CN101348801A - 一种制备动物细胞膜及细胞器的膜蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备动物细胞膜及细胞器的膜蛋白的方法，通过重组杆状病毒BacmidCMV－G－HA感染动物宿主细胞后增殖，在病毒大量出芽后，宿主细胞膜破裂，细胞膜碎片疏水作用会形成膜小球，经分离、超滤，获得细胞膜及细胞器膜蛋白。本发明的有益之处在于：本发明构建了BacmidCMV－G－HA重组杆状病毒，感染动物宿主细胞，病毒携带的HA融合基因表达后将会定位于宿主的细胞膜上，当病毒大量出芽后，导致宿主细胞的细胞膜破裂，形成膜小球，由于蛋白的相互作用，也获得了细胞器的膜成分，反复冻融使细胞器的膜破裂，再对膜成分进行高效液相色谱(HPLC)和质谱分析，从而鉴定并获得膜蛋白。
Description
技术领域
本发明涉及一种蛋白质工程中的蛋白表达与分离纯化的领域，特别涉及一种利用囊膜病毒出芽特性分离获得细胞膜及细胞器的膜蛋白的方法。
背景技术
生物膜有着重要的生物功能，如提供细胞识别位点，介导细胞与细胞、细胞与基质之间的连接等等。膜蛋白的研究也正成为蛋白质组研究的热点。膜蛋白是许多药物的作用靶位点，研究膜蛋白不仅有利于低丰度蛋白的研究，更为药物研发和疾病的诊断提供靶体与标记蛋白质。然而，膜蛋白的分离是膜蛋白研究的“瓶颈”。
本发明提供一种膜蛋白分离与纯化新的技术方法。利用杆状病毒出芽特性，导致宿主细胞膜破裂，然后分离出细胞膜成分。杆状病毒具有限制性，只能感染昆虫细胞。然而，1995年，Hofmann等研究发现在杆状病毒DNA中插入CMV(human cytomegalovirus immediate-early region)后，杆状病毒可以在人肝细胞中表达。1997年，Barsoum等研究报道，在杆状病毒DNA中插入VSV-G(vesicular stomatitis virus G protein)能扩大宿主范围并增加转染率。
发明内容
针对现有技术的不足之处，本发明提供一种细胞膜和细胞器膜蛋白分离与纯化新的技术方法。
本发明的一种制备动物细胞膜及细胞器的膜蛋白的方法，通过重组杆状病毒BacmidCMV-G-HA感染动物宿主细胞后增殖，在病毒大量出芽后，宿主细胞膜破裂，细胞膜碎片疏水作用会形成膜小球，经分离、超滤，获得细胞膜及细胞器膜蛋白。
制备动物细胞膜及细胞器的膜蛋白的方法，具体包括以下步骤：
(1)重组杆状病毒BacmidCMV-G-HA以5MOI感染动物宿主细胞，37℃、5％CO2条件下培养5-6天，用PBS冲洗细胞，收获动物细胞并超声破碎；
(2)将上述破碎液经12000rpm离心20-60min，膜碎片或膜小球沉淀；上清液进行超速离心，35000rpm，30-60min，去除病毒粒子；收集12000rpm离心的沉淀和35000rpm离心的上清液，沉淀用PBS重悬溶解；
(3)将12000rpm离心沉淀的重悬液及35000rpm离心的上清液，用截留分子量为750kD的中空纤维膜超滤，获得细胞膜及细胞器的膜蛋白。
所述重组杆状病毒BacmidCMV-G-Ha的构建方法：在pFastBacTM载体中插入CMV-VSV-G序列和HA融合基因序列后，利用Bac-to-Bac系统获得Bacmi dCMV-G-HA。
所述重组杆状病毒BacmidCMV-G-Ha的构建方法包括以下步骤：
(1)融合基因HA与质粒pFastBacTM同时进行EcoR I和Xho I双酶切，在T4连接酶的作用下使HA融合基因插入到pFastBacTM质粒中，转化到感受态细胞E.coli DH5α中，挑取单菌落，提取质粒，酶切测序鉴定出正确连接的质粒stBac-HA；
(2)通过pHCMV-VSV-G的序列设计一对PCR引物，扩增出CMV-VSV-G的序列，含BamH I位点的上游引物：atggatccgagcttggcccattgcatac，含EcoR I位点的下游引物：gcgaattcgacggatccttatcactttc，PCR反应结束后，电泳，纯化回收反应产物；
