CN101307308A

CN101307308A - 树莓果实中超氧化物歧化酶的提取方法

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Publication number: CN101307308A
Application number: CNA2007100556243A
Authority: CN
Inventors: 关士林; 陈卫民; 胡文学; 郑德隆; 杨世升; 石文渊; 方中琴; 刘景芬; 家贤茹
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2007-05-14
Filing date: 2007-05-14
Publication date: 2008-11-19

Abstract

技术领域：本发明涉及超氧化物歧化酶的提取技术，特别是树莓果实中超氧化物歧化酶(以下简称SOD)的提取技术。要解决的技术问题：(1)提出从树莓果实中提取SOD的新工艺过程；(2)在提取SOD工艺过程中降低SOD的损失，提高产品SOD的纯度；(3)充分利用树莓果实中所有营养成分，开发多种产品。技术方案要点：(1)从树莓果实中提取SOD分为四个分离过程；(2)采用四种措施降低SOD被氧化而造成的损失；采用适合工业化生产的工艺流程及设备，使本发明适于用生产应用。主要用途：本发明产品适用于保健品和药品，用于防癌、防衰老及防心脑血管疾病。

Description

树莓果实中超氧化物歧化酶的提取方法

技术领域

本发明涉及超氧化物歧化酶的提取技术，特别是树莓果实中超氧化物歧化酶的提取技术。

背景技术

超氧化物歧化酶(以下简称SOD)对于人类健康极为重要，医学及`生物化学研究结果表明，它具有防衰老、防癌、防心脑血管疾病的功能。因而SOD制剂被列为国家优先发展的高新技术，列为第31项。由于人工还不能合成SOD，现在只能从动植物中提出SOD。药品级SOD每毫克价格为200元～20000元，为食品级SOD价格的一千倍，因而提取高纯度SOD的医学价值及经济意义重大。

从动物血中提SOD的方法已有很多专利发表。它们的共同特点是工艺流程长，质量较差，产品单一，浪费资源。本发明采用了新的工艺，从树莓果实中提取SOD，其特点及先进性如下：

1、本发明采用了适合于工业化生产的工艺流程，特别是在提取SOD的工艺过程中的每个工序都是适合产业化的，特别需要指出的在采用凝胶过滤色谱分离SOD时，都是采用制备型设备，而不是分析型设备。

2、本发明提取的SOD纯度达99％以上，适合制药品级SOD针剂、SOD粉剂(片剂)。纯度高是由工艺特点决定，而不是人工操作决定的。

3、本发明充分利用树莓果实的各种营养成分，除利用SOD外其它成分也得到充分利用，因而在同一工艺过程的不同阶段开发出系列产品：食品级树莓SOD高档果汁、食品级树莓果汁精华液、药品级SOD针剂、药品级SOD粉剂(片剂)。

发明内容

1、树莓果实中SOD的提取涉及四个分离过程

(1)SOD与树莓果实固性物分离

树莓果实中SOD存在于线粒体中，首先需将SOD与线粒体分离，使SOD进入果汁中。为此需进行粉碎(榨汁)，胶体磨磨细、均化再磨细。将果汁与固性物分离可采用板框过滤机及离心机分离，滤液为SOD果汁。它用于进一步提取SOD，也可以将它加工为“食品级树莓SOD高档果汁”。

(2)SOD与小分子及离子分离

SOD果汁中还有铜、锌、铁、锰、钙、硒、锗、铬、钛、硼、镁、钾、磷、V_B1、V_B2、V_B6、V_C、V_E、V_P、水杨酸、糖、氨基酸、胡萝卜素、磷酯等小分子及离子。将上述小分子物质及离子与SOD分子分离属于小分子与大分子的分离，并且属于水相中的分离，可采用膜分离法、离凝胶过滤色谱分离法。通过上述分离则得到不含有小分子物质及离子的SOD水溶液，还含有其它大分子物质，例如蛋白质。含有小分子的水溶液则可进一步制成“食品级树莓果汁精华液”。

