CN101367786A

CN101367786A - 染料木素一氧化氮供体型衍生物制备方法及其用途

Info

Publication number: CN101367786A
Application number: CNA2008101511672A
Authority: CN
Inventors: 王剑波; 王捷频; 王四旺; 孙纪元; 缪珊; 李阳; 毕玲玲; 杨倩
Original assignee: Fourth Military Medical University FMMU
Current assignee: Fourth Military Medical University FMMU
Priority date: 2008-09-28
Filing date: 2008-09-28
Publication date: 2009-02-18

Abstract

本发明提供了一种含有一氧化氮供体的染料木素衍生物，具体涉及染料木素(Genistein，Gen)与硝酸酯类NO(一氧化氮)供体通过酯键连接所得到的化合物。该化合物由染料木素(5，7，4’－三羟基异黄酮)与相应的硝酸酯类NO供体通过化学反应生成酯键相连的一氧化氮供体染料木素(NO－G)的前体衍生物。该结构在体内经过生物转化，酯键断裂，游离出原药Gen和NO供体部分，后者能够缓慢释放出NO，与Gen协同发挥作用，通过双重协同抗肿瘤的机制，展现了良好的抑制卵巢癌细胞凋亡或诱导卵巢癌细胞凋亡的作用。

Description

染料木素一氧化氮供体型衍生物制备方法及其用途

技术领域

本发明涉及新颖的染料木素一氧化氮供体衍生物、其制备工艺、作为具有抗肿瘤活性化合物，在体内经过生物转化，酯键断裂，游离出原药染料木素(Genistein，Gen)和NO供体部分，后者能够缓慢释放出NO，与Gen协同发挥作用，通过双重协同抗肿瘤的机制，展现了良好的抑制卵巢癌细胞增殖或诱导卵巢癌细胞凋亡的作用，具体是一种治疗妇科肿瘤的新化合物。

背景技术

卵巢肿瘤是女性生殖器常见的三大恶性肿瘤之一。其中，卵巢癌的死亡率居于妇科恶性肿瘤的首位，大多数患者就诊时已属中晚期，五年生存率仅为20％～30％，卵巢癌已经成为妇科肿瘤中最有待研究的肿瘤之一。卵巢癌的首选治疗方法是手术及化疗，手术是切除了肉眼可见的病灶而不能切除隐性转移灶，化疗药物则是消灭隐性灶的重要手段，尽管卵巢癌对一线化疗的疗效可达到60％～80％，但这种有效性维持的时间并不长，最终许多患者终将复发或死亡，据估计卵巢癌10年生存率约20％。加之卵巢肿瘤生物学行为呈多样性，目前对于其发生及浸润转移的机制尚未完全了解，给临床治疗带来困难。寻找疗效好，针对性强，副作用小的药物是当今面临的重要课题。因此，抗肿瘤药物作为卵巢癌治疗手段之一，越来越受到重视，通过抗肿瘤治疗可以调节机体机能，减轻化疗毒副反应，提高生存质量。

一氧化氮(NO)是一种具有广泛生物学活性的小分子化合物。NO是重要的神经传递信使分子；NO能诱导细胞凋亡，尤其是在肿瘤细胞凋亡中的作用日益引起人们的重视。研究发现在卵巢癌细胞中已发现有一氧化氮合酶的表达和NO的产生，NO在卵巢癌的发生和演进中发挥着一定的作用。它通过对①活性氧自身或不同活性氧分子的相互作用如NO与O₂ ^-结合可生成ONOO^-，后者可直接或通过分解成许多小分子毒性更强的物质如NO₂、OH等对靶细胞产生直接的损伤作用而诱导靶细胞凋亡；②与其他细胞因子如IFN、TNF、IL、脂多糖或细菌内毒素等相互作用，或刺激单核巨嗜细胞系统释放细胞因子而杀伤靶细胞，诱导靶细胞凋亡；③通过作用于凋亡促进基因(如c-myc、p53、bax)和凋亡抑制基因(bcl-2、bcl-xl等)，启动细胞凋亡。此外，在细胞毒性方面，NO可直接与含有铁的酶和蛋白质作用，从而抑制这些酶所调节的细胞活性，促进细胞凋亡和阻止DNA修复。在免疫系统方面，NO介导巨噬细胞对肿瘤细胞和细胞病原体等发挥细胞毒作用外，NO可作用于线粒体呼吸链，使线粒体呼吸受阻，ATP消耗增大和产生过少，促进肿瘤细胞死亡。然而，NO作为气体信号分子，在体内半衰期短，不稳定，可控性差等，所以越来越多的研究集中于利用特异性的载体与NO供体偶联，从而在一定的部位释放NO，达到杀死癌细胞的作用。到目前为止，NO的靶向性释放仍是研究的重点。

