CN101343636B - 用于构建流感病毒的反向遗传系统的载体及应用 - Google Patents
用于构建流感病毒的反向遗传系统的载体及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于构建流感病毒的反向遗传系统的载体及应用。所述载体为环状载体，包含原核复制起点、筛选标记基因、多聚腺苷酸加尾信号和两个转录方向相同的启动子，所述多聚腺苷酸加尾信号位于所述两个转录方向相反的启动子的下游，其中，所述两个转录方向相同的的启动子和所述多聚腺苷酸加尾信号之间含有polI元件，所述polI元件自上游至下游依次为RNA聚合酶I启动子、连接片段和RNA聚合酶I终止子，所述连接片段含有如下1)或2)的序列：1)GGGGAGCGAAAGCAGG；2)GGTTATTAGTAGAAACAAGG。所述载体可用来构建流感病毒反向遗传系统质粒，用于病毒拯救。
Description
技术领域
本发明涉及用于构建流感病毒的反向遗传系统的载体及应用。
背景技术
禽流感的频繁暴发不仅给养殖业带来了巨大的经济损失，而且对人类的健康造成巨大威胁。目前对禽流感的研究，特别是H5N1亚型高致病性禽流感的研究日渐深入，并在其致病机理、跨种传播机制、疫苗研究等方面都取得了很大的进展。对流感病毒分子机制方面的研究都得益于近年来流感病毒反向遗传系统的建立，此系统的建立可以使研究者从分子水平上对流感病毒基因组进行突变研究。该技术也大大提高了对流感病毒的认识水平，并且目前使用的流感疫苗均是通过反向遗传技术制备的。
目前已经有的流感反向遗传系统质粒，在构建的流感病毒的八个基因片段质粒过程中，是通过传统的连接方法连接的，首先用限制性内切酶酶切，再用T4DNA连接酶进行连接，传统的这种酶切的连接方法存在连接效率较低、步骤比较烦琐等问题，PCR产物与载体都要通过反复的酶切，电泳，回收等步骤，才能进行进一步的连接。这样既耗费时间，而且连接的效率不是很理想。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于构建流感病毒的反向遗传系统的载体及应用。
本发明所提供的用于构建流感病毒反向遗传系统的载体，有两种，分别命名为pLLB-A和pLLB-G。
pLLB-A是一种环状载体，包含原核复制起点、筛选标记基因、多聚腺苷酸加尾信号和两个转录方向相同的启动子，所述多聚腺苷酸加尾信号位于所述两个转录方向相同的启动子的下游，其中，所述两个转录方向相同的启动子和所述多聚腺苷酸加尾信号之间含有pol I元件，所述pol I元件自上游至下游依次为RNA聚合酶I启动子、连接片段和RNA聚合酶I终止子，所述连接片段含有AGCGAAAGCAGG/CCT序列；所述pol I元件的转录方向与所述两个转录方向相同的启动子的转录方向相反。
pLLB-G也是一种环状载体，包含原核复制起点、筛选标记基因、多聚腺苷酸加尾信号和两个转录方向相同的的启动子，所述多聚腺苷酸加尾信号位于所述两个转录方向相同的启动子的下游，其中，所述两个转录方向相同的启动子和所述多聚腺苷酸加尾信号之间含有pol I元件，所述pol I元件自上游至下游依次为RNA聚合酶I启动子、连接片段和RNA聚合酶I终止子，所述连接片段含有AGCAAAAGCAGG/CCT序列；所述pol I元件的转录方向与所述两个转录方向相同的启动子的转录方向相反。
上述两个转录方向相同的启动子具体可为巨细胞病毒启动子和T7噬菌体启动子；所述多聚腺苷酸加尾信号均可为牛生长激素基因多聚腺苷酸加尾序列。
pLLB-A载体的核苷酸序列具体可为序列表中的序列1。
pLLB-G载体的核苷酸序列具体可为序列表中的序列2。
本发明还提供了一种线性载体，是用Stu I酶酶切所述的pLLB-A和pLLB-G载体得到的线性载体。
本发明的另一个目的是提供pLLB-A和pLLB-G载体的构建方法。
