CN101308092A

CN101308092A - 荧光分光光度计

Info

Publication number: CN101308092A
Application number: CNA2007101965929A
Authority: CN
Inventors: 军司昌秀
Original assignee: Shimadzu Corp
Current assignee: Shimadzu Corp
Priority date: 2007-05-16
Filing date: 2007-12-05
Publication date: 2008-11-19
Anticipated expiration: 2027-12-05
Also published as: US20080285028A1; US7583369B2; CN101308092B; JP2008286562A

Abstract

本发明可补偿光源发光强度的波动。本发明可利用第1分光部(12、13)将光源发出的光进行分光后，将具有特定的波长(λ_Ex)的激发光入射到样品元件15。利用第2分光部(16、17)将来自样品元件部的光进行分光，并利用荧光检测部18来测定荧光强度(I_Em)。另一方面，参照光检测部19检测未经第1分光部选择的光的特定的波长(λ_R)，将由所述参照光检测部检测出的光强度的输出储存于光谱数据储存部21中。根据光谱数据的激发光波长、参照光波长、参照光强度，算出激发光强度(I_Ex)。依据经测定的荧光强度(I_Em)、经算出的激发光强度(I_Ex)，求得荧光分光光度计的输出。

Description

荧光分光光度计

技术领域

本发明涉及一种以特定的波长光作为激发光来照射样品，并测定样品发出的荧光的荧光分光光度计。

背景技术

荧光分光光度计是一种如下的装置：使物质吸收光(激发光)而变为激发状态，并测定从激发状态再回到基态时所发出的光(荧光)，以进行和样品相关的定性·定量分析。荧光分光光度计在定量的灵敏度·精度方面优异，且也可用作液相层析仪的检测器。

根据图5对普通荧光分光光度计加以说明。光源31发出的光由第1分光部也就是激发侧分光部(衍射光栅32、狭缝33)进行分光后，将预期的波长光(激发光)照射到样品元件35中的样品上。照射到样品上的光，使与其能量相应的样品分子中的一部分电子得到激发，使样品分子成为激发状态。从激发状态再回到基态时所发出的光，由第2分光部也就是荧光侧分光部(衍射光栅36、狭缝37)进行分光后，作为样品荧光的预期的波长光λ_Em将到达检测部38。荧光强度取决于激发光的强度，因此激发光强度的波动会对荧光强度的测定产生大的影响。为了补偿激发光强度的波动，而于入射到样品元件35前利用分光镜34，使来自激发光侧分光部的激发光λ_Ex分支，并将其一部分的光作为参照光λ_R而导入到参照光检测部39。来自荧光检测部38及参照光检测部39的信号传递到运算部40后，对作为荧光检测器的输出进行运算。通过以荧光强度与激发光强度的比作为荧光检测器的输出，而使激发光的波动的影响得到抑制。如日本专利特开昭63-88412号公报、日本专利特开平3-274427号公报、日本专利特开2001-83093号公报等所示，使入射到样品元件35中的光分支的构成较为普遍。

发明内容

如上所述，为了获得参照光λ_R，而将入射到样品元件35中的激发光λ_Ex分支，因此入射到样品中的激发光会减少。如果激发光强度减少，则样品发出的荧光也会减少。作为荧光分光光度计的输出变弱后，作为荧光分光光度计优点的灵敏度也会降低，使高灵敏度分析受到妨碍。另外，为了使信号稳定化，而消耗出射光的一部分能量，导致潜在性能的发挥受到妨碍。本发明的目的在于不损及光强度，而对经分光的预期的光线补偿强度。

鉴于上述课题的本发明具备：光源；第1分光部，将所述光源发出的光进行分光后，选择预期的波长光；样品元件部，以所述第1分光部选择的全部波长光作为激发光而入射至样品元件部；第2分光部，对来自所述样品元件部的光进行分光；光检测部，检测来自所述第2分光部的光；参照光检测部，检测出未经所述第1分光部选择的光；光谱数据储存部，储存由所述参照光检测部检测出的光强度的输出作为光谱数据。

利用此构成，光源发出的光经分光后，经选择的所有波长将入射到样品元件中，另一方面，未经选择的光将入射到参照光检测部中。入射到参照光检测部中的光将作为光谱数据而储存于光谱数据储存部中。

此外，本发明的荧光分光光度计具备运算部，此运算部从光谱数据储存部中读出光谱数据，并根据光谱数据中激发光波长下的光强度与参照光波长下的光强度的比、及参照光检测部的输出，以补偿入射到样品元件部中的激发光强度。