染料木素(Genistein，Gen)又名染料木黄酮、金雀异黄素，是一种天然的异黄酮类化合物，具有弱雌激素样活性，表现出良好的抗癌、预防中老年骨质疏松症、女性更年期综合症和心血管疾病等作用，并通过抑制酪氨酸蛋白激酶及DNA拓扑异构酶II活性，清除过多自由基和诱导癌细胞凋亡等机制发挥抗癌作用。体内外研究表明Gen对乳腺癌、前列腺癌和结肠癌细胞有明显抑制作用。已经证实，正常卵巢组织及卵巢良恶性肿瘤组织中，均有激素受体，约50％～60％非粘液性卵巢癌中有雌激素受体。因此，染料木素作为雌激素在卵巢癌中与受体结合而发挥抑制肿瘤的作用。目前认为染料木素抗癌的主要机制是抑制信号转导物质表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)，影响癌细胞内外信号转导，从而抑制肿瘤细胞的生长、增殖或诱导凋亡。。

鉴于Gen和缓慢释放的NO对于肿瘤凋亡的的双重效果，以及NO在介导雌激素对妇科肿瘤的作用中所扮演的重要角色，我们将染料木素与硝酸酯类NO供体通过酯键连接合成了全新的前体药物染料木素-7，4’-硝氧基丁酸酯。该衍生物在卵巢组织经过生物转化，酯键断裂，游离出原药Gen和NO供体部分，后者能够缓慢释放出NO，与Gen协同发挥作用。初步药效学显示能抑制癌细胞的增殖，促进癌细胞凋亡，展现了良好的诱导卵巢癌细胞凋亡的作用，从而为进一步开发抗卵巢癌创新药物奠定了基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有双重协同抗肿瘤机制的，染料木素-7，4’-硝氧基丁酸酯，即染料木素一氧化氮供体型衍生物。

本发明是与通式(I)一致的化合物

通式(I)化合物制备的药学上可以接受的盐，所说药学上可接受的盐是与盐酸、硫酸、氢溴酸、硝酸或磷酸，苯磺酸所形成的盐。药学上可接受的盐可以本领域常规的成盐方法制备。

本发明中可以用包含治疗有效量的通式(I)的抗癌活性成分化合物和药剂上可接受的载体制成组合物。组合物可以本领域常规的制剂手段制备。

本发明的目的是提供通式(I)化合物在治疗诱导肿瘤细胞凋亡中的应用。

本发明进一步的目的是提供通式(I)化合物在治疗卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、乳腺癌等疾病中的应用。

本发明的另一目的在于提供这种化合物的制备方法。

本发明提供如下技术方案：

化学合成的反应过程在氮气保护下进行，投料时无水溶剂用注射器移取。反应过程及产物均通过TLC监控，斑点在紫外灯下观察。所用容器均预先干燥，有机溶剂经过脱水处理。通过与4-溴丁酰氯反应，将烷基侧链引入Gen的7-位和4’-位。Gen7，4’-溴代丁酸盐在乙睛/四氢呋喃(THF)的混合溶液中与硝酸银回流反应生成最后的硝酸酯。

