KR20080067621A - 콜라겐 수용체 ｉ-도메인 결합 조절제 - Google Patents

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KR20080067621A
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이르키 하이노
마크 죤슨
야르모 카필라
앤 마르야마키
토미 니로넨
마리카 오얄라
올리 펜티카이넨
리사 니시넨
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바이오티에 세라피스 코포레이션
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Abstract

본 발명은 α2β1 인테그린 I-도메인, 특히 MIDAS의 세밀하고 상세한 분자 모델, 및 신규 인테그린 조절제, 특히 α2β1 인테그린 조절제를 디자인하기 위한 당해 모델의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 치료학적 잠재력을 갖는 신규 α2β1 I-도메인 조절제에 관한 것이다. 본 발명은 추가로, 콜라겐 수용체와 상호작용하는 소형 분자 조절제의 특정 계열인 테트라사이클릭 폴리케타이드 및 설폰아미드에 관한 것이다. 본 발명은 추가로, 혈전증, 염증 및/또는 암에 대한 약물을 제조하기 위한 상기 조절제의 용도에 관한 것이다.
콜라겐 수용체, 콜라겐 수용체 I-도메인 결합 조절제, α2β1 인테그린 I-도메인, MIDAS, 테트라사이클릭 폴리케타이드, 설폰아미드

Description

콜라겐 수용체 Ｉ-도메인 결합 조절제{Collagen receptor I-domain binding modulators}
본 발명은 I-도메인, 특히 MIDAS로 불리우는 금속 이온 의존성 접착 부위의 세밀하고 상세한 분자 모델 및 신규 인테그린 조절제, 특히 α2β1 인테그린 조절제를 디자인하기 위한 당해 모델의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 MIDAS 아미노산 잔기에 의해 요구되는 주요 상호작용을 특징으로 하는 신규한 α2β1 인테그린 조절제에 관한 것이고 당해 조절제는 인테그린 I-도메인 상호작용, 특히 콜라겐 결합 및 기능을 조절하고 치료학적 잠재력을 갖는다. 본 발명은 추가로 콜라겐 수용체와 상호작용하는 특정 계열의 소분자 조절제인 테트라사이클릭 폴리케타이드 및 설폰아미드에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 혈전증, 혈관 질환, 염증 및/또는 암에 대한 약물을 제조하기 위한 당해 조절제의 용도에 관한 것이다.
인테그린은 큰 계열의 세포 접착 수용체이고 이것은 모든 사람 세포의 주변 세포외 매트릭스로의 접착을 매개한다. 또한, 인테그린은 세포 분열, 분화, 이동 및 생존을 포함하는 다양한 다른 세포 기능에 관여한다. 사람 인테그린 유전자 계 열은 18개의 알파 인테그린 유전자 및 8개의 베타 인테그린 유전자를 포함하고 이들 유전자는 각각 상응하는 알파 및 베타 서브유니트를 암호화한다. 하나의 알파 및 하나의 베타 서브유니트가 각각의 기능적 세포 표면 수용체를 위해 요구된다. 따라서, 24개의 상이한 알파-베타 조합체가 사람 세포상에 존재한다. 알파 서브유니트중 9개는 리간드 인지 및 결합에 관여하는 특이적 "삽입된" I-도메인을 함유한다. αI-도메인 함유 인테그린 서브유니트중 4개의 서브유니트, 즉 α1 , α2, α10 및 α11은 콜라겐의 주요 세포 수용체이다. 당해 4개의 알파 서브유니트중 각각의 서브유니트는 또한 또 다른 MIDAS를 함유하는 I형 도메인을 함유하는 β1 서브유니트와 이종이량체를 형성한다(문헌참조: Springer and Wang, 2004). 따라서, 콜라겐 수용체 인테그린은 α1β1 , α2β1 , α10β1 및 α11β1이다(문헌참조: Reviewed in White et al., Int J Biochem Cell Biol, 2004, 36:1405-1410). 콜라겐은 가장 큰 계열의 세포외 매트릭스 단백질이고 27개 이상의 상이한 콜라겐 서브타입(콜라겐 I-XXVII)으로 구성된다.
인테그린 α2β1은 상피 세포, 혈소판, 염증 세포, 및 많은 간엽 세포(내피 세포, 섬유아세포, 조골세포 및 연골모세포를 포함)상에 발현된다(문헌참조: Reviewed in White et al., supra). 역학적 증거는 혈소판 상의 고발현 수준의 α2β1이 심근 경색 및 뇌졸중(문헌참조: Santoso et al., Blood, 1999, Carlsson et al., Blood. 1999, 93:3583-3586), 당뇨 망막증(문헌참조: Matsubara et al., Blood. 2000, 95:1560-1564) 및 망막 정맥 폐색증(문헌참조: Dodson et al., Eye. 2003, 17:772-777)의 높은 위험과의 관계를 입증한다. 동물 모델로부터의 증거는 혈전증에서 제안된 α2β1의 역할을 지지한다. 인테그린 α2β1은 또한 침입성 전립선암, 흑색종, 췌장암, 위암 및 난소암과 같은 암에서 과발현된다. 이들 관찰은 α2β1 인테그린과 암 침입 및 전이와의 관계를 관련시킨다. 또한, 암 관련 혈관형성은 항-α2 기능 차단 항체에 의해 부분적으로 억제될 수 있다(문헌참조: Sen- ger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1997, 94:13612-13617). 최종적으로, 백혈구는 부분적으로 염증 과정동안에 α2β1 기능에 의존한다(문헌참조: de Fougerolles et al., J. Clin. Invest., 2000, 105:721-729). 조직 분포 및 실험적 증거를 바탕으로, α1β1 인테그린은 염증, 섬유증, 골절 치유 및 암 혈관형성에서 중요한 역할을 할 수 있지만(White et al., supra) 모든 4개의 콜라겐 수용체 인테그린은 골 및 연골 대사의 조절에 관여할 수 있다.
콜라겐 수용체가 다양한 병리학적 진행에 관여함을 지적하는 강한 증거는 이들이 약물 개발에 잠재적인 표적이 되게하였다. α1 또는 α2 서브유니트에 대한 기능 차단 항체는 염증 질환 및 암 혈관형성에 대한 모델을 포함하는 여러 동물 모델에서 효과적이었다. 합성 펩타이드 억제제 및 뱀 독 펩타이드는 α1β1 및 α2β1의 기능을 차단하는 것으로 보고되었다(문헌참조: EbIe, Curr Pharm Design 2005, 11 :867-880). 국제 특허 공보 WO 99/02551는 α2β1의 발현을 조절하지만 실질적으로 인테그린에 결합하지 않는 하나의 소형 분자 약물 후보물을 기재하고 있다.
콜라겐 결합 αI-도메인은 콜라겐 수용체를 표적으로 하는 이상적인 약물 디자인에서 결정적 역할을 한다. 콜라겐 I에서 하나의 고친화성 모티프에 결합하는 α2 I-도메인의 기작은 공지되어 있다. 그러나, α I-도메인은 잠재적으로 약물 개발을 위해 흥미로울 수 있는 다수의 다른 부위를 함유한다.
α2 I-도메인의 비연결된 "불활성"("폐쇄된") 형태의 구조는 문헌[참조Emsley et al. in J. Biol. Chem, 1997, 272: 28512- 7]에서 보고되었다. I-도메인 및 관련 vWf A-도메인의 주요 특징은 이들이 5개의 평행 및 하나의 역평행 베타 쇄의 특징적인 어셈블리를 함유하여 안정한 플랫폼 구조를 형성한다는 것이다. I-도메인의 중요한 또 다른 특징은 이들이 서열 DxSxS(여기서, x는 임의의 아미노산이다)을 갖는 아미노산 모티프를 갖는다는 것이다. 이들 3개의 아미노산 D151, S153 및 S155은 α2 I-도메인의 제1 베타 쇄로부터 기원하는 N-말단 루프에 존재한다. 인접한 펩타이드 루프에서 기타 산소 함유 잔기와 함께 이들은 금속 이온과 배위 결합하여 금속 이온 의존성 접착 부위를 구성한다(MIDAS).
국제 특허 공보 WO 01/73444는 인테그린 α2 I-도메인과 복합체를 형성한 콜라겐 모사 삼중 나선 펩타이드의 결정 구조를 기재한다. 이러한 공보는 당해 활성("개방된") 형태에서 금속 이온이 1997년도의 불활성 구조에서 기재된 바와 같은 Asp254 대신에 Thr221에 대한 금속 이온 배위 결합하고 있음을 기재한다. 배위에서의 당해 변화 뿐만 아니라 WO 01/7344는 C-나선이 풀려져 있고 다음 나선 구조에서 추가로 감겨져 있음을 기재한다. 이것은 또한 지금까지 I-도메인 및/콜라겐 복합체 구조에 가장 인접해 있는 것이다.
