、双咖酚酸灌胃5mg/kg组、双咖酚酸灌胃10mg/kg组、双咖酚酸灌胃50mg/kg组、双咖酚酸灌胃100mg/kg组、双咖酚酸灌胃200mg/kg组，每组10只。大鼠肝纤维化模型复制及各组处置方法：参考吴孟超等复制大鼠肝纤维化模型的方法【吴孟超，杨广顺.大鼠肝硬变模型复制的研究.中华实验外科杂志，1984，1(4)：145—147】，除正常对照组外，各组每3d每100g体重皮下注射40％四氯化碳油溶液0.3ml，首剂量加倍，正常对照组大鼠每3d皮下注射油溶液0.3ml/100g体重，6周后，各组开始给药，连续给药6周，给药结束后用20％乌拉坦溶液腹腔注射麻醉，解剖，腹主动脉采血，留取肝组织，部分用10％中性福尔马林溶液固定，24—48h内制石蜡块。肝组织病理学检查采用HE染色，纤维增生程度分为0-4级【栗坤，赵玉珍，朱秋霜等.川芎嗪对老龄小鼠心、肝超氧化物歧化酶活力的影响.黑龙江医药科学，1998；21：4—5】，对血清中HA(透明质酸)、LN(层粘连蛋白)及PcIII(III型胶原)、及肝中HYP(羟脯氨酸)进行测定，HA、LN、PcIII、HYP按检测试剂盒测定方法测定。
3.3实验结果
病理学检查：正常对照组大鼠肝脏结构正常；模型组大鼠肝脏12周均出现明显的纤维化；双咖酚酸各组中纤维化程度均较模型组轻。
光镜观察：HE常规染色和VG胶原染色肝组织切片显示，肝纤维化模型对照组大鼠肝组织中可见肝细胞脂肪变性，坏死，炎细胞浸润；汇管区内胶原纤维沉积，Henny管增生；纤维结缔组织增生明显，纤维间隔增粗，并有典型假小叶形成。双咖酚酸治疗组大鼠肝组织纤维结缔组织增生程度减轻，纤维间隔变细，假小叶形成不明显。对各组纤维增生程度分值进行秩和检验。结果见表5，双咖酚酸静脉注射5mg/kg组、双咖酚酸静脉注射25mg/kg组、双咖酚酸静脉注射50mg/kg组、双咖酚酸静脉注射100mg/kg组、双咖酚酸灌胃10mg/kg组、双咖酚酸灌胃50mg/kg组、双咖酚酸灌胃100mg/kg组、双咖酚酸灌胃200mg/kg组明显降低纤维增生程度(与模型对照组比较，p<0.05或0.01)。
电镜观察：正常对照组大鼠肝细胞间紧密相连，细胞内各种细胞器分布规整，结构典型。血窦排列整齐，Disse腔内可见肝贮脂细胞，细胞质内有脂滴。模型对照组大鼠肝组织中则出现典型的肝细胞损伤结构，相邻肝细胞间隙增宽，肝细胞变性坏死，核固缩，细胞质内出现大小不等、分布不规则的脂滴。肝组织中存在轻重不等的纤维化病变。肝窦毛细血管化，Disse间隙内可见较多成纤维细胞(活化的肝贮脂细胞)，且周围有大量胶原纤维沉积。汇管区内可出现大量的胶原纤维。双咖酚酸治疗组中，肝细胞损伤有不同程度的减轻，肝细胞间隙较紧密，细胞质内脂肪小滴减少，细胞内结构趋向正常。肝纤维化病变不明显，肝血窦和Disse间隙内胶原纤维沉积及成纤维样细胞数量减少。
对各组HA、LN、PcIII、HYP进行T检验。结果见表6，双咖酚酸静脉注射5mg/kg组、双咖酚酸静脉注射25mg/kg组、双咖酚酸静脉注射50mg/kg组、双咖酚酸静脉注射100mg/kg组、双咖酚酸灌胃10mg/kg组、双咖酚酸灌胃50mg/kg组、双咖酚酸灌胃100mg/kg组、双咖酚酸灌胃200mg/kg组明显降低HA、LN、PcIII、HYP水平(与模型对照组比较，p<0.05或0.01)。双咖酚酸灌胃100mg/kg组降低HA、LN、PcIII、HYP水平与双咖酚酸灌胃200mg/kg组比较，无显著性差异；双咖酚酸静脉注射50mg/kg组降低HA、LN、PcIII、HYP水平与双咖酚酸静脉注射100mg/kg组比较，无显著性差异。
