CN101355874B - 杀细胞的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种在靶细胞的细胞过程中产生改变的方法。所述方法包括使所述靶细胞接触固体缓冲剂，以改变所述细胞的至少一部分中的细胞内pH值，从而在多细胞生物的靶细胞的细胞过程中产生改变。该方法可用于杀死真核细胞或原核细胞。本发明还公开了药物组合物和装置。

Description

杀细胞的组合物和方法
技术领域
本发明涉及基于使用固体缓冲剂进行滴定来杀细胞的组合物和方法。
背景技术
已知多种形式的细胞物质对人有害并可能致死。例如，癌细胞在美国是心脏病之后的第二大死因(Boring等CA Cancel J.Clin.43：7(1993))。细胞微生物也是造成多种疾病的原因。在生物技术工业中，细胞杀伤和靶向细胞杀伤(例如癌症)被充分地研究。
癌症是一种可能无限生长的恶性肿瘤。它最初是在人体内发现的多种类型细胞的病理性复制(丧失了正常的调节控制)。该疾病的初始治疗常常是手术、放射治疗或这些治疗的联用，但常有局部复发和转移性疾病发生。对于一些癌症而言，可用化学治疗，但它们很少带来长期恢复。因此，它们常常不是治愈性的。通常，在已知对产生多药抗性的情况下，对于化疗来说肿瘤及其转移是难以治疗的。在很多情况下，肿瘤对于某些类型的化学治疗剂天生具有耐受性。此外，这些治疗威胁非肿瘤细胞，对于人体来说压力过大并产生很多副作用。因此，需要那些能够靶向肿瘤细胞的改进的药剂。
微生物能侵入宿主组织并增殖，从而引起严重的疾病症状。病原细菌已被确定为是多种致虚弱性疾病或致死性疾病(包括例如结核病、霍乱、百日咳、鼠疫等)的主要原因。为治疗这些严重感染，施用杀死感染物的抗生素。然而，病原性细菌常常对抗生素产生耐药性，因此需要改进的药剂以防止由于这些微生物导致的感染的传播。
就引入体内或提供进入体内之途径的产品来说，所关注的一个主要方面是细菌感染。避免植入医疗装置的这类感染可能尤其是有问题的，因为细菌可形成生物膜，这种生物膜保护微生物不被对象的免疫系统所清除。由于这些感染难以使用抗生素治疗，所以常常需要移除所述装置，这对患者而言是创伤性的并增加了医疗成本。因此，对这些医疗设备来说，技术上长期以来探寻使得这些医疗设备和装置抗菌并有希望地抗微生物的手段和方法。
在现有技术中，一般策略是使用杀菌剂对医疗设备或其表面进行包被。然而，由于大多数杀菌剂是部分水溶性的，或者对有效抗菌作用至少需要足够的溶解性，用杀菌剂简单包被已被证明是不可靠的。由于此原因，现有技术上已探寻将杀菌剂引入医疗设备内或至少提供在其上的稳定涂层。
作为替代，可将材料用抗微生物剂(比如抗生素、季铵化合物、银离子或碘)浸渍，所述抗微生物剂随时间逐步释放进入周围的溶液中并在那里杀死微生物。虽然这些策略在含有细菌的水溶液中已被证实，但不能预计它们在缺少液体介质的情况下也能有效对抗空气传播的细菌；这对于基于释放的材料来说尤其如此，当浸出的抗微生物剂耗尽时，所述基于释放的材料易于变得无效。
用于在医疗环境中阻碍生物膜形成的任何药剂对于使用者来说还必须是安全的。某些以足以干扰生物膜的量存在的杀生剂(biocide)也能损伤宿主组织。被引入局部组织区域的抗生素能诱导耐药性微生物的形成，所述耐药性微生物然后可形成生物膜群落，所述生物膜群落的浮游微生物也将对该特定抗生素耐药。任何抗生物膜剂或防垢剂(anti-foulagent)还必须不干扰医疗装置的有益健康的性质。选择具有以下特定类型之特性的某些材料：可操作性、柔软性、防水性、抗拉强度或耐压性，这些特性不能被用于抗微生物作用而加入的药剂所改变。
食物也是细菌感染的一个来源。为保持食物消费安全，抑制或防止营养变质或感官变化而引起食物风味变差甚至有毒，对食物的保存是至关重要的。可使用多种方法实现食品的保存。具有保存作用的食品的物理操作方法包括例如冷冻、冷藏、烹调、干馏、巴氏杀菌、干燥、真空包装和在无氧包装中密封。这些方法中的一些可以是食品加工操作的一部分。食品加工步骤优选是在获得微生物安全的食品和同时产生具有理想品质的食品之间的平衡。
随着用于构建医学设备以及包装和处理食品中使用聚合物材料的增加，使用抗微生物聚合物变得更加理想。虽然在现有技术中存在抗微生物聚合物，但仍然需要改进的抗微生物聚合物涂敷剂，所述涂敷剂可容易地和廉价地应用于衬底上，以提供具有优秀抗微生物性质的物品，并且当其与细胞物质长时间接触时以持久和非浸出方式保留其抗微生物性质。
美国专利申请No.20050271780教导了结合到离子交换物质(如季铵盐)上的用于食物保存的杀菌聚合物基质。这种聚合物基质通过在其中引入抗菌剂(例如季铵盐)而杀死细菌。所述药剂的正电荷仅在其自身与带负电荷细胞壁之间的静电吸引上有帮助。此外，上述申请未教导遍及其整体具有缓冲容量的固体缓冲剂的用途。
美国专利申请No.20050249695教导了将抗微生物分子(如季铵盐或鏻盐(阳离子的带正电荷实体))固定化而共价结合到固体表面上以使所述表面具有抗菌性。该文中所描述的聚合物通过其上所连接的氨基而连接到固体表面上，并且因此所述聚合物仅能在固体表面上形成单层。
美国专利申请No.20050003163教导了具有抗微生物和/或抗静电性质的基底。这些性质是通过应用由带阳离子电荷的聚合物组合物而形成的涂层或膜而赋予的。
在美国专利申请No.20050271780、20050249695和20050003163中所描述的聚合物的活性依赖于杀菌材料与细胞膜的直接接触。其毒性水平很大程度上取决于杀菌实体的表面浓度。由于暴露的阳离子物质在离子交换反应中可被非常迅速地饱和，因此这种要求带来了很大的限制。
此外，上述美国专利申请中没有教导杀死真核细胞。它们也没有教导聚合物作为抗真核细胞或原核细胞类型的细胞毒剂的体内用途。此外，上述美国专利申请中也没有教导选择性地杀死某些细胞类型的聚合物的构造。
因此，仍需要拥有能够具有抗真核细胞和原核细胞的细胞毒作用的药剂，并且这样的药剂也将是高度有利的。
发明内容
根据本发明的一个方面，提供了一种在多细胞生物体的靶细胞的细胞过程中产生改变的方法，所述方法包括使靶细胞接触固体缓冲剂，以便至少在所述细胞的一部分中改变细胞内pH值，从而产生多细胞生物体的靶细胞的细胞过程的改变。
根据本发明的另一个方面，提供了一种杀死多细胞生物体的靶细胞的方法，包括使所述靶细胞接触固体缓冲剂，以便至少在所述细胞的一部分中改变细胞内pH值，从而杀死该靶细胞。
根据本发明的另一个方面，提供了一种在靶细胞的细胞过程中产生改变的方法，所述方法包括使所述靶细胞接触固体缓冲剂(所述固体缓冲剂是阴离子型的)，以便至少在所述细胞的一部分中改变细胞内pH值，从而在靶细胞的细胞过程中产生改变。
根据本发明的另一个方面，提供了一种在靶细胞的细胞过程中产生改变的方法，所述方法包括使所述靶细胞接触固体缓冲剂(其中所述固体缓冲剂包括缓冲层和置于缓冲层外表面上的透水层)，以便至少在所述细胞的一部分中改变细胞内pH值，从而杀死细胞。
根据本发明的另一个方面，提供了一种杀死细胞的方法，包括使所述细胞接触固体缓冲剂(所述固体缓冲剂的缓冲容量(volumetric bufferingcapacity)大于50mM H+/l.pH且pH大于pH 8或小于pH 4.5)，从而杀死细胞。
根据本发明的另一个方面，提供了一种选择能够杀死细胞的固体缓冲剂的方法，所述方法包括选择具有缓冲容量大于50mM H+/l.pH且pH大于pH 8或小于pH 4.5的固体缓冲剂，所述固体缓冲剂能够杀死细胞。
根据本发明的另一个方面，提供了一种杀死目标细胞亚群的方法，所述方法包括使包含所述目标细胞亚群的样品接触固体缓冲剂(所述固体缓冲剂具有一定的缓冲容量和pH，选择其所述性质以适于特异性杀死所述目标细胞亚群)，从而杀死目标细胞亚群。
根据本发明的另一个方面，提供了一种制造品，其包含：
(i)支持物；和
(ii)附着到该支持物的至少一部分表面的固体缓冲剂层，所述固体缓冲剂包含缓冲层和置于该缓冲层外表面上的离子渗透层。
根据本发明的另一个方面，提供了一种制造品，其包含：
(i)支持物；和
(ii)附着到该支持物的至少一部分表面的固体缓冲剂层，所述固体缓冲剂是阴离子型的。
根据本发明的另一个方面，提供了固体缓冲剂在制备用于治疗与病理性细胞群体相关的医学病况的药物中的用途。
根据本发明的另一个方面，提供了一种药物组合物，其包含作为活性成分的固体缓冲剂和药用载体或稀释剂。
根据本发明的另一个方面，提供了一种选择用于杀死目标细胞的最佳固体缓冲剂的分析方法，所述方法包括：
(i)使多种细胞接触多种固体缓冲剂；
(ii)从能够杀死多种细胞的多种固体缓冲剂中鉴别固体缓冲剂，所述固体缓冲剂针对杀死目标细胞来说被优化。
根据本发明的另一个方面，提供了一种治疗与病理性细胞群体相关的医学病况的方法，所述方法包括将治疗有效量的固体缓冲剂施用于有此需要的对象，以便改变所述病理性细胞群体的至少一部分的细胞内pH值，从而治疗与该病理性细胞群体相关的所述医学病况。
根据以下描述的本发明优选实施方案的另一些特征，产生所述改变导致了细胞的死亡。
根据所描述的优选实施方案中的另一些特征，所述多细胞生物体是高等植物。
根据所描述的优选实施方案中的另一些特征，所述多细胞生物体是哺乳动物。
根据所描述的优选实施方案中的另一些特征，所述接触在体内进行。
根据所描述的优选实施方案中的另一些特征，所述接触是离体进行的。
根据所描述的优选实施方案中的另一些特征，所述接触在体外进行。
根据所描述的优选实施方案中的另一些特征，所述固体缓冲剂沿其至少一部分包含pH梯度。
根据所描述的优选实施方案中的另一些特征，所述固体缓冲剂被所述靶细胞内化。
根据所描述的优选实施方案中的另一些特征，所述固体缓冲剂附着至亲和部分。
根据所描述的优选实施方案中的另一些特征，所述亲和部分选自抗体、受体配体和碳水化合物。
根据所描述的优选实施方案中的另一些特征，所述固体缓冲剂至少部分被选择性屏障物所覆盖。
根据所描述的优选实施方案中的另一些特征，所述选择性障碍物为机械屏障物。
根据所描述的优选实施方案中的另一些特征，所述固体缓冲剂包含缓冲层和置于该缓冲层外表面的透水层。
根据所描述的优选实施方案中的另一些特征，所述透水层为开孔聚合物。
根据所描述的优选实施方案中的另一些特征，所述开孔聚合物选自PVOH、纤维素和聚氨酯。
根据所描述的优选实施方案中的另一些特征，所述固体缓冲剂被配制成颗粒。
根据所描述的优选实施方案中的另一些特征，所述固体缓冲剂被配制成喷雾剂。
根据所描述的优选实施方案中的另一些特征，所述固体缓冲剂被包封于所述颗粒中。
根据所描述的优选实施方案中的另一些特征，所述固体缓冲剂附着至所述颗粒表面。
根据所描述的优选实施方案中的另一些特征，所述颗粒选自聚合物颗粒、微囊脂质体、微球、微乳、纳米颗粒、纳米囊(nanocapsule)和纳米球。
根据所描述的优选实施方案中的另一些特征，所述固体缓冲剂是阴离子型的、离子交换物质，其掺入透水聚合物基质中。
根据所描述的优选实施方案中的另一些特征，所述固体缓冲剂是阳离子型的、离子交换物质，其掺入透水聚合物基质中。
