CN101313902B - 一种具有保肝作用的中药活性单体成分及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及丹参的天然提取物丹参酮IIA在制备用于治疗或预防肝损伤的药物中的用途。本发明还涉及丹参酮IIA在制备用于治疗或预防与血清谷丙转氨酶活性增加相关的疾病的药物中的用途。

Description

一种具有保肝作用的中药活性单体成分及其用途

技术领域

本发明涉及药学领域。具体地说，本发明涉及一种中药来源的活性成份丹参酮IIA对肝损伤的保护作用。

背景技术

肝炎是严重危害人类健康的重大疾病。肝炎特别是病毒性肝炎在中国的发病率持续在较高水平，就乙型肝炎来说，全世界20亿人感染乙肝病毒，其中6.9亿在中国，全球有乙肝病毒表面抗原(HBsAg)携带者3.5亿人，其中三分之一在中国；全世界每年有75万人死于乙肝病毒染引起的疾病，其中28万人来自中国。肝炎从病因看主要有病毒性肝炎，酒精性肝炎，自身免疫性肝炎等。但是研究发现，不论其初始病因如何，炎症和免疫介导的肝细胞和肝组织损伤是这些疾病的病理过程中共同的必经过程和影响疾病严重程度与预后的主要原因。

对于炎症或免疫介导的肝细胞和肝组织损伤，目前认为其治疗关键在于调节宿主免疫功能。如病毒性肝炎治疗中使用免疫增强剂可促进CTL、NK等杀伤细胞的抗病毒作用。但对于病毒性肝炎引起的肝硬化，目前尚无肯定有效的逆转肝硬化的药物，部分活血化淤软坚的中药可用于早期肝硬化的抗纤维化治疗。而在酒精性肝炎和自身免疫性肝炎的治疗中，以肾上腺皮质激素为代表的免疫抑制剂是最主要的治疗方法之一，但长期使用此类激素产生的副作用较大，可导致感染、出血等不良反应，并可加重患者的骨质疏松程度。肝移植对于严重肝损伤所致的肝功能衰竭是一种有效的治疗方法，但存在器官来源不足及费用昂贵等限制因素。

ConA(伴刀豆蛋白，一种植物凝集素)诱导的肝炎模型(ConA inducedhepatitis，CIH)是一种被国际上广泛采用的研究免疫介导的肝损伤的实验模型(Tiegs G，Hentschel J，Wendel A.A T cell-dependent experimental liver injury inmice inducible by concanavalin A.J Clin Invest1992；90：196-203)。在模型诱导后8到24小时，动物的血清谷丙转氨酶(ALT)活性急剧增加，HE染色可见肝脏正常结构被破坏，大量的肝实质细胞凋亡死亡。在这种模型中，细胞因子包括TNF-α、IFN-γ、白介素-12、白介素-4对肝脏的损伤起了关键作用。CIH主要用作免疫介导的肝脏损伤的机理研究和保肝药物作用机理的研究。

丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参(Salvin miltior rhiza Bunge)的干燥根部，具有活血化瘀、消肿止痛、养血安神之功效，是多种中成药的重要组方成分，对冠心病、脑血栓、肝炎、肝硬化、消化性溃疡等有显著疗效。其主要成分包括水溶性和脂溶性两部分。丹参酮IIA(Tanshinone IIA)的化学结构式如式I所示，其作为丹参脂溶性活性成分之一，在丹参中的含量可达0.5％以上。已发现丹参酮IIA对心脑血管疾病、肿瘤、白血病等具有潜在的治疗作用。

式I

发明内容

本发明利用丹参酮IIA，在CIH模型上证实了其对免疫介导的肝损伤有显著的保护作用。丹参酮IIA可以使CIH小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)的活性降低到1000U/L以下(CIH小鼠ALT平均值在5000U/L以上)。肝脏的病理分析也显示，在丹参酮IIA处理组小鼠几乎看不到明显的肝脏正常结构的破坏。发明人进一步的工作表明，丹参酮IIA对免疫介导的肝损伤的保护作用的机理是引起多种炎性细胞因子，包括γ干扰素和肿瘤坏死因子α表达的显著下降，从而保护肝脏免受损伤。

