CN101358206B - 基于昆虫病毒出芽后细胞膜及细胞器膜蛋白的分离方法 - Google Patents
基于昆虫病毒出芽后细胞膜及细胞器膜蛋白的分离方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101358206B CN101358206B CN2008101204759A CN200810120475A CN101358206B CN 101358206 B CN101358206 B CN 101358206B CN 2008101204759 A CN2008101204759 A CN 2008101204759A CN 200810120475 A CN200810120475 A CN 200810120475A CN 101358206 B CN101358206 B CN 101358206B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- membrane
- supernatant
- template
- centrifugal
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 title claims abstract description 18
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 15
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 14
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 13
- 238000000926 separation method Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 239000012528 membrane Substances 0.000 title abstract description 8
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 title abstract 4
- 230000034303 cell budding Effects 0.000 title abstract 3
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 title 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 claims abstract description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 12
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims abstract description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 39
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 34
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 33
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 19
- 101710141347 Major envelope glycoprotein Proteins 0.000 claims description 18
- 101150039660 HA gene Proteins 0.000 claims description 15
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 claims description 13
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 13
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 13
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 11
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 9
- 101100301987 Rattus norvegicus Rida gene Proteins 0.000 claims description 8
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 7
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 4
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 3
- 241000382353 Pupa Species 0.000 claims description 3
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 claims description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 3