根据所描述的优选实施方案中的另一些特征，所述固体缓冲剂包含掺入透水聚合物基质中的阳离子型离子交换物质和阴离子型离子交换物质。
根据所描述的优选实施方案中的另一些特征，所述阳离子型离子交换物质选自磺酸及其衍生物、膦酸(phosphonic acid)及其衍生物、羧酸及其衍生物、次膦酸(phosphinic acid)及其衍生物、酚及其衍生物、胂酸及其衍生物以及硒酸及其衍生物。
根据所描述的优选实施方案中的另一些特征，所述阴离子型离子交换物质选自季铵、叔胺、仲胺和伯胺。
根据所描述的优选实施方案中的另一些特征，所述固体缓冲剂是聚合物。
根据所描述的优选实施方案中的另一些特征，所述固体缓冲剂包含自身性离子传导基质。
根据所描述的优选实施方案中的另一些特征，所述固体缓冲剂是离子交联聚合物(ionomer)。
根据所描述的优选实施方案中的另一些特征，所述离子交联聚合物是磺化四氟乙烯共聚物(Nafion)及其衍生物。
根据所描述的优选实施方案中的另一些特征，所述固体缓冲剂具有大于约20mM H+/l.pH的体积缓冲容量。
根据所描述的优选实施方案中的另一些特征，所述固体缓冲剂包含大于pH 8的pH。
根据所描述的优选实施方案中的另一些特征，所述固体缓冲剂包含小于pH 4.5的pH。
根据所描述的优选实施方案中的另一些特征，所述细胞是患病的细胞。
根据所描述的优选实施方案中的另一些特征，所述固体缓冲剂附着至支持物表面的至少一部分上。
根据所描述的优选实施方案中的另一些特征，所述样品包含至少第二细胞亚群，其中所述目标细胞亚群和所述第二细胞亚群表现出不同的血浆缓冲容量。
根据所描述的优选实施方案中的另一些特征，所述治疗是离体进行的。
根据所描述的优选实施方案中的另一些特征，所述治疗是在体内进行的。
根据所描述的优选实施方案中的另一些特征，所述制造品形成包装材料、医疗装置、织物、支架、滤器或杀菌装置的至少一部分。
本发明通过提供通过使细胞接触固体缓冲剂而使细胞改变的新方法，成功地解决了目前已知构造的不足。
除非另有定义，本文中使用的全部技术和科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员所常规理解的相同含义。尽管在本发明的实践和试验中可以使用与本文所述相近或等效的方法和材料，但合适的方法和材料仍描述如下。本文中所提及的所有公开文献、专利申请、专利和其它参考文献均以其全部内容通过引用并入本文中。在存在冲突的情况下，将以本专利说明书(包括定义)为准。此外，所述材料、方法和实例仅是举例描述而并非意在构成限制。
附图说明
本文中仅以举例方式并参考附图对本发明进行了描述。现详细具体地参考附图，特别要指出，所示具体内容是用于举例，仅用于示例性讨论本发明的优选实施方案之目的，并且是为提供相信是本发明原理和概念方面最有用和易于理解的描述而提出的。在此方面，没有尝试以比用于根本性理解本发明所需更详细的方式显示本发明的结构细节，说明书连同附图使得在实践中可以如何实现本发明的几种形式对于本领域技术人员来说显而易见。
在附图中：
图1A-B示例性描述在含有具有pH梯度的聚丙烯酰胺凝胶的条带上的天然和脲变性形式的藻蓝蛋白的空间分布图。图1A的图表示天然(未变性的)藻蓝蛋白的扫描结果。图1B的图表示8M脲变性的藻蓝蛋白的扫描结果。纵轴代表以O.D.单位表示的吸光度，横轴代表以pH单位表示的凝胶条带的扫描位置。
图2A-B是描述在含有具有pH梯度的聚丙烯酰胺凝胶的条带上的天然和脲变性形式的肌球蛋白的空间分布图。图2A的图代表天然(未变性的)肌球蛋白的扫描结果。图2B的图代表8M脲变性的肌球蛋白的扫描结果。纵轴代表以O.D.单位表示的吸光度，横轴代表以pH单位表示的凝胶条带的扫描位置。
图3A-B是表示两个不同步骤的实验结果的照片，该实验结果证实了两种不同蛋白质肌球蛋白和藻蓝蛋白的pH依赖性分离和再分布。图3A是在将肌球蛋白和藻蓝蛋白的混合物置于中间隔室2中之后即刻的实验小室的俯视图。图3B是将肌球蛋白和藻蓝蛋白的混合物置于中间隔室2中之后七天的相同实验小室照片的俯视图。
图4A-C是举例说明在细胞附着于pH调节珠(pH modifying bead)后GFP在细胞中分布随时间变化的合成显微照片。图4A表示在零时刻(定义为细胞附着至所述珠的时刻)附着至珠(6)上的细胞(8)。图4B表示在最左边照片10分钟后拍摄的附着至珠(6)上的细胞(8)。图4C表示在最左边照片30分钟后拍摄的附着至珠(6)上的细胞(8)。以粗白箭头标记的荧光点代表迁移并在珠6和细胞8之间接触点处积累的GFP荧光。
图5是举例说明在含有具有pH梯度的聚丙烯酰胺基凝胶的immobiline条带上黄色荧光蛋白(Yellow fluorescent protein，YFP)的空间分布的图。纵轴代表光密度，横轴代表以pH单位表示的沿着IPG条带的位置。
图6A-B是举例说明Nafion膜对Jurkat细胞的细胞毒作用的显微照片。图6A举例说明了在非Nafion表面上的Jurkat细胞。图6B举例说明了在Nafion表面上的Jurkat细胞。
图7是显示在暴露于本发明的MVC/HT/56A、B、C和D膜之后的死亡(红色)Jurkat细胞的百分数的线图。
图8A-D是使用LIVE/DEADR BacLightTM细菌活力试剂盒(其中在荧光显微镜下，死细胞显示红色，活细胞显示绿色)(Molecular Probes)举例说明BIOACT 13、15、16和110膜对Jurkat细胞的细胞毒作用的显微照片。图8A举例说明了在1分钟之后的对照Jurkat细胞(未暴露于生物活性膜)。图8B举例说明了在1分钟之后的加入了BIOACT 13膜的Jurkat细胞。图8C举例说明了在10分钟之后的对照Jurkat细胞(未暴露于生物活性膜)。图8D举例说明了在10分钟之后的加入了BIOACT 13膜的Jurkat细胞。
图9A-C是举例说明离子交换树脂珠的抗坏死作用的照片。图9A是在施用离子交换树脂珠之前的坏死组织的照片。图9B是施用离子交换珠两天后的相同组织的照片。图9C是应用离子交换树脂的织物的照片。优选实施方案描述
本发明涉及使用固体缓冲剂影响细胞过程的方法。具体地说，可将本发明用于从杀死体内的患病细胞(比如癌细胞)到杀死环境中有害的原核细胞的范围内的多种应用中。
参考附图和所附说明，可以更好地理解本发明的原理和操作。
在详细解释本发明的至少一个实施方案以前，应当理解本发明的申请并不限于在以下说明书中或通过实施例举例说明而提出的详细内容。可通过各种方式实践或实施本发明的其它实施方式。而且，应当理解本文中所使用的措辞和术语是出于说明的目的，不应被视为限制。
本发明是本发明人偶然发现的结果，是出乎意料的。其证实了生物分子(例如蛋白质)通常具有其沿pH梯度决定其空间分布的pH性质(参见实施例1)。进一步的实验提供了其再分布也可跨生物膜发生的证据(参见实施例3，图4A-C)。
在构思本发明时，本发明人揭示了可通过改变与细胞接触的固体缓冲剂的细胞外pH而操作细胞内部的过程。因此，本发明人已表明可通过使细胞接触具有一定pH的固体缓冲剂而破坏细胞内pH稳定状态，所述一定pH是不同于细胞内组分的pH。此接触造成细胞浆中细胞内pH的滴定并通常导致细胞过程的改变。当缓冲物质的pH超出特定细胞的存活性pH范围时，可导致细胞死亡。
美国专利申请No.20050271780、20050249695和20050003163教导了杀菌聚合物。其中所教导的聚合物依赖所述聚合物与细胞膜的直接接触，因为杀菌活性来源于阳离子分子的纳入，或在其表面上的固定，或引入聚合物结构中。毒性水平很大程度上取决于杀菌实体的表面浓度。这一要求带来了很大的限制，因为暴露的阳离子物质在离子交换反应中可非常快地被饱和。
本发明所教导的固体缓冲剂并不限于阳离子聚合物，阴离子缓冲剂也可以，因为本发明的新机制并不依赖于阳离子基团的渗透而破坏细胞膜，而是依赖于总体体积缓冲作用。本文中所教导的固体缓冲剂不受杀菌实体表面浓度的限制，因为其细胞毒活性来源于其体积性质而不仅是表面性质。
当将本发明用于实践时，本发明人表明固体缓冲剂可对所有细胞类型发挥细胞毒作用，例如酵母细胞(实施例4，表2)、哺乳动物Jurkat细胞(实施例5，表3)、细菌细胞(实施例11，表5)和真菌细胞(实施例12)。
本发明人还证实了可通过选择与细胞接触的固体缓冲剂的pH值而控制细胞死亡率，以便可以通过适当调节与细胞接触的固体缓冲剂的pH值而微调细胞死亡率(参见例如实施例4，表2)。
此外，本发明人表明pH诱导的细胞毒性需要细胞与固体缓冲剂的直接接触。因此，可将特定孔径的物理屏障附着于固体缓冲剂上，以便仅破坏(改变)特定大小的细胞的pH稳定状态。以此方式，可以特定大小的细胞作为靶标，而不改变其它细胞(参见实施例8)。
而且，本发明人表明设置在缓冲层外表面的透水层仍允许固体缓冲剂发挥其细胞作用，因为透水层允许离子的再分配并因此而不降低固体缓冲剂的总体体积作用。因此，如实施例14所举例说明的，可将固体缓冲剂用开孔聚合物覆盖并仍发挥细胞毒作用。
因此，根据本发明的一个方面，提供了一种在多细胞生物体的靶细胞的细胞过程中产生改变的方法，所述方法包括使所述靶细胞接触固体缓冲剂，以改变所述细胞至少一部分的细胞内pH值，从而在多细胞生物体的靶细胞的细胞过程中产生改变。
本发明的细胞可处于任何细胞环境中，例如，孤立的细胞，细胞悬液、细胞培养物、在组织中、或在器官中。细胞可以是健康的或患病的(例如肿瘤细胞)或其组合。
如本文中所使用的，术语“细胞过程的改变”指细胞过程的上调或下调。根据本发明的此方面，示例性的可改变的细胞过程包括但不限于细胞死亡率(细胞凋亡或坏死性细胞死亡)、细胞分化、细胞信号传导、细胞生长、细胞分裂、细胞分化、细胞增殖、肿瘤生长、肿瘤血管形成、肿瘤转移、肿瘤转移迁移和/或运动、细胞运动、细胞器功能(包括但不限于伪足形成、鞭毛运动等)以及跨不同细胞膜和细胞内膜以及隔室的分子转运。
根据本发明此方面的一个特别优选的实施方案，细胞过程的改变导致杀死细胞。以下描述了对固体缓冲剂进行校准以便其能实现细胞毒作用。
如本文中所使用的，术语“多细胞生物体”指包含多于一个细胞的任何生物体。示例性的多细胞生物体包括真核生物(例如哺乳动物)和高等植物。
应当理解，本发明的固体缓冲剂还可用于影响原核细胞以及例如真菌和革兰氏阳性细菌以及革兰氏阴性细菌的细胞过程。
