CN101353628A - 一种蛹虫草可育菌株的快速鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种蛹虫草可育菌株的快速鉴定方法，属于食用菌栽培领域。将子囊孢子萌发的单个菌落挑入，每次挑100个单个菌落置20℃恒温下培养16天，室内自然光线，空气湿度70％，将草牙数量达20根以上、生长整齐，菌落呈现淡黄色，草牙金黄色，长势均匀、健壮无畸形的菌株挑出，再经显微镜检确认即得可育菌株。可育菌株经扩种培养一次，扩种菌株用液体培养基繁殖5～8天，液体中形成的菌丝球即成生产用种。本发明方法具有鉴定时间短、准确性高。从菌落挑选培养到鉴定结果只需20天，可为虫草生产多赢得二代适宜的生产周期，进一步降低生产成本，加快生产速度，提高蛹虫草质量和产量。
Description
一、技术领域
本发明涉及一种蛹虫草可育菌株的快速鉴定方法，属于食用菌栽培领域。包括蛹虫草的繁种筛选和鉴定新技术，以此鉴定方法可以去除不结实菌株，获得完全长草的子一代菌株，此技术具有新颖性、实用性和创造性。
二、背景技术
食用菌产业在我国已列入粮、棉、油、果、茶、食用菌的六大产业之一。目前年生产能力达1600万吨以上，出口量达800万吨。我国已成为世界食用菌生产大国，药用菌(或称保健功能菌)是近十年来我国新发展起来的食用菌产业，其市场需求量大，栽培量逐年递增，但是栽培技术上存在的问题很大程度上限制了栽培规模。
蛹虫草[Cordyceps militaris(L)Link]又称为北虫草、北冬虫夏草，隶属于真菌界的子囊菌门(Ascomycota)、肉座菌目(Hypocreales)、麦角菌科(Clavicipitaceae)，是虫草属的模式种、与冬虫夏草同属异种。蛹虫草菌在鳞翅目昆虫上的子座与虫体的药用价值与冬虫夏草(Cordycepssinensis)相似，是我国极有开发价值的药用滋补性真菌，可以作为冬虫夏草的代用品。近年来，随着研究人员对蛹虫草的滋补保健功效和多种药用价值的认识，其开发利用研究倍受关注，并在药理、有效成分及人工栽培等各方面取得了很大的进展。
本发明的目的是提供一种食用菌品种——蛹虫草在栽培过程中可育性菌株的快速鉴定和利用的新方法。该方法具有准确度高、操作简便、快速高效的特点，并能降低生产成本，生产厂家易于接受，在本专业内能快速推广，此发明方法经生产上的使用效果表明，达到了专利中所要求的新颖性，实用性和创造性的要求。
三、发明内容
技术问题
本发明针对现有蛹虫草栽培和菌种繁殖技术中急需解决的种性不稳定、易于退化不育、子实体畸形和产量下降的问题，提供一种蛹虫草的可育性菌株的快速筛选、鉴定和生产使用的方法，解决生产中极易出现的菌株不育和畸形菇多的问题，为我国蛹虫草的产业化栽培提供高产高效的技术支撑。
技术方案
一种蛹虫草可育菌株的快速鉴定方法，其特征在于：
1)配制蛹虫草成熟的子囊孢子固体培养基：在1000ml的水中，加入琼脂20克、马龄薯200克、牛奶20克、蛋白胨5克、葡萄糖20克、磷酸二氢钾2克、硫酸镁2克和维生素B150毫克；
2)收集成熟的蛹虫草子囊孢子，将其撒落步骤1)配制的子囊孢子固体培养基表面，置20℃恒温中培养，3天后孢子萌发形成菌落，从中挑出子囊孢子萌发的单个菌落再放入步骤1)配制的子囊孢子固体培养基中培养，每批次挑100个单个菌落置20℃恒温下培养，室内自然光线，空气湿度70％，经16天培养，菌丝长出并转为淡黄色，并形成密集的、幼嫩的草牙时进行筛选；