(3)步骤(2)纯化后的PCR产物与步骤(1)所得质粒pFastBac-HA分别进行BamH I和EcoR I双酶切，在T4连接酶的作用下使PCR产物克隆至质粒pFastBac-HA中，转化至感受态细胞DH5α中，挑取单菌落，提取质粒，酶切和测序鉴定正确插入的重组质粒pFastBacCMV-G-HA；
(4)根据Bac-to-Bac
系统，取5ul步骤(3)所得重组质粒pFastBacCMV-G-HA转化到DH10BacTM感受态细胞中，平板于37℃培养24-48h后挑取白色克隆，划线接种至平板上，过夜培养，证实是阳性克隆；第二天，挑取单菌落接种于液体培养基中培养，获得重组质粒Bacmi dCMV-G-HA；
(5)取重组质粒BacmidCMV-G-HA的DNA约5ul加入100ul Sf-900IISFM，取cellfectin
试剂加入到100ul的Sf-900II SFM，再将两者混匀，温放置15-30min，Sf9培养在含50个单位的青霉素和链霉素的SFM中，将细胞转移到27℃至少放置1h，再用不含抗生素的SFM培养基洗涤两次后，加入上述的DNA混合物，27℃培养5h。移去DNA混合物，加入含抗生素的SFM，于27℃培养72h，收获细胞，获得重组杆状病毒BacmidCMV-G-HA。
所述的融合基因HA的构建包括以下步骤：
(1)以gp64DNA为模板，PCR扩增gp64信号肽基因，PCR所用的两种引物为：
Psp1：5’gcgaattcatgctactagtaaatcag 3’
Psp2：5’tgtgtaacagtaacgttcttttccgcaaaggcagaatgcgccgc 3’；
(2)以gp64DNA为模板，PCR扩增gp64跨膜域基因，PCR所用的两种引物为：
Ptm1：5’cgttacaatgcagaatttgcattggtgatactgggctatccaaaa 3’
Ptm2：5’gtgagctcttactttccaagtcggttcatc 3’；
(3)以禽流感病毒H5N1HA基因序列为模板，扩增HA基因，PCR所用的两种引物为：
Pha1：5’aaagaacgttactgttacac 3’
Pha2：5’atgcaaattctgcattgtaa 3’；
(4)以gp64信号肽基因和HA基因为模板，利用PCR方法扩增出sp-HA融合基因序列，PCR所用的两种引物为：
Psp1：5’gcgaattcatgctactagtaaatcag 3’
Pha2：5’atgcaaattctgcattgtaa 3’
(5)以融合基因sp-HA与gp64跨膜域基因为模板，构建出HA融合基因，PCR所用的两种引物为：
Psp1：5’gcgaattcatgctactagtaaatcag 3’
Ptm2：5’gtgagctcttactttccaagtcggttcatc 3’。
所述的DH10BacTM感受态细胞含Bacmid质粒。
步骤(4)所述的平板含Bluo-gal，卡那霉素、庆大霉素、四环素、IPTG。
步骤(4)所述的液体培养基含卡那霉素、庆大霉素、四环素。
步骤(5)中所述的含抗生素的SFM，所述的抗生素为青霉素和链霉素。
本发明的有益之处在于：本发明构建了BacmidCMV-G-HA重组杆状病毒，感染动物宿主细胞，病毒携带的HA融合基因表达后将会定位于宿主的细胞膜上，以HA为膜蛋白上的一个标志，在分离纯化中通过检测HA活性追踪细胞膜。当病毒大量出芽后，导致宿主细胞的细胞膜破裂，破碎的细胞膜因疏水作用而形成“球状”，因此称之为膜小球。由于蛋白的相互作用，细胞膜上可能会带有细胞器的成分，因而也获得了细胞器的膜成分，反复冻融使细胞器的膜破裂。再对膜成分进行高效液相色谱(HPLC)和质谱分析，从而鉴定并获得膜蛋白。膜蛋白质的研究一直是蛋白质组学研究的瓶颈，本发明主要针对膜蛋白，能促进膜蛋白组学研究的发展，有助于发现药物蛋白作用的靶点，促进药物学、医学的发展。
