CN101323842A - 一种抗病、高产棉花的育种方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明是利用抗病芽孢杆菌作为内生菌，采用拌种、灌根和注射不同处理方式的组合技术，获得抗病、高产棉花及后代，经菌落形态、16S rDNA和抗菌蛋白基因片段的核苷酸序列鉴定，其根、茎、叶和种子中内生有抗病芽孢杆菌，直接应用于棉花生产后，黄萎病病情指数5－30，产量增幅15％－40％。

Description

一种抗病、高产棉花的育种方法及应用

技术领域

本发明涉及一种利用抗病芽孢杆菌作为内生菌，获得抗病、高产棉花的育种方法。获得的抗病、高产棉花及后代的根、茎、叶和种子中内生有抗病芽孢杆菌，能直接应用于棉花生产，解决棉花抗病问题。

背景技术

在自然界中，植物与各种各样的微生物共处于一个生态环境。植物不仅与病原菌存在紧密的相互作用，同时和它周围的其他非致病菌也存在着一定的联系。长期以来，为了防治植物病害，人们大量使用化学农药，造成病原物的抗药性不断增强。随着人们环保意识的不断增强，植物病害生物防治，特别是生物农药的研究和应用受到各国政府和民众的高度重视。生物防治具有无污染、无公害、长效性等优点，逐渐成为植物病害综合治理中的重要组成部分。枯草芽孢杆菌是一种自然界广泛存在、对人畜无毒无害、不污染环境、对植物病害有抑制作用的非致病细菌，同时还是植物体内常见的内生细菌。

枯草芽孢杆菌突出的特点是，能产生耐热抗逆的芽孢，有利于生防菌剂的生产、剂型加工及在环境中存活、定殖与繁殖。它还可以产生丰富的抗菌物质，是植物病害生物防治微生物的重要组成部分。枯草芽孢杆菌防病机制主要包括其分泌的抗菌物质具有抗生作用，和致病菌在空间和营养上的竞争，对寄主植物抗性的诱导作用和促生作用等。利用枯草芽孢杆菌防治植物病害是目前植物病害生物防治研究的热点。美国已有四株枯草芽孢杆菌经环保局(EPA)批准进入商品化或有限商品化应用，如GB03，MBI600，QST713和FZB24；日本的RB14和NB22；澳大利亚的A-13和我国自主开发的B-916，B-3，B-908等。我国也在利用枯草芽孢杆菌防治棉花黄萎病菌方面进行了探索。李社增等研究了防治棉花黄萎病的生防细菌NCD-2，经过鉴定，该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(李社增等，2005)。曹君等研究了枯草芽孢杆菌和哈茨木霉协同作用对棉花黄萎病菌防治(曹君等，2005)。Tehrani等从土壤中分离到5株抗棉花黄萎病菌的高效菌株：2020、3、204、202、309，经鉴定2020、3为假单胞杆菌，204、202、309为芽孢杆菌；制成菌剂应用于大田试验，证明这5株菌株不仅对棉花黄萎病菌有拮抗作用，而且能不同程度地提高棉花的产量(Tehrani等，2001)。

利用枯草芽孢杆菌防治植物病害的研究主要是利用其活体菌来防治植物病害，作为活体菌，其本身也存在许多限制因子，例如生态适应性、环境的抗逆性等。在一生态系统中引入生防菌，它能否适应其被引入的生态环境，能否在病菌的寄主植物上定殖、增殖以及与相应病原物竞争是能否成功防治病害的关键。这些都与生防菌的生物学特性紧密相关。理想的生防菌应具有营养竞争能力强，抗菌物质产量高，生长速度快及适应性强等特点，竞争和定殖是细菌在植物促生和防病作用过程中的推动力，也是成功的关键。因此，具有强活力的枯草芽孢杆菌能否在植株上定殖是其能否发挥生防活性的关键因素。