- 238000005336 cracking Methods 0.000 claims description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 3
- 210000002220 organoid Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 32
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 abstract description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 abstract description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 abstract 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 abstract 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 abstract 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 abstract 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 abstract 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 10
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 10
- 238000013461 design Methods 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 5
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 101100348341 Caenorhabditis elegans gas-1 gene Proteins 0.000 description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 101100447658 Mus musculus Gas1 gene Proteins 0.000 description 4
- 239000004519 grease Substances 0.000 description 4
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 4
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 210000004460 N cell Anatomy 0.000 description 2
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000005252 bulbus oculi Anatomy 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000005859 cell recognition Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种基于昆虫病毒出芽后细胞膜及细胞器膜蛋白的分离方法：通过重组杆状病毒Bm-sp-HA-tm感染昆虫宿主细胞后增殖，在病毒大量出芽后，宿主细胞膜破裂，经分离、超滤，获得细胞膜及细胞器膜蛋白。本发明提供了一种大量分离膜蛋白的方法，利用杆状病毒感染昆虫细胞后以出芽的方式大量释放出来，致使细胞破裂，细胞剩余的膜因疏水作用而形成膜“小球”状，并且膜带有杆状病毒表达的HA融合蛋白，以此为膜蛋白的标志，经过多步纯化步骤获得宿主细胞剩余膜，过750kD中空纤维膜超滤后，再经HPLC和质谱分析，鉴定并找出目标膜蛋白。
Description
技术领域
本发明涉及一种蛋白质工程中的蛋白表达与分离纯化的领域，特别涉及一种利用昆虫病毒出芽后分离获得细胞膜及细胞器的膜蛋白的方法。
背景技术
生物膜有着重要的生物功能，如提供细胞识别位点，介导细胞与细胞、细胞与基质之间的连接等等。膜蛋白的研究也正成为蛋白质组研究的热点。膜蛋白是许多药物的作用靶位点，研究膜蛋白不仅有利于低丰度蛋白的研究，更为药物研发和疾病的诊断提供靶体与标记蛋白质。然而，膜蛋白的分离是膜蛋白研究的“瓶颈”。
发明内容
针对现有技术的不足之处，本发明提供一种细胞膜和细胞器膜蛋白分离与纯化新的技术方法。
本发明的一种基于昆虫病毒出芽后细胞膜及细胞器膜蛋白的分离方法：通过重组杆状病毒Bm-sp-HA-tm感染昆虫宿主细胞后增殖，在病毒大量出芽后，宿主细胞膜破裂，经分离、超滤，获得细胞膜及细胞器膜蛋白。
所述的基于昆虫病毒出芽后细胞膜及细胞器膜蛋白的分离方法，依次包括以下步骤：
(1)重组杆状病毒Bm-sp-HA-tm×106PFU/条针刺接种法感染昆虫宿主细胞，培养5—7天，收获细胞；
(2)将上述收获物在4℃下解冻后，与0.85％生理盐水混和，匀浆；3000rpm离心20-60min，取上清；6000rpm离心20-60min，取上清；12000rpm离心30-120min，取上清；18000rpm离心30-120min，取上清；35000rpm离心30-90min；35000rpm离心后，取上清，进行超滤，获得细胞膜及细胞器的膜蛋白。