表5 双咖酚酸对大鼠肝纤维化病理形态的影响
与模型组比较，▲P<0.05；▲▲P<0.01。
表6 双咖酚酸对肝纤维化大鼠肝组织HYP含量及血清HA、LN及PCIII含量的影响
与模型组比较，▲P<0.05；▲▲P<0.01。
试验例4 双咖酚酸对大鼠心肌缺血损伤的影响
4.1材料：
双咖酚酸，按制备例1方法制备。
氯化硝基四氮唑蓝(N-BT)，由军事医学科学院药材供应站提供。
实验动物：普通级SD大鼠，雄性，体重280g—350g，雌雄各半，山东绿叶制药股份有限公司实验动物中心提供，合格证号：SYXK(鲁)20030020。
4.2方法与结果：
动物随机分为模型对照组(生理盐水)、硝苯地平组6mg/kg、双咖酚酸静脉注射2.5mg/kg组、双咖酚酸静脉注射组(7.5mg/kg)、双咖酚酸静脉注射20mg/kg组、双咖酚酸静脉注射50mg/kg组、双咖酚酸静脉注射100mg/kg组、双咖酚酸静脉注射200mg/kg组、双咖酚酸灌胃20mg/kg组、双咖酚酸灌胃50mg/kg组、双咖酚酸灌胃200mg/kg组、双咖酚酸灌胃400mg/kg组。每组10只。禁食12小时后，ip.乌拉坦(1.2g/kg)麻醉，测肢体II导联心电图。剪去左胸前皮毛，碘酒及酒精消毒，沿胸骨左缘1cm处，剪开胸壁肌肉及二条肋骨，迅速打开胸腔，暴露心脏，在动脉圆锥与左心耳之间结扎左冠状动脉，立即将心脏放回，排挤出胸腔空气，用止血钳闭合胸腔，造成大鼠急性心肌缺血模型。硝苯地平组在麻醉前灌胃给药，灌胃给药组连续给药3天，于第2天给药后禁食16小时后，第3天给药30分钟后手术，其余各组术后随既静脉注射相应药物。记录给药前及给药后1.5h、3h心电图，测量心电图J点的升高值，6h后取出心脏，以冷生理盐水洗净后，-20℃冰箱冷冻过夜。次日，将冷冻的心脏由结扎处至心尖部等厚切成5片，浸入新鲜配制的0.25％N-BT磷酸缓冲液(pH7.4)中。37℃水浴振摇10～15min。用滤纸吸干切片表面的染色液，分离染色部分和未染色部分，称重，记算梗死面积。梗死面积(％)＝梗死部分重量/(非梗死部分重量+梗死部分重量)×100％。数据用X±s表示，以组间t检验进行统计学处理。
结果如表7所示，心肌缺血6小时后，模型组大鼠心肌出现明显的灶状缺血区，达到26％左右。双咖酚酸静脉注射7.5mg/kg组、双咖酚酸静脉注射20mg/kg组、双咖酚酸静脉注射50mg/kg组、双咖酚酸静脉注射100mg/kg组、双咖酚酸静脉注射200mg/kg组、双咖酚酸灌胃20mg/kg组、双咖酚酸灌胃50mg/kg组、双咖酚酸灌胃200mg/kg组、双咖酚酸灌胃400mg/kg组降低肢体导联心电图J点的升高、减少缺血面积(与模型组比较，p<0.01)；双咖酚酸静脉注射100mg/kg组与双咖酚酸静脉注射200mg/kg组比较，对肢体导联心电图J点的升高及缺血面积无明显差异(p>0.05)；双咖酚酸灌胃200mg/kg组与双咖酚酸灌胃400mg/kg组比较，对肢体导联心电图J点的升高及缺血面积无明显差异(p>0.05)。
表7 双咖酚酸对大鼠心肌缺血损伤的影响(n＝10)
与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。
试验例5 双咖酚酸提取物对大鼠局部脑缺血损伤的影响
5.1材料
双咖酚酸，按制备例1方法制备。
红四氮唑：美国Sigma公司产品，临用前用生理盐水配成4％溶液。
实验动物：普通级SD大鼠，雄性，体重280g—350g，雌雄各半，山东绿叶制药股份有限公司实验动物中心提供，合格证号：SYXK(鲁)20030020。