迄今为止，已报道的枯草芽孢杆菌类生物农药产品基本都是芽孢制剂，还没有见到将枯草芽孢杆菌抗菌代谢产物直接加工成生物农药产 品的报道或利用枯草芽孢杆菌内生性使植株后代携带菌体，从而获得具有抗病能力的种质资源。虽然科研人员针对棉花黄萎病生物防治做了大量的研究工作，但生物防治效果不够稳定，仍没有一种成功应用于大批量生产和推广的拮抗微生物。目前已有防治其他作物黄萎病的生防制剂商品，但登记注册的防治棉花黄萎病的生防菌还未见报道。

本发明采用的抗病枯草芽孢杆菌能够分泌抗多种植物致病真菌和细菌的抗菌物质。同时枯草芽孢杆菌的作为常见内生菌，在植物中具有较强的定殖能力的特性。利用具有拮抗作用的枯草芽孢杆菌B111，采用拌种、灌根和注射的方法使其定殖的棉花中，提高棉花的抗病能力，最终获得能直接应用于生产的抗病、高产的棉花品种及后代，解决棉花抗病问题

发明内容

本发明提供一种利用抗病芽孢杆菌作为内生菌，培育抗病、高产棉花的育种方法，其特征在于：

(1)处理方法A——拌种：用芽孢悬液浸泡棉花种子。

(2)处理方法B——灌根：棉株发芽后用芽孢悬液灌根。

(3)处理方法C——注射：用芽孢悬液注射棉株茎基或果实幼体。

(4)处理方法D——拌种结合灌根：用芽孢悬液浸泡棉花的种子，棉株发芽后用芽孢悬液灌根。

(5)处理方法E——拌种，灌根结合注射：用芽孢悬液浸泡棉花的种子，棉株发芽后用芽孢悬液灌根，芽孢悬液注射棉株茎基或果实幼体。

本发明中所述的抗病芽孢杆菌中，其中的一种是指抗棉花枯萎病、黄萎病菌的枯草芽孢杆菌B111(分类命名：Bacillus subtilis，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏编号：CGMMCCNo.1497；保藏日期：2005年10月18日)。

本发明还提供一种棉花根、茎、叶和种子中内生有枯草芽孢杆菌的鉴定方法，其特征在于棉花的根、茎、叶和种子中分离出的单菌落，需同时满足以下两个条件，具体步骤如下：

(1)菌落形态检测：菌株细胞杆状，产生芽孢，中生，营养琼脂培养基上菌落无光泽、粗糙、边缘不整齐、凸起，菌落呈褶皱状。革兰氏染色、过氧化氢酶反应和V-P反应呈阳性。能利用葡萄糖、甘露糖，木糖醇，利用葡萄糖不产气，利用半乳糖不产酸，能水解明胶、酪素。

(2)16S rDNA序列测定：从棉花的根、茎、叶和种子中，分离出的菌落形态符合(1)中菌落形态特征的单菌落，菌落培养液经引物27f：5′-gagagtttgatcatggctcag-3′和1541R：5′-cgggatccaaggaggtgatccagcc-3′，PCR扩增获得的1479bp核酸片段序列，与序列表中SEQID NO：1有97％以上的同源性。

本发明另外还提供一种棉花的根、茎、叶和种子中内生有枯草芽孢杆菌B111的鉴定方法，其特征在于棉株的根、茎、叶和种子中分离出的单菌落，除满足以上鉴定棉株中内生有枯草芽孢杆菌的两个条件以外，同时满足以下条件：

(1)利用枯草芽孢杆菌B111的抗菌蛋白基因      bs2核酸片段序列进行鉴定：从棉花的根、茎、叶和种子中，分离出的单菌落培养液，利用引物F1：5’-acggtctcattaaataattcttctgaa-3’，R1：5’-acgatagtaaatctgctccgcttt-3’，以菌体基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得729bp核酸片段序列完全符合序列表中SEQ ID NO：2。

采用本发明所述的利用抗病芽孢杆菌作为内生菌，经不同处理方式的组合技术，选育出的抗病、高产棉花及后代，经菌落形态、16S rDNA和抗菌蛋白基因片段的核苷酸序列鉴定，其根、茎、叶和种子中内生有抗病芽孢杆菌，直接应用于生产后，黄萎病病情指数5-30，产量增幅15％-40％。本发明提供的抗病、高产棉花的育种技术和棉花根、茎、叶和种子中内生抗病芽孢杆菌的鉴定方法，还可以应用于其它单子叶植物和双子叶植物，以获得抗病、高产植物。