(3)SOD与蛋白质分离。

SOD与蛋白质均属于大分子(高聚物)，分子量都大于几万。树莓果实中SOD分子量为3.8万。蛋白质的分子量更高，分子体积更大。可以通过蛋白质变性方法，膜分离，凝胶色谱分离将SOD与蛋白质分离开，得到只含有SOD的水溶液。通过聚乙二醇(PEG)浓缩则得到SOD各种浓度的药品级SOD针剂。

4)SOD与水分的分离。

将SOD浓缩液中的水分除掉，则得到SOD干粉。加热干燥可导致SOD失掉活性，因而必需采用真空冷冻干燥。现已有真空冷冻干燥机可供使用。干燥后所得SOD干粉则为药品级SOD粉剂或制成药品级SOD片剂。

2、保障SOD活性在加工过程及贮存期间不降低的方法

(1)还原剂保护：在制备食品级树莓SOD高档果汁过程中，在还原剂配料工序中加入异抗坏血酸钠，加入量为红树莓果实的0.001％～0.1％，通常可采用0.02％，保护SOD在后续加工过程中不被氧化。

(2)氮气保护：在氮气保护下进行粉碎、磨细、均化、离心分离。防止氧气对SOD的氧化破坏作用。

(3)PEG浓缩冷冻干燥，不采用热浓缩及加热乾燥，而采用PEG浓缩和真空冷冻干燥，保护SOD在浓缩及干燥过程中不被氧化。

(4)氮气置换：产品中不含有氧气，利用氮气置换氧，保护SOD在贮存时不被氧化。

3、SOD提取采用工业生产可行的分离方法

在SOD与小分子分离及SOD与大分子分离过程中均采用可工业化生产的膜分离工艺及制备型凝胶过滤色谱分离工艺。

附图说明

说明书附图中图1为SOD与固性物分离工艺流程框图，其分离后的产品为“食品级树莓SOD高档果汁”。

说明书附图中图2为膜法将SOD与小分子、离子及蛋白质的分离工艺流程框图，其分离后的产品为“食品级树莓果汁精华液”、“药品级SOD针剂”及“药品级SOD粉剂”。

说明书附图中图3为制备型凝胶过滤色谱柱层析法将SOD与小分子离子及蛋白质分离工艺流程框图，其分离后的产品为“食品级树莓果汁精华液”、“药品级SOD针剂”及“药品级SOD粉剂”。

具体实施方式

将上述发明3项内容通过三个实施例表现出来。

实施例1：食品级SOD高档果汁制造方法

实施例1为发明内容中四个分离过程中的第一个分离过程(SOD与固性物分离)的具体实施方式。它的工艺流程框图加说明书附图中图1所示。

对于实施例1工艺流程的某些细节说明如下：

1、选果：首选树莓中SOD含量高的品种，采购树莓果实。树莓果实要选成熟度适当的果实，即SOD含量最高时期的树莓果实。不得有腐烂果实。

2、洗涤：可用0.05％～0.1％KMnO4水溶液消毒8～10min，清水洗2～3次。

3、还原剂配料：还原剂配料指将还原剂加入物料中。加入还原剂的目的是保护SOD在加工过程中不被空气中的氧及其它氧化剂所氧化。对于本工艺过程而言，最合适的还原剂为异抗坏血酸钠。用量范围为0.001～0.1％。本实施例1每kg物料加入0.02kg 1％异抗坏酸钠水溶液，即加入0.02％异粒坏血酸钠。

4、氮气保护粉碎：在打浆过程可采用筛网孔为0.4mm～0.5mm的打浆机。打浆过程在氮气保护罩内进行，也可对打浆机局部氮气保护，防止SOD在打浆粉碎过程被氧化。

5、氮气保护磨细：打浆后的浆料细度不够细，还需在胶体磨中磨1～2次。该过程在氮气保护下进行，防止SOD被氧化。胶体胶要通冷水降温。

6、氮气保护均化：均化是将物料进一步磨细的过程，最终达到SOD分子全部进入水相的目的。可采用连续柱塞式高压均质机进行均化，均化1～2遍，工作压力可选定25MPa。均化过程要有氮气保护。

