CN101351226A

CN101351226A - 针对抑制viii因子的抗体的细胞毒性抗体

Info

Publication number: CN101351226A
Application number: CNA2006800499244A
Authority: CN
Inventors: 克里斯蒂安·贝朗; 克里斯蒂娜·戈谢; 克里斯托夫·德罗莫夫
Original assignee: Universite de Montpellier I
Current assignee: Universite de Montpellier I; LFB Biotechnologies SAS
Priority date: 2005-11-02
Filing date: 2006-11-02
Publication date: 2009-01-21
Also published as: US8038993B2; EP2389954A1; JP2009514516A; EP1973568A1; US20110274684A1; WO2007051926A1; US20090130094A1; KR20080099231A; AU2006310396A1; IL191150A0; FR2892724A1; BRPI0619709A2; FR2892724B1; CA2638166A1

Abstract

本发明涉及靶向抑制人VIII因子的抗体的抗独特型抗体，所述抑制性抗体靶向人VIII因子的C2区，其每一轻链的可变区由与鼠科动物核苷酸序列SEQ ID NO：1具有至少70％一致性的核苷酸序列编码，其每一重链的可变区由与鼠科动物核苷酸序列SEQ ID NO：2具有至少70％一致性的核苷酸序列编码，其轻链和重链的恒定区为来源于非鼠科动物种的恒定区。本发明还涉及所述抗体对激活细胞毒免疫细胞的 FcγRIII受体的应用，并涉及特别用于治疗A型血友病的药物的生产。

Description

针对抑制VIII因子的抗体的细胞毒性抗体

技术领域

本发明涉及针对抑制人VIII因子的抗体的抗独特型抗体，所述抑制性抗体靶向人VIII因子的C2区，所述抗体的每条轻链的可变区的核苷酸编码序列与鼠科动物的核苷酸序列SEQ ID NO：1具有至少70％的一致性，所述抗体的每条重链的可变区的核苷酸编码序列与鼠科动物的核苷酸序列SEQ ID NO：2具有至少70％的一致性，所述抗体的轻链恒定区和重链恒定区来源于非鼠科种的恒定区，本发明还涉及所述抗体在激活细胞毒免疫细胞的FcγRIII受体，以及生产药物，特别是用于治疗血友病的药物中的应用。

背景技术

A型血友病是与X染色体异常连锁的遗传性疾病，其导致受损伤之处血液不能凝集。A型血友病是最常见的影响血液凝集的缺陷症；在法国，每5000人中就有1人罹患，其占血友病病人的80％。该病是有关凝集的蛋白，因子VIII(FVIII)的基因变异所致，其既可以由于血液中完全缺乏FVIII，也可以是FVIII的部分缺陷。

血友病病人的20％罹患血友病的另一类型，血友病B；其由另一凝血因子，IX因子的缺陷引起。

当前的血友病治疗(A型或B型)包括以静脉途径给药缺陷或缺失的凝血因子。在法国，意在治疗A型血友病病人的FVIII可以以来源于血液的药物的形式获得，所述血液由法国血液分割暨生化制品实验室(Laboratoire Francais du Fractionnement et des Biotechnologies)(LFB)或国际药物实验室供应，还可以以来自于基因工程的重组药物的形式获得。事实上，已分离到编码FVIII的DNA，并已在哺乳动物细胞中表达(Wood等人，Nature(1984)312：330-337)，并且已根据cDNA推断出其氨基酸序列。

分泌出的FVIII是分子量为300Kda(2332个氨基酸)的糖蛋白，其在内源性凝血通路中扮演重要的角色。无活性的FVIII由六个结构域组成：从N末端到C末端为，A1(1-372残基)、A2(373-740残基)、B(741-1648残基)、A3(1690-2019残基)、C1(2020-2172残基)和C2(2173-2332残基)。分泌后，FVIII与温韦伯氏因子(von Willebrand factor，vWF)相互作用，vWF保护FVIII不受血浆蛋白酶作用。经凝血酶切割后，FVIII从vWF上解离。切割使B区被排除，并形成异源二聚体。FVIII以该形式在血浆中循环。该异源二聚体由一重链(A1、A2)和一轻链(A3、C1、C2)组成。

当将FVIII灌输入血友病患者体内时，其与患者血液循环中的vWF结合。激活的FVIII作为激活的IX因子的辅助因子起作用，IX因子加速X因子到活性X因子的转换。激活的X因子使凝血酶原转换成凝血酶。之后凝血酶使纤维蛋白原转换成纤维蛋白，并出现凝集。

在给药FVIII中出现的主要问题是在患者体内出现抗FVIII的抗体，其被称为“抑制性抗体”。这些抗体中和FVIII的促凝活性，导致当抗体一经灌注，FVIII就被灭活。因此，在能够抑制出血之前，所应用的凝血因子就被破坏，其中出血导致了一系列的血友病并发症，使治疗失去了效力。而且，某些非遗传性血友病患者可以产生抗内源性FVIII的抑制剂：其为获得性的血友病。

研究显示，抗FVIII免疫应答是多克隆的，主要针对A2和C2结构域(Gilles JG等(1993)Blood；82：2452-2461)。为研究FVIII抑制剂的形成，建立了动物模型；用重组人FVIII免疫的大鼠显示出快速的多克隆型的免疫应答(Jarvis等Thromb Haemost.1996Feb；75(2)：318-25)。

抗FVIII的抑制性抗体干扰FVIII功能的机制有许多，包括干扰FVIII的蛋白裂解，及干扰FVIII与不同伴侣如vWF、磷脂(PL)、IX因子、活性X因子(FXa)或APC(活化蛋白C)的相互作用。

有几种治疗可以减轻这种免疫应答的后果，例如包括涉及去氨加压素，其是刺激FVIII产生的合成激素、诸如促进血栓形成复合物(prothrombic complex)的浓缩物或激活的促进血栓形成复合物的浓缩物的促进凝集的因子、重组VIIa因子，对大量或中间量的FVIII进行血浆除去并灌注的治疗。但是这些方法仍然成本昂贵，不是非常有效率。

另外，就在最近，应用抗独特型抗体中和抑制性抗体在战略上受到青睐(Saint-Rémy JM等(1999)Vox Blood；77(suppl 1)：21-24)。鼠科动物抗独特型单克隆抗体，14C12，见于WO 2004/014955中的描述，在体内以剂量依赖模式对抑制人FVIII的抗体的抑制特性进行中和。但是，这些抗体只进行抗体的中和作用。它们对抑制性抗体的分泌上游没有影响。

因此，非常需要新的治疗工具，使得既能够中和循环中的抑制性抗体又能够对抑制性抗体的分泌上游进行作用以使其减少。

本申请人开发出了新的工具，其可用于治疗血友病A，既作用于分泌出的抑制性抗体，又作用于分泌抑制FVIII的抗体的浆细胞的前体的上游，特别是记忆性B细胞。

发明内容

本申请人开发出了新的细胞毒性抗独特型抗体，所述抗体针对抑制FVIII的抗体，使得既能够通过结合这些循环抑制性抗体而中和它们，也能够通过ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒)机制引起它们的溶解作用于作为产生这些抑制性抗体的浆细胞的来源的记忆性B细胞。

抗独特型抗体是指具有与其他抗体的可变区相互作用的能力的抗体。

根据本发明的抗独特型细胞毒性抗体针对结合任何人FVIII结构域，例如A1结构域、A2结构域、B结构域、A3结构域或者还有C1结构域的任何抑制性抗体。根据本发明的优选的抗独特型抗体是针对结合至FVIII的C2结构域的抑制性人抗体。

FVIII的C2结构域包括磷脂(PL)结合位点，和主要的温韦伯氏因子(vWF)结合位点。磷脂的结合对于FVIII的生理活性，特别是与IX因子(FIX)和X因子(FX)形成特纳斯(tenase)复合物是必不可少的。vWF作为伴侣蛋白，保护FVIII不被早期降解和清除。针对FVIII的C2结构域的FVIII抑制性抗体是在发生抑制性抗体的病人中最常遇见的抑制剂。根据本发明的靶向针对FVIII C2结构域的抑制性抗体的优选抗独特型抗体是特别有益的，因为它们能够影响大多数发生有抑制性抗体的A型血友病患者。