지금까지의 최상의 지식을 바탕으로 하여 콜라겐 수용체 인테그린 α2β1의 MIDAS와 결합하는 것으로 보여지는 어떠한 소형 분자 억제제도 공지되어 있지 않 다. 인테그린 MIDAS의 콜라겐 결합 부위의 표면은 너무 커서 물리적으로 전체 부위를 덮을 만한 구조의 소형(크기 <600g/몰) 분자를 디자인할 수 없었다. 따라서, (인테그린 α2β1 I-도메인) MIDAS 의 개선된 모델, 및 약물 개발을 위해 요구되는 바와 같이 콜라겐과 인테그린 α2β1의 상호작용을 조절하는 신규한 소분자의 디자인을 가능하게 하는 소형 분자 결합을 연구하는 방법이 여전히 요구되고 있다.
도 1은 분자 코어 구조의 도킹 및 I-도메인 MIDAS 내부에서 테트라사이클릭 화합물의 주요 분자간 상호작용을 도시하고 있다.
도 2A 및 2B는 α2 I-도메인의 "개방된"(검정색) 및 "폐쇄된"(회색) 형태를 도시한다. 중첩은 마그네슘 이온(검정 구형)과 배위 결합된 2개의 세린 잔기((153번 및 155번; 볼 앤드 스틱(ball-and-stick))를 기초로한다. "개방된" 형태에서, Thr221은 금속 이온과 배위 결합되어 있는 반면, 폐쇄된 형태에서는 상호작용이 부재이다. 도 2A는 MIDAS를 위에서 본 것이고 도 2B는 측면도이다.
도 3은 C-나선에서 Tyr285 위치가 억제제 리간드(모든 도킹된 테트라사이클릭 폴리케타이드 리간드에 대한 라인-모델로서 보여지는)의 결합 형태를 안정화시킴을 보여준다.
도 4는 인테그린 α2 I-도메인 내부의 주요 물 분자의 위치를 보여준다. 도킹 시뮬레이션의 결과로부터 유래하는 MIDAS 아미노산은 검정색(도킹된 테트라사이클릭 폴리케타이드로부터 4Å이내), 회색(도킹된 테트라사이클릭 폴리케타이드로부 터 4-8Å 거리) 또는 백색(도킹된 테트라사이클릭 폴리케타이드로부터 8Å 초과 거리)으로 나타낸다.
도 5는 α2 I-도메인 MIDAS에서 콜라겐 결합의 소형 분자 조절제 총체에 의해 차지되는 형태 및 용적을 보여준다. 도킹 시뮬레이션의 결과로부터 유래되는 MIDAS 아미노산은 검정색{도킹된 테트라사이클릭 폴리케타이드로부터 4Å 이내), 회색(도킹된 테트라사이클릭 폴리케타이드로부터 4-8Å 거리 또는 백색(도킹된 테트라사이클릭 폴리케타이드로부터 8Å 초과 거리)으로 나타낸다.
도 6A는 I형 콜라겐에 결합하는 α2 I-도메인 (200 ng)에 대한 테트라사이클릭 폴리케타이드 L3015의 용량 의존적 효과를 보여준다.
도 6B는 I형 및 IV형 콜라겐으로의 α11 및 α2 I-도메인 (800 ng)의 결합에 대한 테트라사이클릭 폴리케타이드 L3015의 효과를 보여준다.
도 7A는 I형 콜라겐으로의 α1I-도메인 및 α2 I- 도메인의 결합에 대한 로바스타틴의 효과를 보여준다.
도 7B는 RKK-펩타이드(약 0.5mM)로의 α2 I-도메인의 결합에 대한 테트라사이클릭 폴리케타이드 L3015의 효과를 보여준다.
도 8A는 I형 콜라겐으로의 α2 I-도메인(800 ng)의 결합에 대한 테트라사이클릭 폴리케타이드 L3007, L3008 및 L3009의 효과를 보여준다.
도 8B는 테트라사이클릭 폴리케타이드 L3009 농도의 함수로서 I형 콜라겐으로의 α2 I-도메인(800 ng)의 결합을 보여준다.
도 9는 테트라사이클릭 폴리케타이드 L3009에 의한 I형 콜라겐으로의 α1I, α2 I, α10 I, 및 α11 I-도메인의 결합 억제를 보여준다.
도 10A는 테트라사이클릭 폴리케타이드 L3009에 의한 I형 콜라겐으로의 CHO-α2 세포 접착의 용량 의존적 억제를 보여주고 도 10B는 설폰아미드 유도체 화합물 434에 의한 용량 의존적 억제를 보여준다.
도 11A는 MIDAS에 대한 본 연구에서 보고된 화합물에 존재하는 테트라사이클릭 소형 분자 구조의 바람직한 위치를 보여주는 α2 I-도메인의 구조를 도시한다.
도 11 B는 I-도메인의 폐쇄된 형태(비콜라겐 결합)에서 잠재적인 I-도메인 리간드에 인접한 아미노산의 배열을 나타낸다. 4Å 반경 이내의 주요 잔기는 검정색으로 나타내고 4 내지 8Å 이내의 잔기는 회색으로 나타내고 8 내지 12Å 이내의 잔기는 백색으로 나타낸다.
도 12는 화합물 434가 혈액의 폐쇄 시간을 증가시킴을 보여준다.
발명의 간단한 설명
본 발명은 표 1에 나타낸 아미노산 배위, 특히, Asp151, Ser153, Ser155, Thr221, Asp254, Tyr285, Leu286 및 Leu296 및 아미노산 배위 Asn154, Gly218, Asp219, Gly255, Glu256, Asn289, Leu291 및 Asp292의 아미노산 배위를 특징으로 하는 인테그린 I-도메인의 MIDAS의 세밀한 인 실리코(in silico) 모델에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 주요 물 분자 W514, W699, W701 , W700, W668, W597, W644 및 W506을 특징으로 하는 모델에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상기 모델을 사용하여 잠재적인 조절제를 디자인하거나 선별 하기 위한 I-도메인 함유 인테그린의 잠재적인 조절제를 동정하는 방법에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 α2β1 인테그린, 바람직하게 α2β1 인테그린 억제제를 조절하는 화합물을 동정하는 방법에 관한 것이다. 당해 방법에서, 3차원 분자 모델링을 위한 알고리듬을 I-도메인 함유 인테그린의 원자 배위에 적용하여 당해 인테그린의 MIDAS의 공간 배위를 결정하고 특정 세트의 후보 화합물에 대해 저장된 공간 배위를 실질적으로 당해 공간 배위에 대해 인 실리코 스크리닝한다. 당해 비교를 기초로 하여 당해 인테그린의 MIDAS에 결합할 수 있는 화합물을 동정한다. 바람직하게, 당해 화합물은 인테그린 억제제이다.
본 발명은 추가로 본 발명에 따른 방법에 의해 동정되거나 수득된 I-도메인 함유 인테그린의 신규 조절제에 관한 것이다. 본 발명에 따른 인테그린 조절제는 수소 결합 공여체 또는 수용체의 상호작용, 소수성 결합 및 수소 결합 공여체와 금속 이온의 상호작용을 포함하는, MIDAS 아미노산 잔기에 의해 요구되는 주요 상호작용을 특징으로 한다.
본 발명은 추가로 테트라사이클릭 폴리케타이드 및 설폰아미드 유도체와 같은 신규 인테그린 억제제에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 본 발명에 따른 조절제의 용도, 바람직하게는 혈전증, 암, 섬유증 또는 염증 치료용의 약제학적 조성물을 제조하기 위한 당해 억제제의 용도에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 본 발명에 따른 유효량의 억제제를 투여함에 의해 혈전 증, 혈관 질환, 암, 섬유증 또는 염증을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 신규 조절제와 복합체를 형성한, I-도메인, 특히 MIDAS의 세밀하고 상세한 분자 모델 및 신규 인테그린 소형 분자 조절제, 특히 α2β1 인테그린 조절제를 디자인하기 위한 당해 분자 모델의 용도에 관한 것이다. 당해 소형 분자 인테그린 조절제는 콜라겐 모사 펩타이드에 대해 현재 공지된 결합 기작과는 상이한 결합 기작에 따라 인테그린에 결합한다.
본 발명은 추가로 I-도메인의 금속 이온 의존성 접착 부위(MIDAS)의 상세한 원자적 수준의 분자 모델 및 결합 부위 원자와 당해 부위에 결합하는 소형 분자 조절제간의 상호작용에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 αI-도메인과 합성 테트라사이클릭 폴리케타이드 및 설폰아미드 인테그린 조절제와 같은 조절제간의 복합체 형성에 관여하는 중요한 아미노산, 펩타이드 주쇄의 원자 및 물 분자를 기재한다. 구조 기반 소형 분자 디자인의 도움으로 밝혀진 테트라사이클릭 폴리케타이드 화합물은 실험적으로 α2 I-도메인에 결합하는 것으로 나타난다.
추가로, 본 발명은 공개적으로 유용한 X-선 데이터로부터 유래된 αI-도메인 구조 모델을 기초로 하는 α2 인테그린 결합 신규 소형 분자를 디자인하는 구조 기반 법칙에 관한 것이다.
