CN101314775B - 可用于艾滋病治疗的rna干扰靶点 - Google Patents

可用于艾滋病治疗的rna干扰靶点 Download PDF

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Abstract

本发明涉及可用于治疗艾滋病的32个不同的靶向HIV的RNA干扰靶点，可用于制备治疗艾滋病的药物和方法。本发明提供了经改造的可用于表达靶向HIV的siRNA和/或miRNA和/或核酶和/或反义寡核苷酸的重组表达载体和包装载体(特别是慢病毒)。本发明涉及具有抑制HIV复制和病毒基因表达能力的可表达和/或被导入了以本发明提供的RNA干扰靶点为依据获得的siRNA和/或miRNA和/或核酶和/或反义寡核苷酸和/或药物的细胞。

Description

可用于艾滋病治疗的RNA干扰靶点
技术领域
本发明涉及分子生物学、细胞生物学和基因治疗领域。更具体地，涉及可用于治疗艾滋病的RNA干扰(RNAi)的32个靶点以及应用这些靶点的重组表达载体和应用这些靶点以不同方式获得的用于制备治疗艾滋病的药物和方法。
背景技术
由艾滋病毒(HIV)感染引起的获得性免疫缺陷综合症(AIDS，艾滋病)是全世界面临的最主要健康威胁之一。目前艾滋病已几乎蔓延到世界各国，全球的艾滋病患者已超过4000万，已有近3000万人被夺去生命(WHO，全球艾滋病流行报告，2004年)。近年来，我国艾滋病传播呈快速增长趋势，现感染者累计已达84万人。目前，治疗HIV感染的方法主要是采用高强度的抗逆转录病毒治疗，如联合使用针对病毒逆转录酶和蛋白酶的抑制剂。但由于HIV的高突变率及复杂的致病机理，该类型方法无法彻底根除体内病毒。因此，迫切需要发展新的治疗手段以对付艾滋病的威胁。
RNA干扰(RNAi)是一种由双链RNA(dsRNA)介导的细胞内抑制基因表达的机制，是1998年在线虫中进行基因表达抑制研究中被首次提出(Fire A等，自然，1998年，391卷：806-811页)。之后进一步发现RNAi广泛存在于高等哺乳动物以及真菌、拟南芥、水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等几乎所有的真核生物中，是一种普遍存在和保守的抑制基因表达的机制，可起到调控基因表达、抗病毒入侵、抑制转座子活动等作用(Dykxhoorn DM等，自然分子细胞生物学综述，2003年，4卷：457-467页)。目前RNAi作用的机制已基本阐明：内源或外源产生的dsRNA分子在细胞质中被属RNA酶III的Dicer切割成小干扰RNA(siRNA)。典型的siRNA结构特征为：5′端磷酸化，3′端呈对称性突出2-3nt并带羟基，长度为19-23nt的dsRNA。siRNA分子与RNA诱导的沉默复合体(RNA-inducing silencing complex，RISC)的蛋白复合体进行结合，RISC具有解螺旋酶和核酸内切酶活性。siRNA分子在复合体中被解聚，其中反义链可与匹配的靶mRNA按碱基配对原则结合，并引导与之结合的RISC将靶mRNA在与反义链的结合区中部距5′端10nt的位置处酶解，从而抑制靶基因的表达。目前获得siRNA的方法主要有：可表达小发夹RNA(shRNA)的质粒和重组病毒载体、化学合成方法、体外转录等。
目前，RNAi在包括艾滋病在内的病毒性疾病以及肿瘤等疾病的防治研究已显示出良好的应用前景。研究已显示靶向HIV-1mRNA的siRNA可在体外培养的HIV-1易感细胞中抑制HIV-1的复制和病毒基因的表达(Martinez MA等，免疫学趋势，2002年，23卷：559-561页)。由于HIV的致病机理复杂，要达到有效的治疗目的必须能够高效抑制病毒复制和基因表达。然而，并非所有符合常规设计要求的RNAi靶点都能够有效抑制靶基因的表达，不同靶点间的抑制效率各有差别。因此，选择获得合适的具有高抑制效率的RNAi靶点成为RNAi技术是否能够成功应用于艾滋病治疗的重要因素。选择合适的RNAi靶点需要从结构特征、抑制效率、非人类基因同源性等方面进行综合考虑。可使用的辅助方法包括目前已提出的siRNA辅助设计软件、RNA分子结构分析、核酸序列分析比对以及实验经验等，并通过具体的抑制实验予以验证。
以RNA干扰技术为基础将有望开发出新型的更有效的艾滋病治疗方法，该类型的治疗方法需要提供可有效抑制HIV复制和表达的RNA干扰靶点。本发明满足了这一要求，提供了可用于该目的的RNA干扰靶点、重组表达载体等。
发明内容
本发明提供了可高效靶向HIV的RNA干扰靶点，可用于构建包含或导入了本发明涉及的RNA干扰靶点的编码核酸序列的表达质粒、重组病毒载体和细胞，及可用于获得包含有由本发明涉及的RNA干扰靶点获得的艾滋病治疗药物。在一个具体方面，本发明具体涉及靶向HIVGAG、POL、VIF、或者VPU基因的RNA干扰靶点序列。
本发明提供的RNA干扰靶点可高效靶向HIV，可高效抑制HIV的复制和病毒基因表达。本发明提供的RNA干扰靶点是通过以下方法获得的：选择设计可靶向HIV的RNA干扰靶点序列，通过设计合适的引物构建shRNA，并克隆入pSUPER载体获得相应的shRNA表达质粒，将该质粒分别与HIV感染性克隆质粒进行共转染实验，通过检测HIV p24蛋白的表达水平及鉴定抑制特异性等分析筛选获得高效的RNA干扰靶点。
本发明提供特异靶向HIV的RNA干扰靶点序列，该序列选自：
(1)SEQ ID NO：1-32中任何一个所示的序列，或者
(2)与(1)中序列具有至少70％(优选至少80％、85％、90％、95％、98％或更高)一致性的序列，或者
(3)在严紧条件下或者高度严紧条件与(1)中序列能够杂交的核苷酸序列，或者
(4)与(1)中序列仅有1-3个(优选1-2个，更优选1个)核苷酸不同的序列；或者
(5)上述序列的片段或者互补序列。
在一个具体方面，所述RNA干扰靶点序列可以靶向HIV GAG、POL、VIF、或者VPU基因。
本发明提供的RNA干扰靶点可以是DNA或RNA序列。
在一个优选实施方案中，所述RNA干扰靶点选自siVIF037(SEQ IDNO：24)、siPOL1102(SEQ ID NO：8)、siPOL1217(SEQ ID NO：10)、siPOL1327(SEQ ID NO：29)、和siPOL2252(SEQ ID NO：22)。
本发明还提供包含该RNA干扰靶点序列的核酸构建体或载体如表达载体。
本发明还提供依据上述的RNA干扰靶点序列获得的、能够抑制HIV相应基因的表达和/或HIV的复制和/或感染的siRNA或miRNA或核酶或反义寡核苷酸。
本发明提供了改造后的重组表达载体，其可用于表达本发明的靶向HIV的siRNA和/或miRNA和/或核酶和/或反义寡核苷酸。
在一个实施方案中，本发明重组表达载体具有以下特征：包含了本发明提供的RNA干扰靶点序列的siRNA和/或miRNA和/或核酶和/或反义寡核苷酸的编码核酸序列，这些编码核酸序列与表达控制序列可操作地连接，使得可在动物细胞(特别是哺乳动物细胞，如人细胞，如HIV受体细胞，优选CD4+细胞，如哺乳动物干细胞，优选造血干细胞)中表达所述靶向HIV的siRNA和/或miRNA和/或核酶和/或反义寡核苷酸。
本发明的重组表达载体可以是质粒载体或病毒载体，例如逆转录病毒载体，包括慢病毒载体。优选地，所述重组表达载体是逆转录病毒载体，更优选慢病毒载体。
本发明提供了改造后的用于生产逆转录病毒载体(例如慢病毒载体)的包装载体(如包装质粒)，其含有突变后的来源于HIV的用于表达包装蛋白的基因序列，特别地改造后的基因序列可相互独立地具有如下序列特征：
包装载体的序列突变情况如下所示：
包装载体：--------GTAGACAGGATGAGGATTA--------
