CN101300271A - 结合胶原受体i结构域的调节子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及α2β1整联蛋白I结构域，尤其是MIDAS的改良且详细的分子模型，并涉及此类模型在设计新颖的整联蛋白调节子，尤其是α2β1整联蛋白调节子中的用途。本发明还涉及新颖的α2β1I结构域调节子，其具有治疗潜力。本发明还涉及与胶原受体相互作用的小分子调节子的特定家族：四环聚酮化合物和氨磺酰。本发明还涉及此类调节子在生产用于治疗血栓形成、炎症和/或癌症的药物中的用途。

Description

结合胶原受体I结构域的调节子
技术领域
本发明涉及I结构域改进并详述的分子模型，尤其是称作MIDAS的金属离子依赖性粘着位点并涉及此模型在设计新颖的整联蛋白调节子，尤其是α2β1整联蛋白调节子中的用途。本发明还涉及新颖的α2β1整联蛋白调节子，其特征在于所述MIDAS氨基酸残基需要的关键的相互作用，该调节子调节整联蛋白I结构域的相互作用，尤其是胶原结合与功能，并且其具有治疗潜力。本发明还涉及与胶原受体相互作用的小分子调节子的特定家族：四环聚酮化合物和氨磺酰。本发明还涉及此类调节子在制备用于血栓形成、血管病、炎症和/或癌症的药物中的用途。
发明背景
整联蛋白是细胞粘着受体的大家族，其介导所有人的细胞靶定到周围胞外基质。此外，整联蛋白参与多种其他细胞功能，包括细胞分裂、分化、迁移和存活。人的整联蛋白基因家族含有18个α整联蛋白基因和8个β整联蛋白基因，其编码相应的α和β亚基。每个功能细胞表面受体需要一个α亚基和一个β亚基。因此，在人的细胞上存在24种不同的α-β组合。α亚基中的9个含有特定的“插入的”I结构域，其负责配体识别和结合。4个含有整联蛋白亚基的αI结构域，即α1、α2、α10和α11是胶原的主要的细胞受体。这4个α亚基中的每一个亚基与β亚基形成异源二聚体，该β亚基也含有I样结构域，该结构域含有另一MIDAS(Springer和Wang，2004)。因此胶原受体整联蛋白为α1β1、α2β1、α10β1和α11β1(在White等人，Int J Biochem Cell Biol，2004，36：1405-1410中有评论)。胶原是胞外基质蛋白质最大的家族，由至少27种不同的胶原亚型构成(胶原I-XXVII)。
整联蛋白α2β1在上皮细胞、血小板、炎症细胞和许多间充质细胞，包括内皮细胞、成纤维细胞、成骨细胞和成软骨细胞中表达(在White等人，supra中有评论)。流行病学证据将血小板上α2β1的高表达水平与心肌梗塞和脑血管中风(Santoso等人，Blood，1999，Carlsson等人，Blood.1999，93：3583-3586)、糖尿病性视网膜病(Matsubara等人，Blood.2000，95：1560-1564)和视网膜静脉阻塞(Dodson等人，Eye.2003，17：772-777)的风险增加联系起来。从动物模型获得的证据支持α2β1在血栓形成中提出的作用。整联蛋白α2β1在癌例如侵入性前列腺癌、黑素瘤、胰腺癌、骨癌和子宫癌中也过量表达。这些观察结果将α2β1整联蛋白与癌侵入和转移联系起来。此外，可通过抗α2功能封闭性抗体部分抑制与癌相关的血管发生(Senger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1997，94：13612-13617)。最后，在炎性过程中白细胞部分依赖α2β1的功能(de Fougerolles等人，J.Clin.Invest.，2000，105：721-729)。基于组织分布和实验证据，α1β1整联蛋白可能在炎症、纤维质生成、骨折愈合和癌血管发生中起重要作用(White等人，同上)，而所有四种胶原受体整联蛋白可能参与骨和软骨代谢的调节。
有力证据表明胶原受体参与多种病理过程，这使其成为药物开发的潜在靶点。抗α1或α2亚基的功能封闭性抗体在几种动物模型包括炎性疾病和癌血管发生模型中有效。已经描述了合成肽抑制剂及蛇毒液肽阻断α1β1和α2β1的功能(Eble，Curr Pharm Design 2005，11：867-880)。国际专利公布WO 99/02551公开了一种小分子候选药物，其调节α2β1的表达，但它实际上不结合到整联蛋白上。
所述胶原结合αI结构域在靶定胶原受体的推理性药物设计中起至关重要的作用。α2I结构域结合到胶原I中一个高亲和基序的机理是已知的。然而，αI结构域含有多个其他位点，所述位点对药物开发而言可能是重要的。
Emsley等人已在J.Biol.Chem，1997，272：28512-7中描述了在未连接、“灭活的”(“闭合的”)形式下α2I结构域的结构。I结构域和相关vWf A结构域的主要特征是它们含有5个平行的和一个反平行的β链的特征性装配，其形成所述结构的稳定平台。I结构域的另外的至关重要的特征是它们具有DxSxS序列的氨基酸基序，其中x代表任何氨基酸。这三种氨基酸，D151、S153和S155存在于起于α2I结构域第一个β链的N末端环中。这些和附近肽环中其他含氧残基与金属离子配位并构成所述金属离子依赖性粘着位点(MIDAS)。
国际专利公布WO 01/73444描述了胶原模拟三股螺旋肽与整联蛋白α2I结构域的复合体的晶体结构。该出版物公开了在这种活性的(“开放的”)构象中所述金属离子配位到Thr221而非Asp254，如在1997灭活结构中描述的。除了在配位中的这种改变，WO 01/7344公开了C螺旋是展开的并且在下一个螺旋中有额外的卷曲。这是到目前为止最接近的I结构域/胶原复合体结构。
迄今为止我们知道最多的是不存在已知的小分子抑制剂，该小分子抑制剂已被表明可结合胶原受体整联蛋白α2β1的MIDAS。整联蛋白MIDAS的胶原结合位点的表面很大，以至于不可能设计结构在物理上覆盖整个位点的小分子(大小＜600g/mol)。因此目前需要(整联蛋白α2β1I结构域)MIDAS的改良模型和研究小分子结合以能够设计新颖的小分子的方法，该小分子将调节胶原与整联蛋白α2β1的相互作用，该相互作用是药物发现所需要的。
附图简述
图1显示的是分子核心结构的对接及在I结构域MIDAS内四环化合物的主要的分子间相互作用。
图2A和2B显示的是α2I结构域的“开放的”(黑色)和“闭合的”(灰色)构象。叠加基于与镁离子(黑色球)配位的两个丝氨酸残基(153和155；球-和-棒)。在“开放的”构象中，Thr221与所述金属离子配位，而在“闭合的”构象中不存在这种相互作用。图2A是MIDAS俯视图，图2B是侧面视图。
图3.C螺旋上Tyr285的位置稳定抑制剂配体的结合构象(显示为所有对接四环聚酮化合物配体的线模型)。
图4.在整联蛋白α2I结构域内关键水分子的位置。来自对接模拟结果的MIDAS氨基酸标为黑色(距所述对接四环聚酮化合物内
Figure A20068004090700091
内)、灰色(距所述对接四环聚酮化合物