本发明的一个目的是提供丹参酮IIA在制备用于治疗或预防肝损伤的药物组合物中的用途。

本发明的另一个目的是提供丹参酮IIA在制备用于治疗或预防与谷丙转氨酶活性增加相关的疾病的药物中的用途。

本发明一方面提供丹参酮IIA在制备用于治疗或预防对象的肝损伤的药物组合物中的用途。

在本发明一种实施方式中，所述的肝损伤包括免疫介导的肝损伤。所述免疫介导的肝损伤包括病毒性肝炎、酒精性肝炎和自身免疫性肝炎。

在本发明另一种实施方式中，所述对象包括哺乳动物，优选是人。

在本发明另一种实施方式中，所述药物组合物的剂型包括片剂、粉末剂、颗粒剂、糖浆、胶囊、溶液剂、栓剂或药膏。

在本发明另一种实施方式中，所述药物组合物还包含甘草酸制剂、水飞蓟素等缓解肝脏炎症的其它药物。

本发明第二方面提供丹参酮IIA在制备用于治疗或预防与血清谷丙转氨酶活性增加相关的疾病的药物中的用途。所述与谷丙转氨酶活性增加相关的疾病包括：病毒性肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎、药物性肝炎、脂肪肝、各种内外毒素所致肝损伤、肝内胆汁淤积、胆道梗阻、胰腺疾病、甲状腺功能亢进症、急性心肌梗塞、心力衰竭和多发性肌炎。

在本发明一种实施方式中，所述药物用于降低血清中谷丙转氨酶活性。

在本发明另一种实施方式中，所述药物用于降低血清细胞因子例如肿瘤坏死因子-α和γ-干扰素的表达。

在本发明另一种实施方式中，所述药物用于降低肝脏中编码趋化因子例如IP-10、RANTES或MIP1-α的基因表达。

本发明第三方面提供一种治疗或预防肝损伤、或降低血清谷丙转氨酶活性的方法，包括给需要的对象施用有效量的丹参酮IIA或包含丹参酮IIA的药物组合物。

附图说明

图1显示丹参酮IIA(5mg/kg或10mg/kg)显著降低CIH小鼠血清中的谷丙转氨酶活性。与磷酸缓冲盐水(PBS)对照组相比，p<0.0005。

图2表示肝脏的H&E染色(图2A，PBS处理组；图2B，丹参酮IIA处理组)和TUNEL染色(图2C，PBS处理组；图2D，丹参酮IIA处理组)，说明丹参酮IIA(5mg/kg)显著减少CIH小鼠肝脏炎性侵润和坏死。图2A和B，放大100倍，图2C和D，放大200倍。

图3显示丹参酮ⅡA(5mg/kg)对血清细胞因子例如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)或γ-干扰素的影响。相对于PBS对照组，丹参酮IIA降低了小鼠血清中的TNF-α(P<0.0001)和γ-干扰素(P<0.001)。

图4显示丹参酮IIA(5mg/kg)对肝脏中趋化因子例如IP-10、RANTES或MIP1-α基因表达的影响。相对于PBS对照组，丹参酮IIA处理组小鼠肝脏中IP-10表达水平显著降低(P<0.001)(图4A)，RANTES与MIP-1α的表达水平略有下降(图4B和图4C)。