因此，本发明的目的之一涉及针对抑制人FVIII的抗体的抗独特型单克隆抗体，该抑制性抗体针对人FVIII的C2区，根据本发明的该抗独特型单克隆抗体的每条轻链的可变区由具有与鼠科动物核苷酸序列SEQ IDNO：1至少为70％的一致性的核苷酸序列编码，每条重链的可变区由具有与鼠科动物核苷酸序列SEQ ID NO：2至少为70％的一致性的核苷酸序列编码，并且其轻链和重链的恒定区为来源于非鼠科种的恒定区。

有利地，序列的一致性至少为70％，优选至少为80％，更优选至少为95％或至少99％的一致性。通过将2个待比较的序列进行比对，并计算具有一致核苷酸的位置的数量，该数量除以序列中核苷酸的总数，计算出一致性百分比。遗传密码的简并性可以是由于同样的氨基酸可以由几个不同的核苷酸三联子密码编码。在任何情况下，这些序列的不同不影响单克隆抗体对靶的特异性，也不影响其通过结合目标抑制性抗体而中和它们的抑制活性。优选地，根据本发明的抗体对其靶的亲和性是一致的或几乎一致。

出于本发明的目的，等价的表述“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指具有一致而独特的特异性的抗体分子制剂。

根据本发明的抗独特型单克隆抗体，其轻链和重链的可变区属于的种不同于其轻链和重链的恒定区属于的种，这种抗体被定义为“嵌合”抗体。

可以使用本领域技术人员已知标准的重组DNA技术构建根据本发明的抗独特型嵌合抗体，更具体地，使用例如Morrison等人在Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，81，：6851-55(1984)中所描述的嵌合抗体构建技术，其中使用重组DNA技术用相对应的人免疫球蛋白区域替换来源于非人哺乳动物的抗体的轻链的恒定区和/或重链的恒定区。这种抗体以及它们的制备方法也可见于例如专利公开出版物EP 173494，Neuberger，M.S等人Nature 312(5995)：604-8(1985)的文献，以及专利文献EP 125023中的描述。

鼠科动物核苷酸序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2分别编码由鼠科动物杂交瘤细胞14C12产生的抗体的每条轻链的可变区和每条重链的可变区，自2002年6月30日从比利时微生物协作保藏中心(BelgianCoordinated Collections of Microorganisms)(BCCM)，LMBP(plasmidcollection，Laboratorium voor Moleculaire Biologie，Universiteit，K.L.Ledeganckstraat 35，9000Gent，Belgium)可获得该杂交瘤，保藏号为LMBP5878CB。克隆14C12已在文献WO 2004/014955中描述。选择鼠科动物抗体14C12的序列以编码根据本发明的抗体的可变区，或编码具有与这些序列至少70％，有利地至少80％，更有利地至少90％或至少99％的一致性的衍生序列，这是由于鼠科动物抗体14C12的可变区具有大量的优点，见于文献WO 2004/014955的描述。鼠科动物抗体14C12的第一个优点是其结合针对FVIII的C2结构域的抑制性抗体，抗体BO2C11的能力，抗体BO2C11是对FVIII具有特异性的人单克隆抗体，其来源于发生抑制因子的患者的天然库(Jacquemin et al.(1998)，Blood 92：496-506)，以及以剂量依赖形式抑制循环抑制性抗体与其靶目标，FVIII的C2结构域的结合的能力。在文献WO 01/04269中描述了BO2C11抗体的轻链和重链可变区的核苷酸和肽序列。而且，鼠科动物抗体14C12具有以剂量依赖形式中和BO2C11抗体的抑制特性的能力。而且还显示出，用抑制多克隆FVIII的抗体观察，抗体抑制鼠科动物抗体14C12在体外中和FVIII抑制活性的60％。用来源于不同于产生BO2C11克隆的患者的其他患者的多克隆抗体观察，鼠科动物抗体14C12在体外还显著地中和FVIII抑制活性，这显示鼠科动物抗体14C12识别通常表达于针对FVIII的C2结构域的人抗体之上的抗原决定簇。关于鼠科动物抗体14C12的体内特性，在注射了重组人FVIII和抑制性抗体BO2C11的FVIII-/-C57B1/6小鼠中显示，鼠科动物抗体14C12以剂量依赖形式中和BO2C11抗体的抑制特性，因此验证了鼠科动物抗体14C12在治疗发生了针对FVIII C2结构域的抑制因子的A型血友病患者中的用途。而且，鼠科动物抗体14C12与BO2C11抗体以高亲和力结合，其k_on(开)和k_off(关)值分别为10⁵M^-1s^-1和10^-5s^-1。而且显示出，鼠科动物抗体14C12的重链可变部分既包括由13个一致或同源的氨基酸构成的C2结构域的内部图象，还包括几个对于BO2C11可变区的接触残基。最后，显示出鼠科动物抗体14C12不抑制FVIII与vWF或PL的结合。因此，将鼠科动物抗体14C12给药于发生有针对FVIII的C2结构域的抑制性抗体的A型血友病患者不引起对FVIII功能特性的不良抑制。有利地，根据本发明的抗独特型单克隆抗体具有与14C12抗体可变区有关的所有优点。

根据本发明的抗体还具有属于非鼠科动物种的轻链和重链的恒定区。基于该点考虑，可以使用非鼠科哺乳动物的所有科和种，特别是，例如，人、猴、鼠科动物(muridae)(小鼠除外)、猪科、牛科、马科、猫科、犬科，还有鸟类，该列举是非穷尽性的。

优选地，本发明抗独特型抗体每一轻链的可变区由鼠科动物核苷酸SEQ ID NO：1编码，其每一重链可变区由鼠科动物核苷酸SEQ ID NO：2编码，其轻链和重链的恒定区是来源于非鼠科动物种的恒定区。

有利地，通过细胞以抗体组合物的形式生产根据本发明的抗独特型单克隆抗体，出现在抗体的Fc区糖基化位点上的聚糖结构的海藻糖水平/半乳糖水平比率小于或等于0.6。“Fc区糖基化位点”是指天冬酰胺297(Asn 297，Kabat编码)，其带有N-糖基化位点。事实上，抗体Fc恒定区由2个命名为CH2和CH3的球形结构域组成。2个重链在CH3结构域的水平面上紧密作用，而在CH2结构域的水平面上，在2条链中的每条链上与Asn 297结合的双角型N-聚糖(biantenna-type N-glycan)的存在使2个结构域分离。因此，在本发明的实践中，由抗体组合物上存在的所有糖基化位点携带的聚糖结构具有小于或等于0.6的海藻糖水平/半乳糖水平比率，在专利申请FR 03 12229中显示，这对于抗体获得强力的ADCC活性(抗体依赖性细胞介导的细胞毒)是最佳的。根据本发明的抗独特型抗体对于通过其Fc区激活细胞毒效应细胞的Fc受体，特别是FcγRIIIA受体(也称为CD16)，其为激活细胞毒效应细胞的受体具有升高的激活能力的特点和优势。能够被根据本发明的抗独特型单克隆抗体激活的效应细胞是，例如NK(天然杀伤)细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、CD8淋巴细胞、Tγδ淋巴细胞、NKT细胞、嗜酸性细胞、嗜碱细胞或肥大细胞。优选地，根据本发明的抗独特型抗体能够召集NK细胞。已显示根据本发明的抗独特型单克隆抗体为细胞毒性的。其可以经其Fc区召集效应细胞，效应细胞消灭在表面携带有根据本发明的抗独特型抗体靶目标的细胞。

因此，根据本发明的抗体可以消灭在表面表达有FVIII抑制性抗体的细胞，该细胞是分泌FVIII抑制抗体的淋巴细胞的前体，特别是记忆性B细胞。

优选地，靶细胞是记忆性B细胞。

因此，根据本发明的抗独特型单克隆抗体在一方面通过与FVIII抑制性抗体的独特位(idiotope)结合将抑制所述FVIII抑制性抗体的结合，在另一方面，引起在表面表达有靶抑制性抗体的记忆性B细胞和分泌所述抑制性抗体的淋巴细胞的前体细胞的裂解，这两个效应参与了降低由血友病患者产生的FVIII抑制性抗体的抑制效应。