7、氮气保护离心分离：通过离心分离将果汁与固性物分离，通氮气保护SOD不被氧化。离心分离所得滤液为SOD果汁。

8、氮气置换：往果汁中通氮气，除掉残留在SOD果汁中的氧，用氮气代替。其目的是在商品贮存中防止SOD被氧化。

9、氮气保护灌装：防止在灌装过程中混入空气中的氧，采用氮气保护灌装。

10、食品级树莓SOD高档果汁产品：检查合格后入库，放在阴凉处。该产品中的SOD含量、鞣化酸含量、花青素含量、黄酮含量均是所有水果汁中含量最高的，它具有确切的防癌、防衰老、防心脑血管疾病的功效。

实施例2膜法提取SOD

膜法工艺将发明过程中四个分离过程的第二个分离过程(SOD与小分子分离)、第三个分离过程(SOD与蛋白质分离)及第四个分离过程(SOD与水分子分离)流程统一起来，三个过程分步进行，每步均有一个产品。

实施例2的工艺流程框图如说明书附图中图2所示。对于实施例2工艺流程的某些细节说明如下：

1、微滤

微米过滤在微米膜过滤器中进行。首先要除去微米级颗粒物及细菌等，采用微米膜过滤。它利用的是筛分原理。微米膜的膜孔径在可大于0.1μm的范围内选择，最小孔径为0.1μm。实施例2选择膜孔径为0.1μm，将大于1μm的所有悬浮固体及细菌过滤掉。微米膜过滤现已有各种型号的生产设备及小规模的实验设备可供选用。实施例2使用的设备的过滤体积为10L，使用10kg物料较为方便，微米膜安放在过滤溶器的下边。将物料放入过滤器后，加少许压力，过滤完成后，收集滤液。用清水洗净过滤膜，下次过滤备用。所得滤液为不含有微米级固体颗粒，不含有细菌的SOD溶液，但还含有蛋白质及小分子物质。

2、超滤

超滤在超滤膜过滤器中进行。它利用的是筛分原理。有各种规格超滤膜可选，对有机物截留分子量从1万～10万道尔顿超滤膜可供选择。实施例2选择截留分子量为5万道尔顿的筛孔超滤膜过滤机。将上述近10kg物料放入超滤机中，加适当压力，过滤后收集滤液。滤饼为蛋白质。洗净趣滤膜，下次备用。得到9kg多滤液。此滤液已不含有分子量大于5万道尔顿的蛋白质，只有SOD及小分子。

3、纳滤

纳滤在纳滤机中进行。它的原理也是筛分原理。纳滤膜是纳米颗粒粘在一起。使用时一定多精心保护。纳米膜的孔径是可选的，也就是对截留分子量在200～1000道尔顿范围内可选。实施例2选取孔径最大者，即可将分子量小于1000道尔顿的物质全部滤掉。将9kg上述滤液装入纳滤器中，加压过滤。过滤完成后，收集滤饼，它即是SOD滤饼。滤液不要扔掉，可做其它果汁的原料，它含有大量营养物：鞣化酸、花青素、黄酮、各种维生素、各种矿物质，经包装则为“树莓果汁精华液”产品。

表1“树莓果汁精华液”营养物质含量

名称	含量	名称	含量
名称	含量	名称	含量	黄酮花青素鞣化酸钙铁锌硒锗铬铜钴钛硼镁	4.4～5.9mg/100g30～60mg/100g1.5～2.0mg/100g30～36.4mg/100g4.1mg/100g0.9mg/100g3～5mg/100g3～8mg/100g0.017mg/100g0.5443mg/100g0.017mg/100g0.026mg/100g0.035mg/100g20.7～29mg/100g	钾磷锰V_B1V_B2V_B6V_CV_EV_P水杨酸糖有机酸胡萝卜素	208～281mg/100g32～113.7mg/100g0.06mg/100g0.01～0.02mg/100g0.02～0.05mg/100g0.03～0.05mg/100g20.18mg/100g0.4～1.4mg/100g526～750mg/100g0.5～2.54mg/100g8％2.3％0.25～1.4mg/100g