具体实施方式
本发明的目的是提供一种新的膜蛋白分离纯化的技术方法，通过重组杆状病毒感染动物宿主细胞，病毒携带的HA融合基因表达后将会定位于宿主的细胞膜上，以HA为膜蛋白上的一个标志，有HA活性则表明有细胞膜成分存在。当病毒大量出芽后，导致宿主细胞的细胞膜破裂，膜碎片形成膜小球。分离出宿主细胞膜小球，由于蛋白的相互作用，细胞膜小球上可能会带有细胞器的成分。再对膜“小球”成分进行HPLC和质谱分析，从而鉴定并获得膜蛋白。
为了能时杆状病毒能感染动物细胞，本发明构建了BacmidCMV-G-HA重组杆状病毒，通过从质粒pHCMV-VSV-G中扩增出CMV-VSV-G的序列，同时构建出HA融合基因(在HA基因的N端与C端分别连接上信号肽和跨膜区)，再分别将两者插入到pFastBacTM载体中，形成pFastBacCMV-G-HA质粒，根据Bac-to-Bac
杆状病毒表达系统而获得BacmidCMV-G-HA重组杆状病毒。
下面结合实施例来说明本发明的技术方案：
实施例1
HA基因的作用相当于一个分子标记，在此发明中HA可以用其他的基因或标记物代替，如绿色荧光蛋白GFP，本发明仅以HA基因为例，但这些实施例并不用于限定本发明。
1、融合基因HA的构建
在HA基因(Genbank DQ520855)的5’和3’端分别连接编码杆状病毒囊膜蛋白gp64信号肽基因序列和gp64跨膜区基因序列，并在融合基因的5’和3’端分别引入EcoRI和Xho I酶切位点。分别以杆状病毒(AcNPV)囊膜糖蛋白(gp64)信号肽基因序列(Genbank号NP 074525)、禽流感病毒H5N1HA基因序列(禽流感病毒H5N1杭州流行株，Genbank DQ520855)和AcNPV gp64跨膜区基因序列(Genbank号NP 074525)为模板设计3对引物，首先扩增目的片段gp64信号肽(以下简称：sp)、HA和gp64跨膜域(以下简称：tm)，然后利用各目的片段互为引物和模板合成融合基因HA。设计引物如下：
Psp1：5’gcgaattcatgctactagtaaatcag 3’
Psp2：5’tgtgtaacagtaacgttcttttccgcaaaggcagaatgcgccgc 3’
Pha1：5’aaagaacgttactgttacac 3’
Pha2：5’atgcaaattctgcattgtaa 3’
Ptm1：5’cgttacaatgcagaatttgcattggtgatactgggctatccaaaa 3’
Ptm2：5’gtgagctcttactttccaagtcggttcatc 3’
(1)gp64信号肽(sp)的扩增
以gp64DNA(Genbank号NP 074525)为模板，进行PCR反应，先94℃预变性3min，然后进行30个循环，其循环条件为：94℃变性30s，68℃复性延伸30s；循环结束后，再68℃延伸5min。
在一个无菌的0.5ml离心管中，混合下列成分：
10×PCR Buffer 10μl
25mmol MgCl2 8μl
2.5mmol dNTPs 8μl
Psp1 1μl
Psp2 1μl
模板 1μl
KOD-PlusDNA聚合酶(TOYOBO公司，日本) 1μl
加无菌双蒸水至 100μl
各组分混匀后，放入PCR仪中，按上述反应参数设计30个循环。待反应结束后，电泳鉴定扩增片断，同时切胶回收目的片断。
(2)gp64跨膜域(tm)的扩增
以gp64DNA为模板，进行PCR反应，先94℃预变性3min，然后进行30个循环，其循环条件为：94℃变性30s，68℃复性延伸30s；循环结束后，再68℃延伸5min。
100ul的反应体系同上，所用引物为Ptm1和Ptm2，各组分混匀后，放入PCR仪中，按上述反应参数设计30个循环。待反应结束后，电泳鉴定扩增片断，同时切胶回收目的片断。