附图表说明

图1：从处理后棉花中分离的内生菌菌落与枯草芽孢杆菌B111的形态比较，(A)为从处理后棉花中分离的内生菌，(B)为枯草芽孢杆菌B111。

图2：从棉花中分离的内生菌菌落的16S rDNA PCR结果，泳道1-4。

图3：利用抗菌蛋白基因bs2鉴定棉花中分离的内生菌菌落的PCR结果，泳道1。

具体实施方式

给出以下实施例的目的是举例详细描述本发明，而不构成对本发明待批权利范围的限制。在本发明技术特征和待批权利要求范围内，本领域技术人员可以对本发明作出某些等同的改动和显而易见的改进。

实施例1枯草芽孢杆菌B111芽孢悬液和棉花黄萎病菌孢子悬液的配制

1.枯草芽孢杆菌B111芽孢悬液的配制：将枯草芽孢杆菌B111接种到灭菌的LB培养基(酵母粉5g/l，胰蛋白胨10g/l，NaCl10g/l，pH7.0)中，37℃，250rmp，培养7d后，将菌株B111发酵液置于离心瓶中，4℃、12000rpm离心20分钟，保留菌体，用无菌水洗三次，配制成1×10⁸cfu/mL的芽孢悬液备用。

2.落叶型棉花黄萎病菌V991的培养：取适量斜面上的V991置于200uL的无菌水中，制成孢子悬液均匀涂在Czapek’s平板培养基上，在28℃培养5天。再将10mL无菌水加到平板上，混匀后将该高浓度孢子悬液加到100mL无菌水中，制成OD₅₉₅＝0.795的孢子悬液。存于4℃备用。

实施例2抗病棉花的选育技术在棉花中的应用

枯草芽孢杆菌B111芽孢悬液，对棉花进行拌种、灌根和注射三种方式分别处理，提高棉花抗病性。种植黄萎病敏感棉花品种L14，共4种情况(播种到40cm×31cm的塑料花盆中，每个花盆播种100粒，每盆定苗15株，重复六次)。

a)用1×10⁸cfu/mL B111芽孢悬液拌种至露白后播种；

b)清水浸泡至露白后播种为对照；

c)棉种发芽后用1×10⁸cfu/mL B111芽孢悬液灌根，每株20mL；

d)棉花长至四叶期用1×10⁸cfu/mL B111芽孢悬液注射棉花茎基，每株100uL，注射七天后用黄萎病菌灌根法(孢子浓度为1×10⁸cfu/mL的V991孢子悬液)，检测棉花植株病情指数。

调查记录黄萎病发生情况

按5级分类 标准(0级，无病植株；1级，25％叶片发病的植株；2级，25％-50％叶片发病的植株；3级，50％-75％叶片发病的植株；4级，75％以上叶片发病的植株；记载和计算病情指数，并计算供试细菌对棉花黄萎病的相对防病效果。

病情指数＝∑(级数*株数)/(4*总株数)

防治效果＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100％

试验结果显示，不同方式分别处理后，棉株对落叶型黄萎病菌V991的抗性较对照都有一定程度的提高(表1)。其中拌种处理的防治效果最好，注射处理效果最差，可能是注射造成棉株茎部划伤，形成伤口，利于黄萎病菌的入侵，造成防治效果的降低。

表1枯草芽孢杆菌B111防治落叶型棉花黄萎病菌V991的效果

处理方式	供试植株	病情指数	防治效果(％)
				注射	80	67.5b	16.7c
灌根	90	61.1c	24.6b
				拌种	90	44.4a	45.2a
对照	79	81.0d	/

