CN101357145B

CN101357145B - 苯丙素总苷的新应用

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Publication number: CN101357145B
Application number: CN2007100754780A
Authority: CN
Inventors: 贺震旦
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2007-07-31
Filing date: 2007-07-31
Publication date: 2011-01-19
Anticipated expiration: 2027-07-31
Also published as: CN101357145A

Abstract

本发明涉及苯丙素总苷的新应用，特别是苯丙素总苷在提高机体体液和细胞免疫功能上的生物学活性，以及苯丙素总苷在制备免疫功能的增强剂药物和/或功能性食品中的应用。

Description

苯丙素总苷的新应用

技术领域

本发明涉及苯丙素总苷，特别涉及其在药品和/或功能性食品中的新应用及其苯丙素总苷制剂。

背景技术

苯丙素总苷是一类以苯乙醇基为苷元，以α、β不饱和苯丙酸为取代基的植物苷类成分，是一类分布很广的天然植物成分。迄今对苯丙素苷进行了各种药理实验，发现其具有很高的药用价值：其生物学活性包括抑制血栓形成、抗动脉硬化、抑制血小板凝集、降低血压和血脂水平、抗氧化、降低血糖、抗炎作用以及拮抗支气管平滑肌的收缩等。

根据目前的资料显示，尚未检索到有关苯丙素总苷增强免疫功能活性的报道。

发明内容

本发明的一个目的在于提出苯丙素总苷的新应用，特别是苯丙素总苷在制备增强免疫功能药物和/或功能性食品中的应用。其中，功能性食品包括：保健品、营养辅助食品、营养剂、治疗用食品或健康食品。

本发明中苯丙素总苷可以从任意一种含有苯丙素苷成分的植物中提出而来，优选为以木樨科植物序梗女贞Ligus trum pedunculareRehd.、紫茎女贞L.purpurascens Y.C.Yang、日本毛女贞L.japonicum Thunbvar.pubescens Koidz.、粗壮女贞L.robustum(Roxb.)B1.中的一种或多种作为原料提取；苯丙素主要存在于女贞属植物的叶中，因此优选提取部为女贞属植物的叶，包括序梗女贞干叶、紫茎女贞干叶、日本毛女贞干叶、粗壮女贞干叶等。

苯丙素总苷是同一类苯丙素苷的混合物，取女贞原料，用大孔吸附树脂柱层析纯化时，20％EtOH可将黄酮，萜类苷等成分被洗脱，当黄酮，萜类苷等成分被除去后，用80％EtOH洗脱，可得苯丙素总苷，通过高效液相HPLC测定其苯丙素纯度达到90％以上。

本发明的另一目的在于提出一种苯丙素总苷制剂，其含有有效量的苯丙素总苷和一种或多种药学或食品学上允许的辅料。

本发明苯丙素总苷制剂，其优选为：含有1-99％的苯丙素总苷和99％-1％的辅料。

本发明苯丙素总苷制剂，其优选为：含有10-85％的苯丙素总苷和90％-15％的辅料。

本发明苯丙素总苷制剂，其优选为：含有12-80％的苯丙素总苷和82％-20％的辅料。

本发明苯丙素总苷制剂，其优选为：含有2-30％的苯丙素总苷和92％-70％的辅料

本发明苯丙素总苷制剂可以是胶囊剂、片剂、丸剂、颗粒剂、注射剂、口服液剂中的一种。

本发明以昆明小鼠免疫为模型，研究苯丙素总苷对绵羊红细胞免疫受试动物受体血清溶血素的影响；对绵羊红细胞免疫受试动物受体脾细胞抗体生成的影响；对受试动物巨噬细胞吞噬鸡红细胞的影响；对受试动物NK细胞活性的影响。

根据上述实验结果得出，苯丙素总苷对绵羊红细胞免疫受试动物受体血清溶血素检测结果呈阳性；对绵羊红细胞免疫受试动物受体脾细胞抗体生成试验结果呈阳性，表明受试样品具有增强体液免疫功能作用；受试动物巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验结果阳性，表明受试样品具有增强单核-巨噬细胞功能作用；受试动物NK细胞活性试验结果阳性，表明受试样品具有增强NK细胞活性作用。试验证明苯丙素具有增强免疫功能作用；可将其应用于提高人体免疫功能的药品和/或功能性食品中，起到增强免疫功能的效果。