Figure A20068004090700092
)或白色(距所述对接四环聚酮化合物超过)。
图5.在α2I结构域MIDAS中结合的胶原的小分子调节子总体占据的形状和体积。来自对接模拟结果的MIDAS氨基酸标为黑色(距所述对接四环聚酮化合物内)、灰色(距离所述对接四环聚酮化合物
Figure A20068004090700095
)或白色(距所述对接四环聚酮化合物超过)。
图6A显示的是四环聚酮化合物L3015对α2I结构域(200ng)结合到I型胶原的剂量依赖性效应。
图6B显示的是四环聚酮化合物L3015对α1I结构域和α2I结构域(800ng)结合到I型和IV型胶原的效应。
图7A显示的是洛伐他汀对α1I结构域和α2I结构域结合I型胶原的效应。
图7B显示的是四环聚酮化合物L3015对α2I结构域结合到RKK肽(约0.5mM)的效应。
图8A显示的是四环聚酮化合物L3007、L3008和L3009对α2I结构域(800ng)结合到I型胶原的效应。
图8B显示的是α2I结构域(800ng)与I型胶原结合作为四环聚酮化合物L3009浓度的函数。
图9显示的是四环聚酮化合物L3009对α1I结构域、α2I结构域、α10I结构域和α11I结构域结合到I型胶原的抑制作用。
图10A显示的是通过四环聚酮化合物L3009对CHO-α2细胞粘着I型胶原的剂量依赖性抑制作用，图10B中为通过氨磺酰衍生化合物434的抑制作用。
图11A.α2I结构域的结构表明在MIDAS中本工作报道的化合物中存在的四环小分子结构的优选位置。
图11B.在I结构域的闭合型(非胶原结合)中潜在I结构域配体附近的氨基酸排列。在
Figure A20068004090700101
半径内的主要残基显示为黑色，在
Figure A20068004090700102
内的残基显示为灰色并且在
Figure A20068004090700103
内的残基显示为白色。
图12显示的是化合物434增加血液的闭合时间。
发明概述
本发明涉及整联蛋白I结构域的MIDAS的改进的计算机分析(in silico)模型，其特征在于表1显示的所述氨基酸坐标，尤其是氨基酸坐标Asp151、Ser153、Ser155、Thr221、Asp254、Tyr285、Leu286和Leu296及氨基酸坐标Asn154、Gly218、Asp219、Gly255、Glu256、Asn289、Leu291和Asp292。此外本发明涉及模型，其特征在于关键水分子W514、W699、W701、W700、W668、W597、W644和W506。
本发明也涉及使用所述模型设计或选择潜在调节子来鉴定含I结构域的整联蛋白的潜在调节子的方法。
本发明还涉及鉴定调节α2β1整联蛋白的化合物，优选α2β1整联蛋白抑制剂的方法。在所述方法中将三维分子建模的算法应用到含I结构域的整联蛋白的原子坐标来确定所述整联蛋白MIDAS的空间坐标；并且在计算机分析中所述空间坐标虚拟筛选到一组候选化合物的存储空间坐标。基于这些对比，鉴定了可结合到所述整联蛋白MIDAS上的化合物。优选地这些化合物为整联蛋白抑制剂。
本发明还涉及含I结构域的整联蛋白的新颖的调节子，该调节子通过根据本发明的方法鉴定或得到。根据本发明的整联蛋白调节子通过MIDAS氨基酸残基需要的关键相互作用进行表征，所述相互作用包括氢键供体或受体、疏水的、氢键供体和金属离子的相互作用。
本发明还涉及新颖的整联蛋白抑制剂，如四环聚酮化合物和氨磺酰衍生物。
本发明还涉及本发明调节子的用途，优选涉及抑制剂在制备用于治疗血栓形成、癌症、纤维质生成或炎症的药物组合物中的用途。
此外本发明涉及通过施用有效量的本发明抑制剂来治疗血栓形成、血管病、癌症、纤维质生成或炎症的方法。
发明详述
本发明涉及精确并详细的I结构域，尤其是MIDAS与新颖的调节子络合的分子模型，并涉及此类分子模型在设计新颖的整联蛋白小分子调节子，尤其是α2β1整联蛋白调节子中的用途。此类小分子整联蛋白调节子根据结合机制结合到整联蛋白上，该结合机制不同于目前已知的胶原模拟肽的结合机制。
本发明还涉及所述I结构域的金属离子依赖性粘着位点(MIDAS)的分子模型的原子细节，并涉及所述结合位点的原子与结合到该位点上的小分子调节子之间的相互作用。更具体的是，本发明描述了关键氨基酸、所述肽主链上的原子和水分子，其参与αI结构域与所述调节子，例如合成的四环聚酮化合物和氨磺酰整联蛋白调节子之间络合物的形成。在基于结构的小分子设计的帮助下发现的四环聚酮化合物在实验中显示结合到α2I结构域上。
此外，本发明涉及基于αI结构域结构模型来设计α2整联蛋白结合新颖小分子的基于结构的规则，该αI结构域结构模型由公开可得到的X射线数据得到。
在本发明中报道的小分子结合到所述MIDAS氨基酸上的规则也适用于除四环聚酮化合物或氨磺酰外其他化学实体的结合，只要它们满足报道的发现对配体结合到所述I结构域上至关重要的分子间的相互作用。
还显示本发明方法有助于设计和筛选结合除α2β1整联蛋白外的胶原受体整联蛋白α1β1、α10β1和α11β1的抑制剂。
本发明还设计新颖的αI结构域调节子，其特征在于所述MIDAS氨基酸残基需要的关键的相互作用，包括氢键供体或受体(HBDA)、疏水的(HYD)、氢键供体(HBD)和金属离子(镁)的相互作用。本发明的调节子也可与MIDAS中存在的水分子相互作用或替代该水分子。
本发明整联蛋白调节子包括直接的I结构域MIDAS结合调节子和变构的I样结构域MIDAS结合调节子。此类调节子优选为抑制剂。
本发明因此提供新颖的整联蛋白-抑制剂，如四环聚酮化合物和氨磺酰衍生物。
本发明提供此类整联蛋白-调节子在制备用于治疗血栓形成、癌症、纤维质生成和炎症相关疾病的药物的用途。
I结构域的结构特征详述
当前对所述α2整联蛋白I结构域的结构知识基于上面引用的出版物，该出版物描述了所述I结构域的两个静态结构：闭合型和开放型。事实上，所述I结构域，并且尤其是所述MIDAS的不同部分是活动的。所述I结构域响应细胞中的分子环境来改变它的构象。可通过其它分子结合到所述MIDAS上来诱导不同的构象。设计在结合中与生物分子竞争的小分子，因此能够调节生物学上重要的分子实体与所述MIDAS的相互作用，该设计需要所述受体-配体相互作用动力学的详细信息(该信息不能仅仅来自所述两个静态受体模型)。
两个发表的结构可比作活动结构域的两张“照片”。在本发明中已通过分子建模扩展了来自晶体结构的信息，并已创建了所谓的总体模型，其中已使用Bodil Modeling Environment(Lehtonen等人2004)研究了所述I结构域(并尤其是所述MIDAS)与结合配体结构一致的可能性。此外已使用柔性对接研究调查了所述配体的构象空间和受体诱导的构象改变(程序FlexXin Sybyl，Tripos Inc.)。