同列数据后标注的小写字母相同表示在P＝0.05无显著差异，小写字母不同表示在P＝0.05差异显著。

实施例3棉花根、茎、叶和种子中内生有枯草芽孢杆菌B111的鉴定

将处理后所获得棉株的根，茎，叶、种子各1g，用0.1％氯化汞消毒3-5min后，无菌水洗净三次。在超净台中用无菌玻璃棒磨碎匀浆后用1mL无菌蒸馏水常温下浸泡24h。将10μl浸泡液接种到LB培养基中，37℃培养16h。取100μl培养液涂于LB平板上，调查各棉花各部位的菌落生长及内生情况。

分离出的单菌落，同时满足以下3个条件的即鉴定为该棉花中内生有枯草芽孢杆菌B111，具体步骤如下：

(1)菌落形态检测：菌株细胞杆状，产生芽孢，中生，营养琼脂培养基上菌落无光泽、粗糙、边缘不整齐、凸起，菌落呈褶皱状。革兰氏染色、过氧化氢酶反应和V-P反应呈阳性。能利用葡萄糖、甘露糖，木糖醇，利用葡萄糖不产气，利用半乳糖不产酸，能水解明胶、酪素。

(2)16S rDNA序列测定：从棉花的根、茎、叶和种子中，分离出的菌落形态符合(1)中菌落形态特征的单菌落，菌落培养液经B111菌株16S rDNA引物27f：

5′-gagagtttgatcatggctcag-3′和1541R：5′-cgggatccaaggaggtgatccagcc-3′，PCR扩增，获得1479bp的核酸片段(图2)，其序列完全符合序列表中SEQ ID NO：1。

(3)利用菌株B111中抗菌蛋白基因bs2片段序列进行鉴定：从棉花的根、茎、叶和种子中，分离出的菌落形态符合(1)中菌落形态特征的单菌落的培养液，利用引物F1：5’-acggtctcattaaataattcttctgaa-3’，R1：5’-acgatagtaaatctgctccgcttt-3’，以菌体基因组DNA为模板进行PCR，获得729bp的核苷酸(图3)，其序列完全符合序列表中SEQ ID NO：2。

根据以上鉴定方法，挑取符合枯草芽孢杆菌B111菌落形态的菌落(图1)，采用抗菌蛋白基因bs2特异性引物和枯草芽孢杆菌B111 16S rDNA鉴定引物，分别进行菌落PCR。PCR结果显示，扩增到了1.5kb和700bp左右的两个片段(图2，图3)。测序结果显示，这两个片段分别与枯草芽孢杆菌B111的16S rDNA和抗菌蛋白基因bs2特征片段具有完全100％的同源性。

采用以上方法，鉴定不同方式处理后存活的棉花发现，拌种、灌根和注射这三种处理后的棉花根、茎、叶中，都能分离出大量类似枯草芽孢杆菌B111形态的菌落(图1)，且表现为优势种群。其中采用注射方式处理棉株后，获得的棉种中枯草芽孢杆菌B111的携带比例最高(表2)。这可能是注射法能使枯草芽孢杆菌直接进入棉花维管束，有利于菌株在棉种中的定殖。

每种处理方式随机选取30粒棉种，播种于营养钵中，待长到两片真叶时再次检测棉株根、茎、叶中枯草芽孢杆菌B111的内生情况。结果显示，拌种、灌根和注射处理后收获的棉种，播种发芽后，在棉株的根、茎、叶中仍有枯草芽孢杆菌B111的内生，比例分别为80％，66.7％和86.7％。说明枯草芽孢杆菌B111的内生性能够在下一代棉株中保持，并能通过土壤传播再次提高棉株内生菌株B111的比例。

表2枯草芽孢杆菌B111在棉花中的内生性检测

实施例4拌种、灌根和注射三种方式组合处理后，抗病、高产棉花的获得

枯草芽孢杆菌B111芽孢悬液，对棉花进行拌种、灌根和注射三种方式组合处理，提高棉花抗病性。种植生产应用型棉花品种GR29，4个病池(每个病池已混有棉花枯萎病菌Ag22、Ag26和Ag78；棉花黄萎病菌V991和V43-1，有效面积11.2m²)，处理方式如下：

