CN101353673B - 一种利用光合细菌生产氢气的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及利用一种光合细菌生产氢气的方法。该方法包括深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)ATCC11170菌种活化；所述菌种的种子培养；所述培养菌种在光照培养室中白炽灯光下和自然光下进行发酵培养；收集氢气，直到停止产生氢气。本发明的两阶段光照培养能够明显提高光合产氢率，本发明的方法简单易行、成本低廉，具有广泛应用前景。
Description
【技术领域】
本发明涉及生物能源领域，更具体地，本发明涉及利用一种光合细菌生产氢气的方法。
【背景技术】
能源是人类生存和发展的重要物质基础。进入21世纪以来，随着我国工业化和城市化步伐加快，能源需求出现了前所未有的高增长态势，能源和环境问题已成为更多关注的焦点。实现可持续性发展，满足未来能源的需求，需要进行能源结构优化和多元化发展。可再生清洁能源的加快发展，有助于实现能源可持续发展和加强环境保护。
氢能被誉为最具有开发潜力的新型能源之一，其燃烧热值高，燃烧后无环境污染，是环境友好型的清洁能源。目前，成熟的制氢方式有电解水制氢和化石能源重整制氢，此类制氢方式依赖化石能源，不具有可持续发展性。利用光合细菌光合作用生物制氢具有反应温和、产氢速度快、产氢纯度高、能量利用率高的特点，并且还能将产氢与光能利用、有机物去除有机地耦合在一起，因此得到了越来越受到人们的重视。在光合细菌中，固氮酶是光合放氢的关键酶，黑暗条件可使固氮酶迅速失活，而氢酶会吸收固氮酶产生的氢气，重新供给固氮酶能量，不利于氢气的积累。本发明作者曾构建固氮酶失活酶(draT)和吸氢酶(hupL)基因双缺失深红红螺菌工程菌株，以期使光合细菌在昼夜更替条件下持续高效的产氢，但由于受到昼夜更替的黑暗阶段能量水平的限制，产氢效率依然较低(ZHU Ruiyan，et al.Hydrogen production by draTGBhupL doublemutant of Rhodospirillum rubrum under different light conditions.ChineseScience Bulletin.2006，51：2611-2618)。目前，对光合产氢的报道大部分集中于绿藻。光合产氢工艺优化成功的例子之一是美国加州大学伯克利分校Melis教授突破性地发现硫元素的缺乏可选择性地抑制绿藻的光合放氧，但是不会影响绿藻的呼吸作用强度，如此光合强度和呼吸强度之间的不平衡导致了体系中氧气的消耗速率大于产生速率，从而能达到氢酶基因诱导表达的无氧状态，此种方法在时间上将光合产氢与光合产氧分开，因此称为“两步光合放氢法”。其中：第一步为绿藻进行光合作用，固定二氧化碳，释放氧气并获得生物量；第二步为在缺硫厌氧环境中以诱导氢酶的高效表达，绿藻可以以每小时1.7ml/L(即每毫克叶绿素积累产氢5-7ml)的速度连续产氢70h，氢气总产量可达到120ml/L，尽管进行了工艺优化，此方法的放氢效率依然较低，每毫克叶绿素积累产氢5-7ml(Melis A，et al，Sustained photobiological hydrogen gas production uponreversible incativation of oxygen evolution in the green alga Chlamydomonasreinhardtti.Plant Physiol.2000，122(1)：127-136)。此外还有对此种方法的一些改进，产氢效率提高了1.5倍，每毫克叶绿素积累产氢7.5-11.8ml(CN200510011297.2)。