(3)HA基因的扩增
以禽流感病毒H5N1 HA基因序列(从患病鸡血清中提取，序列见GenbankDQ520855)为模板，进行PCR反应，先94℃预变性3min，然后进行30个循环，其循环条件为：94℃变性30s，68℃复性延伸1min；循环结束后，再68℃延伸7min。在一个无菌的0.5ml离心管中，混合下列成分：10×PCR Buffer 10μl，25mmol MgCl 28μl，2.5mmol dNTPs 8μl，引物Pha1 1μl，引物Pha21μl，模板1μl，KOD-Plus DNA聚合酶1μl，加无菌双蒸水至100μl。
各组分混匀后，放入PCR仪中，按上述反应参数设计30个循环。待反应结束后，电泳鉴定扩增片断，同时切胶回收目的片断。
(4)gp64信号肽sp基因与HA基因的融合
进行PCR反应，先94℃预变性5min，然后进行30个循环，其循环条件为：94℃变性30s，68℃复性延伸1min；循环结束后，再68℃延伸7min。在一个无菌的0.5ml离心管中，混合下列成分：10×PCR Buffer 10μl，25mmolMgCl2 8μl，2.5mmol dNTPs 8μl，引物Psp1 1μl，引物Pha2 1μl，模板sp 1μl，模板HA 1μl，KOD-Plus DNA聚合酶(TOYOBO，日本)1μl，加无菌双蒸水至100μl。
各组分混匀后，放入PCR仪中，按上述反应参数设计30个循环。待反应结束后，电泳鉴定扩增片断，同时切胶回收目的片断。
因为sp的下游引物Psp2设计时加入了HA基因5’端的部分序列，所以PCR扩增出的sp片断3’端序列与HA基因5’端序列存在重叠，再次利用PCR方法就可以扩增出sp-HA融合基因序列。
(5)融合基因sp-HA再次与tm的融合，构建出HA融合基因
PCR反应参数为94℃预变性5min，然后进行30个循环，其循环条件为：94℃变性30s，68℃复性延伸1.5min；循环结束后，再68℃延伸10min。在一个无菌的0.5ml离心管中，混合下列成分：10×PCR Buffer 10μl，25mmol MgCl28μl，2.5mmol dNTPs 8μl，引物Psp1 1μl，引物Ptm2 1μl，模板sp-HA 1μl，模板tm 1μl，KOD-Plus DNA聚合酶1μl，加无菌双蒸水至100l。
各组分混匀后，放入PCR仪中，按上述反应参数设计30个循环。待反应结束后，电泳鉴定扩增片断，同时切胶回收目的片断。
同上，因为tm的上游引物Ptm1设计时加入了HA基因3’端的部分序列，所以PCR扩增出的tm片断5’端序列与HA基因3’端序列存在重叠，再次利用PCR方法就可以扩增出融合基因HA。
2.构建pFastBac-HA质粒
上述得到的融合基因HA与质粒pFastBacTM(invitrogen公司Bac-to-Bac
baculovirus expression system[kits])同时进行EcoR I和Xho I双酶切，在T4连接酶(TAKARA公司试剂盒，按说明书操作进行)的作用下使HA融合基因插入到pFastBacTM质粒中。根据kits中说明书操作，转化到感受态细胞E.coli DH5α中，挑取单菌落，提取质粒，酶切测序鉴定出正确连接的质粒pFastBac-HA。
3.构建pFastBacCMV-G-HA质粒
通过pHCMV-VSV-G(Genebank NO.AJ318514)的序列设计一对PCR引物，扩增出CMV-VSV-G的序列。上游引物(含BamH I位点)：atggatccgagcttggcccattgcatac，下游引物(含EcoR I位点)：gcgaattcgacggatccttatcactttc。PCR程序设计如下：94℃预变性7min，94℃变性1min，68℃复性延伸3min，30个循环，68℃延伸10min。在一个无菌的0.5ml离心管中，混合下列成分：10×PCR Buffer 10μl，25mmol MgCl2 8μl，2.5mmol dNTPs 8μl，引物各3μl，质粒模板1μl，KOD-Plus DNA聚合酶1μl，加无菌双蒸水至100μl。