本文中所使用的术语“革兰氏阳性细菌”指特征在于作为其细胞壁结构之一部分具有肽聚糖和多糖和/或磷壁酸以及特征在于在革兰氏染色过程中呈蓝-紫色反应的细菌。代表性的革兰氏阳性细菌包括：放线菌(Actinomyces spp.)、炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)、双歧杆菌(Bifidobacterium spp.)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringens)、梭状芽孢杆菌(Clostridiumspp.)、破伤风梭状芽孢杆菌(Clostridium tetani)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、杰氏棒状杆菌(Corynebacteriumjeikeium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、真杆菌(Eubacterium spp.)、阴道加德纳菌(Gardnerella vaginalis)、麻疹孪生球菌(Gemella morbillorum)、明串珠菌(Leuconostoc spp.)、脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abcessus)、鸟分枝杆菌(Mycobacterium aviumcomplex)、龟分枝杆菌(Mycobacterium chelonae)、偶然分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)、嗜血分枝杆菌(Mycobacteriumhaemophilium)、堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、海分枝杆菌(Mycobacterium marinum)、瘰疬分枝杆菌(Mycobacterium scrofulaceum)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)、土分枝杆菌(Mycobacterium terrae)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、溃疡分枝杆菌(Mycobacteriumulcerans)、奴卡氏菌(Nocardia spp.)、黑色消化球菌(Peptococcus niger)、消化链球菌(Peptostreptococcus spp.)、丙酸杆菌(Proprionibacteriumspp.)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、耳葡萄球菌(Staphylococcus auricularis)、头状葡萄球菌(Staphylococcus capitis)、科氏葡萄球菌(Staphylococcus cohnii)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)、人葡萄球菌(Staphylococcus hominis)、路邓葡萄球菌(Staphylococcus lugdanensis)、解糖葡萄球菌(Staphylococcus saccharolyticus)、腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)、施氏葡萄球菌(Staphylococcusschleiferi)、模仿葡萄球菌(Staphylococcus similans)、沃氏葡萄球菌(Staphylococcus warneri)、木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B族链球菌)、咽峡炎链球菌(Streptococcus anginosus)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、狗链球菌(Streptococcus canis)、马链球菌(Streptococcus equi)、米勒链球菌(Streptococcus milleri)、和缓链球菌(Streptococcus mitior)、变形链球菌(Streptococcus mutans)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)(A族链球菌)、唾液链球菌(Streptococcus salivarius)、血链球菌(Streptococcus sanguis)。
本文中所使用的术语“革兰氏阴性细菌”指特征在于在每个细菌细胞周围存在双膜的细菌。代表性的革兰氏阴性细菌包括：醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)、伴放线放线杆菌(Actinobacillusactinomycetemcomitans)、嗜水气单孢菌(Aeromonas hydrophila)、木糖氧化产碱杆菌(Alcaligenes xylosoxidans)、类杆菌(Bacteroides)、脆弱类杆菌(Bacteroides fragilis)、杆状巴尔通体(Bartonella bacilliformis)、博德特氏菌(Bordetella spp.)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、卡他布兰汉菌(Branhamella catarrhalis)、布鲁氏菌(Brucella spp.)、弯曲杆菌(Campylobacter spp.)、肺炎衣原体(Chalmydia pneumoniae)、鹦鹉衣原体(Chlamydia psittaci)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)、柠檬酸杆菌(Citrobacterspp.)、侵蚀艾肯菌(Eikenella corrodens)、产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、脑膜炎败血性黄杆菌(Flavobacterium meningosepticum)、梭杆菌(Fusobacterium spp.)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、嗜血杆菌(Haemophilus spp.)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、克雷伯氏菌(Klebsiella spp.)、军团菌(Legionella spp.)、Leptospira spp.、卡他莫拉菌(Moraxellacatarrhalis)、摩氏摩根氏菌(Morganella morganii)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida)、类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)、普雷沃氏菌(Prevotella spp.)、变形杆菌(Proteus spp.)、雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、假单胞菌(Pseudomonas spp.)、普氏立克次氏体(Rickettsia prowazekii)、立氏立克次氏体(Rickettsia rickettsii)、罗卡利马氏体(Rochalimaea spp.)、沙门氏菌(Salmonella spp.)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、志贺氏菌(Shigella spp.)、斑点病密螺旋体(Treponema carateum)、苍白密螺旋体(Treponema pallidum)、地方性苍白密螺旋体(Treponema pallidum endemicum)、极细密螺旋体(Treponema pertenue)、韦荣氏球菌(Veillonella spp.)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)。
如本文中所使用的，术语“固体缓冲剂”指具有缓冲容量的任何固体材料。缓冲容量被定义为当向缓冲剂中加入酸或碱(滴定)时缓冲剂抵抗其pH变化的能力，其通过每单位体积加入的可导致缓冲体系改变1个pH单位的H+离子的浓度而测定。体系的缓冲容量通常来自体系中能保持恒定供应H+离子的解离和非解离化合物的共存。因此，掺入离子传导基质或水/离子可透过基质中的任何酸性或碱性物质(例如离子交换物质)均可被归类为固体缓冲剂。固体缓冲剂的缓冲容量通常来自多种能够释放或结合H+的官能团的存在，并由这些物质的饱和度所决定，所述饱和度即所有这些官能团相互作用时的H+浓度。
示例性的阳离子交换物质包括但不限于磺酸及其衍生物、膦酸及其衍生物、羧酸及其衍生物、次膦酸及其衍生物、酚及其衍生物、胂酸及其衍生物以及硒酸及其衍生物。
示例性的阴离子交换物质包括但不限于叔胺、仲胺、伯胺和季铵。
示例性的透水基质包括但不限于开孔聚合物、开孔陶瓷和凝胶。
示例性的开孔聚合物包括但不限于PVOH、纤维素和聚氨酯。
作为替代，固体缓冲剂可包含自身为离子传导性(intrinsically ionconductive)基质。自身性离子传导的固体缓冲剂的实例包括但不限于离子交联聚合物和聚阳离子物质。
已商业化的离子交联聚合物的一些实例是可由E.I.du Pont deNemours & Co.，Inc.(Wilmington，Del.)获得的NafionRTM全氟化磺酸膜以及同样可从DuPont获得的SurlynRTM热塑性树脂。
通常，固体缓冲剂是聚合物。应当理解，根据本发明的此方面，有多种多样的聚合物可用作固体缓冲剂。以下是这些聚合物的一个有限的列表：聚(4-乙烯基-N-烷基吡啶溴化物)、聚(甲基丙烯酰基氧基十二烷基吡啶溴化物、N-烷基化聚(4-乙烯基吡啶)、聚(乙烯基-N-己基吡啶)、聚(N-烷基乙烯基吡啶)、聚(N-烷基乙撑亚胺)、聚(4-乙烯基-N-烷基吡啶溴化物)、聚(4-乙烯基-N-己基吡啶溴化物)、聚(1-(氯甲基)亚4-乙烯基苯，聚(二甲基辛基[4-乙烯基苯基]甲基氯化铵、聚(二甲基十二烷基[4-乙烯基苯基]甲基氯化铵、聚(二甲基十四烷基[4-乙烯基苯基]甲基氯化铵、50：50聚(1-氯甲基)-4-乙烯基苯)：聚(二甲基十二烷基[4-乙烯基苯基]甲基氯化铵、50：50聚(1-氯甲基)-4-乙烯基举)：聚(二甲基辛基[4-乙烯基苯基]甲基氯化铵、50：50聚(二甲基十二烷基[4-乙烯基苯基]甲基氯化铵：聚(二甲基辛基[4-乙烯基苯基]甲基氯化铵、聚(三丁基-[4-乙烯基苯基]甲基氯化鏻和聚(三辛基-[4-乙烯基苯基]甲基氯化鏻。
应当理解，本发明的固体缓冲剂还可以包括凝胶基质，比如已采用合适缓冲剂(例如以immobilineTM为商品名的丙烯酰胺缓冲剂)进行适当制备的聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶基质。在以下实施例部分的表1中给出了用于产生特定pH之凝胶的immobiline pK缓冲剂的量。本发明的固体缓冲剂也可以是离子交换珠、包被聚合物的离子交换珠或掺有可渗透离子的基质的离子交换珠。
本文中所用的术语“接触”指细胞相对于固体缓冲剂的定位，其受到从固体缓冲剂传导至细胞的离子的必要性的限制，反之亦然。