(1)用1×10⁸cfu/mL B111芽孢悬液拌种至露白后播种；棉种发芽后用1×10⁸cfu/mL B111芽孢悬液灌根，每株20mL；棉花长至四叶期用1×108cfu/mL B111芽孢悬液注射棉花茎基，每株100ul。

(2)用1×10⁸cfu/mL B111芽孢悬液拌种至露白后播种；棉花发芽后用1×10⁸cfu/mL B111芽孢悬液灌根，每株20mL。

(3)用1×10⁸cfu/mLB111芽孢悬液拌种至露白后播种。

(4)清水浸泡至露白后播种作为对照。

田间试验结果(表3)显示，枯草芽孢杆菌B111芽孢悬液不同方式组合处理的棉种和棉株，较对照表现出更高的出苗率、更强的生长势和更好的整齐度。棉花的生育进程较对照加快，现蕾期和开花期比对照提前3-5天，说明菌株B111对棉花的生长具有促进作用。其中拌种和灌根结合的处理方式效果最好，开花期较对照提前5天，对棉花的促生作用明显。

表3棉花GR29生育进程记载表

注释：生长势、整齐度用+表示：生长势强+++，生长势一般++，生长势弱+；整齐度好+++，整齐度一般++，整齐度较差+

截止7月底棉花枯、黄萎病高发期结束后，统计田间棉株发病情况，结果显示(表4)三种组合方式处理棉花后，棉株对枯、黄萎病的抗性明显增强，其中拌种和灌根组合处理方式防病效果最好，病情指数达11.8，防治效果为66.1％。

表4枯草芽孢杆菌B111田间对棉花枯、黄萎病的防治效果

处理方式	供试植株	病情指数	防治效果(％)
				拌种+灌根+注射	82	20.7a	40.5c
拌种+灌根	68	11.8c	66.1a
				拌种	84	15.5b	55.4b
对照	66	34.8d	/

同列数据后标注的小写字母相同表示在P＝0.05无显著差异，小写字母不同表示在P＝0.05差异显著。

田间试验结果(表5、6)显示，枯草芽孢杆菌B111芽孢悬液不同组合方式处理的棉株，较对照产量明显提高。其中拌种结合灌根的处理方式获得的子棉产量和单株结铃个数最高，空果枝数最少，子棉产量增幅达36.3％。结合田间病池防治结果和棉花生育进程记录，发现拌种结合灌根的处理方式不但促进棉花生长，防病效果好，且产量高，可作为应用枯草芽孢杆菌B111田间生物防治棉花枯、黄萎病害的有效候选方法。

表5不同处理对棉花品种GR29农艺性状的影响

处理方式	种植面积(m2)	株数(株)	株高(cm)	果枝始节	果枝(台)	空果枝(台)	株铃(个)
								A	11.2	82	50.97a	6.8b	10.37b	4.2b	9.3b
B	11.2	68	50.07b	6.5b	10.67a	2.7c	13.6a
								C	11.2	84	50.53ab	6.9a	10.97a	5.3a	10.8b
D	11.2	66	49.96c	6.6b	10.13c	3.8b	9.6b

注释：A：拌种+灌根+注射；B：拌种+灌根；C：拌种；D：对照。同列数据后标注的小写字母相同表示在P＝0.05无显著差异，小写字母不同表示在P＝0.05差异显著。

表6不同处理对棉花品种GR29产量的影响

处理方式	子棉(kg/亩)	子棉为CK％	皮棉(kg/亩)	皮棉为CK％	衣分(％)
						A	167.9c	114.9c	71.4	119.8c	41.6a
B	199.1a	136.3a	85.5	143.4a	41.3a
						C	179.2b	122.6.b	77.8	130.5b	41.9a
D	146.1d	100.0d	59.6	100.0d	41.5a

注释：A：拌种+灌根+注射；B：拌种+灌根；C：拌种；D：对照。同列数据后标注的小写字母相同表示在P＝0.05无显著差异，小写字母不同表示在P＝0.05差异显著。