PCR反应结束后，电泳，纯化回收反应产物。
纯化的PCR产物与质粒pFastBac-HA分别进行BamH I和EcoR I双酶切，在T4连接酶的作用下使PCR产物克隆至质粒pFastBac-HA中。转化至感受态细胞E.coli DH5α中，挑取单菌落，提取质粒，酶切和测序鉴定正确插入的重组质粒pFastBacCMV-G-HA。
4.杆状病毒表达质粒BacmidCMV-G-HA
根据Bac-to-Bac
baculovirus expression system操作说明书进行，取5ul(约1ng)重组质粒pFastBacCMV-G-HA转化到DH10BacTM感受态细胞(含Bacmid质粒)中，平板(含Bluo-gal，卡那霉素，庆大霉素，四环素，IPTG)于37℃培养24-48h后挑取白色克隆。划线接种至平板上，过夜培养，证实是阳性克隆。第二天，挑取单菌落接种于液体培养基(含上述三种抗生素)中培养，用来分离重组Bacmid质粒，根据说明书的操作而获得重组质粒BacmidCMV-G-HA。PCR鉴定重组质粒序列正确。
5.含重组质粒的重组杆状病毒BacmidCMV-G-HA的获得
根据操作说明书进行，取重组质粒BacmidCMV-G-HA的DNA约5ul加入100ul Sf-900II SFM(不含抗生素，invitrogen)，取cellfectin
试剂(invitrogen)加入到100ul的Sf-900II SFM(不含抗生素)，再将两者混匀，室温放置15-30min。Sf9(9×105cells/35mm well)培养在含50个单位的青霉素和链霉素的SFM中，将细胞转移到27℃至少放置1h，再用不含抗生素的SFM培养基洗涤两次后，加入上述的DNA混合物，27℃培养5h。用移液器移去DNA混合物，加入SFM(含青霉素和链霉素)，于27℃培养72h。收获细胞，获得重组杆状病毒BacmidCMV-G-HA。
6.重组杆状病毒感染小鼠肝细胞
此重组杆状病毒可以感染哺乳类动物细胞，本发明以小鼠肝细胞为例。
重组杆状病毒以5MOI感染小鼠肝细胞(购于上海麦莎生物)，37℃、5％CO2条件下培养5-6天，PBS冲洗，收获细胞，并超声破碎细胞。
6.膜蛋白的分离
将上述细胞破碎液经12000rpm离心35min，膜碎片或膜小球沉淀；上清液进行超速离心，35000rpm，45min，去除病毒粒子；收集12000rpm离心的沉淀和35000rpm离心的上清液，沉淀用PBS重悬溶解；
8.超滤
12000rpm离心沉淀的重悬液和35000rpm离心的上清，用截留分子量为750kD的中空纤维膜(美国GE公司)进行超滤，得到细胞膜及细胞器的膜蛋白。截留液用于HPLC分析。超滤器的操作根据说明书进行，一定要清洗中空纤维膜。
9.HA活性检测
截留的样品进行测活，测活方法采用红细胞凝集试验。取24孔细胞培养板，在每一排的1到6孔(A1-A6)加250μl生理盐水(0.85％)后，加入250μl样品于第一孔，做倍比稀释，同时设置阴性对照孔，加入不含样品的液体做倍比稀释，再加入1％鸡红细胞悬液250μl至每一孔内，轻轻震荡培养板，于37℃孵育4小时后观察结果。结果显示是阳性，说明HA融合蛋白使定位于膜上的，否则HA将会滤出纤维膜。
10.HPLC与Q-Trap LC-MS/MS质谱分析膜成分
在750kD超滤的样品中，由于蛋白之间的相互作用，细胞膜蛋白可能与细胞器的膜蛋白粘连在一起，为了使细胞器的膜蛋白破裂，将截留样品在液氮和+37℃之间反复冻融3-5次，使膜破裂。12000rpm，离心20-60min，使大片的膜沉淀下来，用于后面的HPLC分析。上清液也用于HPLC分析。