突变为    --------GTAGACAGGACGAAGATTA--------
包装载体：--------GGATTTACCACACCAGACA--------
突变为：  --------GGATTTACCACCCCCGACA--------
包装载体：--------GCTGGACTGTCAATGACAT--------
突变为：  --------GCTGGACTGTGAACGACAT--------
包装载体：--------GCACTAACAGAAGTAGTAC--------
突变为：  --------GCACTAACAGAAGTGGTGC--------
包装载体：--------TAGTAGCCAGCTGTGATAA--------
突变为：  --------TAGTAGCCAGCTGCGACAA--------
本发明还涉及分离的细胞，其包含：(1)本发明RNA干扰靶点序列，或者(2)含有本发明RNA干扰靶点序列的核酸构建体或载体如表达载体。
本发明还涉及转化或转染或转导了重组表达载体的分离的细胞，所述重组表达载体可表达本发明的靶向HIV的siRNA和/或miRNA和/或核酶和/或反义寡核苷酸。
本发明还涉及转化或转染或转导了或包含了本发明的包装载体(如包装质粒)的分离的细胞。
本发明还涉及包含上述细胞的组织和生物，如动物。
本发明还涉及一种改造的细胞(包括动物例如哺乳动物优选人的细胞，优选HIV受体细胞和干细胞，如CD4+细胞和CD34+细胞)，其可表达或包含有本发明siRNA或miRNA或核酶或反义寡核苷酸。
本发明还涉及在基因组中或者基因组外携带本发明涉及的RNA干扰靶点的编码核酸序列的细胞，包括原核细胞(如细菌细胞，如大肠杆菌细胞)和真核细胞(如真菌细胞，昆虫细胞，植物细胞，动物细胞，优选哺乳动物如人的细胞，优选HIV受体细胞和干细胞，如CD4+细胞和CD34+细胞)，其包含有本发明涉及的RNA干扰靶点的编码核酸序列(这些编码核酸序列可与表达控制序列可操作地连接，使得可在该细胞中表达所述的siRNA和/或miRNA和/或核酶和/或反义寡核苷酸)。
本发明还涉及导入了由本发明提供的RNA干扰靶点获得的siRNA和/或miRNA和/或核酶和/或反义寡核苷酸的细胞，包括原核细胞(如细菌细胞，如大肠杆菌细胞)和真核细胞(如真菌细胞，昆虫细胞，植物细胞，动物细胞，优选哺乳动物如人的细胞，优选HIV受体细胞和干细胞，如CD4+细胞和CD34+细胞)，其被导入了包含有由本发明涉及的RNA干扰靶点获得的siRNA和/或miRNA和/或核酶和/或反义寡核苷酸。
在一个优选的实施方案中，含有本发明获得的RNA干扰靶点的编码核酸序列的shRNA表达元件导入HIV受体细胞后可使细胞获得抑制HIV复制和病毒基因表达的能力。
本发明还涉及包含上述细胞的组织和生物，如动物。本发明还涉及包含本发明的细胞的药物组合物。
另一方面，本发明还涉及制备本发明改造细胞的方法，包括用本发明的重组表达载体转化或转染或转导细胞(包括动物例如哺乳动物优选人的细胞，优选HIV受体细胞和干细胞，如CD4+细胞和CD34+细胞)。
在一个实施方案中，所述方法包括用本发明重组逆转录病毒载体(例如慢病毒载体，如慢病毒Lenti-VIF037等)转导哺乳动物优选人的HIV受体细胞和干细胞，如CD4+细胞和CD34+细胞。
在上述方法，所述细胞可以是分离的(或离体的)，例如从感染HIV的患者或者正常个体分离的，或者是在体的，或者是体外培养的细胞株。
本发明还涉及DNA序列的组合，其包括或者由编码正义RNA片段的第一DNA序列和编码反义RNA片段的第二DNA序列组成，所述正义RNA片段包含本发明靶点序列所编码的RNA序列，反义RNA片段和正义RNA片段能形成双链RNA，该双链RNA能抑制HBV基因的表达和/或HBV的复制和/或感染。
本发明还涉及小分子干扰核糖核酸(siRNA)，其包括正义RNA片段和反义RNA片段，所述正义RNA片段包含本发明靶点序列编码的RNA序列，反义RNA片段和正义RNA片段能形成双链RNA，且该双链RNA能抑制HIV相应基因的表达和/或HIV的复制和/或感染。
本发明还涉及由本发明提供的RNA干扰靶点获得的siRNA和/或miRNA和/或核酶和/或反义寡核苷酸在制备治疗HIV感染或者HIV患者的药物和/或药物组合物中的用途。
本发明还涉及由本发明提供的RNA干扰靶点获得的siRNA和/或miRNA和/或核酶和/或反义寡核苷酸在制备抑制HIV复制或者HIV基因表达的药物和/或药物组合物中的用途。
本发明还涉及本发明RNA干扰靶点序列、或核酸构建体或载体、或重组表达载体在制备治疗HIV感染或者HIV患者的药物中的用途。
本发明还涉及本发明的经改造的细胞(包括动物例如哺乳动物优选人的细胞，优选HIV受体细胞和造血干细胞，如CD4+细胞和CD34+细胞)在制备治疗HIV感染或者HIV患者的药物和/或药物组合物中中的用途。
本发明还涉及本发明的siRNA靶序列在筛选抗HIV药物中的应用。
本发明还涉及治疗HIV感染或者HIV患者的方法，包括向有需要的个体给予本发明的RNA干扰靶点序列、核酸构建体或载体、重组表达载体、siRNA或miRNA或核酶或反义寡核苷酸、或细胞。
本发明还涉及本发明载体和细胞用于治疗HIV感染或者HIV患者的用途。
本发明还涉及治疗HIV感染或者HIV患者的方法，包括向患者给予治疗有效量的本发明所述RNA干扰靶点序列、核酸构建体或载体、siRNA或miRNA或核酶或反义寡核苷酸、表达载体、细胞或siRNA。
本发明还涉及抑制HIV复制或者HIV基因表达的方法，包括向有需要的个体给予有效量的本发明所述RNA干扰靶点序列、核酸构建体或载体、siRNA或miRNA或核酶或反义寡核苷酸、表达载体、细胞或siRNA。
本发明还涉及本发明所述RNA干扰靶点序列、核酸构建体或载体、siRNA或miRNA或核酶或反义寡核苷酸、表达载体、细胞或siRNA，用于治疗HIV感染或者HIV患者，或者用于抑制HIV复制或者HIV基因表达。
下面结合附图对本发明进行更详细的说明。从下文的详细描述中，本发明的上述方面和本发明的其他方面将是明显的。
附图说明
图1为pSUPER-siRNA系列表达质粒的构建流程示意图。
图2显示了分别靶向我们获得的32个RNA干扰靶点的siRNA表达质粒在与HIV感染性克隆质粒共转染实验中对HIV基因表达的抑制效果。结果显示，这些RNA干扰靶点可抑制HIV。
图3显示了构建获得的表达载体pDEST-VIF037、pDEST-POL1102、pDEST-POL1217、pDEST-POL1327、pDEST-POL2252可有效表达所编码的siRNA序列，且具有基因靶向特异性。pGL3-VIF与表达载体pDEST-VIF037共转染时luciferase基因的表达受到了有效抑制，而pGL3-control与表达载体pDEST-VIF037共转染时luciferase基因的表达不会受到抑制。pGL3-POL分别与表达载体pDEST-POL1102、pDEST-POL1217、pDEST-POL1327、pDEST-POL2252共转染时luciferase基因的表达受到了抑制，而pGL3-control分别与表达载体pDEST-POL1102、pDEST-POL1217、pDEST-POL1327、pDEST-POL2252共转染时luciferase基因的表达不会受到抑制。
图4显示了突变后的慢病毒包装载体的表达不会受到表达靶向HIV的siRNA的慢病毒表达载体的影响。
图5显示了经携带有靶向HIV的siRNA表达序列的重组慢病毒转导后的HIV受体细胞MT-4细胞对HIV-1NL4-3复制的抑制作用。
图6显示了改造后的HIV受体细胞对HIV-1NL4-3复制的抑制作用。