SEQUENCE LISTING

<110>中国农业科学院生物技术研究所

     郭三堆

<120>一种抗病棉花的育种方法及其应用

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1479

<212>DNA

<213>Bacillus subtilis B111

<220>

<221>16S rDNA

<222>(1)..(1479)

<400>1

tgcagtcgag cggacagatg ggagcttgct ccctgatgtt agcggcggac gggtgagtaa     60

cacgtgggta acctgcctgt aagactggga taactccggg aaaccggggc taataccgga    120

tggttgtctg aaccgcatgg ttcagacata aaaggtggct tcggctacca cttacagatg    180

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<210>2

<211>729

<212>DNA

<213>Bacillus subtilis B111

<220>

<221>bs2 gene fragment

<222>(1)..(729)

<400>1

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gggtacttca ccgatactga ggactgggat atcggtgagg atattacggt cagccagccg    540

gctctccgca gcttatccaa tccgacaaaa tacggacagc ccgaccatta caaaaattat    600

caaaaccttc cgaacactga tgccggcgac tacggcggcg tgcatacaaa cagcggaatt    660

ccgaacaaag ccgcttacaa cacgattaca aaaatcggcg tgaaaaaagc ggagcagatt    720

tactatcgt                                                            729

Claims (6)

1、一种利用抗病芽孢杆菌作为内生菌，培育抗病、高产棉花的育种方法，其特征在于：

(1)处理方法A——拌种：用芽孢悬液浸泡棉花种子。

(2)处理方法B——灌根：棉株发芽后用芽孢悬液灌根。

(3)处理方法C——注射：用芽孢悬液注射棉株茎基或果实幼体。

(4)处理方法D——拌种结合灌根：用芽孢悬液浸泡棉花的种子，棉株发芽后用芽孢悬液灌根。

(5)处理方法E——拌种，灌根结合注射：用芽孢悬液浸泡棉花的种子，棉株发芽后用芽孢悬液灌根，芽孢悬液注射棉株茎基或果实幼体。

2、一种棉花根、茎、叶和种子中内生有枯草芽孢杆菌的鉴定方法，其特征在于棉花的根、茎、叶和种子中分离出的单菌落，需同时满足以下两个条件，具体步骤如下：

(1)菌落形态检测：菌株细胞杆状，产生芽孢，中生，营养琼脂培养基上菌落无光泽、粗糙、边缘不整齐、凸起，菌落呈褶皱状。革兰氏染色、过氧化氢酶反应和V-P反应呈阳性。能利用葡萄糖、甘露糖，木糖醇，利用葡萄糖不产气，利用半乳糖不产酸，能水解明胶、酪素。

(2)16S rDNA序列测定：从棉花的根、茎、叶和种子中，分离出的菌落形态符合权利要求2中(1)的菌落形态特征的单菌落，菌落培养液经引物27f：5′-gagagtttgatcatggctcag-3′和1541R：5′-cgggatccaaggaggtgatccagcc-3′，PCR扩增获得的1479bp核酸片段序列，与序列表中SEQ ID NO：1有97％以上的同源性。

3、权利要求1中所述的抗病芽孢杆菌，其中的一种是指枯草芽孢杆菌B111，棉株中内生有该菌的鉴定方法，其特征在于棉株的根、茎、叶和种子中分离出的单菌落，除满足权利要求2所述的两个条件以外，同时满足以下条件：

(1)利用枯草芽孢杆菌B111的抗菌蛋白基因bs2核酸片段序列进行鉴定：从棉花的根、茎、叶和种子中分离出的单菌落培养液，利用引物F1：5’-acggtctcattaaataattcttctgaa-3’，R1：5’-acgatagtaaatctgctccgcttt-3’，以菌体基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得729bp核酸片段序列，完全符合序列表中SEQ ID NO：2。

4、权利要求1、2和3所述的方法适用于植物抗病、高产品种的选育。

5、权利要求4中所述的植物是指单子叶植物和双子叶植物。

6、采用权利要求1中所述的不同处理方式的组合技术，选出的抗病、高产棉花品种及后代，黄萎病病情指数在5-30，产量增幅15％-40％。

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