5.2方法与结果：随机分成正常组、模型对照组、双咖酚酸静脉注射2.5mg/kg组、双咖酚酸静脉注射组(7.5mg/kg)、双咖酚酸静脉注射20mg/kg组、双咖酚酸静脉注射50mg/kg组、双咖酚酸静脉注射100mg/kg组、双咖酚酸静脉注射200mg/kg组、双咖酚酸灌胃20mg/kg组、双咖酚酸灌胃50mg/kg组、双咖酚酸灌胃200mg/kg组、双咖酚酸灌胃400mg/kg组。每组10只。禁食12小时后，水合氯醛(350mg/kg，i.p.)麻醉，分离右侧颈总动脉，夹闭颈内、颈总动脉，颈外动脉近心端及远心端结扎，中间剪断。将颈外动脉游离端拉至与颈内动脉成一条直线，将栓线(选用直径0.24mm尼龙线，长度5.0cm)由颈外动脉插入至颅内，遇轻微阻力时停止，插入深度约为2cm。结扎颈外动脉开口，并打开颈总动脉动脉夹，消毒缝合伤口，造成右侧大脑中动脉缺血模型；假手术组仅进行右侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉的分离(以上实验均在23℃～25℃进行)。灌胃给药组连续给药3天，于第2天给药后禁食16小时后，第3天给药30分钟后手术，其余各组术后静脉注射相应药物。24小时后按文献【刘小光，徐理纳，一种能评价溶栓和抗溶栓的大鼠脑中动脉模型，药学学报，1995，30：662】所述方法及标准观察并记录大鼠的行为障碍：(A)提鼠尾观察前肢屈曲情况，如双前肢对称伸向地面，计为0分，如手术对侧前肢出现腕屈曲计为1分，肘屈曲计为2分，肩内旋计为3分，既有腕屈曲和/或肘屈曲，又有肩内旋者，计为4分。(B)将动物置于平地面上，分别推双肩向对侧移动，检查阻力。如双侧阻力对等且有力，计为0分，如向手术对侧推动时阻力下降者，根据下降程度不同分为轻、中、重三度，分别计为1，2和3分。(C)将动物双前肢置一金属网上，观察双前肢的肌张力。双前肢肌张力对等且有力者计为0分。同样根据手术对侧肌张力下降程度不同计为1，2和3分。(D)动物有不停地向一侧转圈者，计为1分。根据标准评分，满分为11分，分数越高，表示动物行为障碍越严重。
行为评分后处死大鼠，取脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干，冠状切成5片，脑片用红四氮唑(TTC)染色，正常组织经染色后呈红色，梗塞组织呈白色，染色后照相，用中国航空航天大学病理图像分析软件求梗塞面积比。数据用X±s表示，以组间t检验进行统计学处理。
结果如表8所示，缺血24小时后，模型组大鼠表现出明显的行为障碍，大鼠脑组织也出现明显的灶状缺血区，达到全脑24％左右。双咖酚酸静脉注射组(7.5mg/kg)、双咖酚酸静脉注射20mg/kg组、双咖酚酸静脉注射50mg/kg组、双咖酚酸静脉注射100mg/kg组、双咖酚酸静脉注射200mg/kg组、双咖酚酸灌胃20mg/kg组、双咖酚酸灌胃50mg/kg组、双咖酚酸灌胃200mg/kg组3、双咖酚酸灌胃400mg/kg组4显著改善大鼠行为障碍、减少缺血面积(与模型组比较，p<0.05或p<0.01)，双咖酚酸静脉注射100mg/kg组与双咖酚酸静脉注射200mg/kg组比较，对改善大鼠行为障碍、减少缺血面积无明显差异(p>0.05)；双咖酚酸灌胃200mg/kg组与双咖酚酸灌胃400mg/kg组比较，对改善大鼠行为障碍、减少缺血面积无明显差异(p>0.05)。
表8 双咖酚酸对大鼠脑缺血损伤的影响(n＝10)
与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
试验例6 双咖酚酸对侧脑室注射β淀粉肽所致痴呆大鼠记忆获得性障碍的影响
