CN101358170A - 通过基于磷酸抑制和超声处理样品的方式分离粘附于固体样品微生物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于分离存在于固体样品的微生物群落中微生物的方法。并且一旦分离出微生物，它们可以用于微生物学技术，或从它们中分离到的核酸DNA和RNA可用于进行分子生物学技术的处理。根据本发明，用于分离粘附于固体样品的微生物的方法包括以下的步骤：提供微生物粘附到其上的固体样品；向固体样品中加入含有浓度超过0.5M的磷酸溶液、乙醇和非离子表面活性剂的高摩尔浓度的基于磷酸的缓冲液；超声，回收含有分离自固体样品微生物的上清。

Description

通过基于磷酸抑制和超声处理样品的方式分离粘附于固体样品微生物的方法

技术领域

本发明公开了一种使用基于高摩尔浓度的缓冲液(0.5M以上)和超声技术来分离存在于固体样品中的生物群落的微生物的方法。

背景技术

固体样品中微生物的分析与多种生物技术的领域高度相关，如生物浸矿(Biomining)、生物修复(Bioremediation)领域，一般而言无论是评价野生的或引入的生物群落的特征，都涉及获取特定样品。这种固体样品可以是例如矿源、理解为精矿(ore concentrates)、新矿、黄铁矿、黄铜矿、蓝铜矿(coveline)、尾矿、浸出尾矿、脉石、和通常的金属的和非金属种；等等。

生物浸矿是具有巨大商业利益的技术领域。生物浸矿可以定义为使用微生物从矿石中重新获得金属。最传统的表述是生物浸出(bioleaching)，它是应用直接的或间接的微生物作用在酸性媒介中从复合的基质中溶解金属。但是生物浸矿不仅仅是这一个单独的步骤，它还是对所包含微生物的监控和干预，因为这些技术是复合的并持续发展。其也是涉及改进的工艺和新方法学的开发的实验室水平的研究。

为了有效的发展生物浸出，便于控制，甚至是干预实施上述操作的微生物群落。通过应用一些可能评价存在于矿藏中微生物的技术来实施上述控制。

通常，对微生物群落的分析可以使用多种微生物或分子生物学的技术来进行。这些技术经设计与不涉及非生物材料的基本上纯的微生物培养物一起使用。当这些技术应用到复合的环境样品时，获得的效果很差，因为存在的矿石物理干扰及其氧化-还原性质能够破坏该技术所需要的生物材料。

例如，广泛用于检测和鉴别微生物的一种技术是聚合酶链式反应技术，PCR。这项技术只需要有少量完整的核苷酸分子的存在就可以启动反应。尽管需要的量少，但是对提取自固体样本中的样品进行成功的PCR扩增也是非常困难的。这种情况的发生是因为当使用直接的裂解方法时，细胞与基质接触时破裂，所述基质为矿源时，对溶解到溶液中的核苷酸分子具有很强的破坏性。即使使用具有较少破坏性的矿物基质，例如土壤或沉积物，也很难获得适合在PCR技术中的作为模板的核苷酸(Miller et al，Appl.Environ.Microbiol.Vol65：4715-4724，1999；Zhou et al，Appl.Environ.Microbiol.Vol 62：316-322，1996).

第二种从矿源中获得核酸的分子生物学方法是分离存在于固体样本中的细胞接着破裂这些细胞来纯化核酸。尽管这种方法的优势明显，因为它将核酸从破坏性的环境中分离出来，但只有相对较少的出版物中使用该方法，并且，其不能保证彻底的获得最初存在于样本中的细胞。

在本领域内一直期望能够找到一种将存在于固体样本中的微生物提取出来的方法，无论是将其用于需要分离的微生物存活的微生物学技术中，还是用于纯化那些分离自矿藏中的微生物核酸的分子生物技术中。

本发明解决了这个技术问题，发明了一种方法，其使用高浓度的盐和金属从矿藏中分离其上附着的微生物群落，其使用高摩尔浓度的磷酸缓冲液和超声技术，获得全部和存活的(viable)微生物。所述微生物可用于传统的微生物学或分子生物学技术中。