所述的昆虫宿主细胞为家蚕蛹。
所述重组杆状病毒Bm-sp-HA-tm的构建方法包括以下步骤：
(1)以gp64DNA为模板，PCR扩增gp64信号肽，所用引物：
Psp1：5’gcggatcc atgctactagtaaatcagtc3’；
Psp2：5’catgtgtaacagtaacgttcttttccgcaaaggcagaatgcgccgccgcc3’；
(2)以gp64DNA为模板，PCR扩增gp64跨膜域，所用引物：
Ptm1：5’gtcgttacaatgcagaatttgcattggtgatactgggctatccaaaaatc3’
Ptm2：5’gagcggccgc ttactttccaagtcggttcatctct3’；
(3)以禽流感病毒H5N1HA基因为模板，PCR扩增HA基因，所用引物：
Pha1：5’gaaaagaacgttactgttacacatgc3’
Pha2：5’aatgcaaattctgcattgtaacgac3’
(4)以gp64信号肽和HA基因为模板，PCR扩增sp-HA融合基因，所用引物：
Psp1：5’gcggatcc atgctactagtaaatcagtc3’；
Pha2：5’aatgcaaattctgcattgtaacgac3’
(5)以sp-HA融合基因和gp64跨膜域为模板，PCR扩增sp-HA-tm融合基因，所用引物：
Psp1：5’gcggatcc atgctactagtaaatcagtc3’；
Ptm2：5’gagcggccgc ttactttccaagtcggttcatctct3’；
(6)将融合基因sp-HA-tm连接到pGEM-T vector上，转化至感受态细胞E.coli DH5α中，构建得克隆质粒pGEM-sp-HA-tm；
(7)克隆质粒pGEM-sp-HA-tm经BamHI和NotI双酶切切下sp-HA-tm融合基因片段克隆至经BamH I和Not I双酶切的pBacPAK8中，构建成重组转移质粒pBacsp-HA-tm；
(8)取重组转移质粒pBac-sp-HA-tm DNA和经Bsu36I酶切线性化的修饰型病毒BmBacPAK6DNA，加入无血清的TC-100培养基混匀，取Dosper加入无血清的TC-100培养基混均，将事先培养在平皿中的BmN细胞用无血清的TC-100培养基洗涤两次，并逐滴加入pBac-sp-HA-tm转移质粒和Dosper混合物，27℃培养4-5天，取上清感染平皿中的Bm N细胞，1小时后弃去上清加入等量混合的TC-100培养基和低熔点琼脂糖，4-5天后挑取噬斑，感染BmN细胞3-4天，保存上清，细胞用NaOH裂解用于Southern blot斑点杂交，以sp-HA-tm融合基因作模板用随机引物探针标记试剂盒标记探针，杂交；取阳性克隆的上清感染家蚕细胞扩增，即得到含sp-HA-tm融合基因的重组杆状病毒Bm-sp-HA-tm。
本发明的有益之处在于：提供一种大量分离膜蛋白的方法，利用杆状病毒感染昆虫细胞后以出芽的方式大量释放出来，致使细胞破裂，细胞剩余的膜因疏水作用而形成膜“小球”状，并且膜带有杆状病毒表达的HA融合蛋白，以此为膜蛋白的标志，经过多步纯化步骤获得宿主细胞剩余膜，过750kD中空纤维膜超滤后，再经HPLC和质谱分析，鉴定并找出目标膜蛋白。本发明能促进膜蛋白组学研究的发展，有助于发现药物蛋白作用的靶点，促进药物学、医学的发展。
说明书附图
图1为本发明的实施例的质粒pGEM-sp-HA-tm；
图2为本发明的实施例的质粒pBac-sp-HA-tm。
具体实施方式
下面结合实施例来说明本发明的技术方案：
1.融合基因sp-HA-tm的构建。
在HA基因(Genbank号DQ520855)的5’和3’端分别连接编码杆状病毒囊膜蛋白gp64信号肽基因序列(Genbank号NP074525)和gp64跨膜区基因(Genbank号NP074525)序列，并在融合基因的5’和3’端分别引入BamH I和Not I酶切位点。分别以杆状病毒AcNPV gp64信号肽基因序列(Genbank号NP074525)、禽流感病毒H5N1HA基因序列(Genbank号DQ520855)和gp64跨膜区基因序列(Genbank号NP074525)为模板设计3对引物，首先扩增目的片段gp64信号肽(sp)、HA和gp64跨膜域(tm)，然后利用各目的片段互为引物和模板合成融合基因sp-HA-tm。设计引物如下：
Psp1：5’gcggatcc atgctactagtaaatcagtc3’
Psp2：5’catgtgtaacagtaacgttcttttccgcaaaggcagaatgcgccgccgcc3’
Pha1：5’gaaaagaacgttactgttacacatgc3’
Pha2：5’aatgcaaattctgcattgtaacgac3’
Ptm1：5’gtcgttacaatgcagaatttgcattggtgatactgggctatccaaaaatc3’
Ptm2：5’gagcggccgc ttactttccaagtcggttcatctct3’
gp64信号肽(sp)的扩增
以gp64DNA(Genbank号NP074525)为模板，PCR反应参数设计为，94℃预变性3min，94℃变性30s，68℃复性延伸30s，30个循环，68℃延伸5min。
在一个无菌的0.5ml离心管中，混合下列成分：
10×PCR Buffer 10μl