본 발명에서 보고된 MIDAS 아미노산에 결합하는 소형 분자의 법칙은 또한 이것이 I-도메인에 결합하는 리간드에 결정적인 것으로 밝혀진 보고된 분자간의 상호작용을 충족시키는 한, 테트라사이클릭 폴리케타이드 또는 설폰아미드 이외의 다른 화학적 실체의 결합에 적용될 수 있다.
이것은 추가로, 본 발명의 방법이 α2β1 인테그린 뿐만 아니라 콜라겐 수용체 인테그린 α1β1, α10β1 및 α11β1에 결합하는 억제제를 디자인하고 스크리닝하는데 유용함을 보여준다.
본 발명은 추가로 수소 결합 공여체 또는 수용체(HBDA), 소수성(HYD) 1 수소 결합 공여체(HBD) 및 금속 이온(Mg) 상호작용을 포함하는, MIDAS 아미노산 잔기들에 의해 요구되는 주요 상호작용을 특징으로 하는 신규 α I-도메인 조절제에 관한 것이다. 본 발명에 따른 조절제는 또한 MIDAS에 존재하는 물 분자와 상호작용하거나 물분자를 대체할 수 있다.
본 발명에 따른 인테그린 조절제는 직접적인 I-도메인 MIDAS-결합 조절제 및 알로스테릭 I형 도메인 MIDAS 결합 조절제를 포함한다. 당해 조절제는 바람직하게 억제제이다.
따라서, 본 발명은 테트라사이클릭 폴리케타이드 및 설폰아미드 유도체와 같은 신규한 인테그린-억제제를 제공한다.
본 발명은 혈전증, 암, 섬유증 및 염증과 관련된 질환 치료용의 약물을 제조하기 위한 당해 인테그린 조절제의 용도를 제공한다.
I-도메인의 상세한 구조적 특징
α2 인테그린 I-도메인에 대한 현재 구조적 지식은 I-도메인의 2개의 정적 구조인 폐쇄된 형태 및 개방된 형태를 기재하는 상기 인용된 문헌을 기초로 한다. 실제로, MIDAS의 I 도메인 및 특히 이의 다른 부분은 이동성이다. I-도메인은 분자 환경에 응답하여 세포내에서 이의 형태를 변화시킨다. 상이한 형태는 MIDAS에 결합하는 기타 분자에 의해 유도될 수 있다. 결합에서 생물학적 분자와 경쟁하여 생물학적으로 유의적인 분자 실체와 MIDAS의 상호작용을 조절할 수 있는 소형 분자의 디자인은 단순히 2개의 정적 수용체 모델로부터는 유래될 수 없는 수용체-리간드 상호작용의 동력학에 대한 세부적인 정보를 필요로 한다.
2개의 공개된 구조는 이동성 도메인의 2개의 사진과 비교할 수 있다. 본 발명에서 결정 구조로부터 유래하는 정보는 분자 모델링에 의해 확대되고 소위 총체-모델이 구축되며 이때, I-도메인( 및 특히 MIDAS)이 결합 리간드의 구조와 일치할 가능성은 보딜 모델링 환경(Bodil Modeling Environment)[문헌참조: Lehtonen et. al. 2004]을 사용하여 연구되었다. 추가로, 리간드의 형태적 공간 및 수용체 유도된 형태적 변화는 변동성 도킹 연구(제조원(Sybyl, Tripos Inc.)의 프로그램 FlexX)에 의해 연구되었다.
콜라겐과 I-도메인의 상호작용은 이전에 돌연변이 실험에 의해 연구되었고 α2 I-도메인과 콜라겐이 접촉하는 부위는 β A-쇄 및 알파 나선 1과 결합하는 Asn154; 알파 나선 3 및 4와 결합하는 Asp219 및 Leu200; β D-쇄 및 알파 나선 5와 결합하는 Glu256, His258; C 나선, 알파 나선 6, βC-쇄 및 알파 나선 6과 결합하는 Tyr285, Asn289, Leu291, Asn295 및 Lys298인 것으로 밝혀졌다. 이것은 또한 Glu256 및 Asn295에서 Ala 돌연변이가 콜라겐 결합에서 변화를 유도하지 못하는 것으로 공지되어 있다.
Asp151 , Ser153, Thr221 및 Asp254에 영향을 주는 돌연변이는 콜라겐 결합에 변화를 주는 것으로 공지되어 있다. 당해 효과는 주로 이들 아미노산이 콜라겐 결합에 필수적인 I-도메인의 금속 이온과 결합한다는 사실 때문이다.
국제 특허 공보 WO 01/73444는 α2 I-도메인에 결합하는 삼량체 콜라겐 모사 GFOGER 펩타이드가 하기의 아미노산에 의해 영향받음을 기재하고 있다: 나선 1의 중간 쇄에서 글루타메이트는 금속과 배위 결합하고 Arg는 Asp219와 염 브릿지를 형성하는 반면, 페닐알라닌은 Gln215와 Asn154 사이에 위치하고; 최외곽 나선 2의 길게 이어지는 쇄에서, 페닐알라닌은 Tyr157, Leu286과 접촉해 있고 아르기닌은 Glu256에 인접해 있지만 결정 구조에서 염 브릿지를 형성하지 않고; 나선 3의 주쇄에는 Asn154와 Tyr157간에 수소 결합이 존재하여 접촉 루프 1을 형성하고 루프 3에는 His258이 있다.
콜라겐 모사 펩타이드가 MIDAS에 결합하는 경우, 명백한 형태적 변화가 있다. Mg2+ 금속 배위는 변화하고 I-도메인의 C-나선은 이것이 금속과 배위 결합을 하는 경우 콜라겐으로부터 이동하게 된다. 당해 이동 결과로서 구조의 변화는 I-도메인의 반대편 기둥 전반에 구조적 영향을 수반한다.
국제 특허 공보 WO 01/73444에 기재된 바와 같이, I-도메인이 폐쇄된 형태로부터 개방된 형태로 변화하는 경우 콜라겐은 금속을 아미노산 Thr221쪽으로 민다. MIDAS에서 당해 루프는 그 이동을 따라간다. Ser155에서 뿐만 아니라 Ser153에서 금속 배위 결합은 불변이지만 Asp254 금속 결합은 파괴된다. Gly255 펩타이드 결합은 180도 회전하고 금속으로부터 멀리 이동한다. Glu256은 물을 통해 금속과 결합한다. Tyr175과 His258는 적어도 콜라겐 모사 펩타이드와 관련하여 콜라겐 삼량체 나선 쇄로 함몰한다.
당해 나선 7이 급격히 변화함에 따라서, MIDAS C- 나선은 풀리고 알파 나선 6에 새로운 코일이 형성된다. 복합체 형성의 유리한 지점으로부터 가장 중요한 형태적 변화는 콜라겐 글루타메이트가 금속쪽으로 이동하고 이와 배위 결합한다는 것이다. 콜라겐이 I-도메인의 MIDAS 금속과 접촉될 수 있기 전에, 이것은 Tyr285 측쇄에 의한 입체 장애를 극복해야만 한다. 상기 아미노산은 I-도메인의 C-나선에 위치한다.
α I-도메인내 형태적 변화는 전체 알파-베타 이종이량체에 또 다른 형태적 변화를 유발하고 이어서 이것은 능히 α- 및 β-서브유니트의 세포질 도메인을 서로로부터 멀리 이동시키기 때문에 세포내 시그날 전달 경로를 활성화시킨다.
모델링 및 현존하는 모델의 세밀화동안에 조절제 디자인에 대해 하기의 관찰을 수행하였다:
I-도메인에서 C-나선의 생물학적 역할은 콜라겐의 금속으로의 결합을 억제하는데 있을 수 있다. 콜라겐 결합에 대한 소형 분자 조절제를 디자인하는데 당해 사실을 숙지하는 것이 중요하다. 콜라겐은 C 나선 형태에 의한 수용체의 폐쇄된 형태에서 I-도메인과의 결합이 억제된다. 따라서, 폐쇄된 형태로 C-나선을 추가로 안정화시킬 수 있는 조절제의 특징은 신규한 소형 분자 콜라겐 결합 조절제를 디자인하는 경우 중요한 성질이다. 이러한 성질을 숙지하여 디자인된 조절제는 본 발명자의 실험에서 나타난 바와 같이 콜라겐 결합을 억제한다. 도 2는 I-도메인의 폐쇄된 형태를 회색으로 도시하고 있고 콜라겐 모사 GFOGER-펩타이드가 결합된 개방된 형태를 검정색으로 도시하고 있다(콜라겐 펩타이드는 명백하게 나타나지 않음). 콜라겐 결합 억제 조절제를 디자인하는 경우, 조절제의 결합은 콜라겐 결합을 억제하는 I-도메인의 폐쇄된 형태를 안정화시켜야만 한다.