当超声技术应用于浸埋在缓冲液中的固体样本时，已经发现在某些控制条件下，上清中含有全部的活的微生物，因此可以直接用于微生物学技术，或更优选用于分子生物学技术，因为核酸可以容易的从这些全微生物中提取出来。

我们发现现有技术中没有任何研究能够通过超声技术成功的分离存在于固体样本中的微生物，并且特别当这些固体是含有对微生物和分离的DNA均具有破坏性的试剂的矿源时。有一些研究关于这项技术用于分离存在于土壤或沉积物中微生物，即便是在比矿源施工更“温和”的条件下，没有获得非常好的结果。例如，Picard等(Appl.Environ.Microbiol.Vol 58：2717-2722，1992)描述了超声技术作为最有效的方法分离与土壤粘附的细胞，但是其缺点在于采用该超声技术处理分离自土壤的细胞后导致产生DNA小片段。我们相信这些片段化的DNA是在没有合适缓冲液的情况下极端超声条件的结果，在这种条件下细胞不仅被释放出来，而且被破坏。使用本发明的方法就不会发生这种情况，分离自固体样品的细胞将保持完整和存活，并且，如果要纯化核酸，可以在与从常规实验室培养物获得的相同条件下获得。

另一个出版物中在土壤中使用超声技术的方法是Buesing和Gessner(Aquat.Microb.Ecol.Vol 27：29-36，2002)描述的。四个步骤使用了不同的仪器用于释放与环境沉积物颗粒相结合的细菌，该文章对这两个步骤进行比较。评价的仪器是具有强度80W的棒状超声器；具有强度95W的溶液型超声器；Ultra-Turrax

组织均浆器和Stomacher 80实验室用的混合器。在每种情况下对样品处理0.5到20分钟。已经发现最有效的从沉积物中释放细菌的方法是使用Stomacher 80

，而且使用其他仪器的提取条件非常苛刻，这将导致明显的细胞破坏。Buesing的结果对超声方法来说并不是有利的。而且，因为以低浓度的盐和金属处理环境样品，而且由于其设计Stomacher 80

研磨系统主要适合于小颗粒样品或糊，该系统对矿源样品的有效性是有争议的。矿源样品中通常含有大尺寸颗粒(直径2-5cm)并富含盐和矿物。同时使用本专利中的高摩尔浓度的磷酸缓冲液和超声技术，当对具有不同颗粒尺寸和浓度的盐和矿物不同来源的矿源进行处理时被证明是有效和方便的，并且因为如此，表明是用于解决对来自矿源细胞的提取问题的有效可选择方法。

另一方面，Craig等(Journal of Applied Microbiology，Vol83：557-565，2002)评价了用于分离来自海岸沉积物的细菌的多种技术。人工搅拌；溶液超声，700W，35kHz 6到10分钟，然后棒超声，100W，20kHz 15秒到1分钟，进行比较。1克沉积物的样品与9ml的蛋白胨水(含有0.1％的蛋白胨)混合并进行不同的处理。结果显示溶液超声对从含有高浓度的沙石的沉积物提取细菌更有效，但对含有污泥，粘土和有机碳的沉积物中提取细菌的效率较低。在这些沉积物的最后类型中，最有效的方法是人工搅拌。本发明中开展的方法不同与Craig描述的任何一个方法，因为本发明的方法使用了高摩尔浓度的磷酸缓冲液，其可以保证大多数细胞被提取出来，当然比人工搅拌更有效。

正如你所看到的，迄今为止还没有介绍过合适的从含有高浓度的盐和金属的固体样品中分离微生物的方法。本发明将要解决这一技术问题，证明使用超声技术可以将存在与固体样品中的微生物分离出来。

发明简述

本发明公开了一种用于分离存在于固体样品中的微生物群落的微生物的方法，并且，一旦分离出这些微生物，在微生物学技术中使用它们，或从它们中提取核酸DNA和RNA用于分子生物学技术。