但是，光质对光合细菌产氢影响的报道较少。Laurinavichene等研究发现绿藻产氢的最适光照强度为30-40Em-2s-1，最适光照强度并不依赖色素的多少。Basar Uyara研究了光波长对Rhodobacter sphaeroides O.U.001产氢的影响，发现分别滤过>760nm和<630nm的光会使Rhodobacter sphaeroides光合氢产量从1.2L/L culture降低到0.6L/L culture和1.1L/L culture，表明滤光培养后光合细菌的氢产量会有不同程度的下降(Basar Uyara，et al.Effect of light intensity，wavelength and illumination protocol on hydrogen production inphotobioreactors.Int J Hydrogen Energy.2007，4670-4677)。
因此，改变光合细菌产氢工艺提高光照条件下的产氢生产强度是提高光合细菌产氢率的一个重要途径。本发明人经过大量研究工作发现，采用两阶段光照培养方法，提高了产氢光合细菌产氢率和生产强度，获得了良好的预期产氢效果，且本发明工艺简单，成本低廉，因此，本发明的方法将在光合生物制氢领域中具有广阔的应用前景。
【发明内容】
[要解决的技术问题]
本发明的目的是提供一种利用光合细菌生产氢气的方法。
[技术方案]
本发明是通过下述技术方案实现的。
本发明涉及一种利用光合细菌生产氢气的方法，其特征在于该方法包括下述步骤：
(1)深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)ATCC11170菌种活化：将该菌种接种于SMN平板培养基上，在温度30℃下培养4-5天；
(2)所述菌种的种子培养：将步骤(1)得到的活化R.rubrum菌种接种于30-40ml SMN液体培养基中，在温度30℃与振荡速度100rpm的条件下进行避光振荡培养20-24小时；
(3)所述培养菌种的发酵培养：按4-8％(v/v)接种量将步骤(2)得到的种子培养液接入在厌氧管中的MG培养基里，接种后厌氧管顶部留有空间，以避免产生氢气后使该系统的压力骤然增高；
然后，在光照培养室中将得到的接种培养液置于白炽灯下，在温度30-32℃与厌氧管表面光照强度2500-3000lux的条件下进行培养；
(4)收集氢气，直到停止产生氢气。
根据本发明的一种优选实施方式，在光照培养室中将步骤(3)得到的接种培养液置于波长365-650nm的光下在温度30-32℃与厌氧管表面光照强度2500-3000lux的条件下进行培养0-48小时，然后在白炽灯在温度30-32℃与厌氧管表面光照强度2500-3000lux的条件下进行培养。
根据本发明的另一种优选实施方式，在光照培养室中将步骤(3)得到的接种培养液置于自然光下在厌氧管表面光照强度20000-30000lux与培养温度为28-32℃的条件下进行培养。
根据本发明的另一种优选实施方式，在光照培养室中将步骤(3)得到的接种培养液置于自然光经青蓝色玻璃滤光后的光下，在厌氧管表面光照强度为20000-30000lux与培养温度为28-32℃的条件下进行培养6-48小时，然后置于自然光下在厌氧管表面光照强度为20000-30000lux与培养温度为28-32℃的条件下进行培养。
在本发明中，所述的波长365-650nm的光是使用青蓝色玻璃作为滤波器获得的光。
所述的青蓝色玻璃具有下述特征：青蓝色玻璃厚度为0.3mm，透过波长范围为365-650nm，最高透光率为90％，在365nm和650nm处透光率为50％。
优选地，在厌氧管表面的自然光照强度是22000-28000lux。
