CN101302547B - 一种磷脂酰月桂醇的酶法制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种磷脂酰月桂醇的酶法制备方法，属于磷脂的酶法改性技术领域。本发明以大豆混合磷脂溶于无水的有机溶剂中，加入月桂醇，在经处理的花生磷脂酶D催化下进行碱基交换反应，混合磷脂转化为磷脂酰月桂醇。反应物通过水洗有机相，经脱水脱溶后，用丙酮充分洗涤，分离出丙酮不溶物，干燥得产品。经过HPLC测定，产品磷脂酰月桂醇的含量大于65％。由于本方法中没有水的存在，因而产品中不含有溶血磷脂和磷脂酸等磷脂酰月桂醇产品中不希望含有的成分，使用本方法可以方便的制备在医药工业，脂质体工业具有广泛用途的磷脂酰月桂醇。
Description
技术领域
一种磷脂酰月桂醇的酶法制备方法，属于磷脂的酶法改性技术领域。
背景技术
磷脂主要包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸及磷脂酰丙醇和一系列磷脂衍生物等。近来研究发现磷脂酰月桂醇具有重要的生物学功能及在医药工业上得到愈来愈广泛的应用，而磷脂酰月桂醇在自然界中几乎不存在，因而利用酶法来制备磷脂酰月桂醇具有重要意义。通过文献检索，国内外未发现由大豆混合磷脂为原料采用无水体系经处理的花生磷脂酶D酶法制备磷脂酰月桂醇的方法报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种磷脂酰月桂醇的酶法制备方法，由大豆混合磷脂为原料采用无水体系经处理的花生磷脂酶D酶法制备磷脂酰月桂醇的方法。
本发明的技术方案：一种磷脂酰月桂醇的酶法制备方法，大豆混合磷脂溶于无水的有机溶剂中，加入月桂醇，在经处理的花生磷脂酶D催化下进行碱基交换反应，混合磷脂转化为磷脂酰月桂醇，反应物通过水洗有机相，经脱水脱溶后，用丙酮充分洗涤，分离出丙酮不溶物，干燥得产品，经过HPLC测定，产品磷脂酰月桂醇的含量大于65％，而且产品中不含有溶血磷脂和磷脂酸。
花生磷脂酶D的预处理：花生磷脂酶D在使用前进行预处理，其方法为取2.72g磷酸二氢钾溶于100mL去离子水中，加入少量磷酸氢二钠，调节pH至5.6，配制得磷酸缓冲液；取1g花生磷脂酶D溶于80mL磷酸缓冲液中，得到pH 5.6的花生磷脂酶D酶液，加入49克氯化钾并溶解，完全冷冻后于真空度70Pa，温度-40℃条件下冻干48小时，得到经处理的花生磷脂酶D。使用氯化钾和调节pH来进一步激活花生磷脂酶D。
酶促反应的工艺条件为：有机溶剂∶大豆混合磷脂∶月桂醇∶经处理的花生磷脂酶D的v/w/w/w比为5-20∶0.5-2∶1-10∶0.025-0.25，反应温度20℃-50℃，反应时间为24-48小时。
所用有机溶剂为乙醚，氯仿或正己烷等。
所用的大豆混合磷脂原料来自于油厂油脂加工的副产品，并经进一步加工所得到的醇溶性混合磷脂，且大豆磷脂磷脂酰胆碱含量控制为75％，大豆磷脂磷脂酰乙醇胺16％。采用经处理的花生磷脂酶D在无水的有机溶剂中与月桂醇进行酶促碱基交换反应，反应完成后，水洗有机相，经脱水脱溶丙酮洗涤得到本产品。
本发明的有益效果：本发明以大豆混合磷脂为原料，采用无水体系经处理的花生磷脂酶D酶法制备不含溶血磷脂和磷脂酸的磷脂酰月桂醇的方法，为制备不含溶血磷脂和磷脂酸的磷脂酰月桂醇提供了一种可行的方法，使用本方法可以方便的制备在医药工业，脂质体工业具有广泛用途的磷脂酰月桂醇。由于本方法中没有水的存在，因而产品中不含有溶血磷脂和磷脂酸等磷脂酰月桂醇产品中不希望含有的成分。