利用此构成，进行如下的运算：从光谱数据储存部中读出光谱数据后，根据光谱数据中激发光波长下的光强度与参照光波长下的光强度的比、及参照光检测部的输出，以补偿入射到样品元件部中的激发光强度。

此外，本发明的荧光分光光度计中，入射到所述样品元件部中的激发光与未经所述第1分光部选择的光的关系为波长不同，或者衍射次数不同且波长相同。

至于选择作为激发光以外的光时，波长和激发光不同的光，或者衍射次数不同且波长相同的光将作为参照光。

[发明效果]

由于无需使照射样品的激发光分支便可补偿激发光强度，因此不会损失激发光便可激发样品。另外，由于可测定且储存光源的光谱，因此可抑制光源光谱经时变化的影响。即，可针对激发光的波长下的光强度及参照波长下的光强度，算出更准确的比值，由此可准确补偿激发光强度，使定量性提高。

附图说明

图1是本发明荧光分光光度计的概略图。

图2是用以说明经本发明荧光分光光度计记录的光谱的概念图。

图3是用以储存光源光谱的处理的流程图。

图4是本发明荧光分光光度计的补偿光强度的处理流程图。

图5是先前荧光分光光度计的概略图。

11、31：光源 12、16、32、36：衍射光栅

13、17、33、37：狭缝 34：分光镜

15、35：样品元件 18、38：荧光检测部

19、39：参照光检测部 20、40：运算部

21：光谱数据储存部 23：镜面

S101～S 106：步骤 S201～S209：步骤

具体实施方式

参照图1及图2，对本发明荧光分光光度计加以说明。其与先前的荧光分光光度计同样具备：光源11；第1分光部即激发侧分光部(衍射光栅12、狭缝13)，将来自光源的光进行分光并选择预期的波长的光；样品元件15，配置有用于测定的样品；第2分光部即荧光侧分光部(衍射光栅16、狭缝17)，对样品元件15中的样品发出的荧光选择预期的波长；检测部18，测定荧光强度。本发明的荧光分光光度计中，参照光检测部19如图1所示，配置为能够测定波长与经激发侧分光部分光的预期的激发光波长不同的光。当参照光检测部19的受光面较大时，在参照光检测部19之前还设有狭缝。并且，具备光谱数据储存部21，和衍射光栅12的转动角相对应地记录由参照光检测部19所测定的光强度。光源11的发光光谱作为波长λ_S和此波长中以光强度I_S表示的数据而储存于光谱数据储存部21，当进行激发光的强度补偿时，数据从光谱数据储存部21中读出。激发光波长λ_Ex是根据设定值而算出的数值，入射到参照光检测部19中的光的波长λ_R是根据激发光波长的设定值及光学系统的配置而算出的数值。根据所获得的2个波长(λ_Ex、λ_R)、以及经读出的光谱，而获得经读出的光谱中各波长的光强度(I_Ex、S、I_R、S)。

运算部20实施激发光强度I_Ex与荧光强度I_Em之比的运算，以及基于储存于光谱数据储存部21中的光谱而进行补偿激发光强度的运算。由参照光检测部19实际测定的参照光的强度I_R和I_Ex、S/I_R、S的积成为入射到样品元件15中的激发光的强度I_Ex。根据经补偿的激发光强度I_Ex与荧光强度I_Em，而获得作为荧光分光光度计的输出。

如图2(a)所示，利用参照光检测部19测定的光谱、与激发光的波长范围内的光谱，在波长范围内完全不一致，如果使设定为激发光的波长范围为λ₁～λ₂，则由参照光检测部19测定的波长范围将成为λ₁+Δλ～λ₂+Δλ(或者，λ₁-Δλ～λ₂-Δλ)。Δλ值的大小根据参照光检测部19的配置位置而定，参照光检测部19的配置位置，可考虑衍射光栅12的衍射特性、使来自光源的光入射的角度、仅使经选择的波长的光透射的狭缝配置而任意设定。

如果减小Δλ值，则获得波长接近于激发光波长λ_Ex的参照光。如图2(b)所示，在狭缝13的开口部附近设置镜面23，使由镜面23反射的参照光λ_R，入射到参照光检测部19中，并取出参照光λ_R即可。此时，因狭缝13的开口部为经选择的波长光进行成像的部分，所以为了不使激发光减少，而优选将镜面23设置为不进入光路上。