优选地，本发明的抗独特型抗体所针对的抗FVIII抑制性抗体为BO2C11抗体。该抗体为对来源于具有抑制因子的A型血友病患者天然库的FVIII具有特异性的人IgG4κ单克隆抗体(Jacquemin MG等(1998)Blood 92：496-506)。BO2C11抗体识别C2结构域，并抑制FVIII与vWF以及磷脂(PL)的结合，该作用机制是在具有FVIII C2结构域特异性的抑制性抗体的患者中最为常见的。而且，通过Fab片段和C2结构域的晶体的X光分析已鉴定了BO2C11抗体与C2结构域的精确结合位点(Spiegel PC等(2001)Blood 98：13-19)。在自2000年的文献WO 01/04269中描述了BO2C11抗体的重链和轻链可变区的氨基酸和核苷酸序列。

因此，根据本发明的抗独特型抗体识别循环的BO2C11抗体，以及位于BO2C11记忆性B细胞克隆表面的膜表面抗体BO2C11(BCR)。根据本发明的抗独特型抗体因此在一方面通过结合而中和了循环中的抗体，在另一方面结合膜表面免疫球蛋白，之后通过细胞毒细胞的Fc受体在根据本发明的抗体Fc区和这些细胞毒细胞之间进行结合。根据本发明的抗体因此参与了在表面表达免疫球蛋白BO2C11的记忆性B细胞的裂解。

优选地，根据本发明的抗独特型抗体的每一轻链和每一重链的恒定区为人恒定区。本发明的该优选实施方案可以减少抗体在人体内的免疫原性，由此更加提高其在对人的给药治疗过程中的效率。

在本发明的一个优选实施方案中，根据本发明的抗体的每一轻链的恒定区为κ(kappa)型。任何的同种异型都适宜于实施本发明，例如，Km(1)、Km(1，2)、Km(1，2，3)或(3)，但是优选的同种异型是Km(3)。

在另一个补充的实施方案中，根据本发明的抗体的每一轻链的恒定区为λ(lambda)型。

在本发明的一个具体方面，特别是当根据本发明的抗体的每一轻链和每一重链的恒定区为人的恒定区时，抗体的每一重链的恒定区为γ(gamma)型。根据这些变异，抗体的每一重链的恒定区可以是γ1、γ2或γ3型，这三个恒定区类型具有结合人补体的特点，或者还可以是γ4型。具有每条γ型重链的恒定区的抗体属于IgG类。G型免疫球蛋白(IgG)是由两条重链和两条轻链组成的异质性二聚体，彼此以二硫键连接。每条链在N端位置，由对抗体所针对的抗原具有特异性的可变区或结构域(轻链由重排的V-J基因编码，重链由重排的V-D-J基因编码)组成，在C端位置，由恒定区组成，轻链的恒定区由一个CL结构域组成，重链由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。可变结构域和重链及轻链的CH₁和CL结构域的组合形成了Fab区，其通过非常有弹性的铰链区与Fc连接，铰链区使每一Fab与靶抗原结合，而介导抗体效应特性的Fc区容易接近效应分子，例如FcγR受体和C1q。由2个球形结构域CH₂和CH₃组成的Fc区在2条链中每条链上都存在与Asn 297结合的双角型N-聚糖的情况下，在CH2结构域的水平面上被糖基化。

优选地，抗体的每一重链的恒定区为γ1型，因为这种抗体在最大量的个体(人)中显示出产生ADCC活性的能力。基于该点考虑，任何的同种异型都适宜于实施本发明，例如G1m(3)、G1m(1，2，17)、G1m(1，17)或G1m(1，3)。优选地，同种异型为G1m(1，17)。

在本发明的一个具体方面，抗体的每一重链的恒定区为γ1型，并由与人核苷酸序列SEQ ID NO：3具有至少70％的一致性的核苷酸序列编码，其每一轻链的恒定区由与人核苷酸序列SEQ ID NO：4具有至少70％的一致性的核苷酸序列编码。

有利地，上述序列的一致性至少为80％，特别有利地至少为90％或99％，序列修正不改变根据本发明的抗体的功能特性。

优选地，根据本发明的抗体的每一重链的恒定区为γ1型，并由人核苷酸序列SEQ ID NO：3编码，其每一轻链的恒定区由人核苷酸序列SEQID NO：4编码。

因此，这样的抗体具有鼠科动物的可变区和人的恒定区，重链为γ1型。该抗体因此属于人IgG1亚型。该抗体具有两条轻链和两条重链，其轻链的可变区由鼠科动物核苷酸序列SEQ ID NO：1编码，人恒定区由核苷酸序列SEQ ID NO：4编码，其重链的可变区由鼠科动物核苷酸序列SEQ ID NO：2编码，恒定区由人核苷酸序列SEQ ID NO：3编码。

在本发明的另一方面，根据本发明的抗体的每一轻链由与鼠科动物-人嵌合性核苷酸序列SEQ ID NO：5具有至少70％一致性的序列编码，每一重链由与鼠科动物-人嵌合性核苷酸序列SEQ ID NO：6具有至少70％一致性的序列编码。在一个特别有利的模式中，序列一致性至少为80％，更有利地至少为90％或至少99％，序列修正既不改变抗体的特性也不改变其功能。

优选地，根据本发明的抗体的每一轻链由鼠科动物-人嵌合性核苷酸序列SEQ ID NO：5编码，每一重链由鼠科动物-人嵌合性核苷酸序列SEQID NO：6编码。

通过融合编码抗体每条轻链可变区的鼠科动物核苷酸序列SEQ IDNO：1和编码抗体每条轻链恒定区的人核苷酸序列SEQ ID NO：4而获得编码抗体每条轻链的鼠科动物-人嵌合性核苷酸序列SEQ ID NO：5。通过融合编码抗体每条重链可变区的鼠科动物核苷酸序列SEQ ID NO：2和编码抗体每条重链恒定区的人核苷酸序列SEQ ID NO：3而获得编码抗体每条重链的鼠科动物-人嵌合性核苷酸序列SEQ ID NO：6。有利地，根据本发明的抗体的每条轻链具有与肽序列SEQ ID NO：7至少70％一致性的肽序列，根据本发明的抗体的每条重链具有与肽序列SEQ ID NO：8至少70％一致性的肽序列。在特别有利的方式中，序列之间的一致性至少为80％、90％，或还可以是95％或99％，序列修正既不改变抗体的特性也不改变其功能。

优选地，根据本发明的抗体的每条轻链的肽序列为肽序列SEQ IDNO：7，根据本发明的抗体的每条重链的肽序列为肽序列SEQ ID NO：8。

因此，当抗体的每条轻链由鼠科动物-人嵌合性核苷酸序列SEQ IDNO：5编码，每条重链由鼠科动物-人嵌合性核苷酸序列SEQ ID NO：6编码，根据核苷酸序列SEQ ID NO：5推导出的每条轻链的肽序列为肽序列SEQ ID NO：7，根据核苷酸序列SEQ ID NO：6推导出的每条重链的肽序列为肽序列SEQ ID NO：8。

可以由任何细胞系生产根据本发明的抗体，更具体地，由生产对CD¹⁶具有强亲和力的抗体的细胞系生产。

在特别有利的方式中，本发明的抗体由鼠骨髓瘤细胞系生产。由于将其某些特性赋予给了抗体，生产根据本发明的抗体的细胞系是一个重要的特性。事实上，抗体表达的手段是在翻译后修饰开始，特别是糖基化修饰，其对于一个细胞系和另一个细胞系可以有差别，因此使得尽管具有相同一级结构的抗体却具有不同的功能特性。

在一个优选的实施方案中，由鼠骨髓瘤细胞YB2/0(细胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20，保藏于美国典型培养物保藏中心，保藏号ATCC CRL-1662)生产抗体。由于该细胞系能够生产较例如由CHO细胞产生的具有相同一级结构的抗体有更高ADCC活性的抗体，以及由于没有内源性免疫球蛋白产生，而选择该细胞系。因此，根据本发明在YB2/0细胞系中产生的抗体，通过其Fc区，激活细胞毒细胞的Fc受体的能力，显示出比由其他细胞系产生的具有相同一级结构的抗体更高。而且，该细胞系具有产生具有抗体组合物形式的抗体的特点和优势，在抗体Fc区的糖基化位点存在的聚糖结构的海藻糖水平/半乳糖水平比例，小于或等于0.6。