相对于现有技术而言：本发明提出了苯丙素总苷的新应用，即，苯丙素总苷在提高机体体液和细胞免疫功能上的生物学活性，以及苯丙素总苷在制备免疫功能的药物和/或功能性食品中的应用；同时提出了一种苯丙素总苷制剂，其制剂是任何经胃肠道或非经胃肠道给药剂型，包括胶囊剂、片剂、丸剂、颗粒剂、注射剂、口服液剂等。

说明书附图

图1高效液相HPLC测定图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施方式来说明本发明。

实施例1紫茎女贞中苯丙素总苷的制备方法

取紫茎女贞干叶6000g，以乙醇提取3次，减压浓缩得乙醇提取物3000g，取乙醇提取物加入水混悬，用石油醚脱脂后，经大孔吸附树脂柱层析处理，收集80％EtOH洗脱部分，并浓缩，得紫茎女贞苯丙素总苷1380g。

参见图1，经HPLC分析得知紫茎女贞叶苯丙素总苷中含有阿克苷(acteoside)、紫茎女贞-A(ligupurpuroside A)、反式紫茎女贞-B(trans-ligupurpuroside B)、顺式紫茎女贞-B(cis-ligupurpuroside B)和桂叶苷B(osmanthuside B)。阿克苷、紫茎女贞-A、反式紫茎女贞-B、顺式紫茎女贞-B和桂叶苷B均属于苯丙素苷类成分。经HPLC定量分析得知，在紫茎女贞苯丙素总苷中阿克苷、紫茎女贞-A、反式紫茎女贞-B、顺式紫茎女贞-B和桂叶苷B的含量总和为93.25％。

实施例2序梗女贞中苯丙素总苷的制备方法

取序梗女贞干叶2000g，以乙醇提取3次，减压浓缩得乙醇提取物1200g，取乙醇提取物加入水混悬，用石油醚脱脂后，再经EtOAc萃取，然后经大孔吸附树脂柱层析处理，收集80％EtOH洗脱部分，并浓缩，得序梗女贞苯丙素总苷450g。

实施例3以昆明小鼠免疫为模型，研究苯丙素总苷对绵羊红细胞免疫受试动物受体血清溶血素的影响；对绵羊红细胞免疫受试动物受体脾细胞抗体生成的影响；对受试动物巨噬细胞吞噬鸡红细胞的影响；对受试动物NK细胞活性的影响。

1、实验条件：

1.1受试样品：样品为苯丙素总苷。

1.2剂量：设纯净水对照组和低、中、高三个剂量组，剂量如下：

低剂量组0.22克/k克BW，相当于推荐日服量的5倍

中剂量组0.44克/k克BW，相当于推荐日服量的10倍

高剂量组1.32克/k克BW，相当于推荐日服量的30倍

1.3样品处理：实验时称量样品2.64、0.88、0.44克，用纯净水配制成40ml的样液，分别供高、中、低三个剂量组动物灌胃使用。

1.4动物：SPF级昆明种雌性小白鼠，6-8周龄(体重：18克-22克)。

1.5给予受试物途径：每天按0.2ml/10克BW量灌胃动物给予受试物。

2、试验方法：

2.1小鼠血清容血素滴度测定(血凝法)：实验结束前的第4天免疫动物，每只腹腔注射2％的绵羊红细胞0.2ml，5天后摘除眼球采血，分离血清备用。凝集反应：用生理盐水将血清倍比稀释于微量反应板内，各50μl，加入0.5％的绵羊红细胞50ml，混匀，装入湿润饭盒内盖好，置于37℃温箱3小时后，观察抗凝集反应程度。

2.2小鼠脾细胞抗体生成实验：免疫动物，取脱纤维的羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心(2000r/min)，10min，压积SRBC用生理盐水配成2％(v/v)的细胞悬液，每只鼠腹腔注射0.2ml。

脾细胞悬液制备，将SRBC免疫4天的小鼠颈椎脱臼处死，取出脾脏，放在盛有hank’s液的小平皿内，轻轻磨碎脾脏，制成细胞悬液，经200目筛网过滤，离心(1000r/min)10min，用Hank’s液洗2遍，最后将细胞悬浮在5ml RPMI1640培养液中，计数细胞，并将细胞浓度调整为5×10⁶个/ml.