先前已通过突变实验研究了所述I结构域与胶原的相互作用并且已显示构成所述胶原接触α2I结构域的位点为Asn154，结合βA链和α螺旋1；Asp219和Leu200，结合α螺旋3和4；Glu256、His258，结合βD链和α螺旋5；Tyr285、Asn289、Leu291、Asn295和Lys298，结合C螺旋、α螺旋6、βC链和α螺旋6。也已知在Glu256和Asn295中的Ala突变不诱导胶原结合的改变。
已知影响Asp151、Ser153、Thr221和Asp254的突变引起胶原结合的改变。所述影响主要是因为这些氨基酸结合到所述I结构域的金属离子上，其对所述胶原结合是必要的。
国际专利公布WO 01/73444公开了通过以下氨基酸影响三聚体胶原模拟GFOGER肽结合到α2I结构域上：在螺旋1的中间链中谷氨酸配位到金属上并且Arg与Asp219形成盐桥，而苯丙氨酸位于Gln215和Asn154之间；在最外面螺旋2的尾随链上苯丙氨酸与Tyr157、Leu286接触并且精氨酸在Glu256附近，但是在晶体结构中不形成盐桥；在螺旋3的主链上Asn154和Tyr157之间存在氢键，形成接触环1；并且在环3中存在His258。
所述胶原模拟肽结合到MIDSA上时，发生明显的构象改变。所述Mg2+金属配位发生改变并且当其与金属配位时，所述I结构域的C螺旋远离胶原。该运动引起的结构上的改变自始至终对所述I结构域的异名极具有结构上的影响。
如在国际专利公布WO 01/73444中描述，当I结构域从闭合型变为开放型时，胶原将金属“推”向氨基酸Thr221。MIDAS中的环跟随该运动。在Ser153及Ser155处的金属配位未发生改变，但是Asp254金属键遭到破坏。Gly255肽键旋转180度并离开所述金属。Glu256通过水与所述金属形成键。Tyr175和His258陷入所述胶原三聚体螺旋链中，至少与该胶原模拟肽连接。
由于该螺旋7完全改变，所述MIDAS C螺旋解旋并在α螺旋6中形成新的卷曲。从络合物形成的有利观点上看最重要的构象改变是胶原谷氨酸移向金属并与它配位。在所述胶原与I结构域MIDAS的金属形成接触前，它必须克服Tyr285侧链造成的位阻。该氨基酸位于所述I结构域的C螺旋中。
αI结构域中的构象改变导致整个α-β异源二聚体中另一构象改变，其又导致细胞内信号途径的激活，可能因为α和β亚基的胞质结构域进一步彼此远离。
在现有模型的建模和完善过程中，进行以下观察用于调节子的设计：
在所述I结构域中C螺旋的生物学作用可能在于抑制胶原结合到所述金属上。当设计胶原结合的小分子调节子时考虑该事实是重要的。通过C螺旋构象抑制胶原结合受体的闭合型I结构域。因此，在设计新颖的小分子胶原结合调节子时，能进一步稳定C螺旋处于闭合型的调节子特征是重要的性质。利用该性质设计的调节子确实抑制胶原结合，如我们的实验显示。图2用灰色描述所述I结构域的闭合型并用黑色描述结合胶原模拟GFOGER肽的开放型(胶原肽未显示清楚)。当设计结合胶原的抑制调节子时，所述调节子的结合应该稳定I结构域的闭合型，其能抑制所述胶原结合。
来自MIDAS的一般观察和调节子设计的规则
与早期报道的结合模拟胶原时结构改变的解释相反，我们也已发现了关键氨基酸丝氨酸和苏氨酸(Ser153、Ser155和Thr221)位置和距离(几何学)的新特征，其对新颖的胶原结合调节子的设计是重要的。对严格的蛋白质坐标的改变的解释依赖在叠加所述坐标中使用的方法并因此影响对叠加的解释。本建模聚焦在叠加中MIDAS的结构上，而不使用整个蛋白质结构作为叠加措施。令人惊奇的是，这导致对结构改变的新的解释，该结构改变在结合胶原模拟GFOGER肽时发生。在本发明中，使用Ser153(和Ser155)的关键氨基酸侧链坐标对开放型和闭合型进行叠加。然后，与早期解释相反，所述MIDAS的金属离子保持接近它最初的位置而不移动。更确切而言，围绕所述金属的蛋白质主链重新组织，与在所述I结构域的闭合型中相比，在其开放构象中更接近彼此。
在Mg2+金属配位处发生改变。Thr221与所述金属配位并去除一个配位水分子。从该交替叠加中观察到的是同时在开放构象中围绕所述金属的蛋白质主链之间形成新的接触。Ser153与Thr221在开放型中比在闭合型中更接近彼此。旨在稳定闭合型的调节子的特征应该因此强调以Thr221继续通过水分子与金属配位的方式来稳定化Thr221在闭合型中的位置。这将防止Thr221更接近金属离子，并假定金属配位是开放型I结构域典型的。结晶水W597紧密结合到所述受体与闭合型的I结构域的Thr221上。调节子可例如通过接受来自W597的氢键捕获该结晶水到达Thr221附近(有进一步详细描述)。在开放构象中W597被去除。稳定Thr221-结晶水-金属的调节子因此稳定所述闭合型并可抑制胶原结合。
已进一步发现，I结构域C螺旋的结合口袋壁中的氨基酸的具体特征有助于调节子的结构设计。如果所述调节子与I结构域的闭合型中C螺旋(例如C螺旋的疏水面，图1)在结构上相互作用，那么它稳定C螺旋的结构，导致胶原结合的进一步调节。
在图1中显示所述MIDAS配体结合腔的疏水面(白色区域)优选被结合配体埋藏。可通过与镁离子和Glu256(HBD)的主链氨基及Tyr285的羟基的关键相互作用来稳定配体位置。这些相互作用是维持所述受体在处“闭合”构象的关键的稳定相互作用，因此形成用于新配体发现的基本药效团。
例如，四环聚酮化合物可与C螺旋中的Tyr285形成芳香族-芳香族(pi-pi)相互作用。在图3中显示C螺旋中Tyr285的位置稳定配体的结合构象(显示为所有对接配体的线模型)。在模拟实验中，该类型调节子中的氢键受体也显示与酪氨酸的羟基形成氢键，并在所述调节子的羟基和羰基之间形成氢键。
在模拟实验中显示C螺旋和螺旋6的氨基酸Leu286和Leu291与所述调节子的疏水性异丙基乙基基团及所述结构的芳香族末端基团形成疏水性相互作用。也发现该相互作用对C螺旋的稳定作用是重要的。
α2I结构域与潜在调节子之间的特异性相互作用
本发明提供I结构域的闭合型的MIDAS的一般三维形式。所述MIDAS的形状对调节子的设计是重要的。闭合型的蛋白质调节子形状的匹配也限制新化学基团的引进/去除，其中加入该化学基团来改善例如药理学性质如溶解度、吸收或代谢。这些改善不应该过度妨碍所述化合物的结合亲和力，其为成功的前导化合物主要的必要条件。
表1和图5和11B提供对所述α2I结构域结合位点的氨基酸、主链原子和所述结晶水的详细描述，其所有这些在设计与所述α2I结构域相互作用的调节子时在结构上是重要的。
使用Bodil Modeling Environment(Lehtonen等人，http://www.abo.fi/fak/mnf/bkf/research/johnson/bodil.html：2004)和Sybyl(6.9.1.St.Louis，MO，USA，Tripos Inc.)基于对接模拟实验鉴定了以下氨基酸(表1中)，其中列出了与所述调节子相关的每个氨基酸的距离。
表1
          
Figure A20068004090700171
ASP151    X
SER153    X