有利地，可由在2005年10月25日保藏于法国微生物保藏中心(Collection Nationale de Culture des Microorganismes)(CNCM，25rue duDocteur Roux，75724Paris cedex 15)，保藏号为I-3510的克隆R565产生根据本发明的抗体。

有利地，根据本发明的抗体为抗体EMAB565，其由克隆R565产生。抗体EMAB565的每一轻链由鼠科动物-人嵌合性核苷酸序列SEQ IDNO：5编码，其每一重链由鼠科动物-人嵌合性核苷酸序列SEQ ID NO：6编码。嵌合性抗体与鼠科动物抗体14C12竞争结合FVIII，并且具有远高于鼠科动物14C12的增高的细胞毒活性，这可部分归因于这些抗体重链的N-聚糖的特定糖基化。事实上，克隆R565具有产生海藻糖水平/半乳糖水平比例小于0.6的EMAB565抗体组合物的特点，这在专利申请FR 0312229中已进行了描述，其对于赋予抗体高ADCC活性是最佳的。该抗体因此特别有助于作为治疗工具治疗所要靶向的表达FVIII抑制性抗体的病理细胞。

本发明还包括具有与EMAB565抗体基本相同的特性的任何单克隆抗体。

本发明的另一主题涉及到根据本发明的抗体轻链的表达载体。该载体为能够使根据本发明的抗体表达的载体，该抗体轻链由核苷酸序列SEQ ID NO：5编码，由核苷酸序列推导出的肽序列为序列SEQ ID NO：7。该载体为核苷酸分子，其中插入有编码抗体每一轻链可变结构域的鼠科动物核苷酸序列SEQ ID NO：1和编码抗体每一轻链恒定区的核苷酸序列SEQ ID NO：4，以将它们转导入并保持在宿主细胞中。这使得这些外源核苷酸片段能在具有选择和表达所不可缺少的序列(启动子、多聚腺苷酸序列、选择基因)时得以在宿主中表达。这样的载体对于本领域技术人员是已知的，其可以为腺病毒、逆转录病毒、质粒或噬菌体，这些列举是非限制性的。此外，任何哺乳动物细胞都可以用作宿主细胞，即作为表达根据本发明的抗体的细胞，例如YB2/0、CHO、CHO dhfr(二氢叶酸还原酶缺陷型)-(例如CHO DX B11、CHO DG44)、CHO Lec13、SP2/0、NSO、293、BHK或COS。

本发明的另一目的涉及根据本发明抗体重链的表达载体。该载体为允许根据本发明的抗体表达的载体，该抗体重链由核苷酸序列SEQ IDNO：6编码，由核苷酸序列推导出的肽序列为序列SEQ ID NO：8。该载体为核苷酸分子，其中插入有编码抗体每一重链可变结构域的鼠科动物核苷酸序列SEQ ID NO：2和编码抗体每一重链恒定区的人核苷酸序列SEQID NO：3，以将它们转导入并保持在宿主细胞中。这使得这些外源核苷酸片段能在具有表达所不可缺少的序列(启动子、多聚腺苷酸序列、选择基因)时得以在宿主中表达。正如前所述，这样的载体例如可以为质粒、腺病毒、逆转录病毒、噬菌体，宿主细胞可以是任何哺乳动物细胞，例如YB2/0、CHO、CHO dhfr-(CHO DX B11、CHO DG44)、CHO Lec13、SP2/0、NSO、293、BHK或COS。

通过克隆R565(保藏于CNCM，保藏号为I-3510)产生的EMAB565抗体对在细胞YB2/0中由重链和轻链的表达载体共表达而产生的抗体进行说明。在存在有人NK细胞时，该抗体介导的细胞毒性远高于鼠科动物抗体14C12介导的细胞毒性。而且EMAB565抗体比鼠科动物抗体14C12介导Jurkat-CD16细胞分泌更多的IL-2(白细胞介素-2)。因此，EMAB565抗体，其可以在允许载体表达的前述条件下由克隆R565在培养介质中的培养产生，是能够促进涉及BO2C11的疾病，更具体地为A型血友病的治疗和诊断，以及该领域研究的最有用工具之一。

本发明另一具体主题是表达根据本发明的抗体的稳定细胞系。

有利地，表达根据本发明的抗体的稳定细胞系选自由下列细胞组成的组：SP2/0、YB2/0、IR983F、诸如那马瓦(Namalwa)细胞的人骨髓瘤细胞，或者人源的其他细胞，例如PER.C6、CHO细胞系，特别是CHO-K-1、CHO-Lec10、CHO-Lec1、CHO-Lec13、CHO Pro-5、CHO dhfr-(CHO DX B11、CHO DG44)，或者选自Wil-2、Jurkat、Vero、Molt-4、COS-7、293-HEK、BHK、K6H6、NSO、SP2/0-Ag 14和P3X63Ag8.653的其他细胞系。优选地，使用的细胞系为鼠骨髓瘤细胞YB2/0。选择该细胞系是因为其能够产生比具有相同一级结构的由例如CHO产生的抗体有更高ADCC活性的抗体。

在本发明的一个具体方面，表达根据本发明的抗体的稳定细胞系，更具体地选自上述组的细胞系，如前所述，将重链和轻链的两种表达载体整合在一起。

本发明的一个具体方面涉及保藏号为I-3510，保藏在法国微生物保藏中心(CNCM)的克隆R565。

本发明还涉及产生具有与由前述R565细胞系产生的EMAB565抗体反应性实质相似的反应性的单克隆抗体。

本发明的另一具体主题涉及与针对人FVIII的C2结构域的抗体相结合，并由克隆R565所产生的抗独特型单克隆抗体。

本发明的另一目的涉及编码根据本发明的抗体的重链的序列SEQ IDNO：6的DNA片段。鼠科动物-人嵌合性核苷酸序列SEQ ID NO：6编码抗体的每一重链。它通过将编码抗体每一重链可变区的鼠科动物核苷酸序列SEQ ID NO：2与编码抗体每一重链恒定区的人核苷酸序列SEQ IDNO：3融合在一起而获得。

本发明的另一目的涉及编码根据本发明的抗体的轻链的序列SEQ IDNO：5的DNA片段。鼠科动物-人嵌合性核苷酸序列SEQ ID NO：5编码抗体的每一轻链。它通过将编码抗体每一轻链可变区的鼠科动物核苷酸序列SEQ ID NO：1与编码抗体每一轻链恒定区的人核苷酸序列SEQ IDNO：4融合在一起而获得。

本发明的另一目的是一种有利地为单克隆、抗独特型的、针对人FVIII抑制性抗体的抗体，在通过所述抗独特型抗体的Fc区在体内或体外召集细胞毒免疫细胞中的应用。所述应用可以通过使用针对FVIII任意结构域的任意细胞毒性抗独特型抗体实施。这些细胞毒性抗独特型抗体将激活FcγRIII受体，特别是细胞毒免疫细胞的FcγRIIIA受体。有利地，所使用的抗体是如前所述的根据本发明的抗体，在一个特别有利的方式中，所述抗体为EMAB565抗体。

本发明的抗体具有通过其Fc区激活FcγRIIIA受体的能力。这带来了非常大的益处，因为该受体表达在称为“效应细胞”的细胞表面：抗体的Fc区与由效应细胞携带的Fc受体的结合引起效应细胞FcγRIIIA的激活，以及靶细胞的消灭。所述效应细胞为，例如NK(天然杀伤)细胞、巨噬细胞、嗜中性细胞、CD8淋巴细胞、Tγδ淋巴细胞、NKT细胞、嗜酸性细胞、嗜碱细胞或肥大细胞。

有利地，这种应用的实施可以用于在体内或体外消灭FVIII的分泌抑制性抗体的浆细胞的前体细胞，在所述前体细胞表面表达有FVIII的抑制性抗体。优选地，这些细胞为B细胞，特别是记忆性B细胞。有利地，该抑制性抗体针对FVIII的C2结构域。

B淋巴细胞在其表面表达抗原的受体(BCR即“B细胞受体”)，其由与其他蛋白相连的膜表面免疫球蛋白组成。每一B淋巴细胞只合成一单一种类的膜表面免疫球蛋白，其可变区与分泌型的抗体的可变区相同。B淋巴细胞通过其BCR直接识别抗原。通过BCR的抗原结合，如果伴有其他重要的信号，可以激发所述B淋巴细胞的增殖，通过这种淋巴细胞的增殖引起了克隆的形成。产生于有丝分裂的一些B淋巴细胞分化成分泌循环抗体的浆细胞，其余的细胞形成记忆性B淋巴细胞，其在此第一次反应末没有活性。