当使用衍射光栅进行分光时，关于衍射光栅周期d、每1mm中的缝数N、衍射次数m(m＝0、±1、±2…)、波长λ、入射光与衍射光栅法线所成的角度(入射角)α、衍射光与衍射光栅法线所成的角度(衍射角)β，将使d(sinα±sinβ)＝mλ的关系式(光栅方程式)成立，则入射到衍射光栅中的光根据衍射次数m的值而在各种角度上进行衍射。作为参照光检测部19设置时的位置，最简便的设计是使相同衍射次数的波长范围的光能够入射。

通常可知，光源会因使用而劣化，导致发光光谱发生变化。图2(c)以横轴为波长，并在纵轴上以光为强度来表示光源发光光谱。2C-1是使用时间尚短的光源光谱，2C-2是因使用而劣化的光源光谱。光源劣化后，则整个波长范围中光强度会减小，光谱形状(具有特征性的波峰的波长)会发生变化。如同从光谱2C-1向光谱2C-2变化那样，光源的劣化在特定的波长区域中较为显着的情况并不少见。在此情况下，特定的波长(λ₄)的变化量与其他波长(例如λ₃)的变化量不同，特定的波长(λ₄)的变化量会变得较大。即便如此情况时，本发明荧光分光光度计，也由于光谱数据储存部21中储存有与变化后的光谱相对应的光谱数据，并以最近测定的光谱数据为基础来进行强度的补偿，因此可以准确的激发光强度为基础来进行已算出的分析。

另外，作为荧光分光光度计的光源11，优选从紫外线·可见光延伸到红外线的宽广波长范围内发出较强连续光谱的氙灯。作为荧光检测部18、参照光检测部19，可使用光电二极管或光电倍增管。

参照图3～4，对本发明荧光分光光度计补偿光强度的运作，加以详细阐述。光源、衍射光栅等中所付与的符号，与图1相对应。

若接通荧光分光光度计的电源，则光源11被点亮(S101)。除光源11被点亮外，也同样进行控制部的初始化运作或光学系零件的运作检查。

光源11点亮后并不会立即稳定发光，而且检测部(荧光检测部18、参照光检测部19)的温度也不会达到恒定状态。接通电源后，在通电状态下待机适当时间(例如15分钟)，以进行所谓的暖机运行(S102)。

经过特定的时间后，使衍射光栅12转动，并设定于激发光对样品元件15的波长范围内最长波长的光能够入射的角度(S103)。此时，与入射到样品元件15中的波长λ_Ex不同的波长λ_R的光将入射到参照光检测部19中，因此参照光检测部19的输出将储存在光谱数据储存部21中(S104)。

其次，以使短波长侧的光入射到样品元件15的方式使衍射光栅12转动(S105)。使由激发光的波长分辨率而定的最小单位的波长的短波长的光，入射到样品元件15中，则可获得更详细的光谱数据。

重复转动衍射光栅(S104)、记录该参照光检测部19的输出信号(S105)的运作，直至达到激发光波长范围内最短波长的光入射的角度为止(S106)。根据一系列运作，入射到参照光检测部19中的光强度将储存在光谱数据储存部21中。在光谱数据储存部21中，以入射到参照光检测部19中的光的波长和光对参照光检测部19的入射强度的关系，储存成光谱数据。

利用本发明荧光分光光度计来测定样品时，如果设定激发波长λ_Ex(S201)，则会使衍射光栅12转动，并使波长λ_Ex的光入射到样品元件15中。同时，与激发光不同的波长λ_R的光作为参照光而入射到参照光检测部19中，因此参照光强度I_R得以测定(S203)。

此处，确认光谱数据是否存在于光谱数据储存部21中(S204)。判断用以适当补偿该激发光的光谱数据是否存在，并在特定的判定基准下进行判定。判定基准为：(1)光谱数据本身的存在与否，(2)光谱数据的可靠性，(3)光谱数据经测定的时期。基于全部的判定基准，如果光谱数据判定为合格，则适于补偿该激发光。

(1)关于光谱数据本身的存在，就是判断光谱数据是否储存在于光谱数据储存部21中。如果光谱数据不存在，则进入后述的S207的处理。如果光谱数据存在，则继续进行如下的判断。

(2)光谱数据的可靠性是针对存在于光谱数据储存部21中的光谱数据，由如下的评估来进行，例如，数据是在初始化运作时任何部位均发现不良情形的状态下得到测定的。荧光分光光度计处于不良状态下所取得的数据欠缺可靠性，因此判断为用以适当补偿该激发光的光谱数据不存在，并进入S207的处理。光谱数据的可靠性如无问题，则接着继续进行如下的判断。