为了SOD易被纳滤过滤出来，加入适量絮凝剂。

4、SOD针剂：将滤饼用沌净水溶解，则得到不同浓度的SOD水溶液，经分装可制得不同浓度规格的“药品级SOD针剂”。

5、SOD粉剂(片剂)：将SOD滤饼放入冷冻室中保存，温度为-10℃。待样品贮存一定数量后，将样品一起放入冷冻干燥机，找开真空泵开关，在一10℃下真空干燥。干燥完成后，取出SOD产品在氮气保护下分装。该产品为“药品级SOD粉剂”，所有操作在无菌室中进行，一切操作均要附和制药要求。也可加入片剂附料，打成片剂，制成“药品级SOD片剂”。

实施例3：制备型凝胶过滤色谱柱层析法提取红树莓SOD产品

制备型凝胶色谱柱层析法提取红树莓SOD产品的工艺流程框图如说明书附图中图3所示。它的原理是所谓“分子筛效益”：“一个含有各种分子大小不一的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时，各种分子在柱内进行着两种不同的运动：垂直向下移动和无走向的扩散运动。大分子物质由于分子直径大，不易进行凝胶颗粒孔内，而只能分布颗粒之间而向下移动，因而向下运动速度快。小分子除了可在颗粒间隙中向下运动外，还可以进入凝胶颗粒微孔中，即进入凝胶相中，向下移动。小分子不断在凝胶颗粒中运动，因而流动速度慢，小分子在柱内向下运动速度大大低于大分子。大分子首先从色谱柱流出，小分子最后流出，中等分子在中间流出”。这就是“分子筛效益”。

一、SOD提取的前期准备工作

1、SOD提取工作液的准备

(1)工作液的粒度检查

通过显微镜检查，粒度不得有大于0.45μm颗粒，否则需过滤除掉之。

(2)工作液粘度检查

利用旋转粘度计测量其粘度，工作液的粘度不得大于5cp，否则用纯水稀释使其粘度小于5cp。

(3)SOD的凝胶渗透色谱的测定

利用分析方法制得树莓中SOD纯粹品，然后用凝胶渗透色谱测定SOD峰值。测定每个峰值物质的SOD活性。得知那几个峰是SOD峰，那些峰是其它蛋白质的峰。并计算每个峰的分子量。由于树莓的品种繁多，栽培方法各异，使用的微肥各异，所用分泌SOD菌种各异，因而树莓中SOD种类各异是很正常的。已有文献报导，某树莓果实中有三种SOD同工酶。

(4)SOD及其它蛋白质的热变稳定性试验

进行不同温度下热变试验，如果说SOD稳定，其它蛋白质可沉淀，则可用热变方法除掉蛋白质。如果SOD不稳定，则用分级分离除去蛋白质。

2、分族凝胶过滤色谱设备的建立

现在已有各种凝胶过滤色谱仪供采用，但色谱柱条件及使用工艺要求需用户自己提供。

(1)制备型分族凝胶过滤柱尺寸

长径比(L/D)＝5∶1～10∶1，实施例3采用柱长30cm，直径5cm，L/D＝6∶1。Vt＝589cm³。

(2)凝胶

采用交联葡聚糖凝胶，有几个型号可用SephadexG-25、G50。

(3)试样量：

试样量通常为Vt的20～30％，实施例3采用100cm³。

3、分级凝胶过滤色谱设备的建立

分级凝胶过滤色谱仪已有市售产品可供选购。但制备型分级凝胶过滤色谱条件则需自己提供。

(1)制备型分级凝胶过滤柱尺寸

长径比(L/D)应在20∶1～100∶1范围内，理论塔板数应在3000～6000范围内，实施例3采用L＝90cm，D＝4cm，L/D＝22.5。Vt＝1130cm³。