12000rpm沉淀部分用20％乙腈反复溶解后，取上清，用于HPLC上样，0.5ml/管收集样品。
12000rpm上清液溶解于5％乙腈(acetonitrile)，直接上样于HPLC，按0.5ml/管收集样品。
收集的样品用质谱级胰酶(trypsin，购于sigma)进行酶解，于37℃反应过夜。酶解后的肽段样品再进行HPLC分析，按峰或按管收集样品，用于质谱分析。
经HPLC分析的样品进行Q-Trap LC-MS/MS(美国ABI公司)质谱分析，得到蛋白的可能氨基酸序列，用于数据库比对。
11.数据检索
质谱所测得的可能性氨基酸序列在NCBI蛋白数据库中进行检索，同时通过NPS@提供的跨膜区域分析软件及TMHMM服务器(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)对检索到的蛋白进行跨膜分析，分析结果发现，约80％的蛋白为膜蛋白，具有跨膜区。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
SEQ ID NO 1：
28atggatccga gcttggccca ttgcatac
SEQ ID NO 2：
28gcgaattcga cggatcctta tcactttc
SEQ ID NO 3：
26gcgaattcat gctactagta aatcag
SEQID NO 4：
44tgtgtaacag taacgttctt ttccgcaaag gcagaatgcg ccgc
SEQ ID NO 5：
45cgttacaatg cagaatttgc attggtgata ctgggctatc caaaa
SEQ ID NO 6：
30gtgagctctt actttccaag tcggttcatc
SEQ ID NO 7：
20aaagaacgtt actgttacac
SEQ ID NO 8：
20atgcaaattc tgcattgtaa
Claims (9)
1、一种制备动物细胞膜及细胞器的膜蛋白的方法，其特征在于：通过重组杆状病毒BacmidCMV-G-HA感染动物宿主细胞后增殖，在病毒大量出芽后，宿主细胞膜破裂，细胞膜碎片疏水作用会形成膜小球，经分离、超滤，获得细胞膜及细胞器膜蛋白。
2、根据权利要求1所述的制备动物细胞膜及细胞器的膜蛋白的方法，其特征依次包括以下步骤：
(1)重组杆状病毒BacmidCMV-G-HA以5MOI感染动物宿主细胞，37℃、5％CO2条件下培养5-6天，用PBS冲洗细胞，收获动物细胞并超声破碎；
(2)将上述破碎液经12000rpm离心20-60min，膜碎片或膜小球沉淀；上清液进行超速离心，35000rpm，30-60min，去除病毒粒子；收集12000rpm离心的沉淀和35000rpm离心的上清液，沉淀用PBS重悬溶解；
(3)将12000rpm离心沉淀的重悬液及35000rpm离心的上清液，用截留分子量为750kD的中空纤维膜超滤，获得细胞膜及细胞器的膜蛋白。
3、根据权利要求1或2所述的制备动物细胞膜及细胞器的膜蛋白的方法，其特征在于所述重组杆状病毒BacmidCMV-G-Ha的构建方法：在pFastBacTM载体中插入CMV-VSV-G序列和HA融合基因序列后，利用
系统获得Bacmi dCMV-G-HA。
4、根据权利要求3所述的制备动物细胞膜及细胞器的膜蛋白的方法，其特征在于所述重组杆状病毒BacmidCMV-G-Ha的构建方法包括以下步骤：
(1)融合基因HA与质粒pFastBacTM同时进行EcoRI和XhoI双酶切，在T4连接酶的作用下使HA融合基因插入到pFastBacTM质粒中，转化到感受态细胞E.coli DH5α中，挑取单菌落，提取质粒，酶切测序鉴定出正确连接的质粒pFastBac-HA；