MIDAS 구조로부터 기원하는 조절제 디자인을 위한 일반적 관찰 및 법칙
콜라겐 모사체의 결합 즉시 초기 보고된 구조적 변화에 대한 해석과는 반대로, 본 발명자는 또한 신규 콜라겐 결합 조절제를 디자인하기 위해 중요한 주요 MIDAS 아미노산 세린 및 트레오닌(Ser153, Ser155 및 Thr221)의 위치 및 거리(기하학적)에 대한 새로운 특징을 밝혔다. 고정된 단백질 배위의 변화에 대한 해석은 배위를 중첩시키는데 사용되는 방법에 따라 다양하고 따라서 중첩 위치에 대한 해석에 영향을 준다. 중첩의 척도로서 전체 단배질 구조를 사용하는 것 대신, 본 발명의 모델링은 중첩에서 MIDAS의 구조에 초점을 맞추었다. 놀랍게도, 이것은 콜라겐 모사체 GFOGER-펩타이드의 결합 즉시 발생되는 구조적 변화를 새롭게 해석하게 하였다. 본 발명에서, 개방된 형태 및 폐쇄된 형태는 Ser153(및 Ser 155)의 주요 아미노산 측쇄의 배위를 사용하여 중첩시켰다. 이어서, 초기 해석과는 반대로, MIDAS의 금속 이온은 이동하기 보다는 이의 본래의 위치에 인접하게 유지되어 있다. 금속 주변의 단백질의 주쇄는 폐쇄된 형태와 비교하여 I-도메인의 개방된 형태에서 서로 보다 인접하게 위치하게 된다는 것을 주지시킨다.
변화는 Mg2+ 금속 배위에서 나타난다. Thr221는 금속과 배위 결합을 하고 하나의 배위 결합된 물 분자는 제거된다. 당해 또 다른 중첩으로부터의 관찰은 동시에, 개방된 형태에서 금속 주변의 단백질의 주쇄가 새롭게 서로 접촉하게 된다는 것이다. Ser153 및 Thr221은 폐쇄된 형태에서 보다는 개방된 형태에서 서로 보다 인접하게 위치하게 된다. 폐쇄된 형태를 안정화시키는 것을 목적으로 하는 조절제의 특징은 따라서 이것이 물 분자를 통해 계속해서 금속과 배위 결합을 하는 방식으로 폐쇄된 형태에서 Thr221의 위치의 안정화를 역설한다. 당해 금속 배위가 I-도메인의 개방된 형태에 전형적인 것임을 가정할 때, 당해 사실은 Thr221이 금속 이온에 인접하게 이동하는 것을 차단할 것이다. 결정수 W957은 수용체에 단단하게 결합되어 있고 Thr221은 I-도메인의 폐쇄된 형태에 있다. 조절제는 예를 들어, W597로부터의 수소 결합을 수용함에 의해 당해 결정수를 Thr221에 인접하게 포획함으로써 작용할 수 있다(추후 상세히 기재됨). 개방된 형태에서, 물 W597은 제거된다. 따라서, Thr221-결정수-금속 안정화 조절제는 폐쇄된 형태를 안정화시키고 콜라겐 결합을 억제시킬 수 있다.
I-도메인의 C-나선에서 결합 포켓의 벽내의 아미노산의 구체적 특징이 조절제의 구조적 디자인을 위해 유용한 것으로 추가로 밝혀졌다. 조절제가 I-도메인의 폐쇄된 형태에서 구조적으로 C-나선과 상호작용하는 경우(예를 들어, C-나선의 소수성 측면, 도 1), 이것은 C-나선의 구조를 안정화시키고 추가로 콜라겐 결합을 조절하게된다.
도 1에서, MIDAS 리간드 결합 공동의 소수성 측면(백색 영역)은 바람직하게 결합 리간드에 의해 파묻혀 있는 것으로 나타난다. 당해 리간드 위치는 마그네슘 이온, Glu256 (HBD)의 주쇄 아미노 그룹 및 Tyr285의 하이드록실 그룹과의 주요 상호작용에 의해 안정화될 수 있다. 이들 상호작용은 수용체를 폐쇄된 형태로 유지시키기 위한 주요 안정화 상호작용이고 따라서 새로운 리간드 발견을 위한 기본 약리작용단을 형성한다.
예를 들어, 테트라사이클릭 폴리케타이드는 C-나선에서 Tyr285와 원자-원자(pi-pi) 상호작용을 형성할 수 있다. 도 3에서, C-나선에서 Tyr285의 위치는 리간드의 결합 형태를 안정화키는 것으로 나타난다(모든 계측된 리간드에 대한 라인-모델로서 보여짐). 시뮬레이션 실험에서, 당해 부류의 조절제에서 수소 결합 수용체는 또한 타이로신의 하이드록실과 수소 결합을 형성하고 조절제의 하이드록실과 카보닐 그룹간에 수소 결합을 형성하는 것으로 나타났다.
시뮬레이션에서, C-나선 및 나선 6의 아미노산 Leu286 및 Leu291은 조절제의 소수성 이소프로필-에틸 그룹 및 구조의 원자 말단 그룹과 소수성 상호작용을 형성하는 것으로 나타났다. 당해 상호작용은 또한 C-나선 안정화를 위해 중요한 것으로 밝혀졌다.
α2 l-도메인과 잠재적인 조절제간의 특이적 상호작용
본 발명은 I-도메인의 폐쇄된 형태의 MIDAS의 일반적인 3차원 형태를 제공한다. MIDAS의 형태는 조절제의 디자인을 위해 중요하다. 폐쇄된 형태의 단백질-조절제 형태의 조화는 또한 예를 들어, 용해성, 흡수 또는 대사와 같은 약리학적 성질을 개선시키는데 첨가되는 신규 화학적 그룹의 도입/제거를 제한한다. 이들 개선은 성공적인 선두 화합물을 위한 주요 조건인 화합물의 결합 친화성을 과도하게 붕괴시키지 말아야 한다..
표 1 및 도 5 및 11B는 α2 I-도메인과 상호작용하는 조절제를 디자인하는 경우 구조적으로 중요한 α2 I-도메인 결합 부위의 아미노산, 주쇄의 원자 및 결정수를 상세히 기재하고 있다.
보딜 모델링 환경(Lehtonen et ai., al. http://www.abo.fi/fak/mnf/bkf/research/iohnson/bodil.html: 2004) 및 시빌(Sybyl) (6.9.1. St. Louis, MO1 USA, Tripos Inc.)을 사용한 도킹 시뮬레이션 실험을 기초로, 하기의 아미노산을 표 1에 나타내었고 여기서, 조절제와 관련된 각각의 아미노산의 거리가 열거되어 있다.
Figure 112008027205154-PCT00001
표 1은 테트라사이클릭 폴리케타이드를 사용한 분자 도킹 실험에 따라 중요한 상호작용을 제공하는 아미노산을 열거하고 있다. MIDAS 아미노산은 도 4 및 도 5에서 백색, 회색 및 검정색에 상응하는 3개의 층으로 나누었다. 층 1은 도킹된 리간드의 4Å 이내의 MIDAS 아미노산을 나타내고 도 4 및 도 5에서 검정색으로 도시된다; 층 2{도 4 및 5에서 회색): 도킹된 리간드로부터 4 내지 8Å의 거리 이내의 MIDAS 아미노산; 및 층 3 (도 4 및 5에서 백색): 도킹된 리간드로부터 8Å 초과 거리의 MIDAS 아미노산. 가장 주요한 결합 부위인 아미노산 측쇄 상호작용은 리간드 구조물(층 1, 도 4 및 도 5에서 검정색)과 직접적으로 상호작용하는 것들이다. 기타 층은 또한 "밀기(pushing)" 및 또한 층 1 아미노산에 영향을 줌에 의해 리간드의 MIDAS로의 결합에 영향을 미칠 수 있다. 결합 부위는 유연하고 따라서 상이한 층내의 아미노산은 결합 리간드에 응답하여 동적으로 이들의 위치 또는 배향을 변화시킬 수 있다. 리간드는 상이한 수용체 형태를 유도할 수 있다. 본 리간드 디자인 전략의 초점은 생물학적으로 중요한 분자(콜라겐)의 MIDAS로의 결합을 조절할 수 있느냐에 집중되어 있다. 따라서, 모든 3개의 층은 새로운 리간드를 디자인하는데 중요하다.
폐쇄된 형태를 안정화시키는 추가의 잠재적인 상호작용
조절제/리간드 및 단백질 주쇄 원자 및 기능성 그룹간의 상호작용은 구조적 디자인 과정을 위해 중요하다. 주쇄 원자는 아미노산 측쇄 원자 보다 덜 이동성이고 따라서 구성적 상호작용과 함께 조절제를 단백질에 부착시키는데 효과적으로 사용될 수 있다. 하기는 신규 소형 분자 콜라겐 결합 조절제의 구조를 디자인하는 경우 사용될 수 있는 주쇄 상호작용 목록을 제공한다. 대부분의 상호작용의 형성은 MIDAS로부터 결정수 분자의 대체를 요구한다. 당해 목록에서, 하기의 정의가 사용된다: -NH-, 주쇄 아미노 그룹을 정의하기 위함, 및 O=, 주쇄 카보닐 그룹을 정의하기 위함. 주쇄 상호작용의 번호매기기에서 본 발명자는 PDB-구조 PDB: 1aox에서 공개된 I-도메인의 폐쇄된 형태로부터의 번호 매기기를 사용하였다.