(2)填料

采用交联葡聚糖凝胶SephadexG100，分级范围4000～150000，粒径10～40μm，可分级较大蛋白。

(3)平衡

装好柱后，用洗脱液洗柱时，紫外检测器走直线不代表平衡，平衡至少需要5个柱体积。

(4)样品量

样品量为Vt的2～5％，实施例3采用Vt的3％，样品量为33cm³。

(5)流速

流脱速度通常在5～10cm/h，实施例3，采用8cm/h。

二、制备型凝胶过滤色谱柱层析法提取树莓果实中SOD产品的工艺

该工艺流程图列于说明书附图中图3。重点工序介绍如下：

1、SOD果汁GFC工作液

GFC代表凝胶过滤色谱，SOD果汁GFC工作液代表由实施例1中所得SOD果汁经调制后所得用于凝胶过滤色谱过滤的工作液。其标准是：工作液粘度＜5cp，粒度＜0.45μm，SOD的凝胶渗透色谱已知其分布曲线，其关键是得知SOD峰洗脱体积(Ve)。通过预备实验完成上述工作。

2、分族GFC过滤器层析分离

将SOD果汁GFC工作液加入分族GFC过滤器中，加入量为100cm³(ml)，由于该设备属于制备型，Vt＝589cm³，因而试样量较大。流速可适当加快，视树莓具体品种的分离效果而异。截取分子量(MG大于10000滤液，实际上等于把滤液分为分子量大于10000和分子量小于10000两部分。分子量大于10000滤液中含有SOD与蛋白质，分子量小于10000的滤液含有各种矿物质、维生素、鞣化酸、花青素、黄酮等具有防癌、防衰老、防心脑血管疾病等功能，是树莓果实中的精华成分，由它们制“树莓果实精华液”。

3、树莓果汁精华液

将分子量小于10000的滤液经浓缩分装，制得树莓果汁精华液。浓缩采用先氮气置换，然后减压浓缩，加入万分之一的异抗坏血酸钠，保护鞣化酸、花青素、黄酮等不被氧化。分装在氮气保护下进行，最后产品为“树莓果汁精华液”。

4、分级GFC过滤器层析分离

将分子量大于10000的滤液，经浓缩后才能进入分级GFC过滤器进行层析分离。浓缩可采用PEG浓缩法，即采用聚乙醇2000浓缩法，浓缩后可以大大缩小试样的体积。试样浓度不得大于5％，即SOD与蛋白质浓度之和不得大于5％。

样品量为33cm³(ml)，因为是制备型凝胶过滤色谱设备，所以试样量较大。流速要慢，采用8cm/h。根据条件试验测得的SOD的Ve值，截取SOD组份。经浓缩得到SOD浓缩液，它可用于药品级SOD针剂制造和药品级SOD粉剂(片剂)制造。浓缩采用PEG浓缩，在氮气保护下进行。

5、药品级SOD针剂产品制备

将SOD浓缩到药品级SOD针剂所需浓度后，在氮气保护下，进行针剂配制，针剂分装。最后制得药品级SOD针剂产品。上述操作作在无菌室进行，产品符合制药要求。

6、药品级SOD粉剂(片剂)产品制备

将可用于针剂的SOD浓缩剂，继续浓缩，然后冷冻干燥。冷冻干燥在冷冻机中进行，温度为-10℃，减压干燥。SOD干粉分装在氮气保护下进行，制成“药品级SOD粉剂”。上述操作在无菌室进行，产品符合制药要求。也可加入片剂附料，打成片剂，制成“药品级SOD片剂”。

Claims

1、一种从树莓果实提取过氧化物歧化酶的方法，其特征在于：将过氧化物歧化酶(以下简称SOD)从树莓果实中提取出来涉及四个分离过程：

(1)SOD与固性物分离：通机械磨细方法使SOD从线粒体进入果汁中，然后通过离心分离等分离过程，将含有SOD的果汁与树莓果实的固性物分离得到SOD果汁。它可以用于进一步提取SOD，也可以制成“食品级树莓SOD高档果汁”。