具体实施方式

本发明利用丹参的天然提取物丹参酮IIA在CIH模型上证实了其对免疫介导的肝损伤有显著的保护作用。发明人通过研究发现，丹参酮IIA可以使CIH小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)的活性降低到1000U/L以下(CIH小鼠ALT平均值在5000U/L以上)，并能够抑制ConA诱导的肝脏炎性浸润和坏死。发明人进一步的工作表明，丹参酮IIA对免疫介导的肝损伤的保护作用的机理是引起多种炎性细胞因子(包括γ干扰素和肿瘤坏死因子α)以及趋化因子(例如IP-10、RANTES和MIP1-α)表达的显著下降，从而保护肝脏免受损伤。

根据本发明一种实施方式，可将丹参酮IIA给予需要治疗的对象来治疗或预防肝损伤。在一个优选实施方式中，所述肝损伤是免疫介导的肝损伤。免疫介导的肝损伤是所有由免疫介导的肝脏损伤的统称，在许多肝炎的发病过程中都起了重要作用。免疫介导的肝损伤包括但不限于：病毒性肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎等肝脏损伤疾病。肝损伤、肝纤维化和肝癌是肝脏损伤的不同病理阶段，免疫介导的肝损伤一般出现在急性期或慢性期的早期，如果由急性期转入慢性期多会导致肝脏的纤维化，而如果肝细胞自我修复系统紊乱，细胞大量的恶性增殖就转变为肝癌。

根据本发明另一实施方式，丹参酮IIA可用于制备治疗或预防肝损伤的药物组合物。

根据本发明另一实施方式，丹参酮IIA可用于制备治疗或预防与血清谷丙转氨酶活性增加相关的疾病的药物。所述与谷丙转氨酶活性增加相关的疾病包括：病毒性肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎、药物性肝炎、脂肪肝、各种内外毒素所致肝损伤、肝内胆汁淤积、胆道梗阻、胰腺疾病、甲状腺功能亢进症、急性心肌梗塞、心力衰竭和多发性肌炎。

丹参酮IIA

丹参酮IIA(Tanshinone IIA)是植物丹参(Salvin miltior rhiza Bunge)干燥根部的一种脂溶性提取物，其化学结构如上文式I所示。

尽管已经有数种全合成丹参酮IIA的方法，但由于原料不易得到，反应步骤较长，生产成本高，收率较低，不适于开展工业化生产，因此直接从丹参中提取丹参酮IIA是目前制备丹参酮IIA的主要方法，提取方法分别有以下几种：环糊精辅助水提工艺法、苯提取法、醇提取法、超临界(C02)流体萃取法、微波提取法、超声提取法等〔杜林，傅正生.丹参酮IIA的制备工艺研究进展.中华实用中西医杂志2006年(19)2：2705-2706〕。可通过很多商业途径获得丹参酮IIA，例如可在上海药检所购得。

目前发现丹参酮IIA能抑制左心室肥厚抗心肌缺氧；护肝、抗肝纤维化和抗肝癌；保护局灶性脑缺血再灌注损伤；抑制多种肿瘤细胞生长；抗早幼粒细胞白血病；诱导成人骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞；抑制瘢痕成纤维细胞增殖；对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、溶血性链球菌均有抑制作用；对出血性休克再灌注肾损伤有保护作用等。

制成药物组合物时，丹参酮IIA可以是中性形式或盐形式。这些盐包括酸加成盐，与无机酸，例如盐酸、磺酸或磷酸，或与有机酸，例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成的盐。合适的碱加成盐包括但不限于：基于碱金属或碱土金属的阳离子，包括锂、钠、钾、钙、镁和铝盐；非毒性季铵和胺阳离子，包括铵、四甲铵、四乙铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、二乙胺和乙胺。用于形成碱加成盐的其他代表性有机胺包括乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶和哌嗪。