ASN154    X
SER155    X
TYR157            X
ALA188        X
GL218     X
ASP219    X
LEU220        X
THR221    X
THR223            X
PHE224            X
THR253        X
ASP254    X
GLY255    X
GLU256    X
SER257        X
HIS258        X
ASP259            X
GLY260            X
SER261            X
LEU263            X
TYR285    X
LEU286    X
ARG288            X
ASN289    X
ALA290        X
LEU291    X
ASP292    X
THR293        X
LYS294        X
ASN295        X
LEU296    X
LYS298            X
GLU299        X
ALA302            X
表1列出了使用四环聚酮化合物根据分子对接实验提供重要相互作用的氨基酸。已将所述MIDAS氨基酸分为三层，其对应图4和图5中的白色、灰色和黑色。第1层列出距离对接的配体
Figure A20068004090700181
内的MIDAS氨基酸并在图4和图5中用黑色标出；第2层(在图4和5中为灰色)：距离对接的配体
Figure A20068004090700182
内的MIDAS氨基酸；和第3层(在图4和5中为白色)：距离对接的配体超过
Figure A20068004090700183
的MIDAS氨基酸。最重要的结合位点氨基酸侧链相互作用是那些直接与配体结构相互作用的(第1层，在图4和5中为黑色)。其他层也可通过“推动”且另外影响第1层的氨基酸影响配体结合到所述MIDAS上。所述结合位点是柔性的，因此不同层中的氨基酸可在动力学上响应结合配体改变它们的位置或取向。配体可诱导不同的受体构象。本配体设计策略的焦点集中在能够调节生物学上重要的分子(胶原)与所述MIDAS的结合。因此，所有三层对设计新颖的配体都是重要的。
稳定闭合型的其他潜在相互作用
调节子/配体与蛋白质主链原子和官能团之间的相互作用对结构设计方法是重要的。主链原子比氨基酸侧链原子可动性差，并因此可有效用于利用结构上的相互作用将所述调节子锚定到蛋白质上。当设计新颖的小分子胶原结合调节子时，以下提供可使用的一列主链相互作用。大部分相互作用的形成需要从所述MIDAS上替代结晶水分子。在所述列表中，使用以下定义：-NH-，定义主链氨基，并且O＝，定义主链羰基。在主链相互作用的编号方面，我们已使用在PDB结构PDB：1aox中发表的I结构域的闭合构象的编号。
■Ser155，-NH-，可向调节子提供一个氢键，例如氢键供体(1＊HBD)
■Gly218，O＝，自由接受来自调节子的氢键的一对自由孤对电子，例如氢键受体(1＊HBA)
■Asp219，O＝，1＊HBA，一对孤对电子可接受氢键。关键氨基酸His258的咪唑环立体阻断配体接近Asp219第二对孤对电子
■Asp254，O＝，1＊HBA，结晶水W701占据第二位置，否则所述位置被埋藏且不可能被调节子接近
■Glu256，是用于结合根据建模的调节子的关键接触物
■另外的定义：Glu256，-NH-，1＊HBD，所述Glu256氨基酸侧链取向的改变可引起它旋转并与例如来自调节子的OH-基团形成相互作用。从几何学和物理学上所述调节子的OH-基团可能同时与Glu256-NH-形成接触。结晶水也定位在附近，其可进一步稳定Glu256氨基酸侧链的重新定位。
■Ser257，O＝，2＊HBA，结晶水W650是与该官能团最近的可能的相互作用
■Gly260，-NH-，1＊HBD，与Ser257的侧链氧原子具有弱的相互作用，被埋藏
■Asp292，O＝，任选地2＊HBA，-NH-1＊HBD，在闭合型中所述氨基酸定位于疏水口袋中并通过氢键结合到W506上。推荐用来自调节子的适当的官能团替代弱结合的水。用结晶水来进一步定义该相互作用。
■Asn295，-NH-，1＊HBD，被埋藏，较不可能被调节子接近
■Leu296，-NH-，1＊HBD，被埋藏，较不可能被调节子接近
结晶水分子
用对应的调节子取代基(例如，-OH)取代水分子是改善该调节子结合的一种选择。也显示水分子在胶原结合事件中起活跃的作用。如此处详细描述的，水分子具有做为主要分子间作用介质的重要作用。结晶水的编号对应于PDB结构PDB：1aox中报道的I结构域闭合构象的编号。
在模拟实验中进一步注意到稳定正确晶体水分子的调节子可能具有稳定闭合型的功能性作用，因为该结晶水分子与氨基酸的若干原子形成氢键，当所述MIDAS重组为开放型时所述氨基酸将改变它们的位置。图4显示在α2β1整联蛋白I结构域内部的关键水分子的位置。
氨基酸Glu256处于与水分子W514配位的闭合型，且已检测的/设计的α2I结构域四环和氨磺酰调节子能够替代它的OH-基团。
与所述金属配位的水分子是W699、W701和W700。水W699也稳定苏氨酸Thr221的位置。结合配体可通过关闭它的出口途径来间接稳定该水的位置，并因此在物理上防止Thr221在开放型中呈现它的金属配位位置。基于分析，水W699的另外一对孤电子对似乎在闭合构象中未饱和且经受来自调节子的氢键供体相互作用。
水W700有可能结合时被许多调节子替代，与Ser155主链的氨基及金属配位。Ser155主链氨基是为调节子提供强氢键的可能位点。当在I结构域的开放型中的胶原模拟结合时替代所述水分子。当设计调节子时，可选择两条途径：通过引入氢键受体到该位置上替代所述水来提高调节子的结合，或者如果所述水对闭合型的稳定性重要，水被调节子保留。
水W668只与其他水分子配位并且调节子结合通常从所述MIDAS替代它。
水W597通过氢键结合到三个位点上。水W668，和主链的Glu256O＝。此外，所述水接受来自Thr221的一个氢键。该水分子明显稳定苏氨酸Thr221的位置。在调节子设计中，该水对稳定闭合构象是重要的并因此暗示对于胶原结合的调节具有关键功能。水W597处于向所述调节子提供氢键的好的位置，由此它将通过三个氢键被锁定在它的位置上。
水W644和W506靠近Asp292。这些水分子向Asp292的羧基提供氢键。水W506定位在沟内，除在Asp292主链的氧原子附近外，水W506基本上是疏水的。上面也提及过所述沟，并且其可通过MIDAS上的蛋白质主链(氨基酸255和256)；Leu286(疏水侧链)；Asp292(O＝和-NH-，主链的C-β碳)；Thr293(主链，肽键的平面)；Lys294(与苏氨酸的肽键)；Asn295(主链-NH-，c-β碳，可转向所述沟)；Leu296(主链-NH-，cβ碳)；和Glu256(羧酸基团可转向所述调节子)来定义。