图7显示了合成的靶向HIV的RNA干扰靶点的siRNA对HIV的抑制效果。siR-VIF037转染后可抑制HIV在细胞中的复制表达。
图8显示了合成的并经2’-Ome(2’-甲氧基)修饰和/或磷酸化修饰和/或固醇修饰的靶向HIV的RNA干扰靶点的siRNA对HIV的抑制效果。siRpo-VIF037、siRpo-POL1217、siRpoC-VIF037、siRpoC-POL1217转染后可抑制HIV在细胞中的复制表达。
图9显示了靶向HIV的siRNA在H2K-PBL-SCID小鼠模型中具有抑制HIV复制的能力。VIF037杂合小鼠可显示出抗HIV感染的能力，相比对照组可显著降低血清中HIV蛋白的水平。
具体实施方式
除非特别说明，本发明的术语具有本领域通常使用的含义。
本发明提供了可高效靶向HIV的RNA干扰靶点，包含如下序列或与其具有至少70％(优选至少80％、85％、90％、95％、98％或更高)一致性的序列中的任何一个或几个序列：SEQ ID NO：1-32。
一致性(identity)可以按照本领域公知的方法计算。适合于确定序列一致性和序列相似性百分数的算法的一个优选例子是BLAST和BLAST 2.0算法，它们分别描述在Altschul等(1977)Nucl.Acid.Res.25：3389-3402和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410。采用例如本文所述参数，BLAST和BLAST 2.0可以用于确定本发明的多核苷酸和多肽的序列一致性百分数。执行BLAST分析的软件可以通过国立生物技术信息中心为公众所获得。
在其它实施方案中，所述RNA干扰靶点的序列具有在严紧条件下或者高度严紧条件与本文提供的多核苷酸、或其片段、或其互补序列能够杂交的多核苷酸序列。在分子生物学领域中杂交技术是熟知的。为了举例说明的目的，所述杂交的条件是严紧条件，例如与滤膜结合的DNA在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中约45℃下杂交，之后在0.2×SSC/0.1％SDS中于约50-65℃下作一或多次洗涤；高度严紧条件，例如与滤膜结合的核酸在6×SSC中约45℃下杂交，之后在0.1×SSC/0.2％SDS中于约68℃下作一或多次洗涤；或本领域技术人员已知的其它严紧杂交条件(参见例如Ausubel，F.M.等编，1989，CurrentProtocols in Molecular Biology，第1卷，Green PublishingAssociates，Inc.，和John Wiley&Sons，Inc.，纽约，第6.3.1-6.3.6和2.10.3页)。
本发明还涉及在严紧条件下或者高度严紧条件与SEQ ID NO：1-32的任一序列、或其片段、或其互补序列能够杂交的核苷酸序列。
在本发明中，siRNA和/或miRNA和/或核酶和/或反义寡核苷酸可被设计成靶向目的基因或者调节序列，例如需要抑制其表达的基因或其调控序列，以便抑制或降低其表达。所针对的基因或其调控序列可以是需要抑制或降低其表达的任何基因或其调控序列，例如来自病原体的、或者参与癌症形成和发展的那些，特别是靶向HIV。本发明的siRNA、miRNA、核酶和反义寡核苷酸可按照常规方法设计。
“依据本发明RNA干扰靶点序列获得的siRNA、miRNA、核酶和反义寡核苷酸”指的是通过设计表达或设计合成等方式得到的siRNA、miRNA、核酶和反义寡核苷酸，其所作用的靶序列(可以是DNA或RNA序列)为或包含有本发明涉及的RNA干扰靶点序列。
siRNA的常规设计方法可参考文献(如：Reynolds A等，自然生物技术，2004年，22卷：326-330)或Amhion、Qiagen等公司网站的公开资料或实施例1中的描述。miRNA的常规设计方法可参考文献(Lo HL等，基因治疗，2007年，14卷：1503-1512页)，选择靶序列的方法与siRNA的设计方法相似，例如可将设计的含有靶序列的正义链及相应的反义链替换到pri-microRNA上，使构建的miRNA可阻止含有靶序列的mRNA的表达。核酶的常规设计方法可参考文献(Haseloff J等，自然，1988年，334卷：585-591页)，例如可将与靶序列的前后序列互补的核苷酸序列分别置于核酶保守性核心的序列(如锤头结构)前后，使构建的核酶能在靶序列处切割含有靶序列的核酸。反义寡核苷酸的常规设计方法可参考文献(Matveeva OV等，核酸研究，2003年，31卷：4989-4994页)。
本发明使用的启动子可以是任何适于在目的细胞中表达目的基因的启动子。可以是组成型的，也可以是诱导型的。还可以是复合启动子，如双启动子。
“可操作地连接”是指所连接的分子的连接方式使得能够实现预期的功能。例如，表达控制序列与基因编码序列的可操作的连接可实现表达控制序列对基因编码序列的表达控制作用。
“表达控制序列”是实现基因表达所需要的控制序列，是本领域熟知的。通常必须包括启动子，常常也包括转录终止序列，也可以包含其他序列，如增强子序列。基因表达对于siRNA、miRNA、核酶和反义寡核苷酸等是指转录，也可以包括转录后加工；对于蛋白质编码序列通常是指转录和翻译，产生成熟的蛋白质。
本发明提供可高效靶向HIV的RNA干扰靶点以及根据该靶点设计的siRNA、miRNA、核酶和反义寡核苷酸。本发明的siRNA、miRNA、核酶和反义寡核苷酸包括对构成siRNA、miRNA、核酶和反义寡核苷酸的磷酸骨架和/或核糖和/或碱基等构成部分进行化学修饰的修饰产物，修饰方法是本领域已知的，可以为硫代修饰和/或固醇修饰和/或PEG修饰和/或糖修饰和/或LNA修饰等，可参见文献：Dykxhoorn DM等，生物医学工程年度综述，2006年，8卷：377-402页；Behlke MA等，分子治疗，2006年，13卷：644-670页等。
在一个具体实施方案中，本发明涉及小分子干扰核糖核酸(siRNA)，其包括正义RNA片段和反义RNA片段，所述正义RNA片段包含本发明RNA干扰靶点编码的RNA序列，反义RNA片段和正义RNA片段能形成双链RNA，且该双链RNA能抑制HIV相应基因的表达和/或HIV的复制和/或感染。
在本发明中，术语“小分子核糖核酸”、“小分子干扰核糖核酸”或“siRNA”可互换使用，它们都指能够抑制HIV靶基因表达、包括正义RNA片段区域和反义RNA片段区域的核糖核酸(RNA)。
相关地，本发明还提供DNA序列的组合，其包括或者由编码正义RNA片段的第一DNA序列和编码反义RNA片段的第二DNA序列组成，所述正义RNA片段包含本发明靶序列所编码的RNA序列，反义RNA片段和正义RNA片段能形成双链RNA，且该双链RNA能(通过RNA干扰)抑制HIV基因的表达和/或HIV的复制和/或感染。
在本发明的这方面，所述正义RNA片段和反义RNA片段可以存在于两条不同的RNA链上或者存在于一条RNA链上，例如在一个单链RNA分子包含正义RNA片段和反义RNA片段。
例如，本发明的siRNA可以为发夹型单链RNA分子，其中正义RNA片段和反义RNA片段之间的互补区域形成双链RNA区域。
正义RNA片段和反义RNA片段的长度优选为8-50个核苷酸，优选10-30(更优选15-27，19-23，如19、20或者21)个。但也可以更长或者更短。
在正义RNA片段和反义RNA片段形成的双链RNA的互补区域至少有10个(优选15个，更优选18个，如19、20或者21个)碱基对。优选地，所述正义RNA片段与反义RNA片段之间的互补区域含19、20、或21对互补碱基。
在一个实施方案中，在正义RNA片段和反义RNA片段之间允许有少量的错配，例如1-5个，如1个或2个或3个或4个碱基错配。在一个优选实施方案中，正义RNA片段和反义RNA片段完全互补。