1.反应溶剂的处理：(1)THF溶液的干燥处理：向500mlTHF中加入2-3g氢化钙，加热回流24h以上，冷却后迅速倾出THF于另一干燥的圆底烧瓶中，加入1cm3左右大小的金属钠和适量二苯甲酮继续回流至溶液呈深蓝色。(2)三乙胺溶液的干燥处理：向250ml三乙胺中加入1.5g左右氢化钙，加热回流24h以上即可。

2.合成路线：(1)Gen 7，4’-溴代丁酸酯的合成：冰浴下向0.81g Gen(3mmol)的THF溶液50mI中(溶液呈淡黄色)缓慢加入2.08ml三乙胺(15mmol)和0.91ml4-溴丁酰氯(7.5mmol)(反应液中迅速出现乳白色浑浊)，室温搅拌反应8h，TLC监控反应进度。反应结束后蒸干溶剂，用30ml乙酸乙酯溶解残渣，水洗3次((8ml/次)；饱和盐水洗两次((5ml/次)，无水硫酸钠干燥过夜，过滤。滤液浓缩至略微出现混浊，自然降至室温放置，有白色针状结晶析出。分离结晶和溶液，溶液在4℃冰箱放置继续析晶合并收集到的结晶。(2)Gen 7，4’-硝氧基丁酸酯的合成：取0.85g Gen 7，4’-溴代丁酸酯(1.5mmol)，加32ml乙睛和8mlTHF使溶解，迅速加入0.51g硝酸银((3mmol)，避光回流反应10h。反应结束后反应液为浅棕色，有灰色溴化银沉淀，过滤除去沉淀物。减压蒸干滤液，同上处理。滤液蒸干，残渣加5ml无水乙醇搅拌回流2遍，自然降温至室温，过滤，得浅灰色粉末。

3.结果：按照上述路线进行合成，中间产物Gen 7，4’-溴代丁酸酯为白色针状结晶，熔点120.1-122.7℃，产率约为93.4％；目标化合物为浅灰色粉末，熔点125.5-127.5℃，产率约为87.6％。核磁数据(以氘代氯仿作溶剂)如下：δ 12.74(s，1H)，7.57(d，2H)，7.19-7.26(m，2H)，6.77-6.78(d，1H)，6.60-6.61(d，1H)，3.54-3.57(m，4H)，2.79-2.83(m，4H)，2.29-2.32(m，4H)，1.55(s，4H)；质谱测得相对分子量为532.04，且红外结果部分证明苯环上的酚羟基被取代(吸收峰基本消失)，有含碳基结构的吸收峰出现，与目标化合物一致。

具体实施方式

以下发明通过具体试验例进一步阐述本发明，不以任何形式构成对本发明的限制。

试验例染料木素一氧化氮供体衍生物(NO-Gen)在体外诱导卵巢癌细胞凋亡

试验材料：RPMI-1640和二甲亚砜购于美国Gibco公司。人HO-8910卵巢癌细胞(由中国科学院上海生化细胞研究所提供)；96孔平板(CONING)；

试剂：二甲基亚砜(DMSO)为Amresco公司产品，四甲基偶氮唑蓝((MTT)、台盼蓝为华美公司产品。

药物：Gen 7，4’-硝氧基丁酸酯(NO-Gen)，浅灰色粉末，使用时二甲亚砜溶解，二甲亚砜在溶液中浓度控制在1％以内。

实验方法：人HO-8910卵巢癌细胞(由中国科学院上海生化细胞研究所提供)，在RPMI-1640培养液中，加入10％小牛血清，于37℃、5％ CO₂培养箱中培养，2～3d传代一次，0.25％胰酶消化，实验时取对数生长期细，分为实验组(加药)和空白对照组(不加药)。