这种固体样品可以是例如矿源其含有例如，精矿、新矿、黄铁矿、黄铜矿、蓝铜矿、尾矿、浸出尾矿、脉石、和各种矿中的金属性和非金属性种类；等等。该方法可以应用于任何固体样品颗粒尺寸，在矿石样品的情况下，无论是从矿藏、碎石、渣滓(ground)或粉末中获得。它可以同样的应用到未经生物学处理的固体样品上或经过培养的样品中，以增加其生物数量。

该方法主要包括对浸埋在高摩尔浓度的基于磷酸盐缓冲液中的固体样品进行超声处理，目的是获得含有全部微生物的上清，其可以用于微生物学或分子生物学技术。

本发明的超声缓冲液包括磷酸缓冲液、乙醇和聚山梨酯20或80表面活性剂(吐温20

或吐温80)。该缓冲液还含有非基本成分，例如抗氧化剂、渗透压调节剂、螯合剂、岩酶(lithic enzyme)、溶剂和盐。

固体样品和超声缓冲液的混合物，超声处理15到300秒，尤其是超声水浴中，特别是60到150秒，优选90秒。功率为20到200瓦，特别是80到150瓦，更特别是100瓦，而且频率在10到100KHz的范围内，特别是25到75KHz，更特别的是42KHz。

一旦进行了超声处理，通过传统的细胞分离方法可以从固体样品中分离出感兴趣的生物材料。在其中获得的细胞是存活的，因此它们可以应用在任何的微生物学或分子生物学方法中。

附图简述

图1显示了使用超声处理后0、1、7和11天时的样品和对照中的存在于培养物中的细胞的数量(在显微镜下进行细胞计数)。在没有进行接种的培养基上没有观察到细胞的生长，而在使用本发明的方法用“经接种的矿石1”和“经接种的矿石2”处理过的样品中观察到明显的细胞生长，在“Wenelen培养物”和“经超声的Wenelen”阳性对照中观察到相似的情况。

结论：使用本发明的方法从固体样品中提取到细胞是存活的。

图2显示了应用本发明的方法的样品和阳性对照的核酸的比较凝胶，其中所述样品“经接种的矿石1”＝1“经接种的矿石2”＝2，并且阳性对照“Weneleh培养物”＝2和“经超声的Wenelen＝5”。4种样品具有相同的条带，最上面的一条对应于基因组DNA而下面的两条对应于核糖体RNA。

结论：通过本发明的方法从固体样品种中提取出的细胞具有新陈代谢的活性，通过相应于核糖体RNA(23S和16Sr RNA)条带的存在证明其具有上述活性。

图3显示了用溴化乙啶染色的0.9％琼脂糖凝胶，显示在沙道1和2中，其中的条带对应于使用本发明的方法从固体样品中提取出的总DNA，该方法使用了扩展的超声缓冲液，除了含有基本成分(高摩尔浓度的磷酸缓冲液、乙醇和非离子表面活性剂)外还含有其它非基本成分例如岩酶、醋酸钠、DMSO、EDTA和甘油。提取自固体样品的总DNA的相同条带显示在沙道3和4中，这次使用的是本发明的方法，但是使用的磷酸缓冲液仅含有3种基本成分。

结论：当使用根据本发明所述的扩展的磷酸缓冲液和简单的磷酸缓冲液时，DNA提取的总量没有明显的差别。

发明详述

超声技术是将超声波用于不同目的的应用。它通常用于搅拌容器中的颗粒，其使得溶液中的特定物质分解加速，尤其是在物理搅拌行不通时其非常有用，如在用于核磁共振(NMR)的试管的情形下。它也用于为化学反应提供能量。

超声的传统生物学应用破坏了多种生物材料例如细胞和囊泡，并且使酶失活。其也用于松弛生物学材料，例如粘附到容器壁上的微生物或组织。

有两种典型的方法进行超声，使用超声水浴其中通过水将声波能量从转化器传到样品，或使用超声棒其中浸入到样品中的金属棒产生声波能量。任何这些技术可以应用到本发明中。当使用超声棒时，声能的功率和频率必须降低，相反应用超声溶液时，样品必须有冰浴的保护以消除产生的热量，从而避免由于高温对微生物产生的损伤。在水浴超声下，声波的能量通过水来调控，因此，可以使用较高的功率和频率而不会给存在的微生物带来损伤。