本发明的pLLB-A和pLLB-G载体的构建方法，包括如下步骤：
1)以pEGFP-N1质粒为模板，用如下引物：5’GAATTCTGCAGATATCCTCGAGCATGCATCTAG3’和5’ACATGTTCTTTCCTGCGCCGCTACAGGG3’进行PCR扩增，得到片段A；
2)以pCDNA3.0质粒为模板，用如下引物：5’CCCTGTAGCGGCGCAGGAAAGAACATGT3’和5’CTCGAGGATATCTGCAGAATTCCAGCACAC3’进行PCR扩增，得到片段B；
3)将片段A和片段B导入大肠杆菌感受态细胞中，通过同源重组将片段A和片段B连接，获得重组载体I；
4)以重组载体I为模板，用如下引物：5’GGGGACGCCCTCCCGGCCTCGAGCGGCCATGC3’和5’GGTCGACCAGTACTCCGGAAGCTTGGGTCTCCC3’进行PCR扩增，得到片段C；
5)以PHH21-A或PHH21-G为模板，用如下引物：
5’GGGAGACCCAAGCTTCCGGAGTACTGGTCGACC3’或5’GCATGGCCGCTCGAGGCCGGGAGGGCGTCCCC3’进行PCR扩增，得到片段D或E；
6)将片段C和片段D或E导入大肠杆菌感受态细胞中，通过同源重组将片段C和片段D或E连接，获得pLLB-A和pLLB-G载体。
pLLB-A载体和pLLB-G载体都可用来构建流感病毒反向遗传系统。
本发明的又一个目的是提供用pLLB-A载体和pLLB-G载体构建的流感病毒反向遗传系统质粒。
本发明所提供的流感病毒反向遗传系统质粒，是在pLLB-A载体的连接片段的AGGCTT的G和C位点间插入如下a)或b)或c)的DNA分子：
a)流感病毒PB2基因；
b)流感病毒PB1基因；
c)流感病毒PA基因；
或者，是在pLLB-G载体的连接片段的AGGCTT的G和C位点间插入如下1)至5)中任一DNA分子：
1)流感病毒HA基因；
2)流感病毒NP基因；
3)流感病毒NA基因；
4)流感病毒M基因；
5)流感病毒NS基因。
用pLLB-A载体和pLLB-G载体构建的流感病毒反向遗传系统质粒可用于病毒拯救。
以本发明的pLLB-A和pLLB-G载体为出发载体构建流感病毒反向遗传系统质粒，无需传统的酶切和连接等环节，在整个构建过程中不使用任何内切酶与连接酶，因此比传统的连接过程省略了2-3个步骤，且连接的效率比传统的方法高，克隆阳性率为20％-100％。使得构建过程简便，快速，经济和高效。同时，构建的流感病毒反向遗传系统质粒具有良好的繁殖特性，少量的菌液可以提取出相当量的质粒，而且质粒的条带很单一，只有超螺旋结构的质粒，高质量高纯度的质粒有利于下一步病毒的拯救，大大缩短并简化了流感病毒的拯救步骤，为流感的研究工作提供了更有力的工具。
附图说明
图1为pLLB-G载体结构示意图。
具体实施方式
实施例1、pLLB-A与pLLB-G载体的构建
1)pBackbone-vector载体的构建
设计引物pBackbone-BGH-上游和pBackbone-BGH-下游、pBackbone-CMV-上游和pBackbone-CMV-下游的序列如下：
pBackbone-BGH-上游：5’GAATTCTGCAGATATCCTCGAGCATGCATCTAG3’；
pBackbone-BGH-下游：5’ACATGTTCTTTCCTGCGCCGCTACAGGG3’。
pBackbone-CMV-上游：5’CCCTGTAGCGGCGCAGGAAAGAACATGT3’；
pBackbone-CMV-下游：5’CTCGAGGATATCTGCAGAATTCCAGCACAC3’。
引物均由上海生工公司合成，PAGE纯化。使用时，配制成工作浓度为20μM，分装，于-80℃冻存备用。