25mmol MgCl2 8μl
2.5mmol dNTPs 8μl
Psp1 1μl
Psp2 1μl
模板 1μl
KOD-Plus DNA聚合酶(TOYOBO公司，日本)1μl
加无菌双蒸水至100μl
各组分混匀后，放入PCR仪中，按上述反应参数设计30个循环。待反应结束后，电泳鉴定扩增片断，同时切胶回收目的片断。
(2)gp64跨膜域(tm)的扩增
以gp64DNA(Genbank号NP074525)为模板，PCR反应参数设计为，94℃预变性3min，94℃变性30s，68℃复性延伸30s，30个循环，68℃延伸5min。
100ul的反应体系同上，所用引物为Ptm1和Ptm2，各组分混匀后，放入PCR仪中，按上述反应参数设计30个循环。待反应结束后，电泳鉴定扩增片断，同时切胶回收目的片断。
(3)HA基因的扩增
以禽流感病毒H5N1HA基因(Genbank号DQ520855)为模板，PCR反应参数为94℃预变性3min，94℃变性30s，68℃复性延伸1min，30个循环，68℃延伸5min。在一个无菌的0.5ml离心管中，混合下列成分：10×PCR Buffer10l，25mmol MgCl28μl，2.5mmol dNTPs8μl，引物Pha11μl，引物Pha21μl，模板1μl，KOD-Plus DNA聚合酶(TOYOBO公司，日本)1μl，加无菌双蒸水至100μl。
各组分混匀后，放入PCR仪中，按上述反应参数设计30个循环。待反应结束后，电泳鉴定扩增片断，同时切胶回收目的片断。
(4)gp64信号肽sp基因与HA基因的融合
PCR反应参数为94℃预变性3min，94℃变性30s，68℃复性延伸1min，30个循环，68℃延伸5min。在一个无菌的0.5ml离心管中，混合下列成分：10×PCR Buffer10μl，25mmol MgCl28μ1，2.5mmol dNTPs8μl，引物Psp11μ1，引物Pha21μl，模板sp1μl，模板HA1μl，KOD-Plus DNA聚合酶(TOYOBO公司，日本)1μl，加无菌双蒸水至100μl。
各组分混匀后，放入PCR仪中，按上述反应参数设计30个循环。待反应结束后，电泳鉴定扩增片断，同时切胶回收目的片断。
因为sp的下游引物Psp2设计时加入了HA基因5’端的部分序列，所以PCR扩增出的sp片断3’端序列与HA基因5’端序列存在重叠，再次利用PCR方法就可以扩增出sp-HA融合基因序列。
(5)融合基因sp-HA再次与tm的融合
PCR反应参数为94℃预变性3min，94℃变性30s，68℃复性延伸1.5min，30个循环，68℃延伸5min。在一个无菌的0.5ml离心管中，混合下列成分：10×PCR Buffer10μl，25mmol MgCl28μl，2.5mmol dNTPs8μl，引物Psp11μl，引物Ptm21μl，模板sp-HA1μl，模板tm1μl，KOD-Plus DNA聚合酶(TOYOBO公司，日本)1μl，加无菌双蒸水至100μl。
各组分混匀后，放入PCR仪中，按上述反应参数设计30个循环。待反应结束后，电泳鉴定扩增片断，同时切胶回收目的片断。
同上，因为tm的上游引物Ptm1设计时加入了HA基因3’端的部分序列，所以PCR扩增出的tm片断5’端序列与HA基因3’端序列存在重叠，再次利用PCR方法就可以扩增出sp-HA-tm融合基因即sp-HA-tm序列。
2.克隆质粒pGEM-sp-HA-tm(图1)的构建
将PCR扩增出的融合基因sp-HA-tm连接到pGEM-T vector上
融合基因sp-HA-tm 2ul
pGEM-T vector 0.5ul
2×Rapid Ligation buffer 5ul
T4DNA ligase 1ul
ddH2O 1.5ul
混匀上述组分，25℃反应1h。反应混合物转化至感受态细胞E.coli DH5α中，LB固体培养基培养过夜，挑取单菌落，提取质粒，进行酶切初步鉴定，经测序，序列完全正确。
3.含sp-HA-tm融合基因杆状病毒转移质粒pBac-sp-HA-tm(图2)的获得
质粒pGEM-sp-HA-tm经BamH I和Not I双酶切切下sp-HA-tm融合基因片段克隆至经BamH I和Not I双酶切的pBacPAK8(Clontech公司)中，使sp-HA-tm融合基因置于多角体蛋白(polyhedrin，ph)基因启动子控制之下，构建成重组转移质粒pBacsp-HA-tm，经酶切分析鉴定基因序列正确。
4.含sp-HA-tm融合基因的家蚕重组杆状病毒Bm-sp-HA-tm的获得
取5ul重组转移质粒pBac-sp-HA-tm DNA和6ul经Bsu36I酶切线性化的修饰型病毒BmBacPAK6DNA(购自上海生化细胞所)，加入100ul无血清的TC-100培养基(GIBCOBRL公司)混均。取6ulDosper(宝灵曼公司)加入100ul无血清的TC-100培养基(GIBCOBRL公司)混均。将事先培养在35mm平皿中的BmN细胞用无血清的TC-100培养基洗涤两次，并逐滴加入pBac-sp-HA-tm转移质粒和Dosper混合物，27℃培养4-5天，收取上清进行第一轮噬斑筛选。取5ul上清感染35mm平皿中的Bm N细胞(购自上海生化细胞所)，1小时后弃去上清加入等量混合的TC-100培养基和低熔点琼脂糖。4-5天后挑取噬斑，感染BmN细胞3-4天，保存上清，细胞用NaOH裂解用于Southern blot斑点杂交，以sp-HA-tm融合基因作模板用随机引物探针标记试剂盒(宝灵曼公司)标记探针，杂交方法按照《分子克隆》(科学出版社，1995)。取阳性克隆的上清进行第二轮噬斑筛选。取阳性克隆的上清感染家蚕细胞扩增。即可得到大量的含sp-HA-tm融合基因的重组杆状病毒Bm-sp-HA-tm。该病毒能感染家蚕细胞，在显微镜下细胞呈发病状。