3)按照中华人民共和国农业部行业标准NY/T 1098-2006食用菌品种描述技术规范，从以上100个菌落培养基中将长出的草牙数20根以上、长度2毫米、草牙金黄色，长势健壮；菌丝前端生长整齐、菌落呈现淡黄色的菌株选出，再经显微镜检确认，从显微镜中看到长出的草牙数20根以上、长度2毫米，草牙金黄色、健壮、整齐、向上无畸型的菌株，即为所获得的蛹虫草可育菌株。
以上获得的蛹虫草可育菌株的应用，包括：将蛹虫草可育菌株经液体培养基扩种繁殖培养2次，液体培养基的配方为：白糖100克、蛋白胨30克、硫酸美5克、磷酸二氢钾10克、维生素B1200毫克(20片，每片10毫克)、玉米淀粉50克、食用油1ml、水5000克；液体培养期5～8天，液体中菌丝球形成后即成为生产用种。
有益效果
蛹虫草是目前世界上唯一可人工栽培的虫生子囊菌品种，但是遗传背景复杂，种性不稳定，极易受环境的影响，经孢子或子实体分离的菌丝，经人工培养基培养后，在菌种的扩繁和保存过程中，菌丝变异，可育性丧失。种性的不稳定造成了生产的不稳定性，生产中常出现菌丝培养后不转色、不长草或是畸型草的现象，产量难以稳定，品质参差不齐，这一问题成为蛹虫草产业发展的瓶颈。生产者难以鉴别蛹虫草菌种的可育性，每年购买的菌种都需经过出草试验的鉴定，这种鉴定方法时间长、成本高，在鉴定过程中耗用了一个生产周期，同时增加了生产成本，如是购买了不可育菌株则失去了全年的生产时机，蛹虫草可育菌株的快速鉴定方法恰恰解决了这一生产中的关键难题，推动了蛹虫草产业的快速发展。
为解决蛹虫草种性不稳定、生产用种易于退化的问题，许多食用菌研究人员选用采集野生种的方式来解决种子育性问题，但野生种的生长期受到季节和自然中多因素的限制，即使采到后也须经出菇观察和验正后才能投入生产，因此野生种源也不能作为稳定和快速有效的可育性菌株的筛选方法。另一种是用组织分离的方式进行可育菌株的筛选，组织分离面临着菇体中可育性部位寻找，并需经出菇试验后确定的问题，这两种可育性菌株的筛选方法，所用时间长、成本高、难以操作。本项发明方法，解决了野生分离和组织分离中的时间长、成本高、操作难、效果差的问题。
本项发明的蛹虫草菌株可育性鉴定时间为20天，筛选出的菌株出草率100％，草体整齐、产量稳定。经多点试验和示范均得到了一致性的结果。经在江苏铜山、张家港、丹阳，浙江金华，河北石家庄，四川，重庆等地进行试验示范，筛选出的菌株出草率100％，草体整齐、产量稳定(表1)。
四、具体实施方式
一种蛹虫草可育菌株快速鉴定及利用方法，具体的实施方案为，
1.配制蛹虫草子囊孢子固体培养基：在1000ml的水中，加入琼脂20克、马龄薯200克、牛奶20克、蛋白胨5克、葡萄糖20克、磷酸二氢钾2克、硫酸镁2克和维生素B150毫克。这些营养能促进菌丝中分生孢子生长，在短时间内诱导蛹虫草子实体形成和成长。
2.收集成熟的蛹虫草子囊孢子，将其撒落于上述配制的固体培养基表面，培养基置20℃恒温中培养，3天后孢子萌发形成菌落，从中挑出子囊孢子萌发的单菌落再放入上述固体培养基中培养，每批次挑100个单菌落置20℃恒温下培养，室内自然光线，空气湿度70％，经5天培养，菌丝长出并转为淡黄色，经10天培养，在原菌落周围出现子实体原基，经16天培养后，子实体长成。
3.按照中华人民共和国农业部行业标准NY/T 1098-2006食用菌品种描述技术规范，从以上100个菌落培养基中将长出的草牙数20根以上、长度2毫米、草牙金黄色，长势健壮；菌丝前端生长整齐、菌落呈现淡黄色的菌株选出，再经显微镜检确认，从显微镜中看到长出的草牙数20根以上、长度2毫米，草牙金黄色、健壮、整齐、向上无畸型的菌株，即为所获得的蛹虫草可育菌株。筛选出的菌株经低温保存待用或立即用于扩种，供大面积生产所用。本项发明的蛹虫草菌株可育性鉴定时间为20天，筛选出的菌株出草率100％，草体整齐、产量稳定。