以pEGFP-N1质粒为模板，用引物pBackbone-BGH-上游和pBackbone-BGH-下游PCR扩增片段A，以pCDNA3.0质粒为模板，用引物pBackbone-CMV-上游和pBackbone-CMV-下游PCR扩增片段B。
PCR反应体系：10×PCR Buffer5μL，上游、下游引物各1μL，DNA模板1μL，MgCl2(25mM)3μL，dNTPs(各2.5mM)3μL，Pfu-Taq(5U/μL)0.5μL，最后补水至50μL。
反应条件：94℃热变性5min；94℃变性45s，53℃退火45s，72℃延伸6min，共30个循环；72℃最后延伸10min。
PCR产物用DNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。
50μl感受态细胞中加入片段A和B后混匀，片段A和B质量比为100ng：500ng。混匀后体系冰浴30min。42℃水浴热激90秒，然后冰上放置3min，加入预热的LB培养基900μl，置于37℃下，180-200rpm振摇90min，收集菌体，用LB液体培养基重悬菌体，取200μl重悬液涂布LB板上(含有氨苄青霉素)，37℃培养12-16h。挑取单克隆提取质粒，该质粒命名为pBackbone-vector。
2)pLLB-A与pLLB-G质粒的构建
设计引物pLLB-POL1上游和pLLB-POL1下游、pLLB-上游和pLLB-下游，引物pLLB-POL1上游和pLLB-POL1下游、pLLB-上游和pLLB-下游序列如下：
pLLB-POL1上游：5’GGGAGACCCAAGCTTCCGGAGTACTGGTCGACC3’；
pLLB-POL1下游：5’GCATGGCCGCTCGAGGCCGGGAGGGCGTCCCC3’。
pLLB-上游：5’GGGGACGCCCTCCCGGCCTCGAGCGGCCATGC3’；
pLLB-下游：5’GGTCGACCAGTACTCCGGAAGCTTGGGTCTCCC3’。
其中pLLB-POL1引物用于从PHH21-A与PHH21-G(Shuai Wang，Qinfang Liu，Jinhua Liu，and earl G.Brown et al.Simplified recombineering approach forinfluenza virus reverse genetics.Journal of Virological Methods.2008Jul151(1)：74-8)(中国农业大学)中扩增POLI启动子与终止子元件。pLLB上下游引物用于扩增整个质粒pBackbone vector。pLLB-POL1上游与pLLB-下游的序列是同源互补的，pLLB-POL1下游与pLLB-上游引物序列是同源互补的。POLI启动子与终止子元件插入质粒pBackbone vector的GGGAGACCCAAGCTT/CTCGAGCGGCCATGC。
引物均由上海生工公司合成，PAGE纯化。使用时，配制成工作浓度为20μM，分装，于-80℃冻存备用。
以PHH21-A质粒为模板，用引物pLLB-POL1上游和pLLB-POL1下游PCR扩增片段C；以PHH21-G质粒为模板，用引物pLLB-POL1上游和pLLB-POL1下游PCR扩增片段D；以pBackbone-vector质粒为模板，用引物pLLB-上游和pLLB-下游PCR扩增片段E。
PCR反应体系：10×PCR Buffer5μL，上游、下游引物各1μL，DNA模板1μL，MgCl2(25mM)3μL，dNTPs(各2.5mM)3μL，Pfu-Taq(5U/μL)0.5μL，最后补水至50μL
反应条件：94℃热变性5min；94℃变性45s，52℃退火45s，72℃延伸6min，共30个循环；72℃最后延伸10min。
PCR产物用DNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。