在一个实施方案中，本发明的siRNA为具有10-30(优选，15-27，更优选19-23)对碱基的双链RNA分子，所述双链中至少有10个(优选15个，更优选18个)碱基互补配对。
在一个优选的实施方案中，正义RNA片段和反义RNA片段的GC含量为35％-75％，例如40-60％、45-55％、48-52％，如约50％。
在一个优选的实施方案中，正义RNA片段和反义RNA片段与已知人类基因和基因表达片段无显著的一致性。显著的一致性是指至少60％，例如70，80、90％一致性。
优选的是，所述正义RNA片段自5’端开始的19个核苷酸序列中的碱基为鸟嘌呤(G)的核苷酸数量与碱基为胞嘧啶(C)的核苷酸数量之和占除去3’端的TT以外的19个核苷酸数量的比例为35％-75％(即G/C比例)，所述反义RNA片段及其一个核苷酸的突变体与已知人类基因和基因表达片段无显著一致性。
在本发明重组表达载体的一个实施方案中，本发明重组表达载体包含本发明涉及的RNA干扰靶点的编码核酸序列，这些编码核酸序列与表达控制序列可操作地连接，使得可在动物细胞(特别是哺乳动物细胞，如人细胞，如HIV受体细胞和干细胞)中表达所述靶向HIV的siRNA和/或miRNA和/或核酶和/或反义寡核苷酸。
类似地，在制备本发明改造细胞的方法中，可以通过用包含本发明涉及的RNA干扰靶点的编码核酸序列的表达载体转化或转染或转导细胞(包括动物例如哺乳动物优选人的细胞，优选HIV受体细胞和干细胞，如CD4+细胞和CD34+细胞)来获得本发明改造细胞，只要最终得到的细胞包含本发明涉及的RNA干扰靶点的编码核酸序列即可。
也可以通过在所述细胞中导入包含有由本发明提供的RNA干扰靶点获得的siRNA和/或miRNA和/或核酶和/或反义寡核苷酸来获得本发明改造细胞，只要得到的细胞包含有由本发明提供的RNA干扰靶点获得的siRNA和/或miRNA和/或核酶和/或反义寡核苷酸即可。
本发明的重组表达载体可以是质粒载体或病毒载体，例如逆转录病毒载体，包括慢病毒载体。优选地，所述重组表达载体是逆转录病毒载体，更优选慢病毒载体。
本发明的改造的细胞优选是哺乳动物(优选人)的细胞，优选HIV受体细胞，如CD4+细胞，优选干细胞，特别是造血干细胞，如CD34+细胞。所述细胞在基因组中或基因组外携带本发明涉及的RNA干扰靶点的编码核酸序列，这些编码核酸序列与表达控制序列可操作地连接，使得可在该细胞中表达所述siRNA和/或miRNA和/或核酶和/或反义寡核苷酸。
本发明的重组载体和改造细胞可以用于对HIV感染的治疗。
在具体的实施方案中，涉及以下内容：
1.靶向HIV的RNA干扰靶点序列：
siGAG0942：AAATTGGATGACAGAAACC    (SEQ ID NO.1)
siGAG1091：CTGAAGCAATGAGCCAAGT    (SEQ ID NO.2)
siGAG1273：GATTGTACTGAGAGACAGGCT  (SEQ ID NO.3)
siPOL0922：TGGAAAGGATCACCAGCAA    (SEQ ID NO.4)
siPOL0927：AGGATCACCAGCAATATTC    (SEQ ID NO.5)
siPOL0937：GCAATATTCCAGTGTAGCA    (SEQ ID NO.6)
siPOL1026：GTATGTAGGATCTGACTTA    (SEQ ID NO.7)
siPOL1102：GGATTTACCACACCAGACA    (SEQ ID NO.8)
siPOL1131：GAAAGAACCTCCATTCCTT    (SEQ ID NO.9)
siPOL1217：GCTGGACTGTCAATGACAT    (SEQ ID NO.10)
siPOL1223：CTGTCAATGACATACAGAA    (SEQ ID NO.11)
siPOL1402：CCGGTACATGGAGTGTATT    (SEQ ID NO.12)
siPOL1411：GGAGTGTATTATGACCCAT    (SEQ ID NO.13)
siPOL1468：GGCCAATGGACATATCAAA    (SEQ ID NO.14)
siPOL1470：CCAATGGACATATCAAATT    (SEQ ID NO.15)
siPOL1544：CCCACACTAATGATGTGAA    (SEQ ID NO.16)
siPOL1548：CACTAATGATGTGAAACAA    (SEQ ID NO.17)
siPOL1550：ACACTAATGATGTGAAACAATT (SEQ ID NO.18)
siPOL1734：GAAGTTATGGTACCAGTTA    (SEQ ID NO.19)
siPOL1762：CCCATAATAGGAGCAGAAA    (SEQ ID NO.20)
siPOL2008：TCAGAGTTAGTCAGTCAAA    (SEQ ID NO.21)
siPOL2252：TAGTAGCCAGCTGTGATAA    (SEQ ID NO.22)
siVIF009：CAGATGGCAGGTGATGATT     (SEQ ID NO.23)
siVIF037：GTAGACAGGATGAGGATTA     (SEQ ID NO.24)
siVIF038：TAGACAGGATGAGGATTAA     (SEQ ID NO.25)
siGAG0432：TCAGGCCATATCACCTAGA    (SEQ ID NO.26)
siGAG0738：AATAGGATGGATGACACAT    (SEQ ID NO.27)
siGAG1438：GGAGCCGATAGACAAGGAA    (SEQ ID NO.28)
siPOL1327：GCACTAACAGAAGTAGTAC    (SEQ ID NO.29)
siVIF090：TATTTCAAGGAAAGCTAAG     (SEQ ID NO.30)
siVIF344：TTTCAGAATCTGCTATAAG     (SEQ ID NO.31)
siVPU164：GAGTGAAGGAGAAGTATCA     (SEQ ID NO.32)
2.表达载体，优选慢病毒载体，可用于改造HIV受体细胞或造血干细胞。
A.一个可表达MGMT(P140K)基因和单个或多个siRNAs、和/或miRNAs、和/或靶向HIV的核酶的重组慢病毒载体。
B.一个改造后的用于生产慢病毒载体的包装载体(如包装质粒)，其含有突变后的来源于HIV的用于表达包装蛋白的基因序列。
改造序列的例子为：
包装载体：--------GTAGACAGGATGAGGATTA--------
突变为    --------GTAGACAGGACGAAGATTA--------
包装载体：--------GGATTTACCACACCAGACA--------
突变为：  --------GGATTTACCACCCCCGACA--------
包装载体：--------GCTGGACTGTCAATGACAT--------
突变为：  --------GCTGGACTGTGAACGACAT--------
包装载体：--------GCACTAACAGAAGTAGTAC--------
突变为：  --------GCACTAACAGAAGTGGTGC--------
包装载体：--------TAGTAGCCAGCTGTGATAA--------
突变为：  --------TAGTAGCCAGCTGCGACAA--------
该慢病毒在HIV受体细胞和/或造血干细胞上的应用.