(2)SOD与小分子及离子分离：通过膜分离法或凝胶过滤色谱法将小分子及离子与SOD分离，得到两种产物：一种产物是含有分子量超过一万的大分子物质，它们是SOD和蛋白质的水溶液，可用于进一步提取SOD；一种产物是含有小分子及离子的水溶液，它含有极为丰富的防癌、防衰老、防心脑血管疾病的营养物质，经分装后得到“树莓果精华液”产品。

(3)SOD与蛋白质分离：通过膜分离或凝胶过滤色谱分离将蛋白质与SOD分离，得到非常纯净SOD水溶液，其纯度达到药品级要求，没有细菌，没有杂质。该SOD水溶液经浓缩达到SOD针剂所需浓度的SOD浓缩液，该浓缩液可以用于制“药品级SOD针剂”，也可用于制“药品级SOD粉剂”或“药品级SOD片剂”。

(4)SOD与水分离：通过浓缩及冷冻真空干燥等工艺过程，将SOD浓缩液中的SOD与水分离，得到“药品级SOD粉剂”或“药品级SOD片剂”。

2、根据权利要求1所述的SOD与固性物的分离，其特征在于：

(1)采用了说明书附图中图1所示的工艺流程，该工艺流程是本发明首先提出的从树莓果实中提取SOD果汁的工艺流程。

(2)在加工工艺过程中，全程防止SOD被氧化。其特征是：在粉碎、磨细、均化、离心分离、灌装等分离过程中均采用氮气保护，防止SOD与氧气接触而氧化。在还原剂配料工序加入异抗坏血酸钠，其用量范围是0.001-0.1％。

3、根据权利要求1所述的将SOD与小分子物质及离子的分离、SOD与蛋白质的分离可用膜分离方法，其特征在于：

(1)采用了说明书附图中图2所示的工艺流程，实施例2说明了该工艺流程。其特征：该工艺流程是本发明首先提出的，通过膜分离法从树莓SOD果汁中提取SOD浓缩液的工艺流程。

(2)该膜分离法的特征在于：将微滤、超滤与纳滤技术联合使用。微滤膜孔径为0.1μm，除掉1μm以上的颗粒及病菌。超滤选用截出分子量大于5万的超滤膜，滤液只含有SOD及小分子、离子。纳滤选用截取分子量大于2000的纳滤膜，滤液为小分子营养物，可制“树莓果精华液”。滤饼为SOD。该滤饼SOD可冷冻干燥制成“药品级SOD粉剂”或“药品级SOD片剂”，也可配制成“药品级SOD针剂”。

4、根据权利要求1所述的将SOD与小分子物质及离子的分离，SOD与蛋白质分离可用凝胶过滤色谱分离法，其特征在于：

(1)采用了说明书附图中图3所示的工艺流程，实施例3说明了该流程，其特征在于：该工程流程是本发明首先提出的，通过制备型凝胶过滤色谱分离法从树莓SOD果汁中提取SOD浓缩的工艺流程。

(2)该制备型凝胶过滤色谱分离法的特征在于：

①将树莓SOD果汁制成SOD果汁GFC工作液。

②采用制备型分族凝胶过滤色谱装置：L/D范围在5∶1-10∶1，实例3采用L/D＝6∶1，Vt＝589cm³，凝胶为SephadexG-25，G50。进料样品量为100cm³。

③截取分子量小于10000滤液制“树莓果精华液”。

④截取分子量大于10000滤液用于分离SOD。

⑤采用制备型分级凝胶过滤色谱装置：L/D范围在20∶11-00∶1，实例3采用L/D＝22.5，Vt＝1130cm³，凝胶为SephadexG100。进料试样量为33cm³，流速5-10cm/h，实施例3采用8cm/h。

⑥根据树莓SOD的峰洗提体积Ve截取SOD组份，得到纯SOD水溶液。利用该纯SOD水溶液可制得“药品级SOD针剂”，也可干燥后制得“药品级SOD粉剂”或“药品级SOD片剂”。