本发明的方法用于分离粘附到含有高浓度的盐和金属的固体样品上的微生物群落，获得全部的、存活的微生物，这样就可用于常规微生物学和分子生物学技术了。

能够应用本发明的方法的含有高浓度的盐和金属的固体样品，可以是与铜矿藏有关的矿源或与已发现其他商业感兴趣的金属的矿藏有关，例如黄铁矿、黄铜矿、蓝铜矿、尾矿、浸出尾矿、脉石、和非金属性种类。

该方法可以应用到任何大小的固体样品颗粒，在矿源的情况下，只要从矿中获得，那怕是矿、碎石、渣滓或粉末。可以同时应用到生物学未处理过的固体样品或经过培养的样品，以增加其中的生物量。

在第一阶段中，获取其中存在待分离微生物的固体样品。合适的样品量是1到50g，特别是5到20g，优选10g。将获取的样品放置在合适的反应试管中，如50mL Falcon试管。

向固体样品中加入本发明所述一定体积的超声缓冲液(与固体样品的体积相等)。超声缓冲液包含：

·基于磷酸溶液的缓冲液

·乙醇

·非离子表面活性剂

磷酸缓冲液的pH值在4到9的范围内，虽然在任何的pH范围能够到达相同的效果，鉴于本发明的重点在于高的磷酸摩尔浓度而不是缓冲液的pH值。磷酸缓冲液的摩尔浓度可以超过0.5M，优选在0.8M到2M之间，最优选1M。

乙醇使用的是5％到20％重量/重量浓度的无水乙醇(下文所有的重量/重量百分比简单的表示为“％”)，优选的浓度是8％到12％之间，最优选10％。

其中的非离子表面活性剂优选聚山梨酯酯20或80表面活性剂(吐温20

或吐温80

)，加入的浓度范围是0.01到0.5％，优选0.02到0.1％，最优选0.05％。

方便时，本发明的超声缓冲液具有其它给缓冲液带来有利性质的非基本化合物。

缓冲液可以含有岩酶，其能够帮助分裂生物膜(biofilm)和分子粘附的细胞，使得它们容易释放到上清中。溶菌酶、肽酶，例如羧肽酶A、B、C、Y；氨基肽酶、胰岛素、胰凝乳蛋白酶、胃液素等，是岩酶的例子。岩酶的浓度为0.1到1mg/mL，优选的，浓度范围为0.3到0.8mg/mL，更优选0.5mg/mL。

其它非基本成分是盐，其能够增加缓冲液的摩尔浓度，例如醋酸钠、醋酸钾、柠檬酸钠或钾、琥珀酸钠或钾，作为例子。盐的摩尔浓度可以是20到200mM，优选的浓度是50到150mM，更优选为100mM。渗透压调节剂例如蔗糖、海藻糖、甘露醇、bethaine、甘氨酸等，也可以使用。

缓冲液还可以含有抗氧化剂例如DMSO(二甲基亚枫)，其浓度可以是1到10％，特别是5％；螯合剂例如EDTA(乙二胺四乙酸)，EGTA(乙二醇四乙酸)其摩尔浓度范围是10到100mM，优选50mM。方便时，缓冲液也可以含有甘油作为增稠剂，其浓度为1到10％，特别是5％。

缓冲液中含有还原剂的话更好，其可以选自β-巯基乙醇、DTT或谷胱甘肽。

在优选的例子中，超声缓冲液包括

·基于磷酸溶液的缓冲液

·乙醇

·聚山梨酯20或80表面活性剂(吐温20或吐温80

)