A.可用于稳定表达抗HIV的分子，如可在HIV受体细胞和/或造血干细胞中特异阻断HIV复制的siRNA。
B.可用于防止造血干细胞被BG/BCNU杀死。
3.改造的细胞，如HIV受体细胞和造血干细胞，其包含有本发明涉及的RNA干扰靶点的编码核酸序列，可表达所述的siRNA和/或miRNA和/或核酶和/或反义寡核苷酸；或被导入了由本发明提供的RNA干扰靶点获得的siRNA和/或miRNA和/或核酶和/或反义寡核苷酸。
RNA干扰靶点的序列(SEQ ID NO：1-32)
                        实施例
实施例1.siRNA表达质粒的设计与构建
靶向HIV的RNA干扰靶点序列的设计：以HIV参考序列为靶序列，选择保守性好的区域进行步移设计siRNA序列；将初选获得的siRNA序列在GenBank中进行BLAST检索，选择与非靶向序列具有3个或3个以上碱基相异的序列作为候选序列。
siRNA表达质粒的构建：siRNA的表达载体为pSUPER载体(oligoengine公司Cat.No VEC-PBS-0001/0002)，具体的构建过程可参见该公司的pSUPER载体实验指南(www.oligoengine.com)，构建简要流程可见示意图1。分别合成带有RNA干扰序列的引物，将互补引物经退火处理后连接到经Bgl II和Hind III双酶切的pSUPER载体，经酶切和测序鉴定获得正确的siRNA表达质粒。
对照siRNA表达质粒的构建：以特异靶向luciferase基因的siRNA序列siRNA-luc(具体序列是5’-GTGCGCTGCTGGTGCCAAC-3’)以及不与HIV和人类基因相匹配的无关siRNA序列siRNA-Nk(具体序列是5’-TGCATCGGAAAATAGATGT-3’)作为对照。通过上述方法合成引物构建至pSUPER载体上，经酶切和测序鉴定后获得相应的siRNA表达质粒。
实施例2.共转染实验筛选获得可高效抑制HIV的RNA干扰靶点
pNL4-3质粒(来自于巴斯德研究所；也可以使用其它的I型HIV感染性克隆质粒)是I型HIV的感染性克隆质粒，在转染合适的哺乳细胞后(如293FT细胞)具有可表达HIV病毒蛋白及病毒粒子的能力。p24是HIV病毒的壳蛋白，通过检测细胞培养上清中的p24蛋白的含量可以反映病毒蛋白和病毒粒子的表达水平，也与病毒效价呈正相关。因此可将siRNA表达质粒分别和HIV感染性克隆质粒(pNL4-3质粒)在293FT细胞中进行共转染实验，通过检测共转染后细胞的p24蛋白的表达水平来对不同siRNA抑制HIV-1复制的效率进行检验。
293FT细胞(Invitrogen，Catalog#R700-07)培养于24孔细胞培养板中，汇合率约为70％。12h后每孔细胞转染0.1μg pNL4-3质粒和1μg的siRNA表达质粒，转染试剂为Lipofectamine 2000(Invitrogen Cat.No 11668-027)，转染方法参见该试剂的操作指南。在共转染48h后分别收集细胞培养上清，经梯度稀释后用MurexHIV Antigen Mab(Cat.No.8E77-02)检测细胞培养上清中p24蛋白的活性。以共转染了对照siRNA表达质粒和HIV感染性克隆质粒的293FT细胞的培养上清中的p24蛋白含量为对照，计算各siRNA对HIV的抑制效率。通过比较，获得了32个具有高效抑制能力的RNA干扰靶点。附图2显示了分别以这32个RNA干扰靶点序列构建获得的siRNA表达质粒在转染入细胞后对HIV病毒基因表达的抑制效率。
下面是我们获得的可用于有效抑制HIV的RNA干扰靶点序列：
siGAG0942：AAATTGGATGACAGAAACC    (SEQ ID NO.1)
siGAG1091：CTGAAGCAATGAGCCAAGT    (SEQ ID NO.2)
siGAG1273：GATTGTACTGAGAGACAGGCT  (SEQ ID NO.3)
siPOL0922：TGGAAAGGATCACCAGCAA    (SEQ ID NO.4)
siPOL0927：AGGATCACCAGCAATATTC    (SEQ ID NO.5)
siPOL0937：GCAATATTCCAGTGTAGCA    (SEQ ID NO.6)
siPOL1026：GTATGTAGGATCTGACTTA    (SEQ ID NO.7)
siPOL1102：GGATTTACCACACCAGACA    (SEQ ID NO.8)
siPOL1131：GAAAGAACCTCCATTCCTT    (SEQ ID NO.9)
siPOL1217：GCTGGACTGTCAATGACAT    (SEQ ID NO.10)
siPOL1223：CTGTCAATGACATACAGAA    (SEQ ID NO.11)
siPOL1402：CCGGTACATGGAGTGTATT    (SEQ ID NO.12)
siPOL1411：GGAGTGTATTATGACCCAT    (SEQ ID NO.13)
siPOL1468：GGCCAATGGACATATCAAA    (SEQ ID NO.14)
siPOL1470：CCAATGGACATATCAAATT    (SEQ ID NO.15)
siPOL1544：CCCACACTAATGATGTGAA    (SEQ ID NO.16)
siPOL1548：CACTAATGATGTGAAACAA    (SEQ ID NO.17)
siPOL1550：ACACTAATGATGTGAAACAATT (SEQ ID NO.18)
siPOL1734：GAAGTTATGGTACCAGTTA    (SEQ ID NO.19)
siPOL1762：CCCATAATAGGAGCAGAAA    (SEQ ID NO.20)
siPOL2008：TCAGAGTTAGTCAGTCAAA    (SEQ ID NO.21)
siPOL2252：TAGTAGCCAGCTGTGATAA    (SEQ ID NO.22)
siVIF009：CAGATGGCAGGTGATGATT     (SEQ ID NO.23)
siVIF037：GTAGACAGGATGAGGATTA     (SEQ ID NO.24)
siVIF038：TAGACAGGATGAGGATTAA     (SEQ ID NO.25)
siGAG0432：TCAGGCCATATCACCTAGA    (SEQ ID NO.26)
siGAG0738：AATAGGATGGATGACACAT    (SEQ ID NO.27)
siGAG1438：GGAGCCGATAGACAAGGAA    (SEQ ID NO.28)
siPOL1327：GCACTAACAGAAGTAGTAC    (SEQ ID NO.29)
siVIF090：TATTTCAAGGAAAGCTAAG     (SEQ ID NO.30)
siVIF344：TTTCAGAATCTGCTATAAG     (SEQ ID NO.31)
siVPU164：GAGTGAAGGAGAAGTATCA     (SEQ ID NO.32)
通过上面的实验，我们证明了本发明的32个RNA干扰靶点可用于高效抑制HIV表达。
在以下的实验中，我们从上述RNA干扰靶点选取了siVIF037、siPOL1102、siPOL1217、siPOL1327、siPOL2252为例，进一步分别构建可表达靶向siVIF037、siPOL1102、siPOL1217、siPOL1327、siPOL2252的siRNA的重组慢病毒，构建方法见实施例3和实施例4。
实施例3.表达siRNA的表达载体和慢病毒包装载体的构建
表达载体：在该实施例中，我们使用的慢病毒系统的表达载体pDEST-MR(专利申请号：200510112917.1；公开号：CN1948475)包含了由mPGK启动子控制的MGMT(P140K)基因及一个由H1启动子控制的可用于表达siRNA的表达框。