■ Ser155, -NH-는 조절제에 하나의 수소 결합을 공여할 수 있고 예를 들어, 수소 결합 공여체(1*HBD)이다.
■ Gly218, O=, 하나의 유리된 단독의 쌍은 조절제로부터 수소 결합을 수용하기에 자유롭고 예를 들어, 수소 결합 수용체(1*HBA)이다.
■ Asp219, O=, 1*HBA, 하나의 단독의 쌍은 수소 결합을 수용할 수 있다. Asp219의 제2 단독의 쌍으로의 리간드의 접근은 입체적으로 주요 아미노산 His258의 이미다졸 환에 의해 차단된다.
■ Asp254, O=, 1*HBA, 결정수 제2 위치는 결정수 W701에 의해 차지되고 또한 당해 위치는 파묻히고 조절제가 접근할 수 없다
■ Glu256은 모델링에 따른 조절제 결합을 위한 주요 접촉점중 하나이다.
■ 추가의 정의: Glu256, -NH-, 1*HBD, Glu256 아미노산 측쇄의 배향에서의 변화는 이것을 회전시켜 예를 들어, 조절제 기원의 OH-그룹과 상호작용을 할 수 있게 해준다. 기하학적으로 및 물리적으로 조절제 OH-그룹은 GIu256 -NH-과 동시에 접촉할 수 있다. 결정수는 또한 인접하게 위치하여 Glu256 아미노산 측쇄의 위치 이동을 추가로 안정화시킬 수 있다.
■ Ser257, O=, 2*HBA, 결정수 W650는 상기 기능성 그룹과 가장 인접한 가능한 상호작용이다.
■ Gly260, -NH-, 1*HBD, Ser257의 측쇄 산소와의 약한 상호작용은 파묻힌다
■ Asp292, O=, 임의로 2*HBA, -NH- 1*HBD, 폐쇄된 형태에서 아미노산은 소수성 포켓에 위치하고 W506과 수소 결합한다. 조절제 기원의 적당한 기능성 그룹에 의한 약하게 결합된 물의 대체가 추천된다. 이러한 상호작용은 추가로 결정수로 한정된다.
■ Asn295, -NH-, 1*HBD, 파묻히고 조절제가 근접할 가능성이 적다.
■ Leu296, -NH-, 1*HBD, 파묻히고, 조절제가 근접할 가능성이 적다.
결정수 분자
물 분자를 상응하는 조절제 대체물(예를 들어, -OH)로 대체하는 것은 조절제의 결합을 개선시키기 위한 한가지 선택사항이다. 또한 물 분자는 콜라겐 결합 반응에서 능동적 역할을 한다. 물 분자는 본원에서 상세히 기재된 바와 같이 주요 분자간 상호작용의 매개체로서 작용한다. 결정수의 번호매기기는 PDB-구조 PDB:1aox에서 보고된 I-도메인의 폐쇄된 형태의 번호매기기에 상응한다.
시뮬레이션 실험동안에, 올바른 결정수 분자를 추가로 안정화시키는 조절제는 결정수가, MIDAS가 개방된 형태쪽으로 재구성되는 경우 위치를 변화시키는 아미노산들의 여러 원자와 수소 결합을 형성함으로써 폐쇄된 형태의 안정화를 위한 기능적 역할을 가질 수 있는 것으로 주지된다. α2β1 인테그린 I-도메인 내부의 주요 물 분자의 위치는 도 4에 나타낸다.
아미노산 Glu256는 폐쇄된 형태에서 물 분자 W514와 배위 결합되어 있고 시험된/디자인된 α2 I-도메인 테트라사이클릭 및 설폰아미드 조절제는 이의 OH-그룹을 대체할 수 있다.
금속과 배위 결합된 물은 W699, W701 및 W700이다. 물 W699은 또한 트레오닌 Thr221의 위치를 안정화시킨다. 결합 리간드는 이의 출구를 폐쇄시킴에 의해 간접적으로 당해 물 위치를 안정화시킬 수 있고 따라서 물리적으로 Thr221이 개방된 형태의 금속 배위 결합 위치에 있음을 단언할 수 없다. 당해 분석을 기초로, 나머지 다른 단독 쌍의 물 W699는 폐쇄된 형태에서 불포화되어 있고 조절제로부터의 수소 결합 공여 상호작용을 하는 것으로 보인다.
결합시 많은 조절제에 의해 대체될 가능성이 있는 물 W700은 Ser155의 주쇄 및 금속에 배위 결합되어 있다. Ser155의 주쇄 아미노 그룹은 조절제를 위한 강한 수소 결합을 공여하는데 가능한 부위이다. 물 분자는 I-도메인의 개방 형태에서 콜라겐 모사체 결합 즉시 대체된다. 조절제를 디자인하는 경우, 2개의 방법이 선택될 수 있다: 물은 수소 결합 수용기를 당해 부위에 도입함으로써 조절제의 결합을 개선하기 위해 대체될 수 있거나 물이 폐쇄된 형태의 안정성에 중요한 경우 물은 조절제에 의해 보유될 수 있다.
물 W668은 단지 기타 물 분자에 배위 결합되고 조절제 결합은 정상적으로 물을 MIDAS로부터 대체시킨다.
물 W597은 3개의 부위에 수소 결합된다. 물 W668, 및 주쇄의 Glu256 O=. 추가로, 물은 Thr211로부터 하나의 수소 결합을 수용한다. 당해 물 분자는 명백하게 트레오닌 Thr221의 위치를 안정화시킨다. 조절제 디자인에서 당해 물은 폐쇄된 형태를 안정화시키기 위해 중요하고 따라서 콜라겐 결합과 관련하여 주요 기능을 갖는 것으로 제안된다. 물 W597은 조절제에 수소 결합을 공여하기에 좋은 위치에 있어 이것은 3개의 수소 결합에 의해 이의 위치에 고정될 것이다.
물 W644 및 W506은 Asp 292에 인접해 있다. 이들 물 분자는 수소 결합을 Asp292의 카복실 그룹에 공여한다. 물 W506은 Asp292 주쇄의 산소에 인접한 부근을 제외하고는 기본적으로 소수성인 그루브에 위치한다. 당해 그루브는 또한 상기 언급되어 있고 MIDAS상에서 단백질의 주쇄(아미노산 255 및 256); Leu286 (소수성 측쇄); Asp292 (주쇄의 O= 및 -NH-, C- 베타 탄소); Thr293 (주쇄, 펩타이드 결합의 평판); Lys294 (트레오닌으로의 펩타이드 결합); Asn295 (주쇄 -NH-, c-베타 탄소는 그루브쪽으로 회전할 수 있다); Leu296 (주쇄 -NH-, c 베타 탄소); 및 Glu256 (카복실레이트 그룹은 조절제 쪽으로 회전할 수 있다)에 의해 정의될 수 있다.
잠재적인 I-도메인 결합 조절제의 특성 분석
I-도메인 결합 조절제의 화학적 구조는 상당히 다양할 수 있지만 이들 모두는 결합 부위의 상기된 아미노산, 주쇄의 원자 및 결정수 분자와 함께 형성하는 접촉 지점에서 구조적 및 화학적 유사성을 가져야만 한다.
또한, 특정 에너지 창에서 I-도메인의 구조와 일치할 수 없는 조절제는 I-도메인에 결합할 수 없기 때문에 소형 분자 결합 부위의 일반적 구조를 고려하는 것이 중요하다.
테트라사이클릭 폴리케타이드에 대한 시뮬레이션을 기준으로, I-도메인 표적화 조절제가 차지할 수 있는 일반적 형태 및 용적은 도 5에 제공된다. MIDAS 아미노산은 도 4 및 도 5에서 백색, 회색 및 흑색 층에 상응하는 3개의 층으로 분류되었다. 당해 층들은 도킹된 리간드로부터 아미노산의 거리를 나타낸다(또한 표 1 참조). 가장 중요한 결합 부위 아미노산 측쇄 상호작용은 직접적으로 리간드 구조와 상호작용하는 것들이다(층 1, 도 4 및 5에서 검정색. 다른 층들은 또한 "밀기" 및 층 1 아미노산에 영향을 줌에 의해 MIDAS로의 리간드의 결합에 영향을 줄 수 있다. 결합 부위는 유동성임에 따라서 상이한 층내의 아미노산은 결합 리간드에 응답하여 급격하게 이들의 위치 또는 배향을을 변화시킬 수 있다. 리간드는 상이한 수용체 형태를 유도할 수 있다. 본 리간드 디자인 전략의 초점은 생물학적으로 중요한 분자(콜라겐)의 MIDAS로의 결합을 조절할 수 있는냐에 집중되어 있다. 따라서, 모든 3개의 층은 새로운 리간드를 디자인하는데 중요하다.