潜在I结构域结合调节子的表征
所述I结构域结合调节子的化学结构可有相当大的变化，但是它们在与上述结合位点的氨基酸、主链原子及所述结晶水分子形成的接触中都必须具有结构和化学相似性。
考虑小分子结合位点的一般结构也是重要的，因为不符合某些能量窗中的I结构域结构的调节子不能结合到所述I结构域上。
基于四环聚酮化合物的模拟实验，图5给出了I结构域靶定调节子可能占据的一般形状和体积。已经将所述MIDAS氨基酸分成三层，其对应图4和图5中的白色、灰色和黑色。所述层表明氨基酸距对接配体的距离(也见表1)。最重要的结合位点氨基酸侧链相互作用是那些直接与所述配体结构的相互作用(第1层，在图4和5中为黑色)。其他层也可通过“推动”和另外影响第1层的氨基酸来影响配体结合到所述MIDAS上。所述结合位点是柔性的，因此在不同层中的氨基酸可在动力学上响应结合配体改变它们的位置或取向。配体可诱导不同的受体构象。本配体设计策略的焦点集中在能够调节生物学上重要的分子(胶原)与所述MIDAS的结合。因此，所有三层对设计新颖的配体是重要的。
在图1中显示所述配体结合腔的疏水面被配体埋藏。此外，通过与镁离子和Glu256(HBD)的主链氨基和Tyr285羟基的关键相互作用来稳定所述配体位置。这些相互作用是维持所述受体处于“闭合”构象的关键的稳定相互作用，因此形成基本药效团用于配体开发。
通过使用与基于整联蛋白I结构域MIDAS的三维坐标的药效团模型组合的虚拟筛选技术鉴定能调节含有I结构域的整联蛋白功能的可能的化合物。所述药效团模型含有如上所述关键相互作用位点用于调节子结合。
基于上述改进的计算机辅助分子模型，本发明提供装配在α2I结构域表面峡谷内的分子，其容纳所述MIDAS。更具体地，提供了计算机分析设计的和实体实验室检测的化合物，其与Mg相互作用，具有良好的亲和力并防止胶原结合。
选择链霉菌来源的芳香族聚酮化合物作为合适的文库用于筛选，该链霉菌属来源的芳香族聚酮化合物为含有可能与所述MIDAS相互作用的适当氧原子的扁平四环化合物。设想建模以适合所述峡谷的化合物和第二个环中的氧原子与MIDAS中的镁离子相互作用(图6)。所述化合物在固相α2I结构域结合测定中的筛选证实了已检验的假说。这些化合物阻断所有四个αI结构域结合胶原I的事实表明它们具有共同的结合机制。
进一步利用计算机分析模型鉴定新颖的胶原受体调节子。氨磺酰衍生物是使用根据本发明的计算机分析方法鉴定的化合物的实例，并且其满足上面的标准。使用此处描述的测定进一步证实此类化合物为胶原受体调节子。
通过本发明的方法鉴定的氨磺酰衍生物可通过通式(I)来描述，
其中
Rc选自二烷基氨基、NO2、CN、氨羰基、单烷基氨羰基、二烷基氨羰基、烷酰基、噁唑-2-基、噁唑基氨羰基、芳基、芳酰基、芳基-CH(OH)-、芳基氨羰基、呋喃基，其中所述芳基、芳酰基和呋喃基部分可以是被取代的；胍基(CH2)z-N(R’)-、Het-(CH2)z-N(R’)-、Het-CO-N(R’)-、Het-CH(OH)-和Het-CO-，其中Het是任选取代的4-6元杂环，该杂环含有一个或多个选自N、O和S的杂原子，R’为氢或烷基，并且z为1至5的整数；
RA是具有下式的基团，
其中
R3和R4各自独立的代表氢、卤素、芳基、烷氧基、羧基、羟基、烷氧基烷基、烷氧基羰基、氰基、三氟甲基、烷酰基、烷酰基氨基、三氟甲氧基、任选取代的芳基，并且
RB为氢、烷基、烷酰基、羟基烷基、烷氧基烷基、烷氧基羰基、烷氧基羰基烷基、氨基烷基、单或二烷基氨基烷基或Het-烷基，其中Het如上定义；
条件是
(i)当RC为二烷基氨基时，那么RB不是氢或烷基；
(ii)当RA为式(C)的基团，其中R3为氢并且R4为甲氧基时，那么RC不是Het-CO-N(R)-；并且
(iii)当RA为式(C)的基团，其中R3和R4为氢或卤素时，那么RC不是硝基。
在表2中显示本发明典型的氨磺酰化合物。
表2
Figure A20068004090700241
Figure A20068004090700251
Figure A20068004090700271
Figure A20068004090700281
优选化合物的具体实例为：
4’-氟-联苯-3-磺酸(4-苯甲酰基-苯基)-酰胺，
4’-氟-联苯-3-磺酸(3-苯甲酰基-苯基)-酰胺，
4’-氟-联苯-3-磺酸(α-羟基苄基-苯基)-酰胺，
2-氧代-咪唑烷-1-羧酸{4-[(4’-氟-联苯-3-磺酰基)-甲基-氨基]-苯基}-酰胺。
本发明因此提供新颖的整联蛋白-抑制剂，其满足如在改进的计算机分析模型中描述的所述MIDAS氨基酸残基需要的关键的相互作用。优选的整联蛋白抑制剂为表2中列出的氨磺酰衍生物和表3中列出的四环聚酮化合物。
本发明提供此类整联蛋白-调节子用于制备药物的用途，该药物用于治疗与血栓形成、癌症、纤维质生成和炎症相关的疾病。
本发明化合物为有效胶原受体调节子并可用于在体内或在体外抑制或预防细胞在胶原上的粘着或细胞经过胶原的迁移和侵入。目前描述的化合物抑制恶性细胞的迁移并因此有助于治疗疾病如癌症，包括前列腺癌、胃癌、胰腺癌和卵巢癌，及黑素瘤，尤其是其中α2β1整联蛋白依赖性细胞粘着/侵入/迁移可促进恶性机理、癌症侵入和转移或血管发生。
本发明化合物也抑制血小板向胶原的粘着及胶原诱导的血小板聚集。因此，本发明的化合物可用于治疗需要预防性或改善性治疗血栓栓塞疾病的患者，所述疾病即特征为需要预防血小板向胶原的粘着及胶原诱导的血小板聚集的疾病，例如治疗和预防中风、心肌梗塞、不稳定心绞痛、糖尿病性视网膜病或视网膜静脉闭塞。本发明的化合物还用作药物治疗患有特征为炎性过程如炎症、纤维质生成和骨折疾病的患者。
最后，本发明提供成功的策略来设计靶定到αI结构域中MIDAS上的胶原受体整联蛋白抑制剂。芳香族聚酮化合物和氨磺酰满足胶原受体αI结构域的潜在阻断剂的标准并且它们也预防细胞粘着到胶原上，满足所述改进的计算机分析模型定义的标准的其他化合物也被认为是根据本发明的化合物。
给出以下实施例来阐释本发明但不旨在限制本发明的范围。
实施例
实施例1四环素的生物合成
通过突变的链霉菌属菌株的发酵产生四环素化合物文库。所述发酵以5升批量在E1培养基中30℃下，通过280rpm(转/分钟)搅拌以5升/小时通气进行6天。
通过甲醇提取从细胞级分中收集代谢物，然后用二氯甲烷提取所述化合物、分析并蒸发。
通过两次层析处理然后沉淀来进行化合物的初步纯化。通过薄层层析(TLC)监控所述纯化。在含二氧化硅(在氯仿∶甲醇∶乙酸中)的柱中进行第一次层析分离。利用2％甲醇洗脱所述级分。在用甲苯∶甲醇∶甲酸洗脱的二氧化硅柱中进一步纯化合并的级分。
合并收集的级分，用少量的氯仿洗脱并用己烷沉淀。在己烷相中浓缩所述四环化合物。蒸发己烷并在进一步纯化中使用该级分作为原料。
用草酸处理的二氧化硅柱进一步纯化初步纯化得到的级分，用氯仿中的40％己烷洗脱。在制备C18HPLC柱中用乙腈∶水∶甲酸进一步纯化含四环化合物的级分。合并纯的级分，在氯仿中溶解并蒸发。