因此，根据本发明此方面的一个实施方案，细胞和固体缓冲剂彼此处于直接的物理接触。例如，固体缓冲剂可接触细胞外部或附着至细胞外部。或者，固体缓冲剂可通过已知的细胞外物质的内化(internalization)过程而被细胞所内化，所述内化过程例如但不限于吞噬作用、胞吞作用、受体介导的胞吞作用、与笼形蛋白包被小窝或囊泡相关的内化过程、转铁蛋白感染(transferrinfection)等。
根据本发明此方面的另一个实施方案，通过透水层将固体缓冲剂从细胞分离。这样的透水层将允许离子从固体缓冲剂流动到细胞，并且反之亦然，因此不会妨碍固体缓冲剂的缓冲容量。示例性的透水层是PVOH、乙基纤维素、纤维素醋酸酯、聚丙烯酰胺、没有或具有亲水性添加剂的任何多孔性基质等。
接触可以在体内、离体(即在取自机体的细胞中)和/或在体外(例如在细胞系中)实现。
如上文所述，可配制本发明的固体缓冲剂用于在具体细胞过程中产生改变。通常，可操纵固体缓冲剂的三个性质-pH、缓冲容量和离子传导性，以便使固体缓冲剂影响细胞过程。
以下是如何选择固体缓冲剂以影响(例如增加)细胞死亡过程的实例：
1.固体缓冲剂的pH应当在细胞活力的范围之外。此范围对于每种细胞和细菌而言是特定的。通常，pH小于4或大于8的固体缓冲剂将影响细胞的pH稳定性。
应当理解，可将固体缓冲剂配制为具有pH梯度。所述梯度可用于提供固体缓冲剂对细胞的生物学效应的逐步变化。例如，对固体缓冲剂使用这样的梯度可导致部分固体缓冲剂对细胞具有抑制作用，而该固体缓冲剂的其它区域则具有细胞毒作用。
本领域技术人员应当理解，可以通过适当地控制掺入固体缓冲剂的基质中的离子交换物质来实现这种梯度的形式、强度、位置和整体模式的变化，所有这些均涵盖于本发明的范围之中。可以使用immobilineTM合成梯度缓冲剂，如以下实施例部分中所述。
此外，应当理解，本发明的固体缓冲剂还可以包含以适于有效杀灭作用而设置的阳离子交换物质和阴离子交换物质的组合。因此，固体缓冲剂可例如包含阴离子和阳离子珠的混合物。所述珠的大小可以相同或不同，这取决于靶细胞的定位。
2.由于细胞溶胶和大多数其它细胞成分的公认的缓冲容量的值通常大于20mM H+/升.pH，因此为引起对细胞溶胶的滴定，固体缓冲物质的缓冲容量应大于该值。可用于杀死大多数细胞类型的固体缓冲剂的通常缓冲容量为约100mM H+/升.pH或更高。
3.固体缓冲剂的离子传导性(质子传导性)的变化将影响固体缓冲剂能够杀死细胞的速率。通常，透水性固体缓冲剂的离子流动性将由水中质子的扩散运动决定，且对于扩散常数而言约为10-8m2/秒的量级，这对应于0.1mm/秒的漂移速度。这些固体缓冲剂将在与细胞接触约数秒钟的时间内诱导细胞死亡。
因此，一个杀死细胞的示例性的方法是通过使细胞接触具有约50mM H+/升.pH的缓冲容量和能滴定细胞的pH的固体缓冲剂，从而诱导细胞死亡，所述pH通常大于pH 8或小于pH 4.5。
测量pH和测定缓冲容量的方法是本领域众所周知的。
应当理解，细胞的血浆缓冲能力和pH因细胞而异的，因此，对于这些参数的操纵可使靶向具体的细胞类型成为可能。例如，通常认为肿瘤细胞相比与正常细胞更具碱性，因此，为发挥在肿瘤细胞内的最佳细胞毒活性，固体缓冲剂可能对其它细胞类型具有较小(或没有)作用。此外，每一细胞类型都具有特定的膜通透性，因此对于本发明的固体缓冲剂而言可能天然更(或较不)敏感。
作为又一个实例，已知细菌的缓冲容量高于哺乳动物，但细菌对于缓冲剂的滴定更脆弱，因为在细菌中缓冲介质的量比哺乳动物中大约低3个数量级。这使得使用低缓冲容量的固体缓冲剂杀死细菌而不杀死哺乳动物细胞成为可能。
改变固体缓冲剂的pH和缓冲容量的一个方法是通过改变离子交换物质在水溶性(离子透过性)基质中的浓度。或者，可保持离子交换物质的浓度恒定而可改变离子交换物质。可通过测试具有不同pH和对细胞(包括目标细胞)混合物具有不同缓冲容量的多种固体缓冲剂来选择用于杀死目标细胞的最佳固体缓冲剂。然后可分析目标细胞以确定最佳固体缓冲剂。分析目标细胞的方法可包括显微术、免疫化学或其它本领域已知的生物测定技术。
由于本发明考虑使用固体缓冲剂治疗病症(例如与病理性细胞群体相关的病症)，固体缓冲剂通常在体内或离体施用于机体，因此，固体缓冲剂能够选择性地靶向特定细胞类型是尤其重要的。
因此，根据本发明此方面的一个实施方案，可将固体缓冲剂附着于亲和部分，比如抗体、受体配体或碳水化合物。根据本发明的此方面可使用的抗体的实例包括但不限于肿瘤抗体、抗CD20抗体和抗IL 2Rα抗体。受体的实例包括但不限于叶酸受体和EGF受体。根据本发明的此方面可使用的示例性的碳水化合物是凝集素。
可使用本领域已知的任何连接或结合方法和/或合适的化学连接物，使亲和部分共价或非共价连接或吸附至固体缓冲剂上。这些交联剂和交联方法的确切类型和化学性质优选适于所用的亲和性基团的类型和固体缓冲剂的性质。用于结合或吸附或连接这种亲和标记和基团的方法也是本领域众所周知的。
根据本发明一个优选的实施方案，所述靶细胞可以是表达可识别表面标记的转移的癌细胞。如果选择固体缓冲剂的pH和缓冲容量以在接触时杀死这些细胞，则亲和部分可以是直接对抗由这些恶性细胞所表达的特异性标记的一种或多种抗体。
本发明人所考虑的靶向特异性细胞类型(例如靶向原核细胞和非真核细胞)的另一种方法是基于选择性阻止固体缓冲剂和特定细胞类型之间的物理性接触。因此，根据本发明此方面的另一个实施方案，固体缓冲剂至少部分被选择性屏障物所覆盖。例如，如果以具有可控孔径(例如但不限于滤膜，如具有选定孔径的尼龙滤膜或具有选定开孔大小的筛网等)的机械屏障物来覆盖或保护固体缓冲剂表面，则可排除在某种尺寸以上的细胞附着至固体缓冲剂或与固体缓冲剂形成接触，同时仍可允许具有较小尺寸的细胞进入孔或通过机械屏障物并与固体缓冲剂相接触。
还可通过使用“被动”靶向来实现靶向本发明的固体缓冲剂。由于脉管系统渗漏和缺乏淋巴引流，这利用了肿瘤组织颗粒的增加的渗透性和滞留性。在本领域中已经知道，肿瘤对于200-600纳米大小的颗粒的选择性为相对于健康组织的10～100倍。此特定类型的被动靶向可利用并未被识别基团或部分所官能化的颗粒。
本发明的固体缓冲剂可本身单独施用于生物体，或在与合适的载体或赋形剂混合的情况下以药物组合物施用于生物体。
如本文中所使用的，“药物组合物”指本文中所述的一种或多种活性成分与其他化学组分(比如生理上可接受载体和赋形剂)的制剂。药物组合物的目的在于方便化合物施用于生物体。
如本文中所使用的，术语“活性成分”指对于预期生物效用起作用的固体缓冲剂。
下文中的短语“生理上可接受载体”和“药学上可接受载体”可互换使用，指对生物体不引起明显刺激且不影响所施用化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。助剂包含在这些短语之中。
本文中的术语“赋形剂”指加入至药物组合物中以进一步促进活性成分施用的惰性物质。赋形剂的非限定性实例包括碳酸钙、磷酸钙、各种类型的糖和淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
药物施用和配制的技术可见于最新版的“Remington′sPharmaceutical Sciences”，Mack Publishing Co.，Easton，PA，其通过引用全部并入本文中。
可将本发明的固体缓冲剂配制成颗粒或珠，并可在平均大小几纳米至几毫米及更大的范围内进行制备。
可将固体缓冲剂附着于颗粒表面或包封于颗粒内。应当理解，如果将固体缓冲剂置于颗粒内，则包封颗粒必须由离子传导性材料制成，以允许离子在固体缓冲剂和细胞之间流动。示例性的颗粒包括但不限于聚合物颗粒、微囊脂质体、微球、微乳、纳米颗粒、纳米胶囊和纳米球。
还可用生物可降解衣料将本发明的固体缓冲剂包衣，以提高选择性并防止在循环过程中的活性。示例性的生物可降解衣料包括聚乙烯亚胺(PEI)衣料、聚乙二醇(PEG)衣料、修饰的明胶衣料或任何其它合适的包衣材料。
合适的施用途径可包括例如口服，直肠，透过粘膜特别是经鼻、肠、或胃肠外递送，包括肌肉内、皮下和髓内注射、以及鞘内、直接脑室内、静脉内、腹膜内、鼻内、或眼内注射。
或者，可将药物组合物以局部而不是全身方式进行施用，例如，将药物组合物直接注射进患者的组织区域内。
可通过本领域众所周知的方法制备本发明的药物组合物，例如通过常规的混合、溶解、制粒、制成糖锭剂、水飞、乳化、包封、诱捕(entrapping)或冻干方法来制备。
可通过常规方法，使用一种或多种生理上可接受载体(包括促进活性成分进入可药用制剂的赋形剂和助剂)而配制用于本发明的药物组合物。合适的制剂取决于所选择的施用途径。
对于注射而言，可在含水溶液中配制药物组合物的活性成分，优选配制在生理相容的缓冲液中，比如Hank′s溶液、Ringer′s溶液、或生理盐缓冲液。对于透过粘膜施用而言，将适于透过屏蔽物的渗透剂用于制剂。这样的渗透剂是本领域众所周知的。
对于局部施用而言，可将本发明的固体缓冲剂配制成凝胶、乳膏、洗剂、清洗剂(rinse)或喷雾剂。当将固体缓冲剂局部施用于对象或施用到任何固体表面时，可应用这些。
对于口服施用而言，可通过将活性化合物与本领域众所周知的药学上可接受载体组合而容易地配制药物组合物。这些载体使得能将药物组合物配制成片剂、丸剂、糖锭剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、淤浆(slurry)、混悬剂等以供患者口服摄入。可使用固体赋形剂，任选将所得混合物研磨，并在根据需要加入合适的助剂之后处理颗粒化合物，以得到片芯或糖锭剂芯而制备供口服使用的药物制剂。合适的赋形剂尤其是填充剂比如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制品例如玉米淀粉、小麦淀粉、稻米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄耆胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、和羧甲基纤维素钠；和/或生理上可接受的聚合物比如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可加入崩解剂，比如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或藻酸或其盐，比如藻酸钠。
糖锭剂芯被配以合适的衣层。为此目的，可使用浓糖溶液，其可任选地包含阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇、二氧化钛、漆溶液、以及合适的有机溶剂或溶剂混合物。可将染料和色素加入到片剂和糖锭剂的衣层中以识别或表征活性化合物剂量的不同组合。
可口服施用的药物组合物包括由明胶制成的推入配合的胶囊和由明胶和增塑剂(比如甘油和山梨醇)制成的软的密封胶囊。所述推入配合的胶囊可包含活性成分以及与其相混合的填充剂比如乳糖、粘合剂比如淀粉、润滑剂比如滑石或硬脂酸镁、以及任选地稳定剂。在软胶囊中，可将活性成分溶于或混悬于合适的液体中，比如脂肪油、液体石蜡、或液体聚乙二醇。另外，可以加入稳定剂。所有供口服的制剂均应为适于所选择的施用途径的剂型。