50μl感受态细胞中加入片段C和E后混匀成细胞悬浮液1，片段C和E质量比为100ng：500ng。50μl感受态细胞中加入片段D和E后混匀成细胞悬浮液2，片段D和E质量比为100ng：500ng。细胞悬浮液1和细胞悬浮液2在42℃水浴热激90秒，然后冰上放置3min，加入预热的LB培养基900μl，置于37℃下，180-200rpm振摇90min，收集菌体，用LB液体培养基重悬菌体，取200μl重悬液分别涂布在LB板上(含有氨苄青霉素)，37℃培养12-16h。分别挑取单克隆提取质粒，重组质粒分别命名为pLLB-A与pLLB-G。对pLLB-A与pLLB-G进行测序，测序结果表明，pLLB-A的核苷酸序列如序列表中的序列1，序列表中的序列1自5′末端第1-411位为CMV启动子，自5′末端第412-445位为POL I终止子，自5′末端第462-692位为POL I启动子，自5′末端第455-460位为Stu I酶的识别位点。序列1的自5′端第441-457位的核苷酸序列和序列1的自5′端第457-462位的核苷酸序列为能与流感病毒(8个基因)的PCR扩增产物发生同源重组的序列，自5′末端第693-993位为BGH Ploy A，自5′末端第994-1672位为原核复制起点，自5′末端第1673-3337位氨苄青霉素抗性基因序列，第449位点序列为A。
pLLB-A的核苷酸序列如序列表中的序列1，序列表中的序列1自5′末端第1-411位为CMV启动子，自5′末端第412-445位为POL I终止子，自5′末端第462-692位为POL I启动子，自5′末端第455-460位为Stu I酶的识别位点。序列1的自5′端第441-457位的核苷酸序列和序列1的自5′端第457-462位的核苷酸序列为能与流感病毒(8个基因)的PCR扩增产物发生同源重组的序列，自5′末端第693-993位为BGH Ploy A，自5′末端第994-1672位为原核复制起点，自5′末端第1673-3337位氨苄青霉素抗性基因序列，第449位点序列为G。
图1为pLLB载体结构示意图。
实施例2、用pLLB-A与pLLB-G构建流感病毒的反向遗传系统
1)用pLLB-A与pLLB-G构建流感病毒的反向遗传系统
pLLB-A与pLLB-G载体分别用StuI内切酶酶切线性化，回收线性化后的pLLB-A与pLLB-G载体。
酶切体系如下：10×D buffer10μl，BSA1μl，StuI2μl(20U PROMEGA公司)，pLLB-A与pLLB-G分别10ug，补水至100μl，37℃酶切过夜。
将酶切产物在1×TAE配制的琼脂糖凝胶中电泳，120v，电泳30分钟，用DNA回收试剂盒回收目的片段，回收产物-80℃保存备用。
分别提取三个亚型流感病毒(H1N1、H9N2和H11N9)的RNA，反转录为cDNA，设计引物P1-1和P1-2扩增PB2基因；引物P2-1和P2-2扩增PB1基因；引物P3-1和P3-2扩增PA基因；引物P4-1和P4-2扩增HA基因；引物P5-1和P5-2扩增NP基因；引物P6-1和P6-2扩增NA基因；引物P7-1和P7-2扩增M基因；引物P8-1和P8-2扩增NS基因。该8对引物中的上游引物中均含有序列1的自第5′末端第441-457位的核苷酸序列，下游引物中均含有序列1的自5′端第457-462位的核苷酸序列。具体的引物序列如下(以H11N9引物为例)：
P1-1：GGGGAGCGAAAGCAGGTCAAATATATTC；
P1-2：GGTTATTAGTAGAAACAAGGTCGTTTTTAAAC。
P2-1：GGGGAGCGAAAGCAGGCAAACCATTTGA；
P2-2：GGTTATTAGTAGAAACAAGGCATTTTTTC。
P3-1：GGGGAGCGAAAGCAGGTACTGATCC；
P3-2：GGTTATTAGTAGAAACAAGGTACTTTTTTG。