空斑的测定，将表层培养基加热溶解后，放45-50℃水浴保温，与等量pH7.2-7.4、2倍浓度的Hank’s液混合，分装小试管，每管0.5ml，再向管内加50μl10％SRBC(v/v，用SA缓冲液配制)，25μl脾细胞悬液，迅速混匀，倾倒于已刷琼脂糖薄层的波片上，做平行片，待琼脂凝固后，将波片水平扣放在片架上，放入二氧化碳培养箱中孵育1-1.5h，然后用SA缓冲液稀释的补体(1：8)加入到玻片凹槽内，继续温育1-1.5h后，计数溶血空斑数。

2.3小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验：小鼠巨噬细胞的激活，实验前4天给每只小鼠腹腔注射2％压积羊血细胞0.2ml。用颈椎脱臼处死小鼠，腹腔注射加小牛血清的Hank’s液4ml/只，轻轻按揉腹部20次，以充分洗出腹腔巨噬细胞，然后将腹壁剪开一个小口，用胶头吸管吸取腹腔洗液2ml于试管内。用1ml加样器吸取腹腔洗液0.5ml加入盛有0.5ml1％鸡血红细胞悬液的试管内，混匀。用注射器吸取0.5ml混合液，加入玻片的琼脂圈内。放置孵箱内37℃孵育15-20分钟。孵育结束后迅速用生理盐水将未贴壁细胞冲掉，于甲醇溶液中固定1分钟，克iemsa液染色15分钟。用蒸馏水冲洗干净，凉干，用40×显微镜计数吞噬率和吞噬指数。吞噬率为每100个巨噬细胞中，吞噬鸡红细胞的巨噬细胞所占的百分率：吞噬指数为平均每个巨噬细胞吞噬鸡红细胞的个数。

2.4NK细胞活性测定(LDH法)：脾细胞悬液的制备(效应细胞)，无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank’s液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，制成单细胞悬液。经200目筛网过滤，Hank’s液洗3次，每次离心(1000r/min)10min。然后将细胞悬浮于2ml的完全培养中，用台酚兰染色计数活细胞数(应在95％以上)，最后用RPMI1640完全培养液调整细胞为2×10⁷个/ml。

NK细胞活性检测，取浓度为4×10⁵个/ml的YAC-1靶细胞和效应细胞各100μl(效靶比50:1)，加入U型96孔培养板；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μl，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1％NP₄₀各100μl；上述各项均设三个复孔，于37℃、5％CO₂培养箱中培养4h，然后将96孔培养板以1500r/min离心5min，每孔吸取上清100μl置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100μl，反应3min，每孔加入1mol/L HCl30μl，在酶联仪492nm处测定光密度值。

3、实验结果：

3.1苯丙素总苷对受试动物血清溶血素抗体滴度水平的影响

组别	剂量g/kg BW	动物数(只)	抗体积数	P值(与对照组比)
					对照组	0.00	12	108.2±21.4
低剂量	0.22	12	154.3±36.8	<0.01
					中剂量	0.44	12	151.2±33.8	<0.01
高剂量	1.32	12	151.2±34.9	<0.01
					F值			5.610(P<0.01)

苯丙素总苷对受试动物血清溶血素抗体滴度水平的影响：各剂量组的抗体积数均高于对照组，差异均有显著性意义。表明苯丙素总苷对受试动物血清溶血素抗体滴度水平测定试验结果为阳性。

3.2苯丙素总苷对受试动物脾细胞抗体生成水平的影响

组别	剂量g/kg BW	动物数(只)	溶血空斑数个/106脾细胞	P值(与对照组比)
					对照组	0.00	10	194.2±25.4
低剂量	0.22	10	199.5±37.7	>0.05
					中剂量	0.44	10	232.0±44.3	<0.05
高剂量	1.32	10	235.1±28.7	<0.05
					F值			3.744(P<0.05)

苯丙素总苷对受试动物脾细胞抗体生成水平的影响：中、高剂量组的脾细胞抗体生成水平高于对照组，差异有显著性意义。表明苯丙素总苷对受试动物脾细胞抗体生成水平测定结果为阳性。

3.3苯丙素总苷对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬功能的影响

组别

剂量g/kgBW

吞噬百分率(％)

吞噬百分率转换值

P值(与对照组比)

吞噬指数

P值(与对照组比)