药物组合物

有效量的本发明活性成份丹参酮IIA可与药学上可接受的载体配制成药物组合物。

如本文所用，术语“有效量”指一定量的活性成分，它足以影响疾病的病程和严重性，从而使疾病减弱或缓和。有效量将视给药途径和病人的情况而定。

术语“药学上可接受的载体”指包括任何不干涉活性成分的生物活性效果、并对要施用的宿主无毒的载体。例如，对于肠胃外施用，上述活性成分可以以注射用的单位剂量形式配制在载体，如盐水、葡萄糖溶液和林格溶液中。用于药学活性物质的载体是本领域熟知的。除了与治疗组合物不相容的任何常规介质或试剂外，都可考虑用于本发明组合物中。也可在组合物中加入补充的活性成分。可作为药学上可接受的载体或赋形剂或其组分的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。另外，在Remington′s PharmaceuticalSciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。

例如，对于以片剂或胶囊剂形式的口服给药，可将活性物质与药学上可接受的无毒、口服、惰性载体(如乳糖，淀粉，蔗糖，葡萄糖，甲基纤维素，硬脂酸镁，磷酸二钙，硫酸钙，甘露糖醇，山梨糖醇等)合用；对于液体剂型的经口给药，口服活性物质可与任一种药学上可接受的口服、无毒惰性载体(如乙醇，甘油，水等)合并。如果需要，也可将合适的粘合剂，润滑剂，崩解剂，及着色剂搀混于剂型中。合适的粘合剂包括淀粉，明胶，天然糖类如葡葡糖或β-乳糖，玉米增甜剂，天然及合成的树胶如阿拉伯胶、西黄蓍胶或海藻酸钠，羧甲基纤维素，聚乙二醇，蜡类等。可用于这些剂型的合适的润滑剂包括油酸钠，硬脂酸钠，硬脂酸镁，苯甲酸钠，乙酸钠，氯化钠等。崩解剂的例子包括淀粉，甲基纤维素，琼脂，皂土，黄原胶等。本发明所述的药物组合物也可以脂质体输药系统形式给药，例如小的单层囊，大的单层囊及多层囊。脂质体可由各种磷脂(如胆固醇，硬脂基胺或磷脂酰胆碱)形成。本发明活性成份也可与可溶性聚合物偶合，这些聚合物为可定向的药物载体。这些聚合物的例子包括聚乙烯吡咯烷酮，吡喃共聚物，聚羟丙基甲基丙烯酰胺-酚，聚羟乙基天冬酰胺酚，或被棕榈酰基取代的聚环氧乙烷-聚赖氨酸。这些物质也可与用于控制药物释放的可生物降解的聚合物偶合。合适的聚合物包括聚乳酸，聚乙醇酸，聚乳酸及聚乙醇酸的共聚物，聚ε-己内酯，聚羟丁酸，聚原酸酯类，聚缩醛类，聚二氢吡喃类，聚氰基丙烯酸酯类，水凝胶的交联或两亲性嵌段共聚物。合适的药物载体及药物的制法在《雷明顿医药科学》Mack Publishing Company中有所描述，这是本领域的标准参考文献。

给药方式和剂型

含有本发明活性成份丹参酮IIA的药物组合物可配制成任何合适的剂型，包括片剂、粉末剂、颗粒剂、糖浆、胶囊、溶液剂、栓剂、药膏等。

含有本发明活性成份丹参酮IIA的药物组合物可通过任何合适途径给予需要的对象。例如通过口服、非胃肠道、静脉内、肌内、经皮、含服、皮下、栓剂或其它途径给予。本发明也包括其他可达到活性成份所需血液水平的给药途径。

根据给药途径、病人的情况和特点(性别、年龄、体重、健康、身高)、症状程度、并行的治疗、治疗频率及所希望的效果适当地选择丹参酮IIA使用和配制的最佳剂量。本领域技术人员能够调整和控制合适的剂量范围。

本发明活性成份丹参酮IIA还可以和其它药剂联合使用。它们可以作为单独分开的剂型同时或并行给药，或作为各组分治疗剂的物理组合物以单独或组合的剂型给药。可与本发明活性成份丹参酮IIA联用的其它药剂包括用于治疗肝损伤的其它药物，包括但不限于甘草酸制剂或水飞蓟素。