下面将详细地说明本发明。
一种利用光合细菌生产氢气的方法，其特征在于该方法包括下述步骤：
(1)深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)ATCC11170菌种活化：将该菌种接种于SMN平板培养基上，在温度30℃下培养4-5天。
本发明使用深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)的生物学特性如下：
该菌株的细胞形态：R.rubrum细胞宽度0.8-1.0μm，长度7-10μm，弧状或螺旋状。
该菌株的培养特征：R.rubrum为光能厌氧型光合细菌，厌氧光照或黑暗好氧、微好氧条件下都可生长。好氧或微好氧液体培养物为无色或淡粉色，厌氧液体培养物开始阶段为淡粉色，随着培养时间的延长变为深红色或紫色。最适生长温度为30-35℃，最适pH范围为6.8-7.0。可同化的碳源有：部分三羧酸循环中间代谢产物、果糖、乙醇等，可利用的氮源有铵盐，谷氨酸，天冬氨酸等。
所述的SMN固体培养基制备方法如下：
按照4g/L苹果酸、1g/L氯化氨、3g/L酵母浸膏粉、3g/L酶水解酪蛋白、0.25g/L硫酸镁、10mL10％氯化钙水溶液、10mL微量元素溶液称取各个组分，然后用蒸馏水溶解，用无机碱将其溶液pH调节到6.8，再加入10mL2mol/L磷酸盐缓冲液，用蒸馏水定容到1000mL，在该液体培养基中加入1.2％(w/v)的琼脂即为SMN固体培养基。所述的琼脂、酵母浸膏粉购自北京奥博星生物技术公司，酶水解酪蛋白购自Sigma，其余试剂购自北京化学试剂公司。
得到的活化R.rubrum菌种变成深红色，菌落直径大于2mm时可用于后续步骤。
(2)所述菌种的种子培养：将步骤(1)得到的活化R.rubrum菌种接种于30-40ml SMN液体培养基中，在温度30-32℃与振荡速度90-110rpm的条件下进行避光振荡培养20-24小时，得到的种子培养液变成深红色，液体在600nm的光吸收值大于2.5后可用于后续步骤。
所述的SMN液体培养基制备方法如下：
按照4g/L苹果酸、1g/L氯化氨、3g/L酵母浸膏粉、3g/L酶水解酪蛋白、0.25g/L硫酸镁、10mL10重量％氯化钙水溶液、10mL微量元素溶液称取各个组分，然后用蒸馏水溶解，用无机碱将其溶液pH调节到6.8，再加入10mL2mol/L磷酸盐缓冲液，最后用蒸馏水定容到1000mL，然后在温度121℃下进行灭菌30min，冷却备用。
所述的无机碱例如是氢氧化钠、氢氧化钾等。
在本发明中，所述的微量元素是由0.4g柠檬酸铁、2.0g EDTA-Na2、0.28g硼酸、0.1g钼酸钠、1000mL蒸馏水组成的微量元素溶液。
所述的避光振荡培养是在具有控制温度与振荡速度和避光功能的哈尔滨东联公司生产的振荡培养箱中进行的。
(3)所述培养菌种的发酵培养：按4-8％(v/v)接种量将步骤(2)得到的种子培养液接入在厌氧管中的MG培养基里，接种后厌氧管顶部留有空间，以避免产生氢气后使该系统的压力骤然增高。
所述MG培养基的制备方法如下：按照4g/L苹果酸、1.33g/L谷氨酸钠、0.25g/L硫酸镁、10mL10％氯化钙溶液、10mL2mol/L磷酸缓冲液(单独灭菌)、10mL微量元素溶液称取各个组分，然后用蒸馏水溶解，用无机碱将其溶液pH调节到到6.8，再用蒸馏水定容到1000mL，在121℃下进行灭菌30min。
所述的无机碱例如是氢氧化钠、氢氧化钾等。
在本发明中，所述的微量元素溶液是由0.4g柠檬酸铁、2.0gEDTA-Na2、0.28g硼酸、0.1g钼酸钠、1000mL蒸馏水组成的微量元素溶液。
在本发明中使用的厌氧管是本技术领域的技术人员通常使用的厌氧管，例如首都师范大学生命科学学院以商品名厌氧培养管出售的厌氧管。