因此收到并进一步检测的化合物是2-乙基-2，5，7，12-四羟基-4，6，11-三氧代-1，2，3-三氢并四苯-甲酸甲酯(L3007)、2-乙基-4，5，7，12-四羟基-6，11-二氧代并四苯甲酸甲酯(L3008)、4，5，7，12-四羟基-2-(甲基乙基)-6，11-二氧代并四苯甲酸甲酯(L3009)和2-乙基-4，5，7-三羟基-6，11二氧代并四苯甲酸甲酯(L3015)。在表3中给出所述化合物的结构。
表3
Figure A20068004090700311
实施例2人的重组整联蛋白I结构域
人的整联蛋白αI结构域的克隆
使用人类整联蛋白α1和α2cDNA作为模板，如以前描述通过PCR生成编码α1I及α2I结构域的cDNA。分别使用载体pGEX-4T-3和pGEX-2T(Pharmacia)来产生人α1I和α2I结构域的重组的谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白质。通过RT-PCR从KHOS-240细胞(白种人骨肉瘤)分离的RNA生成所述α10I结构域cDNA。使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)分离细胞总RNA。使用Gene Amp PCR Kit(Perkin Elmer)完成RT-PCR。以前描述了用于克隆的细节(Tulla等人，2001)。扩增的α10I结构域cDNA与pGEX-2T表达载体(Amersham Pharmacia Biotech)均用BamHI和EcoRI限制性内切酶(Promega)消化。用SureClone Ligation Kit(AmershamPharmacia Biotech)将所述α10cDNA连接到pGEX-2T载体上。所述构建体转化入大肠杆菌(E.coli)BL21菌株中用于生产。用DNA测序检测所述构建体的DNA序列并与发表的α10DNA序列对比(Camper等人，1998)。当通过PCR生成α11I结构域时，使用人的整联蛋白α11cDNA作为模板。
αI结构域的表达与纯化
用质粒转化感受态大肠杆菌BL21细胞用于蛋白质生产。将50ml野生型或突变体BL21/pal过夜培养物接种至500ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基(Biokar)并将所述培养物在37℃下生长至所述悬浮液的O.D.600达到0.6-1.0。细胞用IPTG诱导并在离心收集前允许在室温下通常生长额外4-6小时。沉淀的细胞用PBS(pH 7.4)重悬，超声裂解后加入TritonX-100至终浓度2％。冰上温育30分钟后，离心悬浮液并收集上清液。向所述裂解液中加入谷胱甘肽
Figure A20068004090700321
4B(Amersham PharmaciaBiotech)，该裂解液在室温下温和搅拌30分钟进行温育。随后离心所述裂解液，去除上清液，并将结合融合蛋白质的Glutathione
Figure A20068004090700322
4B转移入一次性层析柱(Bio-Rad)中。用PBS洗涤所述柱，并用30mM还原型谷胱甘肽洗脱融合蛋白。
使用SDS及非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析纯化的重组的和谷胱甘肽标记的αI结构域。使用Bradford方法(Bradford，1976)测定蛋白质浓度。产生的重组α1I结构域长度为227个氨基酸，对应于完整α1整联蛋白123-338位的氨基酸，而α2I结构域长223个氨基酸，其对应于完整α2整联蛋白的124-339位氨基酸。α1I结构域和α2I结构域的羧基末端分别含有10个和6个非整联蛋白氨基酸(
Figure A20068004090700331
等人，2000，Tulla等人，2001)。产生的重组α10I结构域长度为197个氨基酸，对应于完整α10整联蛋白141-337位氨基酸。α10I的氨基末端含有2个非整联蛋白残基且羧基末端含有6个非整联蛋白氨基酸(Tulla等人，2001)。重组α11I结构域含有全部204个氨基酸：在α11I159-354位残基的氨基末端前有两个额外残基，在其羧基末端有6个额外的氨基酸。由于在表达和纯化过程中内源性蛋白酶的活性，重组α11I结构域含一些GST杂质(Zhang等人，2003)。重组αI结构域作为GST融合蛋白用于胶原结合实验。
定点诱变
根据Stratagene的QuickChange Mutagenesis Kit的说明书使用PCR在pGEX-2T或pGEX-4T-3载体中进行αI结构域cDNA的定点突变。通过DNA测序检测突变的存在。然后将突变构建体转化进大肠杆菌菌株BL21中用于产生重组蛋白质(
Figure A20068004090700332
等人，2000；Tulla等人，2001)。
实施例3α2I结构域突变体的产生
使用Stratagene QuickChange Mutagenesis Kit按照生产商的说明书在α2I结构域上进行位点专一突变。设计含两条DNA链所需突变的PCR引物。使用Pfu聚合酶(Stratagene)进行PCR，其在68℃产生含α2I结构域序列的全GEX-2T载体(Amersham Pharmacia Biotech)的单拷贝。用切割仅甲基化DNA的DpnI消化PCR产物。随后，将含所需突变的PCR产物DNA链配对。
实施例4αI结构域结合测定
αI结构域的固相结合测定
在+4℃用0.1ml含5μg/cm2(15μg/ml)胶原或20μg/ml三股螺旋肽的PBS过夜包被96孔高结合微量滴定板(Nunc)。用0.1ml
Figure A20068004090700341
DiluentII(Wallac)和PBS 1∶1的溶液包被空白加样孔。所有加样孔上剩余蛋白吸附位点用0.1mlDiluent II(Wallac)和PBS 1∶1的溶液封闭。将
Figure A20068004090700343
Assay Buffer中的重组蛋白质(αI-GST)以所需浓度加入包被后的加样孔内，并在室温温育1小时。然后加入铕标记的抗GST抗体(Wallac)(通常1∶1000)，并在室温温育混合物1小时。以上提及的所有温育在存在2mMMgCl2的条件下进行。向每个加样孔内加入
Figure A20068004090700344
增强溶液(Wallac)并用时间分辨荧光测定法(Victor2多标记计数器，Wallac)测定铕信号。分析至少三个平行加样孔。在某些情况下使用部分改良的固相测定并根据Tulla等人，2001进行。其使用抗GST且铕标记的蛋白G代替铕标记的抗GST抗体。
实施例5细胞粘着测定