도 1에서 리간드 결합 공동의 소수성 측면은 리간드에 의해 파묻히는 것으로 나타난다. 또한, 리간드 위치는 마그네슘 이온, Glu256 (HBD)의 주쇄 아미노 그룹 및 Tyr285의 하이드록실 그룹과의 주요 상호작용에 의해 안정화된다. 이들 상호작용은 수용체를 폐쇄된 형태로 유지시키기 위한 주요 안정화 상호작용이고 따라서 새로운 리간드 발견을 위한 기본 약리작용단을 형성한다.
I-도메인 함유 인테그린 기능을 조절할 수 있는 가능한 화합물은 인테그린 I-도메인 MIDAS의 3차원 배위를 기준으로 하는 약리작용단 모델과 조합된 가상의 스크리닝 기술을 사용하여 동정되었다. 약리작용단 모델은 조절제 결합을 위해 상기된 바와 같은 주요 상호작용 부위를 포함하였다.
상기된 세밀한 컴퓨터 보조 분자를 기준으로, 본 발명은 MIDAS를 함유하는 α2 I-도메인 표면의 협곡에 맞는 분자를 제공한다. 보다 구체적으로, 이것은 Mg와 상호작용하여 우수한 친화성으로 결합하고 콜라겐 결합을 차단하는 인 실리코 디자인되고 습윤 랩 시험된 화합물을 제공한다.
능히 MIDAS와 상호작용하는 적합한 산소 원자를 함유하는 평평한 테트라사이클릭 화합물인 스트렙토마이세스 유래된 방향족 폴리케타이드는 스크리닝을 위해 적합한 라이브러리로서 선택되었다. 제2 환에서 협곡 및 산소에 맞게 모델링된 화합물은 MIDAS에서 Mg 이온과 상호작용하는 것으로 추정되었다(도 6). 고형상 α2 I-도메인 결합 분석에서 화합물의 스크리닝은 시험된 추측을 확인시켜주었다. 모든 4개의 α I-도메인에 의한 콜라겐 I 결합이 당해 화합물에 의해 차단된다는 사실은 이들이 공통 결합 기작을 갖는다는 것을 시사하였다.
인 실리코 모델을 추가로 사용하여 신규 콜라겐 수용체 조절제를 동정하였다. 설폰아미드 유도체는 본 발명에 따른 인 실리코 방법을 사용하여 동정되고 상기 기준을 충족시키는 화합물의 예이다. 당해 화합물은 본원에 기재된 분석을 사용하여 콜라겐 수용체 조절제인 것으로 추가로 입증되었다.
본 발명의 방법에 의해 동정된 설폰아미드 유도체는 화학식 I로 나타낼 수 있다
Figure 112008027205154-PCT00002
상기식에서,
Rc는 디알킬아미노, NO2, CN, 아미노카보닐, 모노알킬아미노카보닐, 디알킬아미노카보닐, 알카노일, 옥사졸-2-일, 옥사졸릴아미노카보닐, 아릴, 아로일, 아릴-CH(OH)-, 아릴아미노카보닐, 푸라닐(여기서 아릴, 아로일 및 푸라닐 잔기는 치환될 수 있다), 구아니디닐-(CH2)z-N(R')-, Het-(CH2)Z-N(R')-, Het-CO-N(R')-, Het-CH(OH)- 및 Het- CO-로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 이때, Het는 N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 함유하는 임의로 치환된 4 내지 6원 헤테로사이클릭 환이고, R'는 수소 또는 알킬이고 z는 1 내지 5의 정수이고;
RA는 하기 화학식 A, B, C 또는 D의 그룹이고;
Figure 112008027205154-PCT00003
Figure 112008027205154-PCT00004
Figure 112008027205154-PCT00005
Figure 112008027205154-PCT00006
여기서,
R3 및 R4는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 아릴, 알콕시, 카복시, 하이드록시, 알콕시알킬, 알콕시카보닐, 시아노, 트리플루오로메틸, 알카노일, 알카노일아미노, 트리플루오로메톡시 또는 임의로 치환된 아릴 그룹이고;
RB는 수소, 알킬, 알카노일, 하이드록시알킬, 알콕시알킬, 알콕시카보닐, 알콕시카보닐알킬, 아미노알킬, 모노- 또는 디알킬아미노알킬 또는 Het-알킬이고, 이때, Het는 상기정의된 바와 같고, 단,
(i) Rc가 디알킬아미노인 경우, RB는 수소 또는 알킬이 아니고;
(ii) RA가 화학식 C의 그룹이고 R3이 수소이고 R4가 메톡시인 경우, Rc는 Het-CO-N(R )-이 아니고;
(iii) RA가 화학식 C의 그룹이고 R3 및 R4가 수소 또는 할로겐인 경우, Rc는 니트로가 아니다.
본 발명의 전형적인 설폰아미드는 표 2에 나타낸다.
Figure 112008027205154-PCT00007
Figure 112008027205154-PCT00008
Figure 112008027205154-PCT00009
Figure 112008027205154-PCT00010
Figure 112008027205154-PCT00011
바람직한 화합물의 특정 예는 다음과 같다: 4'-플루오로-바이페닐-3-설폰산 (4-벤조일-페닐)-아미드, 4'-플루오로-바이페닐-3-설폰산 (3-벤조일-페닐)-아미드, 4'-플루오로-바이페닐-3-설폰산(α-하이드록시벤질-페닐)-아미드, 2-옥소-이미다졸리딘-1-카복실산{4-[(4'-플루오로-바이페닐-3-설포닐)-메틸-아미노]-페닐}-아미드.
따라서, 본 발명은 세밀한 인 실리코 모델에서 기재된 바와 같이 MIDAS 아미노산 잔기에 의해 요구되는 주요 상호작용을 충족시키는 신규한 인테그린-억제제를 제공한다. 바람직한 인테그린 억제제는 표 2에 열거된 설폰아미드 유도체 및 표 3에 열거된 테트라사이클릭 폴리케타이드이다.
본 발명은 혈전증, 암, 섬유증 및 염증과 관련된 질환의 치료용 약제의 제조를 위한 당해 인테그린 조절제의 용도를 제공한다.
본 발명의 화합물은 강력한 콜라겐 수용체 조절제이고 생체내 또는 시험관내에서 콜라겐상의 세포의 접착 및 콜라겐을 통한 세포의 이동 및 침투를 억제하거나 차단하는데 유용하다. 현재 기재된 화합물은 악성 세포의 이동을 억제하고 따라서 전립선 암, 위암, 췌장암 및 난소암 및 흑색종을 포함하는, 특히, α2β1 인테그린 의존성 세포 접착/침투/이동이 악성 기작, 암 침투 및 전이 또는 혈관 형성에 기여할 수 있는 암과 같은 질환을 치료하는데 유용하다.
본 발명의 화합물은 또한 혈소판의 콜라겐으로의 접착을 억제하고 콜라겐 유도된 혈소판 응집을 억제한다. 따라서, 본 발명의 화합물은 혈전색전증, 즉 혈소판의 콜라겐으로의 접착 및 콜라겐 유도된 혈소판 응집을 차단할 필요성을 특징으로 하는 질환의 예방적 또는 완화적 치료, 예를 들어, 뇌졸중, 심근경색, 불안정 협심증, 당뇨망막증 또는 망막 정맥 폐색증의 치료 및 예방을 필요로 하는 환자를 치료하는데 유용하다. 본 발명의 화합물은 추가로 염증, 섬유증 및 골절과 같은 염증 과정을 특징으로 하는 장애를 앓는 환자를 치료하기 위한 약물로서 유용하다.
결론적으로, 본 발명은 α I-도메인에서 MIDAS로 표적화된 콜라겐 수용체 인테그린 억제제를 디자인하기 위한 성공적인 전략을 제공한다. 방향족 폴리케타이드 및 설폰아미드는 콜라겐 수용체 α I-도메인의 잠재적인 차단제로서의 요건을 충족하고 이들은 또한 콜라겐으로의 세포 접착을 차단하지만 세밀한 인 실리코 모델에 의해 정의되는 요건을 충족시키는 기타 화합물도 본 발명에 따른 화합물로서 간주된다.
하기의 실시예는 본 발명을 설명하기 위해 제공되지만 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1
테트라사이클린 생합성
특정 라이브러리의 테라사이클린 화합물은 돌연변이 스트렙토마이세스(Streptomyces) 균주에 의해 생성되었다. 발효는 30℃에서 6일동안 E1 배지에서 5리터 배치, 280rpm의 진탕 및 5ℓ/h의 통기하에 수행하였다.
대사물은 메탄올 추출에 의한 세포 분획으로부터 수거하였고 이후, 화합물을 디클로로메탄으로 추출하고 분석하고 증발시켰다.