罹患A型血友病(特别是严重的A型血友病)的患者具有非常少的内源FVIII或者没有，即该蛋白对于其机体是外源的，并且所给药的FVIII在其第一次给药或随后的给药期间可以激发免疫反应。在所给药的FVIII和在B淋巴细胞上所表达的BCR之间的结合，如果具有充分的亲和性，可以激活B淋巴细胞，导致浆细胞分泌可溶性的抗FVIII抗体，以及形成在表面表达对FVIII具有特异性的BCR的记忆性B淋巴细胞。在与FVIII发生新的接触的情况下，这些记忆性B淋巴细胞增殖以增加具有相同特异性的记忆性B淋巴细胞的数量，并分化成分泌具有高亲和性的抗FVIII抗体的浆细胞。

由记忆性B淋巴细胞产生的反应比原生B淋巴细胞产生的反应强烈，这些记忆细胞数量更大，并具有比其起源的淋巴细胞更高亲和性的BCR。而且，其从记忆细胞分化成浆细胞比具有相同特异性的原始细胞更快速。

由于其针对特定抗原的特异性，膜免疫球蛋白成为B淋巴细胞的一个鲜明特点。具有抗FVIII BCR以及产生分泌FVIII抑制性抗体的浆细胞的B淋巴细胞因而可以通过抗体与免疫球蛋白中与抗FVIII抗体具有特异性的部分结合而被靶向。因此，根据本发明的抗体识别膜免疫球蛋白，并且通过其Fc区召集细胞毒免疫细胞，负责裂解在表面表达BCR的细胞。

更具体地，这种应用的实施可以用于在体内或体外消灭在表面表达有BCR的记忆性B细胞，所述BCR具有BO2C11抗体轻链的可变区(VL)和重链的可变区(VH)。通过抗体依赖的细胞消除机制，特别是ADCC使这种消灭发生。

本发明另一具体主题是根据本发明的抗体在作为药物中的应用。有利地，这样的药物欲用于治疗产生FVIII抑制性抗体的疾病。

本发明的另一目的是根据本发明的抗体在制备药物中的应用。

基于该点，本发明的另一目的是根据本发明的抗体在制备用于治疗A型血友病的药物中的应用。出于本发明的目的，应当理解“用于治疗A型血友病”的表述等同于“欲用于A型血友病的治疗”的表述。

有利地，被治疗的A型血友病是具有抑制因子的A型血友病。

根据本发明的抗独特型抗体可以与FVIII同时给药于病人，其既可以在同一药剂中，也可以在两个分开的药剂中但是伴随给药。

最后，本发明的最后一个目的涉及含有根据本发明的抗体和一种或多种赋形剂和/或制药学上可接受的载体的药物组合物。赋形剂可以是与药物应用相容的并且本领域技术人员已知的任何溶液，例如盐溶液、生理溶液、等渗溶液性、缓冲溶液等，以及任何的悬浮液、凝胶、粉末等。根据本发明的组合物可以进一步包括选自分散剂、增溶剂、稳定剂、表面活性剂、防腐剂等的一种或多种药剂或载体。在另一方面，根据本发明的组合物可以包括其他的药剂或活性组分。

而且，可以以不同的途径和不同的形式给药所述组合物。可以通过用于这种类型的治疗方法的任何标准途径进行所述给药，例如尤其是通过全身途径，尤其是通过静脉内、皮内、肿瘤内、皮下、腹膜内、肌肉内、动脉内注射等。例如可以是所述的肿瘤内注射，或者注射入肿瘤的邻近部位，或冲洗肿瘤。

剂量可以作为给药的次数、与其他活性组分的结合、病理发展阶段等的函数而变化。

附图说明

图1：在存在有NK细胞时，由EMAB565抗体(在图中标示为14C12CH)介导的BO2C11的裂解。

图2：在存在有BO2C11和EMAB565抗体(在图中标示为14C12CH)时，由Jurkat CD16细胞对IL2的分泌。

图3：由EMAB565抗体(在图中标示为14C12CH)介导的BO2C11的BCR的成帽(Capping)。

图4：由EMAB565抗体(在图中标示为14C12CH)介导的BO2C11的调亡。

图5：在补体存在时，由EMAB565抗体(在图中标示为14C12CH)介导的BO2C11的裂解。

具体实施方式

实施例1：抗-Id FVIII EMAB565嵌合性抗体表达载体的构建

A.确定鼠科动物抗体14C12可变区的前导序列

分离产生IgG2a，κ型免疫球蛋白的鼠科动物杂交瘤14C12的总RNA。反转录后，用5’RACE技术(Rapid Amplification of cDNA Ends(cDNA末端的快速扩增))(GeneRacer试剂盒，Invitrogen产品号L1500-01)扩增抗体的轻链(Vκ)和重链(VH)的可变区。

简言之，首先用位于鼠科动物恒定区Cκ或G1的5’区的引物进行第一反转录阶段。之后，将多聚dC序列加至合成的cDNA的3′端，之后使用识别多聚dC序列的5’引物和3’引物扩增Vκ和VH区，所述3’引物位于鼠科动物恒定区Cκ或G1的反转录引物的5′端。用于这两个阶段的引物如下所述：

1.反转录引物

a.鼠科动物κ特异性反义引物(SEQ ID NO：19)

5′-ACT GCC ATC AAT CTT CCA CTT GAC-3′

b.鼠科动物G2a特异性反义引物(SEQ ID NO：20)

5′-CTG AGG GTG TAG AGG TCA GAC TG-3′

2.5′RACE PCR引物

a.鼠科动物κ特异性反义引物(SEQ ID NO：21)

5′-TTGTTCAAGAAGCACACGACTGAGGCAC-3′

b.鼠科动物G2a特异性反义引物(SEQ ID NO：22)

5′-GAGTTCCAGGTCAAGGTCACTGGCTCAG-3′

将获得的PCR产物VH和Vκ克隆入pCR4Blunt-TOPO载体(Zeroblunt TOPO PCR克隆试剂盒，Invitrogen，产品编号K2875-20)并测序。

鼠科动物抗体14C12的Vκ区的核苷酸序列由序列SEQ ID NO：1表示，推导出的肽序列为序列SEQ ID NO：9。Vκ基因属于Vκ23亚型[Almagro JC等Immunogenetics(1998)，47：355-363]。鼠科动物抗体14C12的Vκ区的CDR1、CDR2和CDR3序列，根据Kabat编码方式[Kabat等人，“Sequences of Proteins of Immunological Interest”，NIH Publication，91-3242(1991)]所定义，分别由以下序列表示：SEQ ID NO：13，SEQ IDNO：14和SEQ ID NO：15。鼠科动物抗体14C12的Vκ区的CDR1-IMGT，CDR2-IMGT和CDR3-IMGT序列，根据IMGT(internationalImMunoGeneTics database)(国际免疫遗传数据库)分析[Lefranc，M.-P.等人，Dev.Comp.Immunol，27，55-77(2003)]所定义，分别由下列序列表示：SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29。与只根据序列变异分析的Kabat定义不同，该定义考虑并结合了超变环的特点[Chothia C.和Lesk A.M.J.Mol.Biol.196：901-17(1987)]和抗体的结晶学结构分析。

14C12的VH区的核苷酸序列为序列SEQ ID NO：2，其推导的肽序列为序列SEQ ID NO：10。VH基因属于VH1亚型[Honjo T.和Matsuda F.“Immunoglobulin genes”.Honjo T.和Alt F.W.编辑，Academic Press，London(1996)，pp 145-171]。鼠科动物抗体14C12的VH区的CDR1、CDR2和CDR3序列，根据Kabat编码方式[Kabat等人，“Sequences of Proteins ofImmunological Interest”，NIH Publication，91-3242(1991)]所定义，分别由以下序列表示：SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18。鼠科动物抗体14C12的VH区的CDR1-IMGT，CDR2-IMGT和CDR3-IMGT序列，根据IMGT(international ImMunoGeneTics database)分析[Lefranc，M.-P.等人，Dev.Comp.Immunol，27，55-77(2003)]所定义，分别由下列序列表示：SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32。与只根据序列变异分析的Kabat定义不同，该定义考虑并结合了超变环的特点[Chothia C.和Lesk A.M.J.Mol.Biol.196：901-17(1987)]和抗体的结晶学结构分析。