表1：本方法所得产品指标
| 磷脂酰月桂醇％ | 磷脂酰胆碱％ | 磷脂酰乙醇胺％ | 溶血磷脂％ | 磷脂酸％ |
| 68.4 | 16.22 | 4.31 | - | - |
具体实施方式
实施例1：
将50克混合磷脂加入1000毫升乙醚中于20℃溶解，加入100克月桂醇搅拌恒温半小时，加入5克经处理的花生磷脂酶D，于20℃搅拌反应48小时，用3000毫升去离子水分三次洗涤有机相，在有机相中加入10克无水硫酸钠进行干燥，经干燥后的有机相真空脱溶后，用500毫升丙酮充分洗涤，分离出丙酮不溶物，并干燥得磷脂酰月桂醇含量为68.4％的不含溶血磷脂和磷脂酸的产品。
实施例2：
将50克混合磷脂加入1000毫升氯仿中于30℃溶解，加入100克月桂醇搅拌恒温半小时，加入5克经处理的花生磷脂酶D，于30℃搅拌反应48小时，用3000毫升去离子水分三次洗涤有机相，在有机相中加入10克无水硫酸钠进行干燥，经干燥后的有机相真空脱溶后，用500毫升丙酮充分洗涤，分离出丙酮不溶物，并干燥得磷脂酰月桂醇含量为66.5％的不含溶血磷脂和磷脂酸的产品。
实施例3：
将50克混合磷脂加入1000毫升正己烷中于50℃溶解，加入100克月桂醇搅拌恒温半小时，加入5克经处理的花生磷脂酶D，于50℃搅拌反应24小时，用3000毫升去离子水分三次洗涤有机相，在有机相中加入10克无水硫酸钠进行干燥，经干燥后的有机相真空脱溶后，用500毫升丙酮充分洗涤，分离出丙酮不溶物，并干燥得磷脂酰月桂醇含量为65.2％的不含溶血磷脂和磷脂酸的产品。
Claims (1)
1.一种磷脂酰月桂醇的酶法制备方法，其特征是大豆混合磷脂溶于无水的有机溶剂中，加入月桂醇，在经处理的花生磷脂酶D催化下进行碱基交换反应，混合磷脂转化为磷脂酰月桂醇，反应物通过水洗有机相，经脱水脱溶后，用丙酮充分洗涤，分离出丙酮不溶物，干燥得产品，经过HPLC测定，产品磷脂酰月桂醇的含量大于65％，而且产品中不含有溶血磷脂和磷脂酸；
酶促反应的工艺条件为：有机溶剂∶混合磷脂∶月桂醇∶经处理的花生磷脂酶D的v/w/w/w比为5-20∶0.5-2∶1-10∶0.025-0.25，反应温度20℃-50℃，反应时间为24-48小时；
所用有机溶剂为乙醚，氯仿或正己烷；
所述的花生磷脂酶D在使用前进行了预处理：取2.72g磷酸二氢钾溶于100mL去离子水中，加入少量磷酸氢二钠，调节pH至5.6，配制得磷酸缓冲液；取1g花生磷脂酶D溶于80mL磷酸缓冲液中，得到pH 5.6的花生磷脂酶D酶液，加入49克氯化钾并溶解，完全冷冻后于真空度70Pa，温度-40℃条件下冻干48小时，得到经处理的花生磷脂酶D；
经处理的花生磷脂酶D的酶促反应是在无水的环境中进行的。
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| CN1552882A (zh) * | 2003-06-06 | 2004-12-08 | 长濑化成株式会社 | 磷脂的碱交换方法 |
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| 师文静.磷脂酶D制备及催化反应的初步研究.中国优秀硕士学位论文全文数据库工程科技Ⅰ辑 4.2008,(4),B018-20. |
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