在细胞粘着测定中使用表达野生型α2整联蛋白的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞克隆。在含0.1mg/ml环己酰亚胺(Sigma)的无血清培养基中悬浮细胞且在转入加样孔内前将化合物与细胞预温育。在+37℃下允许细胞(150000/加样孔)附着于I型胶原包被的加样孔(含和不含抑制剂化合物)中2小时，随后去除未粘着的细胞。加入新鲜的无血清培养基并使用细胞活力试剂盒(cell viability kit)(Roche)根据生产商方案来检测活细胞。
实施例6分子建模
发现的四环聚酮化合物和氨磺酰α2整联蛋白I结构域调节子的结合模式在本工作之前是未知的。我们使用标准和专有的分子建模工具结合实验证据来鉴定与α2整联蛋白配体结合(MIDAS)位点络合的四环聚酮化合物和氨磺酰的生物活性构象。使用BODIL建立MIDAS的结构。利用建模的MIDAS结构来叠加结构上和功能上不同的调节子。在建模模拟中我们在考虑MIDAS化学和结构特征的情况下探究调节子的构象空间。该方法为每一配体结构提供了优选的结合构象。随后该信息用于获得小分子所需相互作用的结构规则，该小分子通过α2整联蛋白MIDAS调节胶原结合。
在分子建模中作为起始点使用的I结构域开放型(PDB ID：1dzi)和闭合型(PDB ID：1aox)的晶体结构检索自Protein Data Bank。在BODIL软件中改变氨基酸侧链构象，使用BODIL旋转异构体库建立蛋白质构象系综。在对接模拟实验中包括MIDAS中配位的关键结构水分子作为部分晶体结构。使用Sybyl 6.9.1(旋转)加入蛋白结构和水分子的所有氢。使用SY-BYL6.9.1.中的FlexX和BODIL中的自动化旋转-翻译程序进行对接，其使用SY-BYL 6.9.1中的Comfort/Concord对接产生的自由配体构象。除FlexX评分外，用Xscore评估每一对接配体结构的结合自由能(Wang等人，2002)。
实施例7通过计算机分析鉴定的化合物抑制胶原结合
所述四环链霉菌属化合物在实施例1中合成，其中使用在实施例4中描述的αI结构域测定筛选对胶原结合到α1和α2I结构域的抑制作用。四环聚酮化合物L3015是α2I结构域与I型胶原结合的相对有效的抑制剂。显示了α2I结构域与I型胶原结合的剂量依赖的抑制作用(在0.03mM浓度时约50％的抑制；图6A)。L3015可抑制α1I和α2I结构域与I型和IV型胶原的结合(图6B)。
已知RKK肽结合到α2I结构域的MIDAS上(Ivaska等人，1999)。用实施例4描述的铕标记的蛋白G测定检测存在L3015时整联蛋白α2I结构域与RKK肽的结合。结果显示L3015可在MIDAS处替代RKK肽(图7B)。
此外用实施例4描述的铕标记的抗GST测定检测洛伐他汀存在时α1I和α2I结构域与胶原I的结合。洛伐他汀是白细胞整联蛋白α1I结构域(例如αLI结构域)的别构抑制剂，并且洛伐他汀的结合位点代表可能调节子的任选结合位点。然而，显示洛伐他汀对αI结构域结合到I型胶原没有影响(图7A)。这些生物检测给出通过四环聚酮化合物直接阻断所述MIDAS表面抑制胶原受体αI结构域的进一步证据。
基于使用3D模型，检测来自聚酮化合物家族的其他化合物。用实施例4中描述的铕标记抗GST测定检测所述化合物。四环聚酮化合物L3007、L3008和L3009可抑制α2I结构域与I型胶原的结合(图8A)。在图8B中显示活性最高的结构之一L3009的剂量依赖性抑制效应。
如实施例4描述，用所有胶原结合的整联蛋白αI结构域：a1I、α2I、α10I和α11I检测L3009的抑制效应。L3009可以0.05mM的浓度抑制胶原I与所有四种αI结构域的结合(图9)。
为研究整联蛋白异源二聚体在细胞表面上的功能，进一步在实施例5中描述的功能细胞粘着测定中检测最有效的化合物L3009。为该目的，转染CHO细胞以在它们的表面上表达α2β1整联蛋白作为它们唯一的胶原受体。
L3009为细胞粘着到I型胶原的有效抑制剂，EC50值为约20μM(图10A)。
利用计算机分析模型鉴定新颖的胶原受体调节子。氨磺酰衍生物、化合物434和化合物161是利用所述方法鉴定的新颖分子的实例。在实施例5中描述的功能细胞粘着实验中检测化合物434。图10B和表4显示化合物434是细胞粘着到胶原I型上的有效抑制剂。
表4
化合物编号 EC50，粘附(uM) Emax，粘附(at100uM；％) 50uM下的抑制％ 细胞侵入的EG50(uM)
  354   29   89   78   nt
  358   30   74   71   nt
  359   39   67   42   nt
  383   39   (-)   26   nt
  384   12   81   65   0.8
  398   16   (-)   83   nt
  403   37   86   56   nt
  416   42   79   44   nt
  430   14   59   53   12
  432   15   79   72   1
  434(384的盐) 9.1 78 78 0.8
  440   8.7   78   59   8.3
  442   (-)   22   21   nt
  448   3.8   74   58   27
  452   9.4   (-)   83   0.8
nt＝未检测
实施例8整联蛋白α2I结构域突变
为验证α2β1整联蛋白α2I结构域氨基酸在调节子结合中的作用，使用定点诱变方法。如在实施例3中进行选择的氨基酸突变。将整联蛋白α2I结构域中单个氨基酸突变并在粘着实验中使用表达突变的α2β1整联蛋白的CHO检测；野生型α2β1表达细胞用作对照。如在实施例5中描述进行所述细胞粘着实验。研究的结果表明α2I结构域的三个氨基酸：酪氨酸285、亮氨酸286和亮氨酸296对L3008的抑制功能是重要的。这些氨基酸的突变显著降低了在表达α2β1的CHO细胞粘着到胶原I中四环聚酮化合物L3008、氨磺酰化合物161和氨磺酰化合物434的抑制效应(数据未显示)。
实施例9细胞侵入测定表明所述抑制剂在体外的抗癌潜力
与胞外基质基膜相互作用的能力对恶性癌细胞表型和癌扩散是必要的。已知α2β1的水平在肿瘤发生细胞中上调。过表达调节细胞粘着和迁移到胞外基质和侵入胞外基质。通过阻断胞外基质组分如胶原与α2β1之间的相互作用，可能阻断癌细胞在体外的迁移和侵入。将内源表达α2β1的前列腺癌细胞(PC-3)用于检测本发明调节子在体外的抗癌潜力。
实验方法