除非另有明确说明，本说明书使用的所有术语与本领域普通技术人员所熟悉和理解的含义相同。除非另有描述，本发明的实施将采用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些均是本领域技术人员所知的。这些技术在下列文献中有完整的描述：例如，Sambrook《分子克隆实验指南》第2版(1989)；《DNA克隆》第I和II卷(D.N.Glover编辑1985)；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait编辑，1984)；《核酸杂交》(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑.1984)；《蛋白质纯化：原理和实践》第2版(Springer-Verlag，N.Y.)，以及《实验免疫学手册》I-IV卷(D.C.Weir和C.C.Blackwell编辑1986)。或者，可按照试剂生产商所提供的说明书进行。

实施例

可用本领域熟知方法从丹参中提取丹参酮IIA。本实验所用丹参酮IIA为丹参酮IIA磺酸钠形式，购自上海药检所。给药前，将丹参酮IIA磺酸钠溶于磷酸缓冲盐水(PBS)。

实施例1：丹参酮IIA降低CIH小鼠血清中谷丙转氨酶活性

实验对象

雄性C57BL/6小鼠，8-10周龄，购自上海SLAC实验动物有限公司。随机分组，对照组与低浓度给药组(5mg/kg)、高浓度给药组(10mg/kg)各4-5只。

实验步骤

小鼠经腹腔注射给予磷酸缓冲盐水(PBS，对照组)或者丹参酮IIA(试验组)，剂量分别为5mg/kg体重或10mg/kg体重，即丹参酮IIA磺酸钠溶于PBS，在小鼠体内的终浓度分别为5mg/kg和10mg/kg体重。4小时后，接受同样的给药处理，随后对所有的小鼠尾静脉注射剂量为15mg/kg体重的ConA。17小时后取血清测定谷丙转氨酶活性(ALT试剂盒，上海依华医学科技有限公司)。

实验结果

如图1所示，小鼠在给予5mg/kg丹参酮IIA时，血清谷丙转氨酶活性比对照组降低约60％；在给予10mg/kg丹参酮IIA时，血清谷丙转氨酶活性比对照组降低约85％，达到1000U/L以下(正常小鼠的血清谷丙转氨酶活性约为50U/L)。

相对于对照组，试验组中丹参酮IIA使小鼠血清谷丙转氨酶活性显著下降(P<0.0005)。

实施例2：丹参酮IIA显著减少CIH模型小鼠肝脏炎性侵润和坏死

实验对象

雄性C57BL/6小鼠，8-10周龄，购自上海SLAC实验动物有限公司。随机分组，对照组与给药组(5mg/kg)各4-5只。

实验步骤

小鼠经腹腔注射给予PBS(对照组)或者剂量为5mg/kg的丹参酮IIA(试验组)。4小时后，接受同样的给药处理。随后，对所有的小鼠尾静脉注射剂量为15mg/kg的ConA。8小时后，取肝脏组织切片进行H&E染色或TUNEL染色。H&E染色或TUNEL染色方法如文献所述(Wang Y，Mei Y，Feng D，Xu L.Clin Exp Immunol.2006Sep；145(3)：485-92)。所用试剂盒购自Roche MolecularBiochemicals，Indianapolis，美国。显色后可随即用光学显微镜观察。

实验结果

实验结果如图2所示。其中，图2A和图2B放大100倍，图2C和图2D放大200倍。

图2A显示PBS处理组小鼠H&E染色结果。观察到肝脏组织出现大面积炎性侵润和坏死现象(细胞结构破坏、细胞界线不明显的大片呈浅粉色的区域)，正常肝脏组织结构被严重破坏。图2B显示丹参酮IIA处理组小鼠H&E染色结果。与图2A中相反，图2B中几乎观察不到侵润和坏死现象。这些结果表明丹参酮IIA能够抑制ConA诱导的肝脏炎性浸润和坏死。