·岩酶

·醋酸钠

·DMSO

·EDTA

·甘油

固体样品和超声缓冲液的混合物超声处理15到300秒，优选在超声水浴中，特别是超声处理60到150秒，更特别的超声处理90秒。在50到200瓦，特别是80到150瓦的功率，更特别是100瓦的功率，并且频率从10到100KHz，特别是从25到75KHz，更特别是42KHz。在这个阶段粘附在固体样品上的微生物变得松动，悬浮在超声溶液中。

为了从固体样品中分离出含有微生物的上清，本领域内任何已知的用于分离细胞的方法都可以使用。

在一个优选的方面，超声的反应试管可以进行冷冻离心，以避免核酸降解，利于倾析。离心应当适度，以使固体样品沉淀而生物材料留在悬浮液中。离心可以在500到3,000g进行15到10分钟。特别的，离心在1,000g时进行2分钟。离心之后，获得了含有释放细胞的上清。

为了从悬浮液中将释放的细胞与其它成分分开，可以对获取的上清进行离心。离心应当在这样的条件下进行，以使细胞留在沉淀内而其他较小的成分例如多糖有机残留物、蛋白、脂类或简单的盐，留在上清中，其随后被丢弃。离心在机中进行将是方便的，可以避免生物材料的降解。在优选的情况下，可以在4℃冷冻离心4℃下在超过4,000g离心5分钟。

获得的沉淀可以像处理任何细胞块一样来处理，随后的处理依赖于使用的微生物学或分子生物学技术。例如，可以将获得的沉淀重新悬浮以用于培养物的接种体，或用于细胞计数，或可以使用本领域内的常规技术用于分离核酸，并将这些核酸应用到PCR技术、DNA或RNA排列、FISH、测序等。

可用于重新悬浮沉淀以提取核酸的缓冲液有STT tampon(TRIS 10mM pH8.0；EDTA 20mM；SDS 2％；吐温201％；TRITON X 1001％；Biotechniques 27，p1140-p1145；1999)补充了Proteinaze-K和3M pH 5.2的醋酸钠。

一种优选的获得核酸的方法是酚-氯仿-异戊醇提取，其对于本领域专家是熟知的。也可以通过核酸提取柱来提取。

实现本发明的实施例如下。

实施例1

两个4-g的矿石样品接种在40mL的Wenelen菌株的培养物中，BioSigma(DSM 16786)的特征，生长在9K Fe²⁺培养基(10％p/v溶液)并孵育24小时。然后去除多余的培养基，这样留下的矿石是湿的，并粘附有细胞。

每个矿石样品以这种方式处理，放入到50mL的Falcon试管中，加入与样品体积相同的超声缓冲液体积：

·基于磷酸溶液的缓冲液pH 5.0………………1M

·聚山梨酯20表面活性剂(吐温20)……………0.05％

·乙醇……………………………………………10％

·岩酶……………………………………………0.5mg/mL

·醋酸钠pH 5.2…………………………………100mM

·DMSO……………………………………………5％

·EDTA……………………………………………50mM

·甘油……………………………………………5％

矿石和缓冲液的混合物在超声波水浴中以100瓦的功率和42KHz固定的频率超声90秒。与矿石粘附的微生物在这一阶段被释放出来，并留在超声溶液的悬浮液中。

反应试管以1,000g在4℃冷冻离心机中离心2分钟。离心之后，获取含有微生物的上清；丢弃含有矿石的小块。

上清以9,000g在4℃冷冻离心机中离心5分钟，本次离心中，细胞保留在沉淀中，其他更小的样品成分例如膜或盐类留在上清中，随后被去除。

将提取细胞的沉淀重新悬浮在没有核酸酶的1mL水中，然后标记为“经接种的矿石1”和“经接种的矿石2”。从每个悬浮样品中取出0.5mL，并接种到5mL的9K Fe²⁺培养基。将另外的0.5mL直接用于提取核酸，使用Kiu Choong Syn等，1999描述的方法提取核酸。