5.杆状病毒感染昆虫(家蚕)细胞
将杆状病毒以1×106PFU/条针刺接种法接入家蚕蛹，在感染5-7天后收集蚕蛹。
6.宿主细胞剩余膜即膜“小球”的分离
(1)从蚕蛹中分离纯化含有HA融合蛋白的膜成分
a.取适量经杆状病毒感染的蚕蛹样品，在4℃下解冻后，与0.85％生理盐水适量混和，匀浆至浆液细致均匀即可；
b.将匀浆液加入500ml离心管中，配平，3000rpm离心20-60min，取上清，小心弃去油脂；
c.将3000rpm离心上清液倒入新500ml离心管中，配平，6000rpm离心20-60min，取上清，弃油脂；
d.6000rpm离心的上清液倒入50ml离心管，配平，12000rpm离心30-120min，取上清，弃油脂；
e.12000rpm离心上清液转入新的50ml离心管，配平，18000rpm离心30-120min，取上清，弃油脂；
f.18000rpm离心后的上清，在超净台上分装于灭菌的超离管中，平衡，35000rpm离心30-90min；
g.35000rpm离心后，取上清，进行超滤。
(2)超滤
使用截留分子量为750kD中空纤维膜进行超滤，根据仪器说明书进行操作。先进行清洗，后加样，用适量无菌超纯水超滤。截留的液体将用于后面的实验。
HA融合蛋白检测
测活方法采用红细胞凝集试验。取24孔细胞培养板，在每一排的1到6孔(A1-A6)加250μl生理盐水(0.85％)后，加入250μl样品于第一孔，做倍比稀释，同时设置阴性对照孔，加入不含样品的液体做倍比稀释，再加入1％鸡红细胞(公鸡市售，抽血，制备成1％红细胞溶液)悬液250μl至每一孔内，轻轻震荡培养板，于37℃孵育4小时后观察结果。结果显示是阳性，说明截留的样品中有HA融合蛋白的表达，因HA是定位于膜上，则说明了截留的样品是膜蛋白。
7.HPLC与质谱分析膜蛋白
对于上述分离出的膜蛋白进行—80℃和+37℃反复冻融3次，12000rpm离心30min。沉淀部分用5％乙睛反复溶解，用于HPLC上样，按0.5ml/管收集样品。12000rpm离心的上清直接用于HPLC分析，按0.5ml/管收集样品。
收集到的蛋白溶液注入ABI公司所产的三级四极杆线性离子阱Q-TRAPTMLC/MS/MS系统进行EMS(Enhanced MS)、EMC(Enhanced Multi-charged)和EPI(Enhanced Product Ion)扫描分析。系统条件如下：Ion source：turbosprayTM interface，syringe pump flow rate:3ul/min，syringediameter:4.61.mm。EMS、EMC扫描条件为阳离子模式下Curtain Gas(CUR)：10.0，Collision Gas(CAD):High，Ionspray Votage(IS):5500，ionsource Gas1(GS1):20；Declustering Potential(DP):30.0V，Entrance Potential(EP)：10.0V，Collision Energy(CE)：10.0eV；质荷比(m/z)采集范围为200-1700amu。EPI扫描模式条件为Curtain Gas：15.0，Collision Gas：High，Ionspray Votage：5500；ion source Gas1(Gas1)：20；Declustering Potential(DP)：70.0V，Entrance Potential(EP)：10.0V，Collision Energy(CE)：40.0eV；质荷比(m/z)采集范围为50-1700amu。分析获得目的蛋白质的可能氨基酸序列，建成数据库。
8.数据检索
质谱所测得的可能性氨基酸序列与西南农大和本地的家蚕蛋白数据库进行比对，通过NPS提供的跨膜区域分析软件及TMHMM服务器(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)对蛋白进行跨膜分析，分析结果发现，约85％的蛋白为膜蛋白，具有跨膜区。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
SEQ ID NO1：
SEQ ID NO2：
SEQ ID NO3：
SEQ ID NO4：
SEQ ID NO5：
SEQ ID NO6：
Claims (2)
1.一种基于昆虫病毒出芽后细胞膜及细胞器膜蛋白的分离方法，其特征在于：通过重组杆状病毒Bm-sp-HA-tm感染昆虫宿主细胞后增殖，在病毒大量出芽后，宿主细胞膜破裂，经分离、超滤，获得细胞膜及细胞器膜蛋白；所述昆虫为家蚕蛹；
所述重组杆状病毒Bm-sp-HA-tm的构建方法包括以下步骤：
(1)以gp64 DNA为模板，PCR扩增gp64信号肽，所用引物：
Psp1：5’gcggatcc atgctactagtaaatcagtc 3’；
Psp2：5’catgtgtaacagtaacgttcttttccgcaaaggcagaatgcgccgccgcc 3’；
(2)以gp64 DNA为模板，PCR扩增gp64跨膜域，所用引物：
Ptm1：5’gtcgttacaatgcagaatttgcattggtgatactgggctatccaaaaatc 3’
Ptm2：5’gagcggccgc ttactttccaagtcggttcatctct 3’；