接种的厌氧管顶部必需留有一定空间体积，以避免培养期间产生的氢气使该系统的压力骤然增高，从而使培养过程能够正常地进行，例如容积为25ml装有22ml MG培养基的厌养管，接种后厌养管顶部留有空间体积约1ml。
然后，在光照培养室中将接种培养液置于白炽灯下，在温度30-32℃与厌氧管表面光照强度2500-3000lux的条件下进行培养，收集氢气，直到停止产生氢气。
白炽灯光照培养是在光照培养室中进行的，该光照培养室的温度由空调进行控制，通常将光照培养室的温度控制在22-23℃；白炽灯光照培养的光能例如是由12个60W白炽灯灯盒提供的，这些灯泡分两排，一排六个，厌养管距离白炽灯为15cm，厌养管表面光照强度为2500-3000lux，培养温度控制在30-32℃；当然，也可以采用其它能够达到本发明要求的类似装置进行光照培养，这些装置也是在本发明的保护范围内的。
(4)收集氢气
在本发明中，气体的收集使用密闭注射器，例如50ml一次性注射器收集氢气，像江西洪达医疗器械有限公司生产的密闭注射器，这种密闭注射器的特点在于不漏气，充气时注射器芯滑动灵活，始终保持密闭注射器内部压力与大气压力平衡；一旦在光照培养的厌氧管中产生氢气时，将密闭注射器针头插入厌氧管橡胶塞中，收集所产生的氢气，每隔2h记录一次注射器芯上升的高度，这样可以得到产生氢气气体的体积，读数以ml为单位，该氢气体积除以收集时间(以小时计)得到光照培养产生氢气的速度。注射器芯不被顶起时表明该厌氧管中不再产生氢气，发酵结束，从接种开始计时到发酵结束的时间为一个发酵周期。
当然，也可以采用其它能够达到本发明要求的类似装置进行氢气收集，这些装置也是在本发明的保护范围内的。
在本发明中，厌氧管中产生的氢气是采用气相色谱法进行测定的。例如使用仪器型号为Beifen SQ-206型气相色谱，热导检测器，5分子筛填充柱，柱长2m。测定条件如下：载气氩气，载气压力0.07MPa，热丝温度150℃，柱温60℃。
采用这种方式实施本发明，这种持续光照条件下的产氢率能够达到1640ml/L，即每升接种培养液产生的氢气量在1个标准大气压与温度20℃的标准条件下是1640ml。
在本发明中，可以采用多种方式实施所述接种培养液的光照培养。
根据本发明的一种优选实施方式，在光照培养室中将步骤(3)得到的接种培养液置于波长365-650nm的光下在温度30-32℃与厌氧管表面光照强度2500-3000lux的条件下进行培养0-48小时，然后在白炽灯下在温度30-32℃与厌氧管表面光照强度2500-3000lux的条件下进行培养，即所谓的先滤光培养，再白炽灯光培养。具体地，滤光培养是将厌养管置于安装有青蓝色玻璃的纸盒内，纸盒顶部可用锡箔纸覆盖，提供光能的光源通过青蓝色玻璃后提供给R.rubrum。
在本发明中，所述的波长365-650nm的光是使用青蓝色玻璃作为滤波器获得的光。
在本发明中，所述的青蓝色玻璃应该具有下述特征：青蓝色玻璃厚度一般为0.3mm，透过波长范围为365-650nm，最高透光率为90％，在365nm和650nm处的透光率为50％。
所述的透光率是指在一定波长处透射光强度与入射光强度之比，其比以百分数表示。例如在365nm的透光率50％表示透射光强度是入射光强度的50％。
采用这种方式实施本发明，在这种光照条件下的产氢率能够达到1888-2864ml/L。
因此，采用这种方式实施本发明所达到的产氢率比上述白炽灯持续光照条件下的产氢率(1640ml/L)提高15.1-76.4％。
根据本发明的另一种优选实施方式，在光照培养室中将步骤(3)得到的接种培养液置于自然光下在厌氧管表面光照强度20000-30000lux与培养温度为28-32℃的条件下进行培养。利用自然光作为光源，利用自然光昼夜更替条件下，本发明的R.rubrum光能厌氧型光合细菌进行光照培养的产氢率为1470ml/L。所述的自然光是人们熟知的太阳光。