表达载体pDEST-VIF037、pDEST-POL1102、pDEST-POL1217、pDEST-POL1327、pDEST-POL2252的构建方法：
分别合成VIF037、POL1102、POL1217、POL1327、POL2252基因片段(这里分别包括了实施例2中所示的RNA干扰靶点序列siVIF037(SEQ ID NO：24)、siPOL1102(SEQ ID NO：8)、siPOL1217(SEQ IDNO：10)、siPOL1327(SEQ ID NO：29)、siPOL2252(SEQ ID NO：22)作为示例，但是也可以包括其他本发明提供的RNA干扰靶点序列)，片段的5’端添加Age I位点，3’端添加Sma I位点；基因片段经Age I、Sma I酶切后与经同样酶切的pDEST-MR质粒连接，构建获得表达载体pDEST-VIF037、pDEST-POL1102、pDEST-POL1217、pDEST-POL1327、pDEST-POL2252。
我们对构建获得的重组慢病毒表达载体pDEST-VIF037、pDEST-POL1102、pDEST-POL1217、pDEST-POL1327、pDEST-POL2252的表达有效性进行了验证。在pGL3-control质粒(购自Promega公司)的luciferase基因的终止密码子与PolyA之间分别插入VIF基因序列、POL基因序列构建了报告质粒pGL3-VIF、pGL3-POL。以靶向luciferase的siRNA-luc表达质粒和靶向无关序列的siRNA-Nk表达质粒作为对照，进行共转染抑制实验。结果如图3所示，pGL3-VIF与表达载体pDEST-VIF037共转染时luciferase基因的表达受到了有效抑制，而pGL3-control与表达载体pDEST-VIF037共转染时luciferase基因的表达不会受到抑制；pGL3-POL分别与表达载体pDEST-POL1102、pDEST-POL1217、pDEST-POL1327、pDEST-POL2252共转染时luciferase基因的表达受到了有效抑制，而pGL3-control分别与表达载体pDEST-POL1102、pDEST-POL1217、pDEST-POL1327、pDEST-POL2252共转染时luciferase基因的表达不会受到抑制。结果说明构建获得的表达载体pDEST-VIF037、pDEST-POL1102、pDEST-POL1217、pDEST-POL1327、pDEST-POL2252可表达所编码的siRNA序列，且具有基因靶向特异性。
慢病毒包装载体的改造：由于慢病毒载体主要来源于HIV-1。慢病毒载体的体外包装需要几种HIV-1蛋白如HIV POL和GAG基因的产物。由于我们需要用慢病毒作为靶向HIV-1的siRNA的表达载体，为了防止表达载体上表达的siRNA会抑制慢病毒包装载体的表达，即为了正常获得重组慢病毒，在该实施例中我们对包装载体上来源于HIV-1的基因序列进行了相应的突变。因此，包装细胞中的由包装载体转录出的mRNA不会被所需要表达的siRNA(如本次实施例中作为示例所选的分别靶向siVIF037、siPOL1102、siPOL1217、siPOL1327、siPOL2252的siRNA)所降解。
包装载体的序列突变情况如下所示：
包装载体：--------GTAGACAGGATGAGGATTA--------
突变为    --------GTAGACAGGACGAAGATTA--------
包装载体：--------GGATTTACCACACCAGACA--------
突变为：  --------GGATTTACCACCCCCGACA--------
包装载体：--------GCTGGACTGTCAATGACAT--------
突变为：  --------GCTGGACTGTGAACGACAT--------
包装载体：--------GCACTAACAGAAGTAGTAC--------
突变为：  --------GCACTAACAGAAGTGGTGC--------
包装载体：--------TAGTAGCCAGCTGTGATAA--------
突变为：  --------TAGTAGCCAGCTGCGACAA--------
为了验证突变后的包装载体的表达是否会受表达载体所表达的siRNA的影响。我们进行了共转染验证实验，结果如附图4所示，突变后的包装载体的表达不会受到表达载体pDEST-VIF037、pDEST-POL1102、pDEST-POL1217、pDEST-POL1327、pDEST-POL2252的影响。
实施例4.表达siRNA的重组慢病毒的构建及对HIV受体细胞的基因转移效率
除可表达靶向HIV的siRNA的表达载体质粒和经突变改造的包装载体质粒pLP1-M1，构建重组慢病毒所需的其它质粒为pLP2、VSVG，从Invitrogen公司购买，品名为：pLenti4/V5-DEST Gateway VectorKit，货号：V469-10。
重组慢病毒的制备方法：
(1)用氯化铯-溴化乙锭密度梯度离心法大量提取四种质粒pVSVG、pLP1-M1、pLP2、表达载体质粒(如该实施例中作为示例的pDEST-VIF037质粒、pDEST-POL1102质粒、pDEST-POL1217质粒、pDEST-POL1327质粒、pDEST-POL2252质粒)(提取方法参见《分子克隆实验指南》，J.萨姆布鲁克D.W.拉塞尔著，科学出版社，2002)；
(2)293FT细胞培养于DMEM培养基中(添加10％FBS，2mML-glutamine，0.1mM MEM Non-Essential Amino Acids及1％penicillin-streptomycin)；
(3)将293FT细胞培养于直径10cm的细胞培养板上，汇合率约70％。12h后用磷酸钙转染方法介导10μg pLP1、10μg pLP2、10μgpVSVG、20μg表达载体质粒共4种质粒进行共转染(方法参见《分子克隆实验指南》，J.萨姆布鲁克D.W.拉塞尔著，科学出版社，2002)；
(4)转染48h后收集细胞培养上清，0.45μm的滤膜过滤；用SW28转头(BECKMAN公司)以25,000rpm在4℃离心90min；
(5)弃去上清，加500μL PBS溶解沉淀；
(6)分装病毒收集液，贮存于-80℃备用。
MT-4细胞是人源的CD4+T淋巴细胞，可支持HIV-1的复制。将获得的重组慢病毒Lenti-VIF037、Lenti-POL1102、Lenti-POL1217、Lenti-POL1327、Lenti-POL2252以moi＝40分别对MT-4细胞进行转导实验，培养1周后用免疫荧光染色和流式细胞仪检测靶细胞中MGMT(P140K)基因的表达效率(表1)。结果显示，重组慢病毒Lenti-VIF037、Lenti-POL1102、Lenti-POL1217、Lenti-POL1327、Lenti-POL2252可有效转导MT-4细胞。
  重组慢病毒   对MT-4细胞的转导效率
  Lenti-VIF037   65.02％
  Lenti-POL1102   71.21％
  Lenti-POL1217   70.63％
  Lenti-POL1327   62.25％
  Lenti-POL2252   75.18％
                    表1
表1显示了重组慢病毒对CD4+HIV受体细胞MT-4的转导效率。
实施例5.靶向HIV的siRNA通过重组慢病毒导入HIV受体细胞对HIV的抑制作用
我们应用HIV体外细胞感染模型验证siRNA抑制HIV的效果。
MT-4细胞为人源的CD4+T淋巴细胞株，能够支持HIV的感染和复制，也可用于HIV的体外培养。