4.本方法筛选和鉴定的菌株经液体培养基扩种培养2次，液体培养基的配方为：白糖100克、蛋白胨30克、硫酸美5克、磷酸二氢钾10克、维生素B120片(每片10毫克)、玉米淀粉50克、食用油1ml、水5000克。液体培养期5～8天，液体中菌丝球形成后即可成为生产用种。
上述生产用种时在每瓶栽培基质中接入4ml菌液，经10～15天菌丝培养即转为子实体生长期，栽培瓶中成长的子实体与筛选菌株性状一致，草体生长整齐，产量稳定。
上述可育菌株的示范应用
利用本方明的方法筛选出的菌株经多点试验和示范均得到了一致性的结果。经在江苏铜山、张家港、丹阳，浙江金华，河北石家庄，四川，重庆等地进行试验示范，取得了大量可靠数据，现将这些数据整理如下：
表1蛹虫草出草示范
| 处理 | 品种 | 菌丝性能 | 发菌天数 | 转色天数 | 生产周期(天数) | 出草率(％) | 生物效率(％) |
| 江苏铜山 | 蛹草5号 | 正常发菌 | 12 | 2～3 | 52 | 96 | 65 |
| 江苏张家港 | 蛹草5号 | 正常发菌 | 13 | 2～3 | 55 | 98 | 62 |
| 江苏丹阳 | 蛹草5号 | 正常发菌 | 12 | 2～3 | 53 | 96 | 57 |
| 浙江金华 | 蛹草5号 | 正常发菌 | 13 | 2～3 | 54 | 97 | 61 |
| 河北石家庄 | 蛹草5号 | 正常发菌 | 13 | 2～3 | 54 | 98 | 62 |
| 四川成都 | 蛹草5号 | 正常发菌 | 13 | 2～3 | 55 | 99 | 61 |
Claims (2)
1.一种蛹虫草可育菌株的快速鉴定方法，其特征在于：
1)配制蛹虫草成熟的子囊孢子固体培养基：在1000ml的水中，加入琼脂20克、马龄薯200克、牛奶20克、蛋白胨5克、葡萄糖20克、磷酸二氢钾2克、硫酸镁2克和维生素B150毫克；
2)收集成熟的蛹虫草子囊孢子，将其撒落步骤1)配制的子囊孢子固体培养基表面，置20℃恒温中培养，3天后孢子萌发形成菌落，从中挑出子囊孢子萌发的单个菌落再放入步骤1)配制的子囊孢子固体培养基中培养，每批次挑100个单个菌落置20℃恒温下培养，室内自然光线，空气湿度70％，经16天培养，菌丝长出并转为淡黄色，并形成密集的、幼嫩的草牙时进行筛选；
3)按照中华人民共和国农业部行业标准NY/T 1098-2006食用菌品种描述技术规范，从以上100个菌落培养基中将长出的草牙数20根以上、长度2毫米、草牙金黄色，长势健壮；菌丝前端生长整齐、菌落呈现淡黄色的菌株选出，再经显微镜检确认，从显微镜中看到长出的草牙数20根以上、长度2毫米，草牙金黄色、健壮、整齐、向上无畸型的菌株，即为所获得的蛹虫草可育菌株。
2.权利要求1所获得的蛹虫草可育菌株的应用，其特征在于：将权利要求1所述的蛹虫草可育菌株经液体培养基扩种繁殖培养2次，液体培养基的配方为：白糖100克、蛋白胨30克、硫酸美5克、磷酸二氢钾10克、维生素B1200毫克、玉米淀粉50克、食用油1ml、水5000克；液体培养期5～8天，液体中形成的菌丝球即成为生产用种。
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