根据本发明的另一种优选实施方式，在光照培养室中将步骤(3)得到的接种培养液置于自然光经青蓝色玻璃滤光后的光下，在厌氧管表面光照强度为20000-30000lux与培养温度为28-32℃的条件下进行培养6-48小时，然后置于自然光下在厌氧管表面光照强度为20000-30000lux与培养温度为28-32℃的条件下进行培养。
采用上述两阶段光照培养方法，在相同发酵周期内产氢率可达到1884ml/L，比昼夜更替条件下的产氢率提高28.7％。
优选地，在厌氧管表面的自然光照强度是22000-28000lux。
更优选地，在厌氧管表面的自然光照强度是24000-26000lux。
采用本发明方法制备的氢气是纯度达到98％以上的氢气，这种氢气纯度较高，只需要经过碱性溶液(如5％NaOH溶液)将少量CO2吸收即可得到高纯度氢气。
[有益效果]
本发明提供了一种采用白炽灯或自然光光照培养与两阶段光照培养光合细菌生产氢气的方法。利用白炽灯作为光源，采用两阶段光照培养工艺并控制滤光培养时间，在相同的发酵周期内R.rubrum光合细菌的产氢率1888-2864ml L-1，其产氢率比白炽灯持续光照条件下的产氢率(1640ml/L)提高15.1-76.4％。
利用自然光作为光源，利用自然光昼夜更替条件下R.rubrum产氢率为1470ml/L；采用两阶段光照培养工艺，在相同发酵周期内R.rubrum光合细菌产氢率可达到1884ml/L，比昼夜更替条件下的产氢率提高28.7％。
本发明的两阶段培养光合细菌提高光合产氢率的方法简单易行、成本低廉，具有广泛应用前景。
【附图说明】
图1是青蓝色玻璃光谱曲线特性
图中横坐标为波长，单位是nm；纵坐标为透光率，以％表示。
图2是持续光照和两阶段光照培养条件下(48h滤光培养)的光合产氢速度
图中横坐标为时间，单位是h；纵坐标为产氢率，单位是ml L-1。
图3是持续光照和两阶段光照培养条件下(48h滤光培养)R.rubrum光合细菌的产氢率
图中纵坐标为产氢率，单位是ml L-1。
【具体实施方式】
实施例
下述的实施例将更详细地说明本发明，而不限制本发明的保护范围。
实施例1：使用R.rubrum ATCC11170在白炽灯持续光照条件下制备氢气
按照下述步骤制备氢气：
(1)菌种活化：将R.rubrum ATCC11170接种于SMN平板培养基上，在30℃下培养5天；得到的活化R.rubrum菌落变成深红色，菌落直径达到2mm以上可用于后续步骤。
(2)种子培养：将步骤(1)活化的菌种接种于装有30-40ml SMN液体培养基的50ml三角瓶中，在哈尔滨东联公司生产的振荡培养箱中在30℃与振荡速度100rpm下进行避光振荡培养24h，制得种子培养液；得到的种子培养液在600nm的光吸收值大于2.5可用于后续步骤。
(3)发酵培养：使用首都师范大学生命科学学院以商品名厌氧培养管销售的容积为25ml厌氧管，按8％(v/v)的接种量将步骤(2)得到的种子液接入装有22ml MG培养基的厌氧管中，接种后厌氧管顶部留有体积约1ml的空间，以便避免产生气体后使系统的压力骤然增加。
然后，在白炽灯持续光照条件下进行光照培养，取一个首都师范大学生命科学学院以商品名厌氧培养管销售的厌氧管，往其中装入步骤(2)得到的接种培养液，将该厌氧管置于白炽灯下，进行持续光照条件，厌氧管表面光照强度为2800lux，培养温度为32℃。
(4)培养至开始产气时，将收集气体所用注射器的针头插入厌氧管橡胶塞中，针头要位于培养液液面之上。
厌氧管中产生的氢气纯度是使用仪器型号为Beifen SQ-206型气相色谱仪在下述条件下测定的：热导检测器，5