HIV-1NL4-5为B亚型、T细胞嗜性的HIV-1病毒，可有效感染并在MT-4细胞中复制。
攻毒实验方法：慢病毒Lenti-VIF037、Lenti-POL1102、Lenti-POL1217、Lenti-POL1327、Lenti-POL2252以moi＝40分别转导MT-4细胞，600g离心60min后换液；带有靶向luciferase基因的siRNA表达元件的对照重组慢病毒Lenti-luc(靶向lucifezase基因的siRNA表达元件序列同实施例1；按照实施例3和4的方法制备该对照病毒)moi＝40转导MT-4细胞，600g离心60min后换液；转导后的MT-4细胞在37℃培养48h后，分别以不同剂量的HIV-1NL4-3(100pg和500pg)进行攻毒实验，感染12h后换液培养；在感染后的不同的时间点采集细胞培养上清，用Murex HIV Antigen Mab(Cat.No.8E77-02)检测试剂盒检测细胞培养上清中p24蛋白的含量。攻毒实验对照为未转导的MT-4细胞和对照重组慢病毒Lenti-luc转导的MT-4细胞。
结果如图5所示，重组慢病毒Lenti-VIF037、Lenti-POL1102、Lenti-POL1217、Lenti-POL1327、Lenti-POL2252转导后的MT-4细胞均可显示出抑制HIV-1复制的能力。这表明在携带有靶向HIV的siRNA表达序列的重组慢病毒载体转导后的HIV受体细胞中抗HIV的siRNA在这些细胞中进行了表达，从而导致对HIV的感染产生抗性。
实施例6改造获得可稳定表达靶向HIV的siRNA的HIV受体细胞
我们对重组慢病毒Lenti-VIF037、Lenti-POL1102、Lenti-POL1217、Lenti-POL1327、Lenti-POL2252转导后的MT-4细胞分别应用有限稀释方法进行克隆化筛选。由于慢病毒载体具有稳定整合能力，可将携带的靶向HIV的siRNA表达元件序列及药物筛选基因MGMT(P140K)表达元件序列整合至靶细胞基因组。通过筛选，用免疫荧光染色和流式细胞仪检测筛选后细胞中MGMT(P140K)基因的表达效率。结果如表2所示，经克隆化筛选后可在超过99％的细胞中检测到MGMT(P140K)基因的表达，我们将改造后的细胞分别称为MT-4-VIF037细胞、MT-4-POL1102细胞、MT-4-POL1217细胞、MT-4-POL1327细胞、MT-4-POL2252细胞。
  细胞   MGMT(P140K)基因的表达效率
  MT-4-VIF037   99.90％
  MT-4-POL1102   99.25％
  MT-4-POL1217   99.92％
  MT-4-POL1327   99.30％
  MT-4-POL2252   99.21％
               表2
表2显示了药物筛选基因MGMT(P140K)在改造后的HIV受体细胞中的表达效率。
实施例7改造后的HIV受体细胞在高剂量HIV攻毒实验中对HIV的抑制作用
对经改造后的可表达靶向HIV的siRNA的HIV受体细胞进行高剂量的HIV攻毒实验。实验中HIV-1NL4-3的攻毒剂量分别提高至2500pg和12500pg。在攻毒后分别在不同的时间点采集细胞培养上清，用Murex HIV Antigen Mab(Cat.No.8E77-02)检测试剂盒检测细胞培养上清中p24蛋白的含量。结果显示(图6)，相比对照细胞，经改造后的可稳定表达靶向HIV的siRNA的HIV受体细胞(本实验中的MT-4-POL1102细胞、MT-4-POL1217细胞、MT-4-POL1327细胞、MT-4-POL2252细胞、MT-4-VIF037细胞)在高攻毒条件可获得显著的抑制HIV的效果。这表明了经改造后的携带有靶向HIV的siRNA表达元件的HIV受体细胞具有了抑制HIV病毒复制表达的能力，可对HIV的感染产生抗性。
实施例8化学合成的siRNA对HIV的抑制效果。
我们从上述RNA干扰靶点选取了siVIF037为例(这里包括了实施例2中所示的RNA干扰靶点序列siVIF037(SEQ ID NO.24)作为示例，但是也可以包括其他本发明提供的RNA干扰靶点序列)，合成了可靶向siVIF037的siRNA，siRNA的正义RNA片段包含本发明靶序列siVIF037(SEQ ID NO.24)所编码的RNA序列，反义RNA片段可与正义RNA片段互补形成双链RNA(在本实施例中反义链与正义链完全互补，但是也可以允许反义链和正义链有少量的错配，如1个或2个或3个或4个)，在正义RNA片段和反义RNA片段的3’末端分别添加dTdT。合成好的siRNA命名为siR-VIF037。通过相同方法合成了靶向luciferase基因的siRNA(siR-luc)(siR-luc的靶点序列同实施例1)作为对照。
siRNA的合成方法简述如下：采用β-乙腈亚磷酸胺化学合成法，使用全自动DNA合成仪分别合成siRNA的正义RNA片段和反义RNA片段，合成好的正义RNA片段和反义RNA片段等摩尔比混合，在PCR仪上经过变性、退火过程，得到所需的siRNA。
实验方法：293FT细胞培养于24孔细胞培养板中，汇合率约为70％。12h后每孔细胞转染0.1μg pNL4-3质粒和5ng的化学合成的siRNA，转染试剂为Lipofectamine 2000(Invitrogen Cat.No11668-027)，转染方法参见该试剂的操作指南。在共转染48h后分别收集细胞培养上清，经梯度稀释后用Murex HIV Antigen Mab(Cat.No.8E77-02)检测细胞培养上清中p24蛋白的活性。以共转染了siR-luc和HIV感染性克隆质粒的293FT细胞的培养上清中的p24蛋白含量为对照，计算siR-VIF037对HIV的抑制效率。
结果如图7所示，合成的siR-VIF037可抑制HIV在细胞内的复制表达。
实施例9.化学合成并经修饰的siRNA对HIV的抑制效果
我们从上述RNA干扰靶点选取了siVIF037、siPOL1217为例(这里分别包括了实施例2中所示的RNA干扰靶点序列siVIF037(SEQ IDNO.24)，siPOL1217(SEQ ID NO.10)作为示例，但是也可以包括其他本发明提供的RNA干扰靶点序列)，合成了可分别靶向siVIF037、siPOL1217的siRNA，siRNA的正义RNA片段分别包含本发明靶序列siVIF037(SEQ ID NO.24)，siPOL1217(SEQ ID NO.10)所编码的RNA序列，反义RNA片段和正义RNA片段互补形成双链RNA，在正义RNA片段和反义RNA片段的3’末端分别添加dTdT。同时合成过程中分别采用了不同的修饰方式。其中，siRpo-VIF037和siRpo-POL1217为经过2’-OMe修饰(2’-甲氧基修饰)和磷酸化修饰的分别靶向siVIF037、siPOL1217的siRNA(合成方法：采用β-乙腈亚磷酸胺化学合成法，使用全自动DNA合成仪分别合成siRNA的正义RNA片段和反义RNA片段，其中正义RNA片段和反义RNA片段的5’端三个碱基和3’端dTdT前面的三个碱基用2’-OMe修饰的单核苷酸合成，反义RNA片段的5’末端碱基进行磷酸化处理。合成好的正义RNA片段和反义RNA片段等摩尔比混合，在PCR仪上经过变性、退火过程，得到所需的siRNA)；siRpoC-VIF037和siRpoC-POL1217为经过2’-OMe修饰和磷酸化修饰和固醇修饰的分别靶向siVIF037、siPOL1217的siRNA(合成方法同上，不同的地方是在合成正义RNA片段时，3’端dTdT前面的三个碱基不进行2’-OMe修饰，用含有胆固醇-氨基己酸-吡咯烷(cholestero1-aminocaproic-acid-pyrrolidine)接头的Glass担体作为合成支持物，在3’端dTdT前面的碱基通过硫代磷酸酯连接胆固醇基团。其余步骤均与上述合成siRpo-VIF037和siRpo-POL1217的方法相同)。同时，分别合成了靶向不与HIV和人类基因相匹配的无关RNA干扰靶点siRNA-Nk(序列同实施例1)的并经同样修饰的siRNA(siRpo-Nk和siRpoC-Nk)作为对照。这里分别包括了对靶向实施例2中所示的RNA干扰靶点序列siVIF037(SEQ ID NO.24)，siPOL1217(SEQ ID NO.10)的合成的siRNA进行2’-OMe修饰和/或磷酸化修饰和/或固醇修饰作为示例，但是也可以包括对靶向其他本发明提供的RNA干扰靶点序列的合成的siRNA进行其它不同方式的修饰。