B.嵌合性抗体EMAB565的重链和轻链表达载体的构建

1.κ轻链载体

使用以下的克隆引物扩增被克隆入测序载体pCR4Blunt-TOPO中的Vκ序列：

(a)Vκ正义引物：(SEQ ID NO：23)

5′-GTATACTAGT

GTTTTCACACCTCAGAT-3′

被划线的序列对应于Spe I限制性酶切位点，粗体字体的序列对应于Kozak一致序列，ATG起始子为斜体。

(b)Vκ反义引物：(SEQ ID NO：24)

5′-

-3′

该引物产生鼠科动物Vκ序列(斜体)和人恒定区(Cκ)(粗体)的连接点。被划线的序列对应于Dra III限制性酶切位点。

获得的Vκ的PCR产物包括编码鼠科动物抗体14C12的天然信号肽的序列。Vκ的PCR产物之后被克隆入人Cκ恒定区5′端处的轻链嵌合载体Spe I和Dra III位点之间，所述人Cκ恒定区的核苷酸序列为SEQ ID NO：4，推导出的肽序列为SEQ ID NO：12。已通过沉默突变修正了该嵌合载体的人Cκ序列以制造出Dra III限制性酶切位点以克隆鼠科动物Vκ序列。该嵌合载体含有本领域技术人员已知的启动子，例如CMV或RSV和HGH(人生长激素)多聚腺苷酸序列以及dhfr(二氢叶酸还原酶)选择基因。

为表达EMAB565抗体，嵌合载体的启动子之后被人EF-1α启动子取代。

由该载体编码的嵌合抗体EMAB565的轻链序列的核苷酸序列由SEQ ID NO：5表示，其对应的推导出的肽序列为SEQ ID NO：7。

2.重链载体

使用近似的方法进行EMAB565抗体重链的嵌合。使用以下的克隆引物首先扩增被克隆入pCR4Blunt-TOPO载体中的VH序列：

(a)VH正义引物：(SEQ ID NO：25)

5′-CTATTACTAGT

AATGGAGTTGGATATTT-3′

(b)VH反义引物：(SEQ ID NO：26)

5′-

-3′

该引物产生鼠科动物VH序列(斜体)和人G1恒定区(粗体)的连接点。

被划线的序列对应于Apa I限制性酶切位点。

扩增出的VH片段包括编码鼠科动物抗体14C12的天然信号肽的序列。VH的PCR产物之后被克隆入人γ1恒定区5′端处的重链嵌合载体SpeI和Apa I III位点之间，所述人γ1恒定区的核苷酸序列为SEQ ID NO：3，推导出的肽序列为SEQ ID NO：11。该嵌合载体含有本领域技术人员已知的启动子，例如CMV或RSV和bGH(牛生长激素)多聚腺苷酸序列以及neo(新霉素耐药)选择基因。

由该载体编码的嵌合抗体EMAB565的重链序列由SEQ ID NO：6提供核苷酸序列，其对应的推导出的肽序列为SEQ ID NO：8。

实施例2：建立产FVIII抗抑制性嵌合抗体EMAB565的衍生于细胞系YB2/0的细胞系

在含5％胎牛血清(FCS)(JRH Biosciences，产品编号12107)的EMS培养基(Invitrogen，产品编号041-95181M)中培养大鼠细胞系YB2/0(ATCC#CRL-1662)。5百万细胞在Optimix培养基(Equibio，产品编号EKITE 1)中，用25μg的Aat II线性化轻链载体及27μg的Sca-I线性化重链载体进行电穿孔(Biorad电穿孔仪，1652077型)转染。所应用的电穿孔条件为每0.5ml试管230伏和960微法拉。之后每一电穿孔小杯以5000个细胞/孔的密度分布于5块96孔板中。

在转染后第3天导入含5％透析过的血清(Invitrogen，产品编号10603-017)，500μg/ml的遗传霉素G418(Invitrogen，产品编号10131-027)和25nM的氨甲蝶呤(Sigma，产品编号M8407)的RPMI选择性培养基(Invitrogen，产品编号21875-034)中。

通过ELISA方法在抗性转染孔的上清液中筛选对人免疫球蛋白(Ig)序列有特异性的嵌合免疫球蛋白的存在。

将产生最多抗体的10个转染子在24孔板中扩增，通过ELISA重新分析其上清液以评估其生产力，并选择最好的3个生产者通过有限稀释(40孔/板)用于克隆。

在克隆结束时，选择此后称为“R565”的克隆R565用于生产嵌合抗体EMAB565，并渐进调整以适应CD杂交瘤生产培养基(Invitrogen，产品编号11279-023)。

通过在CD杂交瘤培养基中扩充适应的培养物进行嵌合性抗体EMAB565的生产，其是通过在75cm²和175cm²的烧瓶中稀释至3×10⁵个细胞/ml，之后在滚动细胞培养瓶中稀释至4.5×10⁵个细胞/ml而获得的。在达到最大体积时(1l)，继续进行培养细胞存活率达到20％。生产之后，通过蛋白A亲和层析(经HPLC估计纯度＜95％)纯化嵌合抗体EMAB565，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。

通过HPCE-LIF进行所产生的抗体组合物(EMAB565)的聚糖分析，并且显示出约7％的海藻糖含量，约52％的半乳糖含量，以及0.133的海藻糖/半乳糖比。

实施例3：在人NK细胞存在时，由EMAB565抗体介导的B02C11 裂解

ADCC技术

使用Myltenyi的磁激活细胞分离(MACS)技术从PBMCs(外周血单核细胞)中分离NK细胞。冲洗NK细胞并重悬于IMDM(Iscove′s改进的Dubelcco′s培养基)+5％FCS(45×10⁵个细胞/ml)。以15/1的比例使用效应细胞和靶细胞。将靶细胞BO2C11在IMDM+5％FCS中调整至3×10⁵个细胞/ml。在IMDM+5％FCS中将抗体稀释(终浓度500；50；5；0.5；0.005和0.005ng/ml)。

反应混合物在96孔微孔板中包括50μl的抗体，50μl的效应细胞，50μl的靶细胞和50μl的IMDM培养基。建立两个阴性对照：

无NK的裂解：用IMDM+5％FCS代替NK效应细胞。

无抗体的裂解IAc)：用IMDM+5％FCS代替抗体。

在伴以5％CO₂的一个大气压下，37℃孵育16小时后，离心平板，用特定的试剂(细胞毒性检测试剂盒1 644 793)评价释放入上清液中的细胞内LDH水平。

用校正范围评估裂解百分比，对用Triton×100(2％)裂解的靶细胞进行分别相当于100、50和0％裂解的不同稀释，以获得所述校正范围。

根据下式计算结果：

％裂解＝(％用抗体和NK裂解)-(％无抗体裂解)-(％无NK裂解)

研究鼠科动物14C12和嵌合性伊曼伯林(EMABling)14C12FVIII抑制剂的抗独特型抗体在NK细胞存在时裂解BO2C11细胞的能力。

图1显示了鼠科动物14C12抗体不介导BO2C11细胞的裂解，而嵌合抗体(EMABling Technology)介导剂量依赖性的裂解。

实施例4：在BO2C11和EMAB565抗体存在时Jurkat CD16分泌 IL-2

该实验评估了抗体结合表达在Jurkat CD16细胞上的CD16受体(FcγRIIIa)和介导IL2分泌的能力。

根据此目的，在96孔板中混合下列物质：

-50μl的抗体溶液(在具有5％FCS的IMDM中终浓度为25、2.5、0.25、0.025、0.012μg/ml)，

-50μl的PMA(在具有5％FCS的IMDM中稀释成40ng/ml)，50μl的在具有5％FCS的IMDM中稀释成6×10⁵/ml的BO2C11细胞，以及50μl的Jurkat CD16细胞(在具有5％FCS的IMDM中为20×10⁶/ml)。