6.1材料：
双咖酚酸，按制备例1方法制备。
β淀粉样肽：25～35片段，Sigma公司。
哈伯因(石杉碱甲，Huperzine A)，河南竹林众生制药股份有限公司豫中制药厂产品，批号为0508036。
Y型水迷宫装置，中国医学科学院药物所产品。
动物：普通级Wistar大鼠，雌雄各半，体重250g—280g，山东省天然药物工程技术研究中心实验动物中心提供，合格证号：SYXK(鲁)20030020
6.2方法与结果
大鼠随机分为正常对照组，模型对照组，哈伯因0.01mg/kg组，双咖酚酸静脉注射2.5mg/kg组，双咖酚酸静脉注射15mg/kg组，双咖酚酸静脉注射50mg/kg组，双咖酚酸静脉注射100mg/kg组，双咖酚酸静脉注射200mg/kg组，双咖酚酸灌胃剂量5mg/kg组，双咖酚酸灌胃剂量20mg/kg组，双咖酚酸灌胃剂量50mg/kg组，双咖酚酸灌胃剂量200mg/kg组，双咖酚酸灌胃剂量400mg/kg组，每组10只。各组动物分别按文献【陈勤，夏宗勤，胡雅儿.知母皂苷元对拟痴呆大鼠β-淀粉样肽沉积及胆碱能系统功能的影响.中国药理学通报，2002，184)：390-3.】所述方法，行脑定位右侧单侧脑室注射β淀粉样肽4μg/只，正常对照组注射等量生理盐水。造模结束后，灌胃相应药物，每天1次，连续30天后按文献【徐淑云，卞如濂，陈修.药理实验方法学.北京：人民卫生出版社，1991，662】所述方法进行训练。训练前，先将大鼠放在梯子附近使其自行爬上2次，之后分3阶段进行训练。第1阶段：用挡板在A处拦住，使大鼠从A处开始训练；第2阶段：用挡板拦住B处，由此开始训练；第3阶段：由起点C处开始训练。每一阶段学习训练2次，休息5min后再进行下一阶段训练。全部训练完毕后使大鼠休息5min，再将其放于爬梯附近使其自行爬上2次，然后直接将其放于C处，记录大鼠游完全程到达爬梯的时间和进入盲端的次数错误次数，5min不能游出者按5min计，以此作为学习成绩。24h后重复测试，作为记忆成绩。
结果如表9显示，模型组大鼠的学习成绩、记忆成绩与假手术组相比，错误次数明显增多、游泳时间明显延长；双咖酚酸剂量组、哈博因组与模型组比，错误次数、游泳时间明显减少。
表9 双咖酚酸对血管性痴呆大鼠水迷宫试验的影响(x±s，n＝10)
**P<0.001vs假手术组；△P<0.05，△△P<0.01vs模型对照组
试验例7 双咖酚酸对血管性痴呆大鼠学习记忆的影响
7.1材料
双咖酚酸，按制备例1方法制备。
尼莫地平片：由正大青春宝药业有限公司生产，批号：000605，每片20mg。硝普钠：由北京双鹤现代医药技术有限责任公司生产，批号：005071。
大鼠跳台装置，北京医科大学仪器厂生产。
普通级Wistar大鼠：雌雄各半，体重250g～280g，山东省天然药物工程技术研究中心实验动物中心提供，合格证号：SYXK鲁20030020
7.2方法与结果
大鼠随机分为假手术组，模型组，尼莫地平组10mg/kg组，双咖酚酸静脉注射2.5mg/kg组，双咖酚酸静脉注射15mg/kg组，双咖酚酸静脉注射50mg/kg组，双咖酚酸静脉注射100mg/kg组，双咖酚酸静脉注射200mg/kg组，双咖酚酸灌胃5mg/kg组，双咖酚酸灌胃剂量20mg/kg组，双咖酚酸灌胃剂量50mg/kg组，双咖酚酸灌胃剂量200mg/kg组，双咖酚酸灌胃剂量400mg/kg组，每组10只。灌胃给药，每天1次，3天后按文献【周小青，刘旺华，李花，等.丹龙醒脑片对血管性痴呆大鼠学习记忆及脑组织兴奋性氨基酸影响的实验研究.湖南中医学院学报，2002，222：4-7】所述血管性痴呆大鼠模型建立方法(加以改良)，将水合氯醛麻醉的大鼠腹腔注射0.05％硝普钠(5ml/kg)，常规消毒，分离双侧颈总动脉，用无创动脉夹夹闭，30min后，再通30min，再夹闭30min，再通后，伤口严格消毒，缝合，回笼室温27±0.5℃饲养并灌胃相应药物，每天1次，连续30天。假手术组麻醉及手术过程同模型组，但不阻断双侧颈总动脉，不注射硝普钠。