P4-1：GGGGAGCAAAAGCAGGGGAAATAC；
P4-2：GGTTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTTTACTGCA。
P5-1：GGGGAGCAAAAGCAGGGTAGATAATC；
P5-2：GGTTATTAGTAGAAACAAGGGTATTTTTC。
P6-1：GGGGAGCGAAAGCAGG GTCAAGATGA；
P6-2：GGTTATTAGTAGAAACAAGGGTCTTTTTTC。
P7-1：GGGGAGCAAAAGCAGGTAGAT；
P7-2：GGTTATTAGTAGAAACAAGGTAGTTTTTTAC。
P8-1：GGGGAGCAAAAGCAGGGTGACAAA；
P8-2：GGTTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTTTTAGT。
PCR产物用DNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。
50μl感受态细胞中加入线性化的pLLB-G质粒后，分别加入三个亚型流感病毒(H1N1、H9N2和H11N9)的PB2基因片段、PB1基因片段和PA基因片段混匀，形成细胞悬浮液3-1、3-2和3-3，细胞悬浮液4-1、4-2和4-3，细胞悬浮液5-1、5-2和5-3，基因片段和线性化的pLLB-G质粒质量比为100ng：500ng。
50μl感受态细胞中加入线性化的pLLB-A质粒后，分别加入三个亚型流感病毒(H1N1、H9N2和H11N9)HA基因片段、NP基因片段、NA基因片段、M基因片段和NS基因片段混匀，形成细胞悬浮液6-1、6-2和6-3，细胞悬浮液7-1、7-2和7-3，细胞悬浮液8-1、8-2和8-3，细胞悬浮液9-1、9-2和9-3，细胞悬浮液10-1、10-2和10-3，基因片段和线性化的pLLB-A质粒质量比为100ng：500ng。
上述24个细胞悬浮液在42℃水浴热激90秒，然后冰上放置3min，加入预热的LB培养基900μl，置于37℃180-200rpm振摇90min，分别收集菌体，用LB液体培养基重悬菌体，取200μl24种重悬液分别涂布在LB板上(含有氨苄青霉素)，37℃培养12-16h。
分别提取平板中的单克隆，利用PCR与质粒测序的方法鉴定阳性的克隆。
将pLLB-G质粒的StuI位点分别插入H1N1亚型病毒的PB2基因片段、PB1基因片段和PA基因片段的重组质粒分别命名为pLLB-G-H1N1-PB2、pLLB-G-H1N1-PB1和pLLB-G-H1N1-PA。
将pLLB-G质粒的StuI位点分别插入H9N2亚型病毒的PB2基因片段、PB1基因片段和PA基因片段的重组质粒分别命名为pLLB-G-H9N2-PB2、pLLB-G-H9N2-PB1和pLLB-G-H9N2-PA。
将pLLB-G质粒的StuI位点分别插入H11N9亚型病毒的PB2基因片段、PB1基因片段和PA基因片段的重组质粒分别命名为pLLB-G-H11N9-PB2、pLLB-G-H11N9-PB1和pLLB-G-H11N9-PA。
将pLLB-A质粒的StuI位点分别插入H1N1亚型病毒的HA基因片段、NP基因片段、NA基因片段、M基因片段和NS基因片段的重组质粒分别命名为pLLB-A-H1N1-HA、pLLB-A-H1N1-NP、pLLB-A-H1N1-NA、pLLB-A-H1N1-M和pLLB-A-H1N1-NS。
将pLLB-A质粒的StuI位点分别插入H9N2亚型病毒的HA基因片段、NP基因片段、NA基因片段、M基因片段和NS基因片段的重组质粒分别命名为pLLB-A-H9N2-HA、pLLB-A-H9N2-NP、pLLB-A-H9N2-NA、pLLB-A-H9N2-M和pLLB-A-H9N2-NS。