实验方法：293FT细胞培养于24孔细胞培养板中，汇合率约为70％。12h后每孔细胞分别共转染0.1μg pNL4-3质粒和5ng合成并经修饰的siRNA，转染试剂为Lipofectamine 2000(Invitrogen Cat.No11668-027)，转染方法参见该试剂的操作指南。在共转染48h后分别收集细胞培养上清，经梯度稀释后用Murex HIV Antigen Mab(Cat.No.8E77-02)检测细胞培养上清中p24蛋白的活性。分别以共转染了siRpo-Nk、siRpoC-Nk和pNL4-3质粒的293FT细胞的培养上清中的p24蛋白含量为对照，检测siRpo-VIF037、siRpo-POL1217、siRpoC-VIF037、siRpoC-POL1217对HIV的抑制效率。
结果如图8所示，合成的siRpo-VIF037、siRpo-POL1217、siRpoC-VIF037、siRpoC-POL1217均可抑制HIV在细胞内的复制表达。
实施例10在H2K-PBL-SCID小鼠模型上验证siRNA对HIV的抑制效果。
我们从上述RNA干扰靶点选取了siVIF037为例(这里包括了实施例2中所示的RNA干扰靶点序列siVIF037(SEQ ID NO.24)作为示例，但是也可以包括其他本发明提供的RNA干扰靶点序列)，以慢病毒表达载体质粒pDEST-MR(见实施例3)为基础构建了质粒pDEST-H2K-VIF037，该质粒具有H2K基因表达框和可表达靶向siVIF037的siRNA的表达框。同时进一步将pDEST-H2K-VIF037质粒上表达靶向siVIF037的siRNA的表达框替换为靶向luciferase的siRNA(靶点序列同实施例1)表达框，得到pDEST-H2K-luc质粒，作为对照。用pDEST-H2K-VIF037和pDEST-H2K-luc分别制备慢病毒Lenti-H2K-VIF037和Lenti-H2K-luc(方法参见实施例4)。
抽取人全血40ml，用Ficoll-paque plus(GE Heathcare cat.NO17-1440-03)分离PBMC细胞后(方法见操作手册)，在AIM-V培养基中(GIBCO cat.NO 12055)以PHA刺激培养48h。然后，用慢病毒Lenti-H2K-VIF037和Lenti-H2K-luc分别转导PHA刺激的PBMC细胞(转导方法同实施例5)。转导后的细胞在含有IL-2的AIM-V培养基中继续培养72h。
用MAcSelect Kk transfected cell selection kit(MiltenyiBiotec cat.NO 130-091-986)分别分离上述被慢病毒Lenti-H2K-VIF037和Lenti-H2K-luc感染并稳定表达外源标记基因H2K的细胞(方法见操作手册)。阳性筛选细胞在含有IL-2的AIM-V培养基中继续培养96h。
联合免疫缺陷型(SCID)小鼠(无菌级，7～8周龄，体重约为16～20g，每组3只小鼠)，使用前1周腹腔注射0.5ml石蜡油，然后每只小鼠腹腔内注射经上述步骤获得后的PBMC细胞(5×105/g体重)，得到H2K-PBL-SCID杂合小鼠。小鼠体内的人PBMC细胞如来源于Lenti-H2K-VIF037转导的细胞则简称其为VIF037杂合小鼠，如来源于Lenti-H2K-luc转导的细胞则简称其为luc杂合小鼠。
12h后通过腹腔分别注射HIV-1NL4-3到VIF037杂合小鼠和luc杂合小鼠体内。HIV-1NL4-5为B亚型、T细胞嗜性的HIV-1病毒。感染病毒后7d、14d用眼球采血法采集200μL血液，经梯度稀释后用Murex HIVAntigen Mab(Cat.No.8E77-02)检测细胞培养上清中p24蛋白的活性。以luc杂合小鼠体内的p24蛋白活性为实验对照。
结果如图9所示，VIF037杂合小鼠具有抑制HIV复制的能力。
本领域的技术人员应当明了，尽管为了举例说明的目的本文描述了本发明的具体实施方案，但可以对其进行各种修改而不偏离本发明的精神和范围。因此，本发明的具体实施方案和实施例不应当视为限制本发明的范围。本发明仅受所附权利要求的限制。本申请中引用的所有文献均完整地并入本文作为参考。
                            序列表
Figure S2008101100073D00281
Figure S2008101100073D00291
Figure S2008101100073D00311
Figure S2008101100073D00321

Claims (20)

1.靶向HIV的RNA干扰靶点，其序列选自：
(1)SEQ ID NO：1序列；或者
(2)上述序列的互补序列。
2.包含权利要求1的RNA干扰靶点的核酸构建体。
3.包含权利要求1的RNA干扰靶点的载体。
4.依据权利要求1所述的RNA干扰靶点获得的、能够抑制HIV相应基因的表达和/或HIV的复制和/或感染的siRNA，其序列是AAAUUGGAUGACAGAAACC UUCAAGAGA GGUUUCUGUCAUCCAAUUU UU。
5.一种重组表达载体，其可表达权利要求4的siRNA。
6.权利要求5的重组表达载体，其包含靶向HIV的siRNA的编码核酸序列，这些编码核酸序列与表达控制序列可操作地连接，使得可在动物细胞中表达所述的siRNA。
7.权利要求6的重组表达载体，其中所述动物细胞是哺乳动物细胞。
8.权利要求7的重组表达载体，其中所述哺乳动物细胞是人细胞。
9.权利要求6的重组表达载体，其中所述动物细胞是HIV受体细胞，所述HIV受体细胞是CD4+细胞或CD34+细胞。
10.权利要求5的重组表达载体，其是质粒载体或病毒载体。
11.权利要求10的重组表达载体，其中所述病毒载体是逆转录病毒载体。
12.权利要求11的重组表达载体，其中所述逆转录病毒载体是慢病毒载体。
13.转化或转染或转导了权利要求5-12任一项的重组表达载体的分离的细胞。
14.一种改造的分离的细胞，其可表达或包含有权利要求4的siRNA。
15.权利要求14的改造的细胞，其在基因组中或者基因组外携带权利要求1中所述的RNA干扰靶点的编码核酸序列，这些编码核酸序列与表达控制序列可操作地连接，使得可在该细胞中表达所述siRNA。
16.权利要求15的改造的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
17.权利要求16的改造的细胞，其中所述哺乳动物细胞是人细胞。
18.权利要求15的改造的细胞，其中所述细胞是HIV受体细胞，所述HIV受体细胞是CD4+细胞或CD34+细胞。
19.制备权利要求13-18任一项的细胞的方法，包括用权利要求5-12任一项的重组表达载体转化或转染或转导细胞。
20.权利要求4的siRNA、或权利要求5-12任一项的重组表达载体、或权利要求13-18任一项的细胞在制备治疗HIV感染或者HIV患者或者抑制HIV复制或者HIV基因表达的药物中的用途。
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