30天后按文献【周小青，刘旺华，李花，等.丹龙醒脑片对血管性痴呆大鼠学习记忆及脑组织脂质过氧化和钙超载的影响.湖南中医学院学报，2002，223：1-5】所述方法进行学习训练。训练前先将动物放入箱中自由活动3min，熟悉环境，然后将动物置于圆台上，接通铜栅电源，记录动物3min内错误次数动物跳下圆台次数及受电击总时间，作为学习成绩。24h后直接将动物置于圆台上，记录其放入至第1次下台受到电击的时间潜伏期、3min内错误次数及受电击总时间，作为记忆成绩。
结果如表10显示，模型组大鼠的学习成绩、记忆成绩与假手术组相比，错误次数及受电击时间显著增多，潜伏期(记忆成绩)明显缩短。
表10 双咖酚酸对血管性痴呆大鼠跳台试验的影响(x±s，n＝10)
**P<0.01vs假手术组；△P<0.05，△△P<0.01vs模型对照组
Claims (10)
1.一种新化合物，结构式如下：
2.权利要求1所述的化合物的制备方法，A制备丹参多酚酸；B碱性条件下降解丹参多酚酸：取丹参多酚酸，加入碱和极性溶剂，回流降解；C纯化：取降解液，减压回收乙醇，过滤，用大孔吸附树脂，收集洗脱液，浓缩近干，有黄色沉淀析出，过滤，干燥滤饼，即得。
3.根据权利要求2所述的方法，其制备方法为：A取丹参生药粉碎，30倍量水渗漉提取，过滤，用大孔吸附树脂进行吸附，提取液与树脂的体积比3：1，用纯化水洗脱3—5个柱体积，再用30％的乙醇溶液洗脱5个柱体积，收集洗脱液，调节pH值为2-5，浓缩乙醇，冻干，得丹参多酚酸；B取丹参多酚酸，按重量比2：1加入氢氧化钠，加入50倍量50％乙醇溶液，回流降解；C取降解液，减压回收乙醇，过滤，滤液上AB-8大孔树脂层析柱，水洗5体积，15％乙醇洗脱4体积，收集该部分洗脱液，浓缩近干，放冷，有黄色沉淀析出，干燥即得。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其制备方法为：取丹参生药粉1kg，30倍量水渗漉提取，过滤，大孔吸附树脂吸附，提取液与树脂的体积比为3：1，用纯化水洗脱5个柱体积，再用30％的乙醇溶液洗脱5个柱体积，收集洗脱液，调节pH值为2，浓缩，冻干；将冻干得到的丹参多酚酸，按重量比2：1加入氢氧化钠，再加入50倍量50％乙醇溶液，回流降解；取降解液，减压回收乙醇，过滤，滤液上AB-8大孔树脂层析柱，水洗5个柱体积，15％乙醇洗脱4个柱体积，收集该部分洗脱液，浓缩近干，放冷，有黄色沉淀析出，干燥即得30g该化合物。
5.权利要求1所述化合物在制备治疗或预防肝脏疾病、心脑血管疾病及痴呆疾病的药物中的应用。
6.权利要求1所述化合物在制备治疗或预防急、慢性肝损伤或肝纤维化的药物中的应用。
7.权利要求1所述的化合物在制备治疗或预防缺血性脑中风、脑缺血/再灌注损伤、冠心病或心绞痛的药物中的应用。
8.权利要求1所述的化合物在制备治疗或预防老年性痴呆、血管性痴呆的药物中的应用。
9.以权利要求1化合物为活性成分的药物组合物。
10.权利要求9所述的药物组合物在制备治疗或预防肝脏疾病、心脑血管疾病及痴呆疾病的药物中的应用。
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