37℃过夜孵育后，离心平板，用商业化试剂盒(来自R&D的Quantikine)评价上清液中所含有的IL2。在450nm读取OD值。

结果以IL-2水平表示为抗体浓度的函数。

研究FVIII抑制剂EMAB565的抗独特型抗体在存在BO2C11细胞时，介导被CD16转染的Jurkat细胞分泌IL2的能力。

图2显示EMAB565抗体介导了IL-2的分泌。

实施例5：由EMAB565抗体介导的BO2C11的BCR的成帽

冲洗BO2C11细胞(1.2×10⁶个细胞/ml)，将其保存在含5％FCS，pH 7.4的IMDM中。与先前标记的浓度在10μg/ml的EMAB565抗体(ALEXA)在4℃和37℃孵育1小时、4小时和16小时。用LEICA荧光显微镜(×63油浸镜头)可见由于抗体的受体成帽。

研究不同的孵育时间，并显示出在成帽加强出现早期(30分钟)，并一直持续。通过示例，图4显示在16小时，结合BO2C11的抗体呈杆状聚集，不均匀地分布于膜表面。这显示抗体14C12CH与BO2C11的结合介导了膜受体的重排，并潜在地介导了转导信号。

实施例6：由EMAB565抗体介导的BO2C11凋亡

在24孔板上于1ml的RMPI和10％FCS中在37℃孵育BO2C11细胞(2.5×10⁵)与EMAB565抗体24小时，其中有交联剂(羊F(ab2)’抗人IgG Fcγ，10μg/ml)存在或者没有存在。之后离心细胞，在PBS中冲洗两次置于试剂盒供应的缓冲液中，根据BD Biosciences的推荐，与膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)和碘化丙锭(PI)一起孵育。用流式细胞仪分析细胞，凋亡细胞的百分比等于被膜联蛋白V标记的细胞(膜联蛋白V和膜联蛋白V+PI)。

图4显示在EMAB565抗体(EMABling技术)存在时，凋亡的诱导比没有交联剂存在或只有6.5％的交联剂存在的诱导少3％(图4)。

实施例7：在补体存在时EMAB565抗体诱导B02C11的裂解

冲洗BO2C11细胞，当在IMDM培养基+FCS 5％中被稀释成1：10的补体源(来自Cedarlane的幼兔补体)存在时，将细胞与不同浓度的EMAB565抗体(终浓度为0-2.5μg/ml)一起在37℃孵育1小时。之后将细胞在1200rpm(270g)下离心两次，每次1分钟，弃上清。用特定试剂(细胞毒性检测试剂盒1 644 793)测定相当于细胞裂解的细胞内LDH释放入上清液中的量。

用校正范围评估裂解百分比，对用Triton×100(2％)裂解的靶细胞进行分别相当于100、50、25和0％裂解的不同稀释，以获得所述校正范围。对照包括自发释放(只有靶细胞)。

根据下式计算结果：

％裂解＝(％用抗体和补体裂解)-(％无补体裂解)

图5显示了在使用最强抗体浓度时，由EMAB565抗体(EMABling技术)介导的CDC(补体依赖细胞毒)活性最大为5％。

序列表

<110>法国血液分割暨生化制品实验室(LFB)

<120>针对抑制VIII因子的抗体的细胞毒性抗体

<130>14C12ch

<160>32

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>321

<212>DNA

<213>小家鼠

<400>1

gatcttgtgc taactcagtc tccagccacc ctgtctgtga ctccaggaga tagtgtcagt 60

ctttcctgta gggccagcca agatattacc aacacccttc actggtatca tcaaaaatca 120

catgagtctc caaggcttct catcaagtat gtttcccagt ccatctctgg gatcccctcc 180

aggttcagtg gcagtggatc agggacagtt ttcactctca gtatcaacag tgtggagact 240

gaagattttg gagtgtattt ctgtcagcag agtaccagct ggccgtacac attcggaggg 300

gggaccaagt tggaaataaa a 321

<210>2

<211>366

<212>DNA

<213>小家鼠

<400>2

gaggtccagc ttcagcagtc tggacctgag ctggttaagc ctggggcttc agtgaagctg 60

tcctgcaagg cttctggata cacattcact agctctgtta tgcactggct gaagcagaag 120

tctgggcagg gccttgagtg gattggatat attaatcctt acaatgatgg tactaagtac 180

aatgagaagt tcacagccaa ggccacactg acttcagaca aatcctccag cacagtctac 240

atggagctca gcggcctgac ctctgaggac tttgcggtct attactgtgc acgatcggga 300

ggtttactac gaggttactg gtacttcgat gtctggggcg cagggaccac ggtcaccgtc 360

tcctca 366

<210>3

<211>990

<212>DNA

<213>人类

<400>3

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720

ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960

cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 990

<210>4

<211>321

<212>DNA

<213>人类

<400>4

cggactgtgg ctgcaccaag tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60

ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120

tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180

agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240

aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300

agcttcaaca ggggagagtg t 321

<210>5

<211>642

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>5

gatcttgtgc taactcagtc tccagccacc ctgtctgtga ctccaggaga tagtgtcagt 60

ctttcctgta gggccagcca agatattacc aacacccttc actggtatca tcaaaaatca 120

catgagtctc caaggcttct catcaagtat gtttcccagt ccatctctgg gatcccctcc 180

aggttcagtg gcagtggatc agggacagtt ttcactctca gtatcaacag tgtggagact 240

gaagattttg gagtgtattt ctgtcagcag agtaccagct ggccgtacac attcggaggg 300

gggaccaagt tggaaataaa acggactgtg gctgcaccaa gtgtcttcat cttcccgcca 360

tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420

cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480

gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540

ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600

ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642

<210>6

<211>1356

<212>DNA

<213>人工序列

<220>合成的构建体

<223>

<400>6

gaggtccagc ttcagcagtc tggacctgag ctggttaagc ctggggcttc agtgaagctg 60

tcctgcaagg cttctggata cacattcact agctctgtta tgcactggct gaagcagaag 120

tctgggcagg gccttgagtg gattggatat attaatcctt acaatgatgg tactaagtac 180

aatgagaagt tcacagccaa ggccacactg acttcagaca aatcctccag cacagtctac 240

atggagctca gcggcctgac ctctgaggac tttgcggtct attactgtgc acgatcggga 300

ggtttactac gaggttactg gtacttcgat gtctggggcg cagggaccac ggtcaccgtc 360

tcctcagcct ccaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 420

tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 480

gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 540

tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 600

cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt 660

gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 720

gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 780

acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 840

aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 900

tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 960

ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1020

atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1080

gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1140

gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1200

cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1260

aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1320

tacacgcaga agagcctctccctgtctccg ggtaaa 1356

<210>7

<211>214

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>7

Asp Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Thr Asn Thr

20 25 30

Leu His Trp Tyr His Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Val Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Val Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Thr Ser Trp Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210>8

<211>452

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>8

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser

20 25 30

Val Met His Trp Leu Lys Gln Lys Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Thr Ala Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Gly Gly Leu Leu Arg Gly Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp

100 105 110

Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Pro Gly Lys

450

<210>9

<211>107

<212>PRT

<213>小家鼠

<400>9

Asp Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Thr Asn Thr

20 25 30

Leu His Trp Tyr His Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Val Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Val Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Thr Ser Trp Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210>10

<211>122

<212>PRT

<213>小家鼠

<400>10

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser

20 25 30

Val Met His Trp Leu Lys Gln Lys Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Thr Ala Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Gly Gly Leu Leu Arg Gly Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp

100 105 110

Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210>11

<211>330

<212>PRT

<213>人类

<400>11

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210>12

<211>107

<212>PRT

<213>人类

<400>12

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210>13

<211>11

<212>PRT

<213>小家鼠

<400>13

Arg Ala Ser Gln Asp Ile Thr Asn Thr Leu His

1 5 10

<210>14

<211>7

<212>PRT

<213>小家鼠

<400>14

Tyr Val Ser Gln Ser Ile Ser

1 5

<210>15

<211>9

<212>PRT

<213>小家鼠

<400>15

Gln Gln Ser Thr Ser Trp Pro Tyr Thr

1 5

<210>16

<211>5

<212>PRT

<213>小家鼠

<400>16

Ser Ser Val Met His

1 5

<210>17

<211>17

<212>PRT

<213>小家鼠

<400>17

Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Thr

1 5 10 15

Ala

<210>18

<211>13

<212>PRT

<213>小家鼠

<400>18

Ser Gly Gly Leu Leu Arg Gly Tyr Trp Tyr Phe Asp Val

1 5 10

<210>19

<211>24

<212>DNA

<213>小家鼠

<400>19

actgccatca atcttccact tgac 24

<210>20

<211>23

<212>DNA

<213>小家鼠

<400>20

ctgagggtgt agaggtcaga ctg 23

<210>21

<211>28

<212>DNA

<213>小家鼠

<400>21

ttgttcaaga agcacacgac tgaggcac 28

<210>22

<211>28

<212>DNA

<213>小家鼠

<400>22

gagttccagg tcaaggtcac tggctcag 28

<210>23

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>23

gtatactagt gccgccacca tggttttcac acctcagat 39

<210>24

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>24

tgaagacact tggtgcagcc acagtccgtt ttatttccaa cttggtc 47

<210>25

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>25

ctattactag tgccgccacc atggaatgga gttggatatt t 41

<210>26

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>26

gaccgatggg cccttggtgg aggctgagga gacggtgacc gtg 43

<210>27

<211>6

<212>PRT

<213>小家鼠

<400>27

Gln Asp Ile Thr Asn Thr

1 5

<210>28

<211>3

<212>PRT

<213>小家鼠

<400>28

Tyr Val Ser

1

<210>29

<211>9

<212>PRT

<213>小家鼠

<400>29

Gln Gln Ser Thr Ser Trp Pro Tyr Thr

1 5

<210>30

<211>8

<212>PRT

<213>小家鼠

<400>30

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser Val

1 5

<210>31

<211>8

<212>PRT

<213>小家鼠

<400>31

Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr

1 5

<210>32

<211>15

<212>PRT

<213>小家鼠

<400>32

Ala Arg Ser Gly Gly Leu Leu Arg Gly Tyr Trp Tyr Phe Asp Val

1 5 10 15

Claims

1.针对抑制人VIII因子(FVIII)的抗体的抗独特型单克隆抗体，所述抑制性抗体针对人FVIII的C2区，其特征在于，所述抑制性抗体的每一轻链的可变区由与鼠科动物核苷酸序列SEQ ID NO：1具有至少70％一致性的核苷酸序列编码，每一重链的可变区由与鼠科动物核苷酸序列SEQ ID NO：2具有至少70％一致性的核苷酸序列编码，所述抑制性抗体的轻链和重链的恒定区为来源于非鼠科动物种的恒定区。

2.根据权利要求1所述的抗独特型单克隆抗体，其特征在于，其每一轻链的可变区由鼠科动物核苷酸序列SEQ ID NO：1编码，每一重链的可变区由鼠科动物核苷酸序列SEQ ID NO：2编码，其轻链和重链的恒定区为来源于非鼠科动物种的恒定区。

3.根据权利要求1或2中任一项所述的抗独特型单克隆抗体，其特征在于，其由细胞以抗体组合物的形式产生，存在于Fc区的糖基化位点的聚糖结构的海藻糖/半乳糖水平的比例小于或等于0.6。

4.根据前述权利要求中任一项所述的抗独特型抗体，其特征在于，所述FVIII抑制性抗体为抗体BO2C11。

5.根据前述权利要求中任一项所述的抗独特型单克隆抗体，其特征在于，其每一轻链和每一重链的恒定区为人恒定区。

6.根据前述权利要求中任一项所述的抗独特型单克隆抗体，其特征在于，其每一轻链的恒定区为κ型。

7.根据前述权利要求中任一项所述的抗独特型单克隆抗体，其特征在于，其每一重链的恒定区为γ型。

8.根据权利要求7所述的抗独特型单克隆抗体，其特征在于，其每一重链的恒定区为γ1型。

9.根据前述权利要求中任一项所述的抗独特型单克隆抗体，其特征在于，其每一重链的恒定区为γ1型，并由与人核苷酸序列SEQ ID NO：3具有至少70％一致性的序列编码，其每一轻链的恒定区由与人核苷酸序列SEQ ID NO：4具有至少70％一致性的序列编码。

10.根据前述权利要求中任一项所述的抗独特型单克隆抗体，其特征在于，其每一重链的恒定区为γ1型，并由人核苷酸序列SEQ ID NO：3编码，其每一轻链的恒定区由人核苷酸序列SEQ ID NO：4编码。

11.根据前述权利要求中任一项所述的抗独特型单克隆抗体，其特征在于，其每一轻链由与鼠科动物-人嵌合性核苷酸序列SEQ ID NO：5具有至少70％一致性的核苷酸序列编码，其每一重链由与鼠科动物-人嵌合性核苷酸序列SEQ ID NO：6具有至少70％一致性的序列编码。

12.根据前述权利要求中任一项所述的抗独特型单克隆抗体，其特征在于，其每一轻链由鼠科动物-人嵌合性核苷酸序列SEQ ID NO：5编码，其每一重链由鼠科动物-人嵌合性核苷酸序列SEQ ID NO：6编码。

13.根据前述权利要求中任一项所述的抗独特型单克隆抗体，其特征在于，其每一轻链具有与序列SEQ ID NO：7至少70％一致性的肽序列，其每一重链具有与序列SEQ ID NO：8至少70％一致性的肽序列。

14.根据前述权利要求中任一项所述的抗独特型单克隆抗体，其特征在于，其每一轻链的肽序列为肽序列SEQ ID NO：7，其每一重链的肽序列为肽序列SEQ ID NO：8。

15.根据前述权利要求中任一项所述的抗独特型单克隆抗体，其特征在于，其由鼠杂交瘤细胞产生。

16.根据权利要求15所述的抗独特型单克隆抗体，其特征在于，其由鼠杂交瘤细胞YB2/0(保藏于美国典型培养物保藏中心，保藏号为ATCC CRL-1662的细胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20)产生。

17.根据前述权利要求中任一项所述的抗独特型单克隆抗体，其特征在于，其能够由保藏于法国微生物保藏中心，保藏号为I-3510的克隆R565产生。

18.根据前述权利要求中任一项所述的抗独特型单克隆抗体，其特征在于，所述抗体为抗体EMAB565，其由保藏于法国微生物保藏中心，保藏号为I-3510的克隆R565产生。

19.表达根据权利要求1-14中任一项所述的抗体的稳定细胞系。

20.根据权利要求19所述的稳定细胞系，所述细胞系选自由下列细胞系组成的组：SP2/0、YB2/0、IR983F、人骨髓瘤那马瓦、PER.C6、CHO细胞系、特别是CHO-K-1、CHO-Lec10、CHO-Lec1、CHO-Lec13、CHOPro-5、CHO dhfr-、Wil-2、Jurkat、Vero、Molt-4、COS-7、293-HEK、BHK、K6H6、NSO、SP2/0-Ag 14和P3X63Ag8.653。

21.保藏于法国微生物保藏中心，保藏号为I-3510的克隆R565。

22.编码根据权利要求1-18中任一项所述的抗体的重链的序列SEQID NO：6的DNA片段。

23.编码根据权利要求1-18中任一项所述的抗体的轻链的序列SEQID NO：5的DNA片段。

24.针对人FVIII抑制性抗体的抗独特型单克隆抗体在体外通过所述抗独特型抗体的Fc区用于召集细胞毒免疫细胞的应用。

25.根据权利要求24所述的应用，其特征在于，所述抗体为根据权利要求1-18中任一项所述的抗体。

26.根据权利要求24或25中任一项所述的抗独特型单克隆抗体用于在体外消灭在表面表达有FVIII抑制性抗体的B细胞，特别是记忆性B细胞的应用。

27.根据权利要求24-26中任一项所述的抗体用于在体外消灭在表面表达有BCR的记忆性B细胞的应用，所述BCR具有抗体BO2C11的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)。

28.根据权利要求24-27中任一项所述的应用，其特征在于，所述消灭机制为抗体依赖性细胞裂解机制(ADCC)。

29.根据权利要求1-18中任一项所述抗体在制备药物中的应用。

30.根据权利要求1-18中任一项所述抗体在制备用于治疗A型血友病的药物中的应用。

31.根据权利要求30所述的抗体的应用，其特征在于，所述A型血友病为具有抑制剂的A型血友病。

32.含有根据权利要求1-18中任一项所述的抗独特型单克隆抗体和一种或多种赋形剂和/或制药上可接受载体的药物组合物。