(3)对光谱数据经测定的时期进行评估。如果光谱数据经测定的时期较长，则光源11的经时变化继续进展，光谱发生变化的可能性高。利用如荧光分光光度计那样的分析装置所获得的数据中，通常记录有取得数据的时日，因此利用其进行评估即可。或者，如果是作业系统(OS，operatingsystem)方面，则因生成文件的时日插入在文件中，因此利用其进行评估即可。另外，即使光谱数据的时间较新，也会因点亮·熄灭的运作，而使光源11的发光部分受到相当多的负荷，因此优选包括有无点亮·熄灭的运作来进行评估。

当存在正常的光谱数据时，读出光谱数据(S205)。算出以波长与光强度的关系所记录的光谱数据中激发光的波长λ_Ex的强度I_Ex、S、和参照光的波长λ_R的强度I_R、S的比(I_Ex，S/I_R，S)(S206)，并输出此比值与经测定的参照光的强度I_R的乘积(I_R×I_Ex、S/I_R、S)以作为入射到样品元件15中的光强度。

基于上述判定，光谱数据不存在，或者欠缺可靠性，或者光谱数据时间较久时，显示为无适当的光谱数据(S207)，并将经测定的数据(荧光光谱)是并未进行补偿该激发光强度的数据通知给操作者。了解到光源11的光谱数据为不存在状态的操作者，在结束实施中的分析后，进行用以补充光源11的光谱数据的操作。对于此测定，使I_Ex，S/I_R，S为1以进行处理(S208)。

并且，荧光分光光度计基于I_R×I_Ex、S/I_R、S的数值，以输出结果(S209)。

经过S208的处理后，由于使I_Ex，S/I_R，S＝1，因此光强度并未进行补偿。在进行波形处理或者定量计算等之前，补充光谱数据，进行光强度的补偿的运算。

接通荧光分光光度计的电源，并且在光源11发出的光的强度稳定后(点亮后约15分钟左右)，或者进行样品分析之前，或者进行样品分析之后，由参照光检测部19进行光谱测定，由此可准确补偿光强度。

所述实施例仅为本发明的一例，也可于本发明的宗旨范围内进行适当的变更或者修正。明确的是，经过这些变更或者修正后，它们也包含在本发明中。

将流动单元用作样品元件部时，该流动单元也可用作液相层析仪用的检测器。此时则具备：输送流动相的泵、将样品导入到由泵输送的流动相中的进样器、以及将导入的样品分离为每一成分的管柱。

[产业上的可利用性]

本发明可用作荧光分光光度计、液相层析仪用途的荧光分光光度检测器。

Claims

1.一种荧光分光光度计，其特征在于其具备：光源；第1分光部，将所述光源发出的光进行分光后，选择预期的波长光；样品元件部，以所述第1分光部选择的所有波长光作为激发光而入射至样品元件部；第2分光部，将来自所述样品元件部的光进行分光；光检测部，检测来自所述第2分光部的光；参照光检测部，检测未经所述第1分光部选择的光；光谱数据储存部，储存由所述参照光检测部检测出的光强度的输出作为光谱数据。

2.根据权利要求1所述的荧光分光光度计，其特征在于具备运算部，所述运算部从所述光谱数据储存部中读出光谱数据，并根据所述光谱数据中激发光波长下的光强度与参照光波长下的光强度的比，及所述参照光检测部的输出，以补偿入射到所述样品元件部中的激发光强度。

3.根据权利要求1所述的荧光分光光度计，其特征在于入射到所述样品元件部的激发光与未经所述第1分光部选择的光的波长不同。

4.根据权利要求1所述的荧光分光光度计，其特征在于入射到所述样品元件部的激发光与未经所述第1分光部选择的光，衍射次数不同，且波长相同。

5.一种液相层析仪，其特征在于其具备输送流动相的泵、将样品导入到所述泵所输送的流动相中的进样器、将所导入的样品分离为每一成分的管柱、根据权利要求1至4中任一项所述的荧光分光光度计，并将经分离的样品导入到所述样品元件部中。

6.根据权利要求1所述的荧光分光光度计，其特征在于光源发出的光经分光后，经选择的所有波长将入射到样品元件中，未经选择的光将入射到参照光检测部中。

7.根据权利要求1或6所述的荧光分光光度计，其特征在于入射到参照光检测部中的光将作为光谱数据而储存于光谱数据储存部中。

8.根据权利要求1至4中任一项所述的荧光分光光度计，其特征在于选择作为激发光以外的光时，波长和激发光不同的光，或者衍射次数不同且波长相同的光将作为参照光。