对于口颊施用而言，组合物可采取以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。
对于通过经鼻吸入的施用而言，可方便地以气溶胶喷雾剂的形式递送用于本发明的活性成分，所述喷雾剂以加压包装或雾化器并在使用合适的抛射剂(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、或二氧化碳)下提供。在加压的气雾剂的情况下，剂量可通过提供递送计量量的阀来确定。可配制用于分配器的例如明胶的胶囊和药筒，其包含化合物和合适的粉末基质(比如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
可配制本文中所描述的药物组合物用于胃肠外施用，例如通过推注或连续输注。可以单位剂型提供注射制剂，例如在安瓿中或在多剂量容器中，任选地含有添加的防腐剂。组合物可以是处于油性或水性载体中的混悬液、溶液或乳液，并可含有配制试剂比如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。
胃肠外施用的药物组合物包括水溶性形式的活性制备物的含水溶液。另外，可将活性成分的混悬液配制为合适的油性或基于水的注射混悬液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油比如芝麻油，或合成脂肪酸酯比如油酸乙酯、甘油三酯或脂质体。含水注射混悬液可包含增加混悬液粘度的物质，比如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选地，混悬液还可包含合适的稳定剂或增加活性成分溶解度的试剂，以允许制备高浓度溶液。
还可以使用例如常规的栓剂基质(比如可可脂或其它的甘油酯)将本发明的药物组合物配制成直肠组合物，比如栓剂或保留灌肠剂。
适合用于本发明中的药物组合物包括其中活性成分以可有效到达意欲目的的量存在的组合物。更具体地，“治疗有效量”意为可有效预防、缓解或改善病症的症状(例如缺血)或延长治疗对象的生存的活性成分(例如核酸构建体)的量。
治疗有效量的确定在本领域技术人员的能力范围之内，尤其是根据本文中所提供的详细公开内容的前提下。
对于用于本发明方法的任何制剂而言，最初可由体外或细胞培养试验估计剂量或治疗有效量。例如，可在动物模型中配置剂量以达到所需的浓度或滴度。可使用这些信息以更准确地确定人的有用剂量。
可通过体外、细胞培养或实验动物发热标准药学方法测定本文中所述活性成分的毒性和疗效。得自这些体外和细胞培养方法以及动物研究的数据可用于配制多种用于人的剂型。剂量可根据所施用的剂型以及所使用的施用途径而变化。可由各个医生根据患者的状况选择确切的制剂、施用途径和剂量(参见例如Fingl，E.等的“The Pharmacological Basis ofTherapeutics”，第1章第1页)。
可对剂量和施用间隔进行各自调整以提供足够的活性成分血浆水平或脑水平(例如，最小有效浓度，MEC)以诱导或抑制生物效应。尽管MEC因每种制剂而变化，但可由体外数据对其进行估计。达到MEC的必需剂量将取决于个体性质和施用途径。可使用检测方法确定血浆浓度。
根据待治疗病症的严重程度和响应性，剂量可以是单次或多次施用，治疗时程持续数天到数周，或直到实现治愈或达到疾病状态的降低。
待施用的组合物的量当然将取决于治疗对象、病症的严重程度、施用方式、处方医生的判断等。
如果需要，可以在包装或分配装置中提供本发明的组合物，所述分配装置比如FDA批准的试剂盒，其可包含含有活性成分的一种或多种单位剂型。所述包装可以例如包含金属或塑料箔，比如泡罩包装。所述包装和分配装置可以配有施用说明书。所述包装和分配装置还可以配有由管理药品生产、使用或销售的政府机构所规定形式的通知，该通知反映了用于人用或兽用的此形式的组合物被所述机构批准。这样的通知例如可包括由美国食品药品管理局所批准的用于处方药的标签或批准的产品附页。也可以制备包含在药学可接受载体中配制的本发明制备物的组合物，至于适当容器中，并标明治疗适应症，如以上所详细描述的。
应当理解，本发明还考虑到使用本发明的固体缓冲剂包被固体表面或材料。本文中所使用的术语“表面”指任何材料的任何表面，包括玻璃、塑料、金属、聚合物等。其可包括由多于一种材料构造的表面，包括包被的表面。
可使用任何本领域已知的方法使固体缓冲剂附着于表面，所述方法包括喷雾、润湿、浸没、浸溃、涂抹、超声焊接、焊接、接合或粘附，或者以其他方式提供具有本发明固体缓冲剂的表面。本发明的固体缓冲剂可以作为单层或多层来附着。
可用本发明的固体缓冲剂包被的示例性固体表面是体内或体外的医疗装置或植入物。
本文中所用的“植入物”指意在置于人体内的非活组织的任何物体。植入物可以是临时性的或永久的。植入物包括天然来源的对象，其已被处理以便使其活组织已失去生命力。作为实例，可对骨移植物进行处理以便除去其活细胞(非细胞化)，但仍维持其形状以用作客体骨向内生长的模板。作为另一个实例，可处理天然产生的珊瑚以得到羟磷灰石制备物，其可用于机体的某些整形外科治疗和牙科治疗。植入物还可以是包含人造成分的物品。
因此，例如本发明构思使用本发明固体缓冲剂包被的血管支架。固体缓冲剂可排斥或吸引细胞内特定类型的蛋白质，所述蛋白质在与表面接触时可影响内皮细胞的细胞周期以减少或预防再狭窄，或以本发明方法包被的一般类型的植入物以达到使植入物与组织相整合的有益效果。
本发明的固体缓冲剂的另一个可能应用是见于包被医疗环境和牙科环境中的表面。
见于医疗环境中的表面包括各种仪器和装置(无论一次性的还是意在重复使用的)的内表面和外表面。实例包括适于医用的全部物品，包括手术刀、针、剪刀和用于侵入性手术、治疗过程或诊断过程的其它装置；血液过滤器、植入医疗装置，包括人造血管、导管和用于除去流体的装置或将流体递送至患者的装置，人工心脏、人工肾、整形外科钉、板和植入物；导管和其它管(包括尿路导管和胆管、器官导管、外周可插入的中央静脉导管、透析导管、长期隧道式中央静脉导管、外周静脉导管、短期中央静脉导管、动脉导管、肺导管、斯旺-甘兹式导管、导尿管、腹腔导管)，泌尿科装置(包括长期泌尿科装置、组织结合泌尿科装置、人造尿道括约肌、尿道扩张器)，分流管(包括心室分流管或动静脉分流管)；假体(包括乳房植入物、阴茎假体、血管移植假体、动脉瘤修复装置、心脏瓣膜、人工关节、人工喉、耳科植入物)，吻合口装置、血管插管口、夹钳、栓塞装置、伤口引流管、脑积水分流管、起搏器和植入式除颤器等。其它的实例对于这些领域的医师来说将是显而易见的。
见于医疗环境中的表面还包括在卫生保健环境中人员佩戴或携带的医疗设备、医疗装置的内表面和外表面。这样的表面可包括用于医疗过程或用于准备医疗设备的领域中的台面和固定物，用于呼吸治疗的管和滤毒罐，包括施用氧、喷雾器中的增溶药物以及麻醉剂。还包括在医疗设置中意在作为感染性生物体的生物屏障物的那些表面，比如手套、围裙和面罩。常用的生物屏障物材料可以是基于乳胶的或基于非乳胶的。乙烯树脂(vinyl)常用作非乳胶手术手套的材料。其它的这样的表面可包括不意在无菌的医疗设备或牙科设备的手柄和线缆。此外，这些表面可包括管和其它设备的那些非无菌性外表面，所述管和其它设备见于其中通常遇到血或体液或其它危险的生物材料的区域中。
其它与健康相关的表面包括涉及水纯化、水储存和水运输的那些物品、以及涉及食品过程的那些物品的内表面和外表面。因此，本发明考虑包被食品或饮料容器的固体表面以延长其内容物的保存期限。
与健康相关的表面还包括涉及提供营养、卫生或疾病预防的那些家庭用品的内表面和外表面。实例可包括用于家用的食物处理设备、用于婴儿护理的材料、卫生棉条和抽水马桶。
如在实施例15中所举例说明的，本发明的固体缓冲剂可用于增强创伤敷料的抗菌活性。同样，本发明的固体缓冲剂可用于增强缝合线、布、织物和伤口药膏的抗菌活性。
根据本发明的另一个实施方案，所述固体表面可以是显微镜载玻片、培养箱(culturing hood)、培养皿或本领域中已知的任何其它合适类型的组织培养器皿或容器。
如本文中所使用的，术语“约”指加或减10％。
通过考察以下的实施例(其不意在构成限制)，本发明的其它目的、优点和新的特征对本领域普通技术人员而言将是显而易见的。另外，如上所述的本发明的各种实施方案和方面的每一种以及如以下权利要求部分中所要求的内容均可在以下实施例中找到实验支持。
实施例
现将参考以下实施例连同上述说明，以非限定的方式对本发明进行举例说明。
通常，本文中所使用的命名和本发明中所使用的实验方法包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。在参考文献中对这些技术进行了详尽地解释。参见例如“Molecular Cloning：A laboratory Manual”Sambrook等，(1989)；“Current Protocols in Molecular Biology”VolumesI-III Ausubel，R.M.，ed.(1994)；Ausubel等，“Current Protocols inMolecular Biology”，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，“A Practical Guide to Molecular Cloning”，John Wiley & Sons，New York(1988)；Watson等，“Recombinant DNA”，Scientific AmericanBooks，New York；Birren等(eds)“Genome Analysis：A LaboratoryManual Series”，Vols.1-4，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NewYork(1998)；在美国专利No.4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中所提出的方法；“Ceu Biology：A Laboratory Handbook”，Volumes I-III Cellis，J.E.，ed.(1994)；“Culture of Animal Cells-A Manualof Basic Technique”by Freshney，Wiley-Liss，N.Y.(1994)，Third Edition；“Current Protocols in Immunology”Volumes I-III Coligan J.E.，ed.(1994)；Stites等(eds)，“Basic and Clinical Immunology”(8th Edition)，Appleton &Lange，Norwalk，CT(1994)；Mishell和Shiigi(eds)，“Selected Methods inCellular Immunology”，W.H.Freeman和Co.