将pLLB-A质粒的StuI位点分别插入H11N9亚型病毒的HA基因片段、NP基因片段、NA基因片段、M基因片段和NS基因片段的重组质粒分别命名为pLLB-A-H11N9-HA、pLLB-A-H11N9-NP、pLLB-A-H11N9-NA、pLLB-A-H11N9-M和pLLB-A-H11N9-NS。
鉴定结果表明，此质粒系统的连接阳性率较高20％-100％不等。具体数据如表1所示：
表1.用pLLB-A与pLLB-G构建流感病毒的反向遗传系的效率
2)利用pLLB-A与pLLB-G拯救流感病毒
将上述pLLB-G-H1N1-PB2、pLLB-G-H1N1-PB1和pLLB-G-H1N1-PA、pLLB-A-H1N1-HA、pLLB-A-H1N1-NP、pLLB-A-H1N1-NA、pLLB-A-H1N1-M和pLLB-A-H1N1-NS质粒各0.5ug混合，得到混合物I。
将上述pLLB-G-H9N2-PB2、pLLB-G-H9N2-PB1和pLLB-G-H9N2-PA、pLLB-A-H9N2-HA、pLLB-A-H9N2-NP、pLLB-A-H9N2-NA、pLLB-A-H9N2-M和pLLB-A-H9N2-NS质粒各0.5ug混合，得到混合物II。
将上述pLLB-G-H11N9-PB2、pLLB-G-H11N9-PB1和pLLB-G-H11N9-PA、pLLB-A-H11N9-HA、pLLB-A-H11N9-NP、pLLB-A-H11N9-NA、pLLB-A-H11N9-M和pLLB-A-H11N9-NS质粒各0.5ug混合，得到混合物III。
混合物I、II和III中分别加入1/10体积的2.5M的醋酸纳，再加入2体积的95％酒精，混匀，放于冰上10min，然后4℃，13000rpm，离心15分钟，1ml75％的酒精洗涤沉淀一次，室温晾干，将沉淀溶于10μL的无菌三蒸水中，分别得到上述三种亚型病毒的8种质粒混合物的水溶液。
取10ul lipofectamine2000(Invitrogen公司)加入到250ul的OPTI-MEMI培养基(Invitrogen公司)中，室温放置5分钟，获得溶液1；将上述三种亚型病毒的8种质粒混合物的水溶液分别加入到250ul的OPTI-MEMI培养基中，获得溶液2-1、2-2和2-3；将溶液1分别与溶液2-1、2-2和2-3，室温孵育20分钟，再加入500ul的OPTI-MEMI培养基，得到溶液3-1、3-2和3-3。
将293T细胞与MDCK细胞(10:1)混合，6孔细胞板中培养。等待细胞长至60-80％时将细胞用PBS洗涤两次，然后分别加入溶液3-1、3-2和3-3，37℃孵育5个小时，吸出溶液3-1、3-2和3-3，加入新鲜的OPTI-MEMI培养基(含有2.5％胰酶)，继续培养。
分别以缺少pLLB-A-H1N1-NS、pLLB-A-H9N2-NS和pLLB-A-H11N9-NS质粒的转染样品为阴性对照。
收集培养48h的上述细胞培养液的上清，接种到10日龄的SPF鸡胚，72h收取尿囊液，检测HA效价。
HA效价测定结果表明，拯救的H1N1，H9N2与H11N9细胞上清，分别接种鸡胚，72后收获尿囊液的HA效价分别达到26，29和210。对拯救的病毒的基因HA，NA序列进行扩增测序，结果显示序列与原始病毒的同源性均为100％。说明拯救的病毒没有发生基因突变，繁殖特性与原始病毒一致。上述结果说明利用pLLB-A与pLLB-G反向遗传系统质粒完全可以用于流感病毒的拯救。
序列表
<110>中国农业大学
<120>用于构建流感病毒的反向遗传系统的载体及应用
<130>CGGNARW81622
<160>2
<210>1
<211>3338
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
<210>2
<211>3338