图2C显示PBS处理组小鼠TUNEL染色结果，观察到出现大量TUNEL阳性的凋亡细胞(即细胞核呈褐色的细胞)，说明大量肝细胞凋亡。图2D显示丹参酮IIA处理组小鼠TUNEL染色结果，未发现TUNEL阳性的细胞。这些结果说明丹参酮IIA能够抑制ConA诱导的肝细胞凋亡。

实施例3：丹参酮IIA对血清细胞因子的影响

实验对象

实验对象及分组与实施例2相同。

实验步骤

给药及肝损伤诱导处理与实施例2中相同。ConA注射2小时后取小鼠血清，ELISA(ELISA kit，R&D Systems，Minneapolis，美国)检测血清中肿瘤坏死因子-α的浓度；或ConA注射8小时后取小鼠血清，ELISA(ELISA kit，R&D Systems，Minneapolis，美国)检测血清中γ-干扰素的浓度。

实验结果

实验结果如图3所示。图3A显示ConA注射2小时后取小鼠血清，ELISA检测血清中肿瘤坏死因子-α的浓度。丹参酮IIA处理组小鼠血清中肿瘤坏死因子-α的含量显著低于对照组(P<0.0001)。

图3B显示ConA注射8小时后取小鼠血清，ELISA检测血清中γ-干扰素的浓度。丹参酮IIA处理组小鼠血清中γ-干扰素的含量显著低于对照组(P<0.001)。

实施例4：丹参酮IIA对肝脏中趋化因子基因表达的影响

实验对象

实验对象及分组与实施例2相同。

实验步骤

给药及肝损伤诱导处理与实施例2中相同。ConA注射8小时后取小鼠肝脏组织，提取RNA(RNeasy Mini Kit，Qiagen，Hilden，德国)，实时定量PCR检测趋化因子IP-10、RANTES和MIP1-α的表达水平。PCR所用试剂、引物和程序及PCR产物的检测如文献所述(Wang Y，Mei Y，Feng D，Xu L Clin Exp Immunol.2006Sep；145(3)：485-92)。引物具体序列如下：

β-actin：正向引物5′-TGTCCACCTTCCAGCAGATGT-3′，

反向引物5′-AGCTCAGTAACAGTCCGCCTAGA-3′；

MIP-1α：正向引物5′-CACCCTCTGTCACCTGCTCAA-3′，

反向引物5′-ATGGCGCTGAGAAGACTTGGT-3′；

IP-10：正向引物5′-GCCGTCATTTTCTG CCTC-3′，

反向引物5′-ATGGCGCTGAGAAGACTTGGT-3′

RANTES：正向引物5’-ACACCACTCCCTGCTGCTTT-3’；

反向引物5’-GACTGCAAGATTGGAGCACTTG-3’

实验结果

实验结果如图4所示。丹参酮IIA处理组小鼠肝脏中IP-10表达水平含量显著低于对照组(图4A)，而RANTES与MIP-1α的表达水平与对照组相比也略有下降(图4B和图4C)。

以上参考具体实施方式和附图详细描述了本发明，但应理解，提供这些实施例只是出于阐释性目的，并非限制本发明。本发明范围只受所附权利要求书的限制。本领域技术人员理解，可对本发明做出很多改动和变化而不脱离本发明的精神和范围，这些改动和变化都落在本发明范围之内。

Claims (6)

1.丹参酮IIA在制备用于抑制对象的免疫介导的肝脏炎性浸润和坏死的药物组合物中的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述对象包括哺乳动物。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述对象是人。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物的剂型包括片剂、粉末剂、颗粒剂、糖浆、胶囊、溶液剂、栓剂或药膏。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物组合物还包含缓解肝脏炎症的其它药物。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述缓解肝脏炎症的其它药物选自甘草酸制剂或水飞蓟素。

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