，New York(1980)；可用的免疫测定广泛描述于专利和科学文献中，参见例如美国专利No.3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；“Oligonucleotide Synthesis”Gait，M.J.，ed.(1984)；“NucleicAcid Hybridization”Hames，B.D.和Higgins  S.J.，eds.(1985)；“Transcription and Translation”Hames，B.D.和Higgins S.J.，eds.(1984)；“Animal Cell Culture”Freshney，R.L，ed.(1986)；“Immobilized Cells andEnzymes”IRL Press，(1986)；“A Practical Guide to Molecular Cloning”Perbal，B.，(1984)和“Methods in Enzymology”Vol.1-317，Academic Press；“PCR Protocols：A Guide To Methods And Applications”，Academic Press，San Diego，CA(1990)；Marshak等“Strategies for Protein Purificationand Characterization-A Laboratory Course Manual”CSHL Press (1996)；所有这些文献均通过参考并入本文，如同全部在本文中提出一样。其它的一般参考文献在本文中各处均有提供。相信其中的方法对本领域而言是众所周知的，为方便读者而将其提供。在这些参考文献中所包含的全部信息均通过参考并入本文中。
实施例1
蛋白质在pH梯度中的分布
进行以下实验，以便确定是否蛋白质具有特殊的pH性质。材料和方法
凝胶制备：使用测量约7厘米的四条immobiline凝胶条。每一条带是从含有ampholine的聚丙烯酰胺基凝胶上剪下来的，所述凝胶具有4-9的pH梯度，按本领域已知方法制备(所述凝胶含有4％的聚丙烯酰胺和5％的双丙烯酰胺交联剂)。
蛋白质溶液制备：制备了4种不同的蛋白质溶液。第一种溶液含有在DDW中的1.0mg/ml的肌球蛋白(可从Sigma，USA商购，目录编号M-0630)。第二种溶液含有在DDW中的1.0mg/ml的肌球蛋白，并含有8M最终浓度的尿素用于蛋白质变性。第三种溶液含有在DDW中的1.0mg/ml的藻蓝蛋白(可从Sigma，USA商购，目录编号P-2172)。第四种溶液含有在DDW中的1.0mg/ml的藻蓝蛋白，并含有8M最终浓度的尿素用于蛋白质变性。所有的蛋白质溶液均具有约7.0的pH。
实验过程：将10ml的上述每种蛋白质溶液置于培养皿中并将凝胶条带浸入每种溶液中。盖上培养皿并将凝胶在室温下培养3～5天。在培养阶段结束时，将凝胶条带从培养皿中取出，小心地以过量的液体印迹并以Epson平板办公扫描仪进行扫描。
结果
如图1A-B和2A-B中所示，根据条带不同区域上的pH，蛋白质被差异性吸收进入凝胶条带的不同区域中。
肌球蛋白具有pI≈6，藻蓝蛋白具有pI≈4.2。尽管肌球蛋白在天然蛋白和变性蛋白之间的空间(和依赖pH的)分布曲线的位移相当小(图2A-2B)，但是对于大得多的藻蓝蛋白来说则观察到了非常强的位移(吸光度的空间分布的差别，其中吸光度作为沿凝胶条带的pH的函数)(图1A-1B)。
结论
蛋白质在pH梯度上的分布代表了对于每种测试蛋白质而言具有特异性的特征，并代表了蛋白质的pH性质。
实施例2
蛋白质根据其pH性质的跨凝胶膜再分布
材料和方法
凝胶制备：通过放置两个凝胶膜将长方形腔室分隔成三个隔室，形成2mm厚的基于聚丙烯酰胺的凝胶板，如图3A-B所示。通过加入10μlImobilineTM(Amersham)、0.5μl过硫酸铵(APS)、0.25μl TEMED(1∶10)、10％的聚丙烯酰胺和5％的双丙烯酰胺制备凝胶。一个凝胶膜按pH 4(酸性，含有Immobiline的聚丙烯酰胺)制备，另一个凝胶膜按pH 6(碱性，含有Immobiline的聚丙烯酰胺)制备。
蛋白质溶液制备：将肌球蛋白和藻蓝蛋白均以0.1克/升(g/L)的浓度溶于二次去离子的水(DDW)中。
实验过程：将300μl的每种蛋白质溶液置于以两个膜为边界的中央小室中。将在酸性侧的小室填充1mM的谷氨酸(pH＝3.8)缓冲溶液，将在碱性侧的小室填充1mM的TRIS(pH＝8.3)溶液。将小室静置于室温下。数天后，对小室进行肉眼观察并使用数码照相机拍照(俯视图)。
结果
如图3A所示，在实验开始时，上述多隔室小室的中间隔室2中的溶液呈深色，这来自存在于中间隔室2中的肌球蛋白和藻蓝蛋白的组合吸收，而在标为1和3的隔室(其分别含有酸性的(1mM的谷氨酸；pH＝3.8)缓冲液和碱性的(1mM的TRIS；pH＝8.3)缓冲液)中则几乎未观察到任何颜色。
如图3B所示，在实验结束时，上述多隔室小室的中间隔室2中的溶液具有浅得多的品红样颜色，这来自其中留下的浓度低得多的肌球蛋白和藻蓝蛋白的组合吸收。在标记1的隔室(其含有酸性的(1mM的谷氨酸；pH＝3.8)缓冲液，大量肌球蛋白迁移进入其中)中观察到强的浅红色。在标记3的隔室(其含有碱性的(1mM的TRIS；pH＝8.3)缓冲液，大量藻蓝蛋白迁移进入其中)中观察到强的浅蓝色。
结论
在由ImobilineTM膜所分开的隔室中的不同pH值的控制下，两种颜色的蛋白质发生了几乎完全的再分布和分离。
实施例3
进行以下实验，以证实在活的功能细胞内影响胞浆蛋白细胞内再分布的可行性。
材料和方法
转染HeLa细胞以在其胞质溶液中表达GFP。在溶解细胞后，测试提取的蛋白质以确定GFP蛋白最大积累的pH区域，如以上实施例1所描述。发现GFP蛋白最大积累的pH区域(通过在扫描的凝胶条带上定位峰值荧光而确定)在约pH＝9。
将具有平均直径约50微米的商品聚丙烯酰胺珠(Biogel P10，Cat.No.1504140，Biorad，USA)浸泡于pH＝9的聚丙烯酰胺和immobiline的共聚物的溶液(按上述实施例2中的详细叙述而制备)中。使ImobilineTM聚丙烯酰胺溶液进行化学聚合，然后将所得珠的水悬液加入表达GFP的HeLa细胞的细胞培养物中。一些细胞附着于所述珠上。然后通过将琼脂糖溶液(低熔点琼脂糖，目录编号1620019，Biorad USA，熔点约36℃)浇到细胞和珠上并使琼脂糖冷却到约25℃来将细胞和珠的混合物固定。在荧光显微镜(Axioscope 2Fluorescence Microscope，Zeiss，Germany)下观察接触珠的细胞，并在30分钟期间对GFP分布的变化进行肉眼观察和摄影监测。
结果
从图4A-C中可以看出，细胞与珠附着点的荧光强度在开始附着30分钟后比在零时刻时测量的细胞内的初始强度高约50倍。此测量密度占细胞中GFP的主要部分。类似的现象还在附着于珠的几种细胞中观察到。
采用具有pH＝7的涂层(未显示)的类似珠进行的对照实验并未显示附着于珠并同样观察的细胞中GFP分布方式的任何变化。
结论
上述实验观察清楚地证实了在活细胞中可能诱导基于pH分布的局域化蛋白质(GFP)的累积或再分布机制，并且可以通过与在其表面具有受控pH的材料或物体进行接触来产生浓度梯度或细胞内蛋白的局域化浓度。本实验还证实了可利用此性质产生活细胞内一种或多种蛋白质的再分布。
实施例4
pH对酵母细胞细胞毒性的作用
进行本实验以检测pH调节的酵母细胞表面的细胞毒性。
材料与方法
用0.5mm厚的含immobiline(丙烯酰胺缓冲剂)的聚丙烯酰胺凝胶包被9种表面皿的底部，每种凝胶与在前的凝胶相差约1个pH单位。第一个皿的涂层是pH 3的丙烯酰胺ImobilineTM缓冲剂凝胶，第二个皿的涂层是pH 4的丙烯酰胺ImobilineTM缓冲剂凝胶，第三个皿的涂层是pH 5的丙烯酰胺ImobilineTM缓冲剂凝胶，等......，第九个皿的涂层是pH 11的丙烯酰胺ImobilineTM缓冲剂凝胶。
通过本领域中已知的标准聚合方法制备涂层。Imobiline的组成列于以下表1中：
表1
表1中的数字以起始原料(具有100mM的浓度)的μl数给出，通过加入双蒸水，以所述起始原料制备10ml的pH溶液。
将悬于组织培养基(Roswell Park Memorial组织培养基，RPMI-1640Dutch型号01-1-7-1)中的1-2百万个酵母细胞Sacharomices(可商购的面包酵母)置于各培养皿中。细胞沉降至皿的底部并逐渐与聚丙烯酰胺表面接触，将细胞按以下表2中所示的预设时间置于皿中。在所指示的接触时间之后，使用台盼蓝将细胞染色并估计每皿死细胞的数目。
结果
下表2列出了在所指出的pH和暴露时间下的细胞死亡率的数据(占总细胞的％)。
表2
从表2可以看出，在极端pH值(pH 3、pH 4、pH10和pH 11)下，细胞在与控制pH的基质相对短的接触时间内死亡。在pH 7和pH 8时，没有观察到明显的细胞毒性，甚至在延长时间之后也是如此。在中间的pH值时(在pH 5-9的范围内)观察到时间依赖的毒性。
结论
在凝胶中改变的唯一参数是酰胺缓冲剂的组成。由于凝胶在水浸泡下是非常稳定的，因此可以设想没有将任何种类的毒性剂释放到细胞培养基中。因此，所观察到的细胞毒性最有可能是由于细胞中的离子(带电荷的蛋白质、氢离子、钾离子以及其它细胞内离子)的再分配引起的，所述细胞与实验中所用的控制pH的聚丙烯酰胺的表面相接触。这种假定得到以下事实的进一步支持，即如果比较在pH 3、4、5和6时所观察到的组成和毒性，则高酸性组分的浓度几乎恒定，而毒性变化最显著。在碱性一侧也可观察到同样的现象，对于pH 11、10、9和8而言最碱性组分的浓度仅轻微变化，而毒性变化显著。
这一观察结果证实了毒性并非是现有技术中所声称的引入高度阳离子或阴离子成分的结果，而是体积pH性质的结果。
本实验的结果进一步证实了可以通过选择与细胞接触的控制pH的物质或基质而控制细胞的死亡率(延迟的细胞毒性作用)，并且可通过适当调节与细胞接触的表面或基质的pH值而对此作用(细胞死亡速率)进行微调。
实施例5
pH诱导的对Jurkat细胞的细胞毒性
材料与方法
Jurkat细胞克隆E6-1生长于含有2mM L-谷氨酸、10mM HEPES、10mM丙酮酸钠和10％PBS的RPMI 1640中。使所述细胞暴露于如前所述的酵母细胞的不同pH表面(实施例4)。
结果
下表3列出了在所指示的pH和暴露时间下的细胞死亡率的数据(占总细胞的％)。此结果证实了具有低和高pH表面的高细胞毒性。
表3
实施例6
黄色荧光蛋白(YFP)的吸收特征
材料与方法
使1μg表达黄色荧光蛋白(来源-Phialadium sp.SL-2003)的H1299肺癌细胞溶解。检测提取的蛋白质以确定在IPG条带(AmershamBiosciences，ImmobilineTM干条带，pH 3-10)上YFP最大累积的pH区域。将条带浸没于溶液中22小时，然后使用UV扫描仪(Zeiss Axiscope 2Plus，UV microscope)对其进行扫描。