(3)以禽流感病毒H5N1 HA基因为模板，PCR扩增HA基因，所用引物：
Pha1：5’gaaaagaacgttactgttacacatgc 3’
Pha2：5’aatgcaaattctgcattgtaacgac 3’
(4)以gp64信号肽和HA基因为模板，PCR扩增sp-HA融合基因，所用引物：
Psp1：5’gcggatcc atgctactagtaaatcagtc 3’；
Pha2：5’aatgcaaattctgcattgtaacgac 3’
(5)以sp-HA融合基因和gp64跨膜域为模板，PCR扩增sp-HA-tm融合基因，所用引物：
Psp1：5’gcggatcc atgctactagtaaatcagtc 3’；
Ptm2：5’gagcggccgc ttactttccaagtcggttcatctct 3’；
(6)将融合基因sp-HA-tm连接到pGEM-T vector上，转化至感受态细胞E.coli DH5α中，构建得克隆质粒pGEM-sp-HA-tm；
(7)克隆质粒pGEM-sp-HA-tm经BamH I和Not I双酶切切下sp-HA-tm融合基因片段克隆至经BamH I和Not I双酶切的pBacPAK8中，构建成重组转移质粒pBac-sp-HA-tm；
(8)取重组转移质粒pBac-sp-HA-tm DNA和经Bsu36I酶切线性化的修饰型病毒BmBacPAK6 DNA，加入无血清的TC-100培养基混匀，取Dosper加入无血清的TC-100培养基混均，将事先培养在平皿中的BmN细胞用无血清的TC-100培养基洗涤两次，并逐滴加入pBac-sp-HA-tm转移质粒和Dosper混合物，27℃培养4-5天，取上清感染平皿中的BmN细胞，1小时后弃去上清加入等量混合的TC-100培养基和低熔点琼脂糖，4-5天后挑取噬斑，感染BmN细胞3-4天，保存上清，细胞用NaOH裂解用于Southern blot斑点杂交，以sp-HA-tm融合基因作模板用随机引物探针标记试剂盒标记探针，杂交；取阳性克隆的上清感染家蚕细胞扩增，即得到含sp-HA-tm融合基因的重组杆状病毒Bm-sp-HA-tm。
2.根据权利要求1所述的基于昆虫病毒出芽后细胞膜及细胞器膜蛋白的分离方法，其特征依次包括以下步骤：
(1)重组杆状病毒Bm-sp-HA-tm1×106PFU/条针刺接种法感染昆虫宿主细胞，培养5-7天，收获细胞；
(2)将上述收获物在4℃下解冻后，与0.85％生理盐水混和，匀浆；3000rpm离心20-60min，取上清；6000rpm离心20-60min，取上清；12000rpm离心30-120min，取上清；18000rpm离心30-120min，取上清；35000rpm离心30-90min；35000rpm离心后，取上清，进行超滤，获得细胞膜及细胞器的膜蛋白。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2008101204759A CN101358206B (zh) | 2008-08-29 | 2008-08-29 | 基于昆虫病毒出芽后细胞膜及细胞器膜蛋白的分离方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2008101204759A CN101358206B (zh) | 2008-08-29 | 2008-08-29 | 基于昆虫病毒出芽后细胞膜及细胞器膜蛋白的分离方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101358206A CN101358206A (zh) | 2009-02-04 |
| CN101358206B true CN101358206B (zh) | 2012-08-01 |
Family
ID=40330804
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2008101204759A Expired - Fee Related CN101358206B (zh) | 2008-08-29 | 2008-08-29 | 基于昆虫病毒出芽后细胞膜及细胞器膜蛋白的分离方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101358206B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103665150B (zh) * | 2012-12-24 | 2015-08-19 | 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 | 猪β2肾上腺素受体融合蛋白及其编码基因和表达方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101113460A (zh) * | 2007-07-03 | 2008-01-30 | 中国科学院武汉病毒研究所 | 重组杆状病毒AcBacΔCC－GP41及其构建方法 |
| CN101168743A (zh) * | 2007-10-11 | 2008-04-30 | 浙江中奇生物药业股份有限公司 | 重组杆状病毒及其制备方法和应用 |
-
2008