당해 화합물의 예비 정제는 2개의 크로마토그래피 처리에 이어서 침전에 의해 수행하였다. 정제는 박층 크로마토그래피(TLC)로 모니터하였다. 제1 크로마토그래피 분리는 클로로포름:메탄올:아세트산중에서 실리카 함유 칼럼에서 수행하였다. 2% 메탄올을 사용하여 분획물을 용출시켰다. 배합된 분획물을 톨루엔:MeOH:HCOOH로 용출시키는 실리카 칼럼에서 추가로 정제하였다.
수거된 분획물을 배합하고 소량의 클로로포름으로 희석시키고 헥산으로 침전시켰다. 테트라사이클릭 화합물을 헥산 상에서 농축시켰다. 헥산을 증발시키고 당해 분획물을 추가의 정제에서 출발 물질로서 사용하였다.
예비 정제로부터 수득한 분획물을, 클로로포름중의 40% 헥산으로 용출시키는 옥살레이트 처리된 실리카 칼럼으로 추가로 정제하였다. 테트라사이클릭 화합물을 함유하는 분획물을 아세토니트릴:물:포름산을 사용하는 정제용 C18 HPLC 칼럼에서 추가로 정제하였다. 순수한 분획물을 배합하고 클로로포름중에 용해시키고 증발시켰다.
수득되고 추가로 시험된 화합물은 메틸 2-에틸-2,5,7,12-테트라하이드록시-4,6,11-트리옥소-1,2,3-트리하이드로나프타센-카복실레이트(L3007), 메틸 2-에틸-4,5,7,12-테트라하이드록시-6,11-디옥소나프타센카복실레이트(L3008), 메틸 4,5,7,12-테트라하이드록시-2-(메틸에틸)-6,11-디옥소나프타센카복실레이트(L3009) 및 메틸 2-에틸-4,5,7-트리하이드록시-6,11 디옥소나프타센카복실레이트(L3015)이었다. 화합물의 구조는 표 3에 나타낸다.
Figure 112008027205154-PCT00012
실시예 2
사람 재조합 인테그린 I-도메인
사람 인테그린 αI-도메인의 클로닝
α1I 및 α2 I-도메인을 암호화하는 cDNA는 주형으로서 사람 인테그린 α1 및 α2 cDNA을 사용하는 초기 기재된 바와 같은 PCR로 제조하였다. 벡터 pGEX-4T-3 및 pGEX-2T(Pharmacia)를 사용하여 각각 사람 α1I 및 α2 I-도메인의 재조합 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST) 융합 단백질 제조하였다. α10 I-도메인 cDNA는 KHOS-240 세포로부터 분리된 RNA로부터 RT-PCR에 의해 제조하였다(Human Caucasian osteosarcoma). 총 세포 RNA는 RNeasy 소형 키트(Qiagen)를 사용하여 분리하였다. 유전자 Amp PCR 키트(Perkin Elmer)를 사용하여 RT-PCR을 수행하였다. 클로닝을 위한 세부 사항은 초기에 기재하였다(TuIIa et al., 2001). 증폭된 α10 I-도메인 cDNA를 BamHI 및 EcoRI 제한 효소(Promega)를 사용하여 pGEX-2T 발현 벡터(Am ersham Pharmacia Biotech)와 함께 분해하였다. pGEX-2T 벡터에 α10 cDNA를 SureClone 연결 키트(Amersham Pharmacia Biotech)를 사용하여 연결시켰다. 작제물로 생산용 이. 콜리 BL21 균주를 형질전환시켰다. 작제물의 DNA 서열은 DNA 서열분석으로 조사하였고 공개된 α10 DNA 서열과 비교하였다(Camper et al., 1998). α11 I-도메인이 PCR에 의해 제조되는 경우 사람 인테그린 α11 cDNA를 주형으로서 사용하였다.
α I-도메인의 발현 및 정제
컴피턴트 이. 콜리 BL21 세포를 단백질 생산을 위한 플라스미드로 형질전환시켰다. 100 μg/ml 앰피실린을 함유하는 500 ml의 LB 배지 (Biokar)에 야생형 또는 돌연변이 BL21/pal의 50ml의 하룻밤 배양물을 접종하고 현탁물의 O.D.600이 0.6 내지 1.0에 도달할때까지 37℃에서 배양하였다. 세포를 IPTG로 유도하고 전형적으로 4 내지 6시간동안 실온에서 배양시킨 후 원심분리로 수거하였다. 펠렛화된 세포를 PBS (pH 7.4)중에 재현탁시킴에 이어서 초음파 처리로 용해시킴에 이어서 최종 농도가 2%가 될 때까지 트리톤 X-100을 첨가하였다. 빙상에서 30분동안 항온처리 한 후, 재현탁물을 원심분리하고 상등액을 모았다. 글루타티온 세파로스® 4B (Amersham Pharmacia Biotech)를 약한 진탕과 함께 30분동안 실온에서 항온처리된 용해물에 첨가하였다. 이어서 용해물을 원심분리하고 상등액을 제거하고 융합 단백질이 결합된 글루타티온 세파로스® 4B를 1회용 크로마토그래피 칼럼(Bio-Rad)로 전달하였다. 칼럼을 PBS로 세척하고 융합 단백질을 30mM의 환원된 글루타티온으로 용출시켰다.
정제된 재조합 및 글루타티온 태그된 α I-도메인을 SDS 및 본래의 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)으로 분석하였다. 단백질 농도는 브래드포드의 방법으로 측정하였다(Bradford, 1976). 제조된 재조합 α1 I-도메인의 길이는 227개의 아미노산이고 전체 α1 인테그린의 123번 내지 223번의 아미노산에 상응하였다. α1 I 및 α2 I-도메인의 카복실 말단은 각각 10개 및 6개의 비-인테그린 아미노산을 함유하였다(Kapyla et al., 2000, TuIIa et al., 2001 ). 제조된 재조합 α10 I-도메인의 길이는 197개의 아미노산이고 전체 α10 인테그린의 141번 내지 337번의 아미노산에 상응하였다. 아미노 말단은 2개의 비-인테그린 잔기를 함유하였고 α10 I의 카복실 말단은 6개의 비-인테그린 아미노산을 함유하였다(TuIIa et al., 2001). 재조합 α11 I-도메인은 총 204개의 아미노산을 함유한다: 아미노 말단에는 α11 I, 잔기 159-354 앞에 2개의 여분의 잔기가 존재하고 카복실 말단에는 6개의 여분의 아미노산이 존재한다. 재조합 α11 I-도메인은 발현 및 정제동안에 내인성 프로테아제 활성으로 인해 불순물로서 몇몇 GST를 함유한다(Zhang et al., 2003). 재조합 αI-도메인은 콜라겐 결합 실험을 위해 GST-융합 단백질로서 사용하였다.
부위 지시된 돌연변이 유발
pGEX-2T 또는 pGEX-4T-3 벡터에서 α I-도메인 cDNA의 부위 지시된 돌연변이는 스트라타진의 퀵체인지 돌연변이 유발 키트 (Stratagene's QuickChange Mutagenesis Kit) 지침서에 따라 PCR을 사용하여 제조하였다. 돌연변이의 존재는 DNA 서열분석으로 조사하였다. 이어서 돌연변이 작제물로 재조합 단백질 생산용 이. 콜리 균주 BL21을 형질전환시켰다(Kapyla et al., 2000; TuIIa et al., 2001).
실시예 3
α2 I-도메인 돌연변이의 제조
α2 I-도메인에서 부위 특이적 돌연변이는 제조업자의 지침에 따라 스트라타진 퀵체인지 돌연변이 유발 키트를 사용하여 제조하였다. 2개의 DNA-쇄에 대해 목적하는 돌연변이를 갖는 PCR 프라이머를 디자인하였다. 68℃에서 α2 I-도메인 서열을 함유하는 1 카피의 전체 GEX-2T 벡터(Amersham Pharmacia Biotech)를 제조하는 Pfu 폴리머라제(Stratagene)를 사용하는 PCR을 수행하였다. PCR 생성물은 단지 메틸화된 DNA만을 절단하는 DpnI로 분해시켰다. 이후, 목적하는 돌연변이를 갖는 PCR 생성물 DNA 쇄의 쌍을 형성시켰다.