分子筛填充柱，柱长2m。测定条件如下：载气氩气，载气压力0.07MPa，热丝温度150℃，柱温60℃。氢气纯度可以达到98.7％。
观察光合放氢速度、放氢持续时间和产氢率(图2，图3)，确定在持续光照条件下的产氢率达到1640ml/L。
实施例2：使用R.rubrum ATCC11170以白炽灯作为光能来源分两阶段光照培养制备氢气(滤光培养48h)
按照下述步骤制备氢气：
本实施例按照实施例1的步骤(1)、(2)与(4)进行，而步骤(3)按照下述方式进行：
两个阶段光照培养下的光合放氢。
第一阶段是滤光培养：
首先取一个首都师范大学生命科学学院以商品名厌氧培养管销售的厌氧管，往其中装入步骤(2)得到的接种培养液，将该厌氧管封闭于装有青蓝色玻璃的纸盒内，纸盒顶部由锡箔纸覆盖，白炽灯提供光能，该青蓝色玻璃特性如前面所述，在安装有青蓝色玻璃的纸盒表面光照强度为2800lux与温度32℃下培养时间48h；
第二阶段是在白炽灯光照条件下光照培养：
上述接种培养液在滤光培养48h后，去掉青蓝色玻璃，将该厌氧管在白炽灯光下继续光照培养，厌氧管表面光照强度为2600lux，培养温度为32℃。
通过上述的气相色谱分析测定氢气纯度可达到99.5％，在上述条件下的产氢率可以达到2464ml L-1。
实施例3：使用R.rubrum ATCC11170以白炽灯作为光能来源分两阶段光照培养制备氢气
按照下述步骤制备氢气：
本实施例按照实施例1的步骤(1)、(2)与(4)进行，而步骤(3)按照下述方式进行：
在不同滤光培养时间后两阶段光照培养下的光合放氢。
第一阶段是滤光培养：
首先取一个首都师范大学生命科学学院以商品名厌氧培养管销售的厌氧管，往其中装入步骤(2)得到的接种培养液，将接种后的厌氧管置于装有青蓝色玻璃的纸盒内，纸盒顶部由锡箔纸覆盖，白炽灯提供光能，在安装有青蓝色玻璃的纸盒表面光照强度为2800lux与培养温度为32℃下进行滤光培养6h、12h、24h；
第二阶段是白炽灯光照条件下光照培养：
在上述滤光培养6h、12h、24h后，去掉青蓝色玻璃，将该厌氧管在白炽灯光下继续光照培养，厌氧管表面光照强度为2700lux，培养温度为32℃。
通过上述的气相色谱分析测定，在滤光培养6h、12h、24h后然后在持续光照下培养，氢气纯度分别可达到99.2％，98.9％和99.7％，在上述条件下的产氢率结果列于表1中，这些结果表明两阶段光照培养中第一阶段滤光培养6-24h都能提高光合产氢率。
表1不同滤光时间下两阶段光照
培养R.rubrum产氢率比较
实施例4：使用R.rubrum ATCC11170以白炽灯作为光能来源滤光培养制备氢气
按照下述步骤制备氢气：
本实施例按照实施例1的步骤(1)、(2)与(4)进行，而步骤(3)按照下述方式进行：
首先取一个首都师范大学生命科学学院以商品名厌氧培养管销售的厌氧管，往其中装入步骤(2)得到的接种培养液，将接种后的厌氧管封闭于装有青蓝色玻璃的纸盒内，纸盒顶部由锡箔纸覆盖，白炽灯提供光能，培养温度为32℃；在整个培养周期(125h)中，细胞生长良好，但没有产气现象的发生。
实施例5：使用R.rubrum ATCC11170以白炽灯作为光能来源分两阶段光照培养制备氢气
按照下述步骤制备氢气：
本实施例按照实施例1的步骤(1)、(2)与(4)进行，而步骤(3)按照下述方式进行：
利用自然光的两个阶段光照培养制备氢气。
第一阶段是滤光培养：
首先取一个首都师范大学生命科学学院以商品名厌氧培养管销售的厌氧管，往其中装入步骤(2)得到的接种培养液，将接种后的厌氧管置于光照强度约为28000lux的温室内培养。