1.MTT法测定IC₅₀值：HO-8910细胞，调整终浓度至2×10⁵/ml，接种于96孔板。分别加入不同浓度NO-Gen，加入NO-Gen后，每孔的终浓度分别为：2、4、8、16、32、64、128mg/L。每个浓度设三个复孔，细胞培养72h，加入MTT，孵育4h，加纯二甲亚砜震荡，酶联免疫仪检测，综合计算法得出IC₅₀值，结果：MTT法检测NO-Gen对HO-8910细胞增殖的抑制率，相同处理条件，作用时间均为72h。不同浓度NO-Gen对细胞生长抑制率不同。NO-Gen对HO-8910细胞的IC₅₀值为28.63mg/L，确定以30mg/L剂量为NO-Gen最佳干预剂量。统计显示NO-Gen≥8mg/L时，对HO-8910细胞生长抑制率与空白对照组(加相应浓度二甲亚砜溶剂)比较具有统计学意义(t＝0.7305，P<0.05)。

2.瑞氏染色：对数生长期，终浓度为2.5×10⁵m的HO-8910细胞，30mg/LNO-Gen作用HO-8910细胞，同时设空白对照组，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，分别于12、24、36、48h收获细胞，取上述细胞液800r/min离心5min，PBS洗2遍，细胞涂片经瑞氏染色后封片，油镜下观察细胞形态学改变并各组每个时段随机三个视野计算凋亡率(AP％)，重复3次，结果：光学显微镜油镜下，实验组各时段均可观察到HO-8910细胞典型的凋亡形态学改变，凋亡细胞可见核固缩、碎裂、染色质变深，以及形成膜包裹的凋亡小体。空白对照组HO-8910细胞凋亡细胞很少见，视野中细胞形态无改变，细胞核呈深蓝色，色泽均一，两组结果比较具有统计学意义(t＝6.21P<0.01)。如下表所示。

表 NO-Gen实验组和对照组不同时段凋亡率的比较(x±s，t/h)

^**P<0.01

3.流式细胞仪检测细胞凋亡率对数生长期，终浓度为2.5×10⁵/ml的HO-8910细胞，30mg/L NO-Gen干预，于37℃、5％CO₂培养箱中培养至所需时间后收获。取上述各时段细胞液离心弃上清；加1％Triton X-100摇匀后静置10min，离心弃上清；加0.01％RNA酶消化10min后，离心弃上清；加0.005％PI染色15min。上机，每次计数10000个细胞，用Modfit LT软件进行分析，结果：浓度30mg/L NO-Gen作用HO-8910细胞，12、24、36、48h用流式细胞仪检测凋亡率分别为：10.36％、15.46％、21.87％、33.91％；对照组分别为：2.73％、3.42％、4.53％、4.97％。随着时间的延长，凋亡率逐渐增加。

结论：本实验应用MTT法、光学显微镜(瑞氏染色)法和流式细胞术检测细胞凋亡，对NO-Gen作用HO-8910细胞的过程，从不同水平和角度进行了较全面的检测和观察，结果证实诱导HO-8910细胞凋亡是其主要抗癌作用机制，为其应用于临床卵巢癌治疗特别是卵巢癌腹腔灌注化疗等提供实验依据。

Claims

1.通式(I)化合物及其药学上可接受的盐。

2.一种权利要求1的通式(I)化合物的制备方法，包括以植物提取物染料木素通式(II)为原料和4-溴丁酰氯反应合成的步骤。

3.如权利要求2的方法与4-溴丁酞氯反应，在冰浴和四氢呋喃、三乙胺存在条件下，绝水绝氧将烷基侧链引入Gen的7-位和4’-位，获得中间体化合物Gen 7，4’-溴代丁酸酯。

4.如权利要求3的方法，通过中间化合物Gen 7，4’-溴代丁酸酯，在避光条件下，以硝酸银为原料，于乙睛/四氢呋喃(THF)的混合溶液中，回流反应10小时而合成的。

5.如权利3要求的方法，是在室温下搅拌8小时充分反应，并有饱和食盐水洗涤条件下进行的。

6.一种可以具有雌激素样作用的一氧化氮前体药物，含有权利要求1的化合物和药学上可接受的载体。

7.权利要求1的化合物在制备治疗肿瘤尤其是妇科肿瘤(卵巢癌、宫颈癌)的药物中的应用。