- 2008-08-29 CN CN2008101204759A patent/CN101358206B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101113460A (zh) * | 2007-07-03 | 2008-01-30 | 中国科学院武汉病毒研究所 | 重组杆状病毒AcBacΔCC－GP41及其构建方法 |
| CN101168743A (zh) * | 2007-10-11 | 2008-04-30 | 浙江中奇生物药业股份有限公司 | 重组杆状病毒及其制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 吕新法等..流行性出血热病毒的冻融裂解及其机理探讨.《 浙江医科大学学报》.1990,第19卷(第2期),49-52. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101358206A (zh) | 2009-02-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hoang et al. | Identification, characterization, and distribution of southern rice black-streaked dwarf virus in Vietnam | |
| Tsai et al. | Genomic and proteomic analysis of thirty-nine structural proteins of shrimp white spot syndrome virus | |
| Pearson et al. | p39, a major baculovirus structural protein: immunocytochemical characterization and genetic location | |
| Larsen et al. | Evolution and diversity of bat and rodent paramyxoviruses from North America | |
| US20240085419A1 (en) | Methods and kits for quantifying the removal of mock virus particles from a purified solution | |
| CN101358206B (zh) | 基于昆虫病毒出芽后细胞膜及细胞器膜蛋白的分离方法 | |
| CN109402069A (zh) | 一种假病毒颗粒及其制备方法和应用 | |
| CN110643580B (zh) | 槟榔坏死梭斑病毒及其检测方法 | |
| CN101358203B (zh) | 一种基于昆虫的囊膜病毒出芽方式制备膜蛋白的方法 | |
| CN100340673C (zh) | 人类免疫缺陷病毒hiv－1核酸扩增－荧光定量检测试剂盒 | |
| CN101358204B (zh) | 一种重组杆状病毒感染后细胞膜及细胞器膜蛋白的制备方法 | |
| Chen et al. | A vicilin-like seed storage protein, PAP85, is involved in tobacco mosaic virus replication | |
| Stewart et al. | Identification of novel subgroup A variants with enhanced receptor binding and replicative capacity in primary isolates of anaemogenic strains of feline leukaemia virus | |
| CN101561415B (zh) | 一种同时检测香蕉束顶病毒和花叶心腐病毒的检测方法 | |
| Huang et al. | A mitochondrial membrane protein is a target for rice ragged stunt virus in its insect vector | |
| CN110129362B (zh) | 芜菁花叶病毒p3蛋白插入标签的方法及其重组载体和应用 | |
| CN110643579B (zh) | 槟榔坏死环斑病毒及其检测方法 | |
| CN101348800A (zh) | 一种利用囊膜病毒出芽特性高效获得动物膜蛋白的方法 | |
| CN101487016B (zh) | 禽流感疫苗及其制备方法 | |
| CN108998443A (zh) | 一种羊睾丸成纤维细胞膜体系酵母cDNA文库及构建方法 | |
| CN101348801A (zh) | 一种制备动物细胞膜及细胞器的膜蛋白的方法 | |
| Schuhmann et al. | Tobamovirus spread and diversity in Anthropocene | |
| CN101358207A (zh) | 一种基于人囊膜病毒出芽方式制备膜蛋白的方法 | |
| CN109913476A (zh) | 蝙蝠源腺相关病毒基因组、扩增引物及其应用、扩增方法 | |
| CN106906308B (zh) | 一种家蚕BmBDV的LAMP-LFD快速试剂盒及检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20120801 Termination date: 20130829 |