为了评价通过本发明的方法获得的细胞的存活性，将培养基中的样品培育11天，在此期间监测存在于培养物中的细胞数目，如图1所示。

除了本发明方法的样品，培养三种对照：

-Wenelen培养物：从生长的Wenelen培养物中取出0.5mL并接种到5mL的9K Fe²⁺培养基上。另取出0.5mL用于提取核酸。

-经超声的Wenelen：从生长的Wenelen培养物中取出40mL，然后在与含有矿石的试管同样的条件下超声处理，换句话说，添加来自相同发明的超声缓冲液，在超声水浴中以100W的功率和42KHz固定的频率超声处理90秒。随后在4℃的冷冻离心机中以9,000g离心5分钟，获取的沉淀重新悬浮于1mL的无核酸酶水中。从该悬浮液中取出0.5mL接种到5mL的9K Fe²⁺培养基上，另取0.5mL用于进行核酸提取。

-无接种的培养基；将0.5mL的无核酸酶水加入到5mL的9K Fe²⁺培养基中。

将两个样品，“经接种的矿石1”和“经接种的矿石2”和三个对照，“Wenelen培养基”，“经超声的Wenelen”和“无接种的培养基”，放置在6孔的无菌板上，在无搅拌的情况下，30℃，培养11天。在第0、1、7和11天时从每个孔中取出20μl的样品，以通过在显微镜下观察计数细胞。

图1显示了在经处理后在所示天数时样品和对照的相对显微镜计数。在没有接种的培养基中没有观察到细胞的生长，而在本发明的方法处理过的样品“经接种的矿石1”和“经接种的矿石2”中有明显的细胞生长，在阳性对照“Wenelen培养基”和“经超声处理的Wenelen”中观察到了相似的结果。这证明了使用本发明的方法从固体样品中提取中的细胞是存活的。

正如指出的那样使用Kiu Choong Syn等，1999描述的方法提取核酸，使用来自“经接种的矿石1”、“经接种的矿石2”、“Wenelen培养基”和“经超声处理的Wenelen”的样品各5mL。图2中的凝胶显示了提取的核酸。可以观察到4个样品存在相同的条带，其中最上面的条带对应于基因组DNA，下面的两条条带对应于核糖体RNA。核糖体条带的存在是另一个使用本发明方法从固体样品中提取的细胞活的并具有新陈代谢的活性的另一个清楚的证据。