(2)通过pHCMV-VSV-G的序列设计一对PCR引物，扩增出CMV-VSV-G的序列，含BamH I位点的上游引物：atggatccgagcttggcccattgcatac，含EcoR I位点的下游引物：gcgaattcgacggatccttatcactttc，PCR反应结束后，电泳，纯化回收反应产物；
(3)步骤(2)纯化后的PCR产物与步骤(1)所得质粒pFastBac-HA分别进行BamH I和EcoR I双酶切，在T4连接酶的作用下使PCR产物克隆至质粒pFastBac-HA中，转化至感受态细胞DH5α中，挑取单菌落，提取质粒，酶切和测序鉴定正确插入的重组质粒pFastBacCMV-G-HA；
(4)根据
系统，取5ul步骤(3)所得重组质粒pFastBacCMV-G-HA转化到DH10BacTM感受态细胞中，平板于37℃培养24-48h后挑取白色克隆，划线接种至平板上，过夜培养，证实是阳性克隆；第二天，挑取单菌落接种于液体培养基中培养，获得重组质粒Bacmi dCMV-G-HA；
(5)取重组质粒BacmidCMV-G-HA的DNA约5ul加入100ul Sf-900IISFM，取
试剂加入到100ul的Sf-900 II SFM，再将两者混匀，室温放置15-30min，Sf9培养在含50个单位的青霉素和链霉素的SFM中，将细胞转移到27℃至少放置1h，再用不含抗生素的SFM培养基洗涤两次后，加入上述的DNA混合物，27℃培养5h。移去DNA混合物，加入含抗生素的SFM，于27℃培养72h，收获细胞，获得重组杆状病毒BacmidCMV-G-HA。
5、根据权利要求4所述的制备动物细胞膜及细胞器的膜蛋白的方法，其特征在于所述的融合基因HA的构建包括以下步骤：
(1)以gp64DNA为模板，PCR扩增gp64信号肽基因，PCR所用的两种引物为：
Psp1：5’gcgaattcatgctactagtaaatcag 3’
Psp2：5’tgtgtaacagtaacgttcttttccgcaaaggcagaatgcgccgc 3’；
(2)以gp64DNA为模板，PCR扩增gp64跨膜域基因，PCR所用的两种引物为：
Ptm1：5’cgttacaatgcagaatttgcattggtgatactgggctatccaaaa 3’
Ptm2：5’gtgagctcttactttccaagtcggttcatc 3’；
(3)以禽流感病毒H5N1HA基因序列为模板，扩增HA基因，PCR所用的两种引物为：
Pha1：5’aaagaacgttactgttacac 3’
Pha2：5’atgcaaattctgcattgtaa 3’；
(4)以gp64信号肽基因和HA基因为模板，利用PCR方法扩增出sp-HA融合基因序列，PCR所用的两种引物为：
Psp1：5’gcgaattcatgctactagtaaatcag 3’
Pha2：5’atgcaaattctgcattgtaa 3’；
(5)以融合基因sp-HA与gp64跨膜域基因为模板，构建出HA融合基因，PCR所用的两种引物为：
Psp1：5’gcgaattcatgctactagtaaatcag 3’
Ptm2：5’gtgagctcttactttccaagtcggttcatc 3’。
6、根据权利要求4所述的制备动物细胞膜及细胞器的膜蛋白的方法，其特征在于：步骤(4)所述的DH10BacTM感受态细胞含Bacmid质粒。
7、根据权利要求4所述的制备动物细胞膜及细胞器的膜蛋白的方法，其特征在于：步骤(4)所述的平板含Bluo-gal，卡那霉素、庆大霉素、四环素、IPTG。
8、根据权利要求4所述的制备动物细胞膜及细胞器的膜蛋白的方法，其特征在于：步骤(4)所述的液体培养基含卡那霉素、庆大霉素、四环素。
9、根据权利要求4所述的利用囊膜病毒出芽特性高效获得膜蛋白的方法，其特征在于：步骤(5)中所述的含抗生素的SFM，所述的抗生素为青霉素和链霉素。
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