结果
从图5可以看出，在9.5-10的pH范围内显示出YFP的最强累积。
实施例7
防止pH诱导的细胞毒性的物理或机械屏障物
设计以下实验，以确定是否pH诱导的细胞毒性需要细胞与控制pH的基质表面的直接接触。
材料与方法
向培养皿底部浇上0.5mm厚的pH 3的immobiline聚丙烯酰胺凝胶(IPG)层。将平均孔径2μm的10μm厚的尼龙滤膜(可从Nalgene，USA购得)置于紧贴IPG层表面处。
将组织培养基(Roswell Park Memorial组织培养基，RPMI-1640Dutch，型号01-1-7-1)中的20万个酵母细胞的悬液置于培养皿中，并使细胞静置沉降6小时。在6小时沉降阶段末，使用台盼蓝将细胞染色。
结果
计数的死亡细胞数为计数的总细胞数的约5％。
结论
插入细胞和控制pH的基质的表面之间的尼龙滤膜防止了pH诱导的细胞毒性。
实施例8
区分细胞毒性装置
为进一步确认细胞和控制pH的基质之间的直接接触是pH诱导的细胞毒性所需要的，使用了允许细菌细胞与基质接触而不允许酵母细胞与基质接触的滤膜，方法如下：
材料与方法
向培养皿底部浇上0.5mm厚的pH 3的immobiline聚丙烯酰胺凝胶(IPG)层。将平均孔径2μm的10μm厚的尼龙滤膜(如上述实施例6中所描述的)置于紧贴IPG层表面处。将悬于0.5ml细胞培养基中的大肠杆菌(100单位/微升)和酵母细胞(100万/ml)的混合物置于尼龙滤膜顶部上的培养皿中，并将培养皿在37℃培养12个小时。在培养阶段之后，从培养基取样用于在McConkey琼脂上进行细菌菌落分析。然后使用台盼蓝将酵母细胞染色以进行死细胞计数。
结果
未检测到细菌菌落，未观察到明显的酵母细胞死亡率。
结论
本实验的结果证实了与细胞毒剂接触的细菌细胞被杀死，而未与细胞毒剂接触的酵母细胞仍存活。本实验的结果还证实了控制pH的基质的细菌毒性性质。
实施例9
在Jurkat细胞中pH诱导的细胞毒性
为确定在Jurkat细胞中是否产生pH诱导的细胞毒性，进行了以下实验。
材料与方法
由pH 9.0的聚丙烯酰胺+immobilineTM的混合物制备具有约1微米平均珠大小的聚丙烯酰胺基珠的悬液。将珠加入到悬于1ml组织培养基中的1百万个Jurkat细胞中，以便珠对细胞的比率约为20个珠每Jurkat细胞。在将珠加入细胞悬液后，于0.5、1.0和2.0小时取出小份试样。使用台盼蓝将细胞染色并计量死细胞和总细胞的数目。
结果
在加入珠后0.5小时，样品中死细胞部分为5％。在向细胞中加入珠后1.0小时，样品中死细胞部分为10％。在向细胞中加入珠后2.0小时，样品中死细胞部分为27％。
实施例10
Nafion的细胞毒作用
磺化四氟乙烯共聚物(例如Nafion)是具有强缓冲性质和高缓冲容量的酸性(带负电荷的)生物活性聚合物。这些类型的膜由基质(例如聚丙烯酸甲酯、尼龙或聚酯)和作为活性层的磺化聚合物组成。Nafion不被认为是细胞毒性的或杀菌的，通常在燃料电池应用中用作离子传导电极。进行以下毒性试验以确定Nafion对细胞是否有毒。
材料与方法
使在PBS缓冲液中的1百万Jurkat细胞沉淀在1平方厘米的nafion商业膜(NAFION 117，全氟化膜，Sigma，274674-1EA)上。为区分活细胞和死细胞，将膜以1μl的1μg/μl碘化丙锭或台盼蓝染色。
结果
如图6A-B所见，在暴露于nafion 10分钟后，超过95％的细胞死亡。
实施例11
层压物的细菌毒性和细胞毒性
材料与方法
层压物样品：层压物样品由包被有110μm聚酯基质的膜组成。BIOACT13、15和16系列：
BIOACT 16：110μm聚酯基质+丙烯酸改性聚氨酯引发层。
BIOACT 13：110μm聚酯基质+丙烯酸改性聚氨酯引发层+在PVOH粘合剂(w/w比4∶1)中的“活性”亚微米型二氧化硅(silica)；总包被重量0.97g/m2，包被pH 4.06。
BIOACT 15：110μm聚酯基质+丙烯酸改性聚氨酯引发层+在PVOH粘合剂(w/w比4∶1)中的“活性”阳离子型聚氨酯聚合物；总包被重量0.76g/m2，包被pH 4。
未包被的样品作为对照。
MVC/HT/56A、B和C系列：此系列的层压物是基于引入聚(甲基丙烯酸二乙氨基乙酯)的对甲苯磺酸盐(pH 3)作为涂层的活性组分。
MVC/HT/56A：110μm聚酯基质+PVOH+对甲苯磺酸盐。总的干涂层重0.9gsm(～0.9微米)，其中活性组分的干涂层重为0.6gsm。
MVC/HT/56B：与MVC/HT/56A相同，但为不同批次。
MVC/HT/56C：110μm聚酯基质+PVOH+对甲苯磺酸盐。总的干涂层重0.58gsm(～0.5微米)，其中活性组分的干涂层重为0.24gsm。
MVC/HT/56D：与MVC/HT/56A相同，但为不同批次。
活细菌和死细菌悬液的制备：将10ml E.coli DH5在LB肉汤中培养至对数后期。通过在5000rpm离心5分钟浓缩1ml培养物。将沉淀物再悬于100μl0.85％的NaCl中。将50μl此悬液加入到950μl 0.85％的NaCl(对于活细菌而言)中或850μl 70％的2-丙醇(对死细菌而言)中。将两种样品均在RT下培养1小时，然后通过在5000rpm离心5分钟将沉淀分离。将所得的沉淀物再悬于500μl 0.85％的NaCl中并在离心。最后，将两沉淀物均再悬于50μl0.85％的NaCl中。
活细菌悬液和死细菌悬液的染色：使用LIVE/DEADR BacLightTM细菌活力试剂盒(Molecular Probes)进行染色。在SYTO9和碘化丙锭染色下，具有完整细胞膜的细菌被染成荧光绿，而细胞膜受损的细菌被染成荧光红。基本上，将2μl SYTO 9染料、1.67mM/碘化丙锭和1.67mM组分A与2μl 1.67mM/碘化丙锭、18.3mM组分B相混合。将0.15μl染料混合物加入到50μl细菌悬液中。将2.5μl染色细菌捕集到载玻片和盖玻片之间。在荧光显微镜下观察活细胞和被杀死的细胞。
膜的抗菌活性试验：使用非活化的(来自货架)膜和在1M NaCl溶液中处理20分钟的膜进行两个系列的试验。在两个系列中，均通过在荧光显微镜下对沉淀于生物活性膜上的样品中死的和活的染色细菌的数目进行计数来评估抗菌活性。
膜的细胞毒活性试验：在通过以下过程使活的和死的Jurkat细胞暴露于生物活性膜后，对活的和死的Jurkat细胞进行计数：将0.15μl染料混合物加入在50μlPBS中的1百万个Jurkat细胞中。将2.5μl染色细菌捕集到活化膜和盖玻片之间。在荧光显微镜下观察活细胞和死细胞。
结果
MVC HT 56A、B、C和D的抗菌活性测试：如上所述，在将Jurkat细胞与层压物培养30分钟后，观察在对照、MVC/HT/56/B膜和MVC/HT/56/D膜中的活(动的)细胞，其在绿色滤光片(5-2)下是绿色或浅红色的。相比而言，在对MVC/HT/56/A和/56C层压物培养1分钟之后，所有的细胞均附着且在绿色绿光片下观察为红色。
MVC HT 56A、B、C和D的细胞毒活性测试：从图7和以下表4中可以看出，Jurkat细胞与56/A和56/C膜的相互作用与其与56/B和56/D的相互作用不同。
表4
BIOACT13、15和16的抗菌活性：在BIOACT 13上培养45分钟后，50-70％的大肠杆菌(E.coli)细胞死亡。同时，在BIOACT 15上培养后，20-40％的大肠杆菌死亡。大肠杆菌细胞不附着于BIOACT 16上。在BIOACT 15上培养20-30分钟后，几乎全部的大肠杆菌都死亡。由于背景噪声水平很高，评价这些细胞的附着是困难的。
BIOACT13、15和16的细胞毒活性测试：在下表5中示出了3个独立实验的结果，其结果表示为绿Jurkat细胞的数目：红Jurkat细胞的数目和绿Jurkat细胞占全部细胞的百分数。
表5
下表6以红色细胞的百分数总结了来自3个实验的结果。表8A-D示出了在使Jurkat细胞暴露于Bioact 13后的典型实验。
表6
  1分钟   10分钟
  无载体   6.4   10.2
  13   6.2   57.8
  15   5   23.5
  16   6.4   9.4
  110   3.7   35.9
结论
大肠杆菌和Jurkat细胞与56/A和56/C膜的相互作用不同于其与56/B和56/D膜的相互作用。在BIOACT 13、15和16系列中，BIOACT 13显示最高的细胞毒活性和抗菌活性。
实施例12
Nafion和聚丙烯酰胺pH凝胶的抗菌活性
进行以下毒性试验以确定Nafion和其它膜是否对细菌有毒性。
材料与方法
测试了6种塑料膜的杀菌作用。
1.Nafion(商品，Dupont)；
2.Nafion(商品，Dupont)；
3.500微米厚的聚酯基质上含immobiline聚丙烯酰胺，pH 10；
4.与3相同的聚丙烯酰胺，pH 9；
5.聚氨酯膜(商品)；
6.500微米的聚酯上的聚丙烯酰胺，pH 5；
对照聚酯膜
测试金黄色葡萄球菌(Staph.A ureus)、葡萄球菌(Staph.Spp)、A群β溶血性链球菌(Strept.Beta-hemolitgr.A)和G群β溶血性链球菌(Strept.Beta-hemolitgr.G)：使用“播散”方法，在血琼脂上测试这些细菌的活力。基本上，使用特殊的细菌接种环在血琼脂上播散0.01ml微生物液体培养基。将6个塑料膜(10mmx10mm)中的每个放置在测试板上，使活性一侧向下。在37℃下培养过夜后，评估菌落的数目。比较测试组和对照组。
测试总的细菌和真菌剂：使用“沉降”法在Saburo琼脂上测试上述膜的总的抗微生物和抗菌作用。将Saburo琼脂的无盖的板开放式放置8小时。将6个塑料膜(10mmx10mm)中的每个放置在测试板上，使活性一侧向下。在37℃下培养过夜后，评估集落的数目。比较测试组和对照组。
结果
本发明的板(sheet)对金黄色葡萄球菌生长的作用归纳于表7中。本发明的板对葡萄球菌生长的作用归纳于表8中。本发明的板对A群β溶血性链球菌生长的作用归纳于表9中。本发明的板对G群β溶血性链球菌生长的作用归纳于表10中。本发明的板对总微生物和真菌剂的作用总结于表11中。
表7
表8
表9
表10
表11
结论
Nafion和3号板(500微米厚的在聚酯基质上含immobiline的聚丙烯酰胺，pH 10)均显示了高的抗细菌活性和总的抗微生物和抗真菌活性。
实施例13
牛奶的保存期试验
测试了本发明的膜对牛奶保存期的作用。
材料与方法
使用巴氏灭菌的均化牛奶以测试牛奶对本发明的膜的稳定性。在两组实验中，将牛奶均以UV进行处理。
试验1：将7个空的35mm培养皿以新鲜牛奶填充至顶部。用本发明的膜将6个培养皿盖上，以便使其活性一侧接触牛奶，在两者之间没有空气。第7个板用作对照。将各板于室温下置于桌上6天。每天检测板的pH。为补偿蒸发，每日添加无菌DDW。所加入DDW的总体积小于牛奶总体积的5％，因此，预计不会影响pH动力学。重复此实验两次。