将接种后的厌氧管分别进行自然光照和由自然光提供光能使用青蓝色玻璃作为滤光片的滤光培养，在自然光光照条件下厌氧管表面光照强度为28000lux，培养温度为30℃；由自然光提供光能的滤光培养是将接种后的厌氧管置于镶嵌有青蓝色玻璃的纸盒内，纸盒顶部使用锡箔纸覆盖，光合细菌生长和产氢所需要的光能通过青蓝色玻璃提供，安装有青蓝色玻璃的纸盒表面光照强度为28000lux，培养温度为30℃。
第二阶段是自然光光照培养：
在第一阶段培养48h后，将滤光培养的厌氧管从纸盒中取出，接受自然光光照培养，其厌氧管表面光照强度为28000lux，培养温度为30℃。
通过气相色谱分析测定，该条件下氢气纯度可达到98.1％，在自然光昼夜更替条件下培养的R.rubrum的光合产氢率为1470ml/L；而利用自然光作光源，在滤光培养与自然光两个阶段在自然光照培养条件下的产氢率为1884ml/L。由此可见，在自然光昼夜更替的条件下，R.rubrum的产氢率比昼夜更替条件下的产氢率提高28.7％。
Claims (2)
1.一种利用光合细菌生产氢气的方法，其特征在于该方法包括下述步骤：
(1)深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)ATCC11170菌种活化：将该菌种接种于SMN平板培养基上，在温度30℃下培养4-5天；
所述SMN平板培养基的制备方法是按照4g/L苹果酸、1g/L氯化氨、3g/L酵母浸膏粉、3g/L酶水解酪蛋白、0.25g/L硫酸镁、10mL 10％氯化钙水溶液、10mL微量元素溶液称取组分，然后用蒸馏水溶解，用无机碱将其溶液pH调节到6.8，再加入10mL 2mol/L磷酸盐缓冲液，用蒸馏水定容到1000mL，在该液体培养基中加入1.2％w/v的琼脂；
(2)所述菌种的种子培养：将步骤(1)得到的活化R.rubrum菌种接种于30-40ml SMN液体培养基中，在温度30-32℃与振荡速度90-110rpm的条件下进行避光振荡培养20-24小时；
所述SMN液体培养基的制备方法是按照4g/L苹果酸、1g/L氯化氨、3g/L酵母浸膏粉、3g/L酶水解酪蛋白、0.25g/L硫酸镁、10mL 10重量％氯化钙水溶液、10mL微量元素溶液称取组分，然后用蒸馏水溶解，用无机碱将其溶液pH调节到6.8，再加入10mL 2mol/L磷酸盐缓冲液，最后用蒸馏水定容到1000mL，然后在温度121℃下进行灭菌30min；
(3)所述培养菌种的发酵培养：按4-8％v/v接种量将步骤(2)得到的种子培养液接入在厌氧管中的MG培养基里，接种后厌氧管顶部留有空间，以避免产生氢气后使该系统的压力骤然增高；
所述MG培养基的制备方法是按照4g/L苹果酸、1.33g/L谷氨酸钠、0.25g/L硫酸镁、10mL 10％氯化钙溶液、10mL 2mol/L磷酸缓冲液、10mL微量元素溶液称取各个组分，然后用蒸馏水溶解，用无机碱将其溶液pH调节到6.8，再用蒸馏水定容到1000mL，在121℃下进行灭菌30min；
在光照培养室中将上述步骤得到的接种培养液置于自然光经青蓝色玻璃滤光后的光下，在厌氧管表面的光照强度为20000-30000lux与培养温度为28-32℃的条件下进行培养6-48小时，然后置于自然光下在厌氧管表面光照强度为20000-30000lux与培养温度为28-32℃的条件下进行培养；
(4)收集氢气，直到停止产生氢气。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的青蓝色玻璃具有下述特征：青蓝色玻璃厚度为0.3mm，透过波长范围为365-650nm，最高透光率为90％，在365nm和650nm处透光率为50％。
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