实施例2；

为了评价使用含有简单组分(与扩展的组分相对)的高摩尔浓度基于磷酸缓冲液(超声抑制)从固体样品中分离微生物方法的有效性，进行如下的步骤；

·将40g相同的均质矿物样品分成相等的4份，每份中加入10mL相等体积的高摩尔浓度的基于磷酸的抑制物。

·在情形A中(图3中的1和2的副本(replica))使用扩充的组合物的超声缓冲液组分：

·基于磷酸溶液的缓冲液pH 5.0…………………1M

·聚山梨酯20表面活性剂(吐温20)………………0.05％

·乙醇………………………………………………10％

·岩酶………………………………………………0.5mg/mL

·醋酸钠pH 5.2……………………………………100mM

·DMSO………………………………………………5％

·EDTA………………………………………………50mM

·甘油………………………………………………5％

·在情形B下(3和4的副本)使用简化的组合物的超声缓冲液：

·基于磷酸溶液的缓冲液pH 5.0…………………1M

·聚山梨酯20表面活性剂(吐温20)………………0.05％

·乙醇………………………………………………10％

·将A和B矿石与缓冲液的混合物在超声水浴中以100瓦的功率和固体的频率42KHz超声90秒。

·将四个超声试管在4℃的冷冻离心机中以1,000g离心2分钟。离心之后，回收含有微生物的上清；丢弃含有矿石的沉淀。

·将在4℃的冷冻离心机中以9,000g对上清离心5分钟。在这样离心条件下细胞留在沉淀内，样品中其它较小的成分，例如膜或盐，留在了上清中，将其去除。

·将提取的细胞沉淀重新悬浮在不含核酸酶的1mL水中。从该样品中取出0.5mL，根据Kiu Choong Syn等人，1999描述的方法进行核酸的提取。

图3显示了经过0.9％溴化乙啶染色的琼脂糖凝胶，表明使用扩展的或简单的超声缓冲液进行DNA提取没有明显的差别。而且，当使用NanoDrop ND 1000分光光度计定量提取自4个副本的DNA时，如表1所示，经过相同类型超声器处理的1和2之间的浓度差别比经过不同类型超声缓冲液处理的1和3之间的差别要大。情形A(1和2)中DNA的平均浓度，555.95ng/μl，非常接近于情形B(3和4)中DNA的平均浓度，522.98ng/μl。因此，可以得出两种组合物是等效的缓冲液，只有在对处理样品太复杂时才建议加入一些或全部可选的缓冲成分(EDTA或EGTA、甘油、岩酶、盐例如醋酸钠、醋酸钾、柠檬酸钠或钾、琥珀酸钾或钠、渗透压调节剂、DMSO和/或还原剂)。

表1

	样品类别	ng/μl
			1	超声缓冲液DNA扩充的1(Amplified 1)	43042
2	超声缓冲液DNA扩充的2	68148
			3	超声缓冲液DNA简化的1(Simplified 1)	45648
4	超声缓冲液DNA简化的1	58949

Claims (14)

1.一种用于分离粘附到固体样品上的微生物的方法，其特征在于包括下列的步骤：

a.提供微生物粘附到其上的固体样品；

b.向所述固体样品中加入含有浓度超过0.5M的磷酸溶液、乙醇、和非离子表面活性剂的高摩尔浓度的基于磷酸的缓冲液，

c.超声，

d.回收含有分离自固体样品微生物的上清。

2.根据权利要求1所述的分离粘附到固体样品上的微生物的方法，特征在于高摩尔浓度的基于磷酸的缓冲液的pH值在4到9之间。

3.根据权利要求1所述的分离粘附到固体样品上的微生物的方法，特征在于所述的乙醇为浓度是5到20％的无水乙醇。

4.根据权利要求1所述的分离粘附到固体样品上的微生物的方法，特征在于所述的非离子表面活性剂选自聚山梨酯20表面活性剂或聚山梨酯80表面活性剂，并且其使用的浓度范围是0.01到0.5％；优选0.02到0.1％；更特别是0.05％。

5.根据权利要求1所述的分离粘附到固体样品上的微生物的方法，特征在于所述高摩尔浓度的基于磷酸的缓冲液任选的包括其他成分，其选自EDTA或EGTA、甘油、岩酶、盐例如醋酸钠、醋酸钾、柠檬酸钠或钾、琥珀酸钠或钾、渗透压调节剂、DMSO和/或还原剂。

6.根据权利要求1所述的分离粘附到固体样品上的微生物的方法，特征在于可以使用超声水浴进行超声。

7.根据权利要求6所述的分离粘附到固体样品上的微生物的方法，特征在于进行超声处理的时间为15到300秒。

8.根据权利要求6所述的分离粘附到固体样品上的微生物的方法，特征在于进行超声处理的时间为60到150秒。

9.根据权利要求6所述的分离粘附到固体样品上的微生物的方法，特征在于进行超声处理的功率为20到200瓦。

10.根据权利要求6所述的分离粘附到固体样品上的微生物的方法，特征在于进行超声处理的频率为10到100KHz。

11.根据权利要求1所述的分离粘附到固体样品上的微生物的方法，特征在于通过离心分离含有分离自固体样品的微生物的上清。

12.根据权利要求1所述的分离粘附到固体样品上的微生物的方法，特征在于全部微生物通过超过4,000g离心任选地与上清中的其他组分分离，以使细胞留在沉淀中。

13.根据权利要求1所述的分离粘附到固体样品上的微生物的方法，特征在于分离自固体样品的微生物用于微生物学或分子生物学技术中。

14.根据权利要求1所述的分离粘附到固体样品上的微生物的方法，特征在于固体样品对应于矿源，例如精矿、新矿、黄铁矿、黄铜矿、蓝铜矿、尾矿、浸出尾矿、脉石、通常的金属和非金属种。

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