试验2-采用Nafion进行的14天试验：采用商品Nafion作为活性物质(层)进行此试验。使用巴氏灭菌的均化牛奶(w/o抗生素)以测试牛奶稳定性。将3个空的35mm培养皿以新鲜牛奶填充至顶部。用Nafion将2个培养皿盖上，以便使其活性一侧接触牛奶，在两者之间没有空气。第3个板用作对照。将各板于室温下置于桌上14天。每天检测板的pH。为补偿蒸发，每日添加无菌DDW。所加入DDW的总体积小于牛奶总体积的5％，因此，预计不会影响pH动力学。
检测总的微生物和真菌剂：使用“沉降”法在Saburo琼脂上进行该测试。将含Saburo琼脂的无盖平板开放式放置8小时。将6个塑料膜(10mmx10mm)中的每个放置在测试板上，使活性一侧向下。在37℃下培养过夜后，评估集落的数目。比较测试组和对照组。
结果
试验1后牛奶的pH结果记录于下表12中。
表12
  第1天   第2天   第3天   第4天   第5天   第6天
  膜1   7.4   7.2   6.9   6.8   6.7   6.3
  膜2   7.4   7.3   6.8   6.6   6.2   6.1
  膜3   7.4   7.3   6.9   5.9   5.4   4.9
  膜4   7.4   7.0   6.6   6.1   5.5   4.7
  膜5   7.4   6.8   6.2   5.6   4.4   3.7
  膜6   7.4   7.0   6.6   5.6   4.8   4.1
  对照   7.4   6.9   6.1   5.4   4.1   4.0
牛奶的pH结果(试验1，重复实验)记录于下表13中。
表13
  天   pH
  第0天   8.5
  第1天   8.7
  第2天   8.8
  第3天   8.7
  第4天   8.5
  第5天   8.6
  第6天   8.9
  第7天   8.5
  第8天   8.3
  第9天   8.5
  第10天   8.7
  第11天   8.8
  第12天   8.5
  第13天   8.5
  第14天   8.4
  第15天   8.5
14天试验的pH结果(试验2)记录于下表14中。
表14
测试总的微生物和真菌剂的结果记录于下表15中。
表15
实施例14
第二系列层压物的细胞毒试验
通过热塑层压方法制备第二系列的聚酯基质层压物。所述层压物由在PVOH基质中的活性阴离子组分组成。在一些样品中所述活性层包被有PVOH层。
层压物的组成和结构提供于下表16中。
表16
(T-以克/平方米计的总厚度；R-活性成分与PVOH粘合剂的比例；T1-以微米计的近似厚度，T2-以微米计的PVOH覆盖层的厚度)材料与方法
pH的测定：将膜在水中弄湿后，使用pH-Fix 0-14(Macherey-Nagel)测定pH。
细胞毒性测试：如实施例12和13中所述进行细胞毒性测试。
结果
pH结果列于下表17中。
表17
  膜   pH
  1.MVC/HT/58/AY   5.0
  2.MVC/HT/58/AY-pH 5.0   5.0
  3.MVC/HT/58/AYTCG-pH 6.0   6.0
  4.MVC/HT/58/AYTCG-pH 6.0   6.0
  5.MVC/HT/58/BY   ＜5.0(4.8)
  6.MVC/HT/58/BR   4.0
  7.MVC/HT/58/BYTCG   ＜5.0(4.8)
  8.MVC/HT/58/CY   6.0
细胞毒性结果列于下表18中。细胞毒作用按PI染色的(死)细胞％测量。20分钟后，在对照样品(无膜)中约80％的细胞是绿色的。
表18
  编号   指定名   细胞毒作用％
  1分钟   2分钟   10分钟   20分钟
  1   AY   95   ND   100   ND
  2   AR   85   ND   100   ND
  3   AYTCG   95   ND   100   ND
  4   AYTCB   50*   90   100   ND
  5   BY   90   ND   100   ND
  6   BR   70*   ND   100*   ND
  7   BYTCG   5   ND   100*   100
  8   CY   10*   ND   50*   50*
应当指出，样品3、4和7具有中性的PVOH涂层且仍表现出高的细胞毒性。
实施例15
抗菌织物
为确定本发明的材料是否能用于防止坏死，将离子交换树脂珠掺入棉织物中并与坏死组织接触两天。
材料与方法
初始材料：Biorad离子交换树脂AG 501-X8(D)(目录号142-6425)。每cm2棉织物中加入约100个珠。
结果
如图9A-C中所示，含有Biorad离子交换树脂的棉花具有抗坏死作用。
结论
含有具有缓冲性质的Biorad离子交换树脂的棉花可有效防止坏死。
应当理解，为清楚起见，本发明的某些特征描述于分开的实施方案中，它们也可以组合形式提供在单个实施方案中。反之，为简单起见，本发明的某些特征描述于单个实施方案中，它们也可以单独地或以任何合适的亚组合形式来提供。
尽管已结合本发明的具体实施方案对本发明进行了描述，但显然很多替代、改变和变化形式对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，意在涵盖落入所附权利要求书的精神和宽泛范围之内的所有这些替代、改变和变化形式。在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均以其整体通过引用并入本说明书中，如同具体且分别地指出每一篇单独的出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文中一样。另外，在本申请中任何参考文献的引用或确认不应理解为承认这些参考文献可作为本发明的现有技术。

Claims (40)

1.pH＜4.5或＞8的阳离子型固体缓冲剂在制备用于通过使靶细胞与固体缓冲剂接触而杀死活的靶细胞的药物中的用途。
2.权利要求1的用途，其中所述靶细胞是细菌细胞、真菌细胞或酵母细胞。
3.权利要求1的用途，其中所述靶细胞是细菌细胞。
4.权利要求1的用途，其中所述固体缓冲剂具有选自以下的一种或多种官能团：磺酸和膦酸。
5.权利要求1的用途，其中所述固体缓冲剂是磺化四氟乙烯共聚物。
6.权利要求1的用途，其中所述固体缓冲剂包括凝胶基质，所述凝胶基质选自已采用IMMOBILINETM丙烯酰胺缓冲剂适当制备的聚丙烯酰胺凝胶基质和琼脂糖凝胶基质。
7.权利要求1的用途，其中所述离子交换物质是离子交联聚合物或包括自身性离子传导聚合物。
8.权利要求1的用途，其中所述固体缓冲剂是离子交换珠、包被聚合物的离子交换珠以及掺入可渗透离子的基质中的离子交换珠中的一种或多种。
9.权利要求1的用途，其中所述固体缓冲剂具有大于20mM H+/L/pH单位的体积缓冲容量。
10.权利要求1的用途，其中所述固体缓冲剂具有≥100mM H+/L/pH单位的体积缓冲容量。
11.权利要求1的用途，其中所述固体缓冲剂用于增强创伤敷料的抗菌活性。
12.权利要求1的用途，其中所述固体缓冲剂用于增强缝合线、布料、织物或创伤软膏的抗菌活性。
13.pH＜4.5或＞8的阳离子型固体缓冲剂在制备用于在多细胞生物的靶细胞的细胞过程中产生改变的药物中的用途，以便在所述靶细胞的至少一部分中改变细胞内pH值，从而在所述多细胞生物的靶细胞的细胞过程中产生改变。
14.权利要求13的用途，其中所述靶细胞是细菌细胞、真菌细胞或酵母细胞。
15.权利要求13的用途，其中所述靶细胞是细菌细胞。
16.权利要求13的用途，其中所述多细胞生物是哺乳动物或高等植物。
17.权利要求13的用途，其中所述固体缓冲剂具有选自以下的一种或多种官能团：磺酸和膦酸。
18.权利要求13的用途，其中所述固体缓冲剂是磺化四氟乙烯共聚物。
19.权利要求13的用途，其中所述固体缓冲剂包括凝胶基质，所述凝胶基质选自已采用IMMOBILINETM丙烯酰胺缓冲剂适当制备的聚丙烯酰胺凝胶基质和琼脂糖凝胶基质。
20.权利要求13的用途，其中所述离子交换物质是离子交联聚合物或包含自身性离子传导聚合物。
21.权利要求13的用途，其中所述固体缓冲剂具有大于20mMH+/L/pH单位的体积缓冲容量。
22.权利要求13的用途，其中所述固体缓冲剂具有≥100mMH+/L/pH单位的体积缓冲容量。
23.权利要求13的用途，其中所述固体缓冲剂用于增强创伤敷料的抗菌活性。
24.权利要求13的用途，其中所述固体缓冲剂用于增强缝合线、布料、织物或创伤软膏的抗菌活性。
25.一种pH＜4.5或＞8的固体缓冲剂，其包含缓冲层和置于缓冲层外表面的透水层，其中所述固体缓冲剂是以下之一：(a)掺入透水聚合物基质中的阳离子型离子交换物质，和(b)掺入透水聚合物基质中的阴离子型离子交换物质和阳离子型离子交换物质，并且其中所述固体缓冲剂发挥细胞毒作用。
26.权利要求25的固体缓冲剂，其中所述透水层是开孔聚合物。
27.权利要求25的固体缓冲剂，其中所述透水层是选自以下中一种或多种的开孔聚合物：聚乙烯醇、纤维素、乙基纤维素、醋酸纤维素、聚丙烯酰胺和聚氨酯。
28.权利要求25的固体缓冲剂，其中所述靶细胞是细菌细胞、真菌细胞或酵母细胞。
29.权利要求28的固体缓冲剂，其中所述靶细胞是细菌细胞。
30.权利要求25的固体缓冲剂，其中所述体积缓冲容量大于20mMH+/L/pH单位。
31.权利要求25的固体缓冲剂，其中所述体积缓冲容量≥100mMH+/L/pH单位。
32.权利要求25的固体缓冲剂，其具有选自以下的一种或多种官能团：磺酸和膦酸。
33.权利要求25的固体缓冲剂，其中所述固体缓冲剂是磺化四氟乙烯共聚物。
34.权利要求25的固体缓冲剂，其中所述固体缓冲剂包括凝胶基质，所述凝胶基质选自已采用IMMOBILINETM丙烯酰胺缓冲剂适当制备的聚丙烯酰胺凝胶基质和琼脂糖凝胶基质。
35.权利要求25的固体缓冲剂，其中所述离子交换物质是离子交联聚合物或包括自身性离子传导聚合物。
36.权利要求25的固体缓冲剂，其中所述固体缓冲剂处于涂层、喷雾剂、膜、膜上层压物、层压物中膜、板、阴离子和阳离子珠的混合物、掺入织物中的珠、颗粒、微粒、微囊或微乳的形式。
37.固体缓冲剂在制备用于在多细胞生物的靶细胞的细胞过程中产生改变的药物中的用途，所述固体缓冲剂包含pH＜4.5或＞8的一种或多种离子交换物质，所述固体缓冲剂包含缓冲层和置于缓冲层外表面的透水层，其中所述固体缓冲剂是以下之一：(a)掺入透水聚合物基质中的阳离子型离子交换物质，和(b)阴离子型离子交换物质和阳离子型离子交换物质。
38.权利要求37的用途，其中所述靶细胞是细菌细胞、真菌细胞或酵母细胞。
39.权利要求38的用途，其中所述靶细胞是细菌细胞。
40.权利要求37的用途，其中所述多细胞生物是哺乳动物或高等植物。
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