使用BD Biocoat侵入插入件(BD Biocoat invision inserts)(BDBiosciences)研究PC-3细胞(CRL-1435，ATCC)通过Matrigel的侵入。在-20℃保存插入件。在实验前，允许插入件调整到室温。向所述插入件中加入500μl无血清培养基(Ham’s F12K培养基，2mM L-谷氨酰胺，1.5g/l碳酸氢钠)并允许在细胞培养箱中37℃下再水化2小时。吸出剩余的培养基。将PC-3细胞解吸、沉淀并悬浮在无血清培养基中(50000细胞/500μl)。在不存在(对照)或存在本发明抑制剂下向所述插入件加入300μl细胞悬浮液。插入件置于24孔板上；每孔包含700μl细胞培养基，含有3％的胎牛血清作为化学引诱物。允许细胞在细胞培养箱中37℃下侵入72小时。用700μlPBS洗涤插入件，并用4％多聚甲醛固定10分钟。吸出多聚甲醛，用700μlPBS洗涤细胞并用苏木精温育1分钟对插入件染色。用700μlPBS洗涤插入件去除染料。允许插入件干燥。在显微镜下计算固定的侵入细胞。计算与对照比较的侵入百分比。
该细胞侵入测定用作体外癌症转移的模型。显示所述氨磺酰分子抑制体外肿瘤细胞侵入(表4)。某些结构甚至以亚微摩尔浓度抑制侵入。
实施例10使用血小板功能分析仪PFA-100表明所述α2β1调节子抗凝血潜力
血小板功能分析仪PFA-100用于表明α2β1调节子可能的抗凝血作用。所述PFA-100为高剪切诱导装置，其刺激小血管损伤后的初步止血。所述系统包含试验筒，该试验筒含有胶原加肾上腺素包被的生物活性膜。将抗凝的全血样品在恒定真空下流经毛细管。膜上的血小板激动剂(肾上腺素)与高剪切速率引起血小板聚集的激活，导致稳定血小板塞堵塞孔。所述孔完全被堵塞所需要的时间被命名为“闭合时间”。将每种命中化合物加入全血样品中并用PFA-100测定所述闭合时间。如果当与对照样品比较时闭合时间增加，那么提示所述命中化合物具有抗血栓形成活性。
实验方法
通过静脉穿刺从供者将血液收集到含作为抗凝血剂的3.2％缓冲柠檬酸钠的抽真空的血液收集管中。将血液等分装入15mL管中并用抑制化合物或对照(DMSO)处理。在室温下旋转样品10分钟并随后测定血液的闭合时间。
导致闭合时间超过装置测量范围(＞300秒)的采集被分配300秒的值。计算每个处理的平均值和标准差。对所得数据应用斯氏t检验。
显示化合物434增加血液的闭合时间(图12)。

Claims (25)

1.α2β1整联蛋白I结构域的MIDAS的改进的计算机分析模型，其特征在于氨基酸坐标Asp151、Ser153、Ser155、Thr221、Asp254、Tyr285、Leu286和Leu296。
2.权利要求1所述的模型，其特征在于氨基酸坐标Asn154、Gly218、Asp219、Gly255、Glu256、Asn289、Leu291和Asp292。
3.权利要求2所述的模型，其特征在于表1中显示的氨基酸坐标。
4.权利要求1至3所述的模型，其特征在于关键水分子W514、W699、W701、W700、W668、W597、W644和W506。
5.鉴定调节α2β1整联蛋白的化合物的方法，该方法包括步骤：
(a)将三维分子建模算法应用于含α2β1I结构域的整联蛋白的原子坐标来确定所述整联蛋白的金属离子依赖性粘着位点(MIDAS)的空间坐标；和
(b)对步骤(a)中确定的所述空间坐标通过计算机分析筛选一组候选化合物的存储空间坐标来鉴定可以结合到所述整联蛋白的MIDAS的化合物。
6.权利要求5所述的方法，其还包括步骤：
(c)提供整联蛋白α2I结构域的片段，该片段含有在所述模型中使用的氨基酸残基；
(d)将所述片段接触所述候选调节子；和
(e)确定所述肽段结合所述潜在抑制剂的能力。
7.权利要求5或6任何一项所述的方法，其中所述化合物为整联蛋白抑制剂。
8.通过权利要求5至7任何一项所述的方法鉴定或获得的调节含α2β1I结构域的整联蛋白的化合物。
9.权利要求8所述的化合物，其具有通式(I)
Figure A20068004090700031
其中
Rc选自二烷基氨基、NO2、CN、氨羰基、单烷基氨羰基、二烷基氨羰基、烷酰基、噁唑-2-基、噁唑基氨羰基、芳基、芳酰基、芳基-CH(OH)-、芳基氨羰基、呋喃基，其中所述芳基、芳酰基和呋喃基部分可以是被取代的；胍基(CH2)z-N(R’)-、Het-(CH2)z-N(R’)-、Het-CO-N(R’)-、Het-CH(OH)-和Het-CO-，其中Het是任选取代的4-6元杂环，该杂环含有一个或多个选自N、O和S的杂原子，R’为氢或烷基，并且z为1至5的整数；
RA是具有下式的基团，
Figure A20068004090700032
其中
R3和R4各自独立的代表氢、卤素、芳基、烷氧基、羧基、羟基、烷氧基烷基、烷氧基羰基、氰基、三氟甲基、烷酰基、烷酰基氨基、三氟甲氧基、任选取代的芳基，并且
RB为氢、烷基、烷酰基、羟基烷基、烷氧基烷基、烷氧基羰基、烷氧基羰基烷基、氨基烷基、单或二烷基氨基烷基或Het-烷基，其中Het如上定义；
条件是
(i)当RC为二烷基氨基时，那么RB不是氢或烷基；
(ii)当RA为式(C)的基团，其中R3为氢并且R4为甲氧基时，那么RC不是Het-CO-N(R)-；并且
(iii)当RA为式(C)的基团，其中R3和R4为氢或卤素时，那么RC不是硝基。
10.权利要求7所述的化合物，其为整联蛋白抑制剂。
11.权利要求8所述的化合物，其为4’-氟-联苯-3-磺酸(4-苯甲酰基-苯基)-酰胺。
12.权利要求8所述的化合物，其为4’-氟-联苯-3-磺酸(3-苯甲酰基-苯基)-酰胺。
13.权利要求8所述的化合物，其为4’-氟-联苯-3-磺酸(α-羟基苄基-苯基)-酰胺。
14.权利要求8所述的化合物，其为2-氧代-咪唑烷-1-羧酸{4-[(4’-氟-联苯-3-磺酰基)-甲基-氨基]-苯基}-酰胺。
15.权利要求8所述的化合物，其为四环聚酮化合物。
16.权利要求14所述的化合物，其具有分子式2-乙基-2，5，7，12-四羟基-4，6，11-三氧代-1，2，3-三氢-并四苯-甲酸甲酯。
17.权利要求14所述的化合物，其具有分子式2-乙基-4，5，7，12-四羟基-6，11-二氧代并四苯甲酸甲酯。
18.权利要求14所述的化合物，其具有分子式4，5，7，12-四羟基-2-(甲基乙基)-6，11-二氧代并四苯甲酸甲酯。
19.权利要求14所述的化合物，其具有分子式2-乙基-4，5，7-三羟基-6，11-二氧代并四苯甲酸甲酯。
20.权利要求8至18任何一项所述的化合物在生产用于治疗血栓形成、血管病、癌症、纤维质生成和炎症的药物组合物中的用途。
21.权利要求19所述的用途，用于生产治疗前列腺癌、胃癌、胰腺癌或卵巢癌，或黑素瘤和预防癌症血管发生的药物组合物。
22.权利要求10所述的用途，用于生产预防或治疗肿瘤转移的药物组合物。
23.权利要求19所述的用途，用于生产治疗中风、心肌梗塞、糖尿病性视网膜病或视网膜静脉阻塞的药物组合物。
24.权利要求19所述的用途，用于生产治疗与纤维质生成和骨折相关的炎性疾病的药物组合物。
25.治疗血栓形成、癌症、纤维质生成或炎症的方法，其包括对需要这种治疗的患者施用有效量的权利要求8至18任何一项所述的化合物。
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