对照组

0.00

14.0±11.4

0.36±0.15

0.27±0.26

低剂量

0.22

21.7±12.4

0.47±0.16

>0.05

0.51±0.32

>0.05

中剂量

0.44

29.1±10.6

0.56±0.13

<0.01

0.69±0.26

<0.01

高剂量

1.32

25.5±13.6

0.52±0.16

<0.05

0.59±0.36

<0.05

F值

3.177(P<0.05)

3.520(P<0.05)

吞噬百分率转换值：X＝Sin^-1(P)^1/2

苯丙素总苷对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬功能的影响：中、高剂量组吞噬百分率转换值及吞噬指数指标与对照组比较，差异有显著性意义。表明苯丙素总苷对受试动物腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验结果为阳性。

3.4苯丙素总苷对小鼠NK细胞活性的影响

组别	剂量g/kg BW	NK细胞活性(％)	NK细胞活性转换值	P值(与对照组比)
					对照组	0.00	3.17±2.50	0.16±0.09
低剂量	0.22	4.08±2.21	0.19±0.06	>0.05
					中剂量	0.44	5.45±1.81	0.23±0.05	<0.01
高剂量	1.32	4.99±1.65	0.22±0.04	<0.05
					F值			3.045(P<0.05)

NK细胞活性转换值：X＝Sin^-1(P)^1/2

苯丙素总苷对受试动物NK细胞活性的影响：中、高剂量组的NK细胞活性均高于对照组，差异比较有显著性意义。表明苯丙素总苷对受试动物NK细胞活性试验结果为阳性。

实施例4胶囊剂的制备

称取苯丙素总苷14～67克，食用纤维素33～86克及适量胶囊剂辅料，以任意比例混合30分钟，直到混合均匀；填充胶囊，胶囊为0#胶囊，填充规格为0.44克/粒；将填充好的胶囊装入玻璃瓶中，每瓶60粒。

实施例5片剂的制备

称取9～59克苯丙素总苷、30～80克微晶纤维素、8～15克乳糖、1克硬脂酸镁及适量片剂辅料。将苯丙素总苷、食用纤维素、乳糖及适量片剂辅料以任意比例混合均匀，按公知的片剂制作技术和装备制成片剂。产品规格为：0.5克/片，每日服用三次，每次两片。

实施例6丸剂的制备

将苯丙素总苷与微晶纤维素分别过100目筛，并称取苯丙素14～67克、微晶纤维素33～86克及适量丸剂辅料，以任意比例混合均匀，往混合好的物料中添加一定比例的炼制蜂蜜，按公知的丸剂制作技术和装备制成丸剂。产品规格为0.25克/粒。

实施例7颗粒剂的制备

分别称取苯丙素总苷14～67克，微晶纤维素33～86克及适量颗粒剂辅料。部分苯丙素总苷用水溶液溶解，剩余的苯丙素总苷与微晶纤维素及适量颗粒剂辅料以任意比例混合均匀，使用喷雾干燥工艺进行制粒，喷雾干燥制粒工艺与上述所提到的苯丙素总苷的喷雾干燥工艺一致。

实施例8注射剂的制备

苯丙素总苷15～80克及适量注射剂辅料加注射用水制成1000ml，配制成每ml含15～80m克的溶液，过滤至澄明、罐封，高温瞬时灭菌即得。

注射剂的溶液配制，滤过、罐封都在10万级以上的车间完成。

实施例9口服液制剂的制备

称取苯丙素总苷5～15克、蜂蜜10克及适量口服液剂辅料，用纯化水配制成100ml的溶液，过滤、罐装，高温瞬时灭菌即得。

上述苯丙素总苷制剂中，苯丙素总苷为主要活性成分。

本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。因此，无论从哪一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制本发明，权利要求书指出了本发明的范围，而上述的说明并未指出本发明的范围，因此，在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。

Claims

1.苯丙素总苷在制备增强免疫功能的药物和/或功能性食品中的应用，其中所述苯丙素总苷采用下述方法制备：以木樨科植物紫茎女贞L.purpurascens Y.C.Yang的叶为原料，用大孔吸附树脂柱层析纯化，纯化时用20％EtOH洗脱，再用80％EtOH洗脱，即得苯丙素总苷，所述苯丙素的纯度为90％以上。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述功能性食品是保健品、营养辅助食品、营养剂、治疗用食品或健康食品。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物含有有效量的苯丙素总苷和一种或多种药学上允许的辅料，所述功能性食品含有有效量的苯丙素总苷和一种或多种食品学上允许的辅料。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物是任何经胃肠道或非经胃肠道给药剂型。