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
Claims (7)
1.一种环状载体，包含原核复制起点、筛选标记基因、多聚腺苷酸加尾信号和两个转录方向相同的启动子，所述多聚腺苷酸加尾信号位于所述两个转录方向相同的启动子的下游，其特征在于：所述两个转录方向相同的启动子和所述多聚腺苷酸加尾信号之间含有pol I元件，所述pol I元件自上游至下游依次为RNA聚合酶I启动子、连接片段和RNA聚合酶I终止子，所述连接片段含有AGCAAAAGCAGGCCT序列；所述pol I元件的转录方向与所述两个转录方向相同的的转录方向相反；
所述环状载体的核苷酸序列为序列表中的序列1。
2.一种环状载体，包含原核复制起点、筛选标记基因、多聚腺苷酸加尾信号和两个转录方向相同的启动子，所述多聚腺苷酸加尾信号位于所述两个转录方向相同的启动子的下游，其特征在于：所述两个转录方向相同的启动子和所述多聚腺苷酸加尾信号之间含有pol I元件，所述pol I元件自上游至下游依次为RNA聚合酶I启动子、连接片段和RNA聚合酶I终止子，所述连接片段含有AGCGAAAGCAGGCCT序列；所述pol I元件的转录方向与所述两个转录方向相同的启动子的转录方向相反；
所述环状载体的核苷酸序列为序列表中的序列2。
3.一种线性载体，是用Stu I酶酶切权利要求1或2所述的载体得到的线性载体。
4.权利要求1或2所述载体的构建方法，包括如下步骤：
1)以pEGFP-N1质粒为模板，用如下引物：5’
GAATTCTGCAGATATCCTCGAGCATGCATCTAG 3’和5’ACATGTTCTTTCCTGCGCCGCTACAGGG 3’进行PCR扩增，得到片段A；
2)以pCDNA3.0质粒为模板，用如下引物：5’CCCTGTAGCGGCGCAGGAAAGAACATGT3’和5’CTCGAGGATATCTGCAGAATTCCAGCACAC 3’进行PCR扩增，得到片段B；
3)将片段A和片段B导入大肠杆菌感受态细胞中，通过同源重组将片段A和片段B连接，获得重组载体I；
4)以重组载体I为模板，用如下引物：5’GGGGACGCCCTCCCGGCCTCGAGCGGCCATGC 3’和5’GGTCGACCAGTACTCCGGAAGCTTGGGTCTCCC 3’进行PCR扩增，得到片段C；
5)以PHH21-A为模板，用如下引物：
5’GGGAGACCCAAGCTTCCGGAGTACTGGTCGACC 3’或5’
GCATGGCCGCTCGAGGCCGGGAGGGCGTCCCC 3’进行PCR扩增，得到片段D；
以PHH21-G为模板，用如下引物：
5’GGGAGACCCAAGCTTCCGGAGTACTGGTCGACC 3’或5’
GCATGGCCGCTCGAGGCCGGGAGGGCGTCCCC 3’进行PCR扩增，得到片段E；
6)将片段C和片段D导入大肠杆菌感受态细胞中，通过同源重组将片段C和片段D连接，获得权利要求1所述载体；
将片段C和片段E导入大肠杆菌感受态细胞中，通过同源重组将片段C和片段E连接，获得权利要求2所述载体。
5.权利要求1至3中任一所述的载体在构建流感病毒反向遗传系统中的应用。
6.流感病毒反向遗传系统质粒，是在权利要求1所述载体的连接片段的AGGCTT的G和C位点间插入如下a)或b)或c)的DNA分子：
a)流感病毒PB2基因；
b)流感病毒PB1基因；
c)流感病毒PA基因。
7.流感病毒反向遗传系统质粒，是在权利要求2所述载体的连接片段的AGGCTT的G和C位点间插入如下1)至5)中任一DNA分子：
1)流感病毒HA基因；
2)流感病毒NP基因；
3)流感病毒NA基因；
4)流感病毒M基因；
5)流感病毒NS基因。
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