실시예 4
알파- I-도메인 결합 분석
α I-도메인에 대한 고형상 결합 분석
96-웰의 높은 결합 미세역가 플레이트(Nunc)의 피복은 5 μg/cm2 (15 μg/ml)의 콜라겐 또는 20 μg/ml의 삼중 나선 펩타이드를 함유하는 PBS 0.1ml에 +4℃에서 밤새 노출시킴에 의해 수행하였다. 블랭크 세포는 1:1 의 0.1 ml Delfia® 희석제 II (Wallac) 및 PBS의 용액으로 피복하였다. 모든 웰상의 잔여 단백질 흡수 부위는 1:1의 0.1 ml의 Delfia® 희석제 II (Wallac) 및 PBS 용액으로 차단하였다. 재조합 단백질(αI-GST)을 Delfia® 분석 완충액중에서 목적하는 농도로 피복된 웰에 첨가하고 실온에서 1시간동안 항온처리하였다. 유로품 표지된 항-GST 항체(Wallac)를 이어서 첨가하고(전형적으로 1:1000) 당해 혼합물을 실온에서 1시간동안 항온처리하였다. 상기 언급된 모든 항온처리는 2 mM MgCl2의 존재하에 수행하였다. Delfia® 증진 용액(Wallac)은 각각의 웰에 첨가하고 유로퓸 시그날을 시간 분리된 형광측정기 (빅터(Victor)2 다중표지 계수기, Wallac)로 측정하였다. 3개 이상의 병행 웰을 분석하였다. 몇몇 경우에 변형된 고형상 분석을 사용하였고 문헌[TuIIa et al, 2001]에 따라 수행하였다. 유로퓸 표지된 항-GST 항체 대신에 항-GST 및 유로퓸 표지된 단백질 G를 사용한다.
실시예 5
세포 접착 분석
야생형 α2 인테그린을 발현하는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포를 세포 접착 분석에 사용하였다. 세포를 0.1 mg/ml 의 사이클로헥스이미드(Sigma)를 함유하는 무혈청 배지에 현탁시키고 화합물을 웰에 전달하기 전에 세포와 예비 항온처리하였다. 세포(150000/웰)를 +37℃에서 2시간동안 콜라겐 I형 피복된 웰(억제제 화합물의 존재 및 부재)상에 부착시키고 이후, 비접착 세포를 제거하였다. 새로운 무혈청 배지를 첨가하고 생존 세포를 제조업자의 프로토콜에 따라 세포 생존 키트를 사용하여 검출하였다.
실시예 6
분자 모델링
발견된 테트라사이클릭 폴리케타이드 및 설폰아미드 α2 인테그린 I-도메인 조절제에 대한 결합 양상은 본 연구전에 공지되어 있지 않았다. 본 발명자는 실험 증거와 조합된 표준 및 독점 분자 모델링 도구를 사용하여 α2 인테그린 리간드 결합(MIDAS) 부위와 복합체화된 테트라사이클릭 폴리케타이드 및 설폰아미드의 생활성 형태를 동정하였다. MIDAS의 구조는 BODIL를 사용하여 모델링하였다. 모델링된 MIDAS 구조를 사용하여 구조적으로 및 화학적으로 다양한 조절제를 중첩시켰다. 모델링 시뮬레이션에서, 본 발명자는 MIDAS의 화학적 및 구조적 특징을 고려하면서 조절제의 형태적 공간을 연구하였다. 당해 과정은 각 리간드의 구조에 대해 바람직한 결합 형태를 제공하였다. 이어서 당해 정보를 사용하여 α2 인테그린 MIDAS를 통한 콜라겐 결합을 조절하는 소형 분자로부터 요구되는 상호작용에 대한 구조적 법칙을 유도하였다.
분자 모델링에서 시발점으로서 사용되는 I-도메인의 개방된 형태(PDB ID: 1dzi) 및 폐쇄된 형태 (PDB ID: 1aox)의 결정 구조는 기관[Protein Data Bank]으로부터 입수하였다. 아미노산 측쇄 형태는 BODIL 소프트웨어에서 변화시켜 BODIL 로타머 라이브러리를 사용함으로써 총체적 단백질 형태를 제조하였다. MIDAS내에 배위 결합된 주요 구조적 물은 도킹 시뮬레이션에서 결정 구조의 일부로서 포함되었다. 단백질 구조 및 물 분자의 모든 수소는 시빌(Sybyl) 6.9.1 (회전)을 사용하여 첨가하였다. 시빌 6.9.1에서 컴포트/컨코드를 사용하여 생성된 비압박 리간드 형태를 도킹시키는, 시빌 6.9.1.에서 FlexX 및 BODIL에서 자동화 회전-해독 과정을 사용하여 도킹시켰다. FlexX 스코어링에 추가로, 각각의 도킹된 리간드 구조에 대해 결합의 유리된 에너지를 X스코어로 평가하였다(Wang et al., 2002).
실시예 7
인 실리코에서 동정된 화합물에 의한 콜라겐 결합의 억제
실시예 1에서 합성된 테트라사이클린 스트렙토마이세스 화합물은 실시예 4에 기재된 α I-도메인 분석을 사용하여 α1 및 α2 I-도메인으로의 콜라겐 결합 억제에 대해 스크리닝하였다. 테트라사이클릭 폴리케타이드, L3015은 I형 콜라겐에 결합하는 α2 I-도메인의 비교적 강력한 억제제이다. 이것은 I형 콜라겐에 결합하는 α 2 I-도메인의 용량 의존적 억제를 보여주었다(0.03 mM 농도에서 약 50% 억제; 도 6A). L3015은 α1 및 α2 I-도메인 둘다의 I형 및 IV형 콜라겐으로의 결합을 억제할 수 있다(도 6B).
RKK-펩타이드는 α2 I- 도메인의 MIDAS에 결합하는 것으로 공지되어 있다(Ivaska et al., 1999). L3015의 존재하에 RKK-펩타이드에 결합하는 인테그린 α2 I-도메인은 실시예 4에 기재된 유로퓸 표지된 단백질 G 분석에서 시험하였다. 당해 결과는 L3015이 MIDAS에서 RKK 펩타이드를 이탈시킬 수 있음을 보여준다(도 7B).
추가로 로바스타틴의 존재하에 콜라겐 I에 결합하는 α1I 및 α2 I-도메인은 실시예 4에 기재된 유로퓸 표지된 항-GST 분석에서 시험하였다. 로바스타틴은 백혈구 인테그린 αI-도메인(예를 들어, αL I-도메인)의 알로스테릭 억제제이고 로바스타틴의 결합 부위는 가능한 조절제에 대한 선택적 결합 부위를 나타낸다. 그러나, 로바스타틴은 I형 콜라겐으로의 αI-도메인 결합에 대해 어떠한 효과를 갖지 않는 것으로 나타났다(도 7A). 이들 생물학적 시험은 추가로 콜라겐 수용체 αI-도메인이 테트라사이클릭 폴리케타이드에 의한 MIDAS 표면의 직접적인 차단으로 억제된다는 추가의 증거를 제시했다.
3D 모델의 사용을 기초로, 폴리케타이드 계열 기원의 기타 화합물들을 시험하였다. 당해 화합물은 실시예 4에 기재된 유로퓸 표지된 항-GST 분석으로 시험하였다. 테트라사이클릭 폴리케타이드 L3007, L3008 및 L3009는 I형 콜라겐으로의 α2 I-도메인의 결합을 억제할 수 있었다(도 8A). 가장 활성 구조중 하나인 L3009의 용량 의존적 억제 효과는 도 8B에 나타낸다.
L3009의 억제 효과는 실시예 4에 기재된 바와 같은 모든 콜라겐 결합 인테그린 α I-도메인인 α1I, α2I, α10I 및 α11I과 함께 시험하였다. L3009는 0.05mM 농도에서 모든 4개의 αI-도메인의 콜라겐 I 결합을 억제할 수 있었다(도 9).
가장 강력한 화합물인 L3009은 실시예 5에 기재된 기능성 세포 접착 분석에서 추가로 시험하여 세포 표면상에서의 인테그린 이종이량체의 기능을 연구하였다. 이러한 목적을 위해 CHO 세포를 형질감염시켜 이들의 표면상에 이들의 유일한 콜라겐 수용체로서 α2β1 인테그린을 발현시켰다.
L3009는 EC50값이 약 20 μM인 I형 콜라겐에 대한 세포 접착의 강력한 억제제였다(도 10A).
인 실리코 모델을 사용하여 신규한 콜라겐 수용체 조절제를 동정하였다. 설폰아미드 유도체인 화합물 434 및 화합물 161은 당해 방법으로 동정되는 신규 분자의 예이다. 화합물 434는 실시예 5에 기재된 기능성 세포 접착 시험에서 시험하였다. 도 10B 및 표 4는 화합물 434가 콜라겐 I형에 대한 세포 접착의 강력한 억제제임을 보여준다.
Figure 112008027205154-PCT00013
실시예 8
인테그린 α2 I-도메인 돌연변이
조절제 결합에서 α2β1 인테그린 α2 I-도메인 아미노산의 역할을 확인하기 위해, 부위 지시된 돌연변이 유발 방법을 사용하였다. 선택된 아미노산 돌연변이는 실시예 3에 기재된 바와 같이 제조하였다. α2 I-도메인 영역내의 단일 아미노산을 돌연변이시키고 접착 실험에서 돌연변이된 α2β1 인테그린을 발현하는 CHO를 사용하여 시험하였다; 야생형 α2β1 발현하는 세포를 대조군으로서 사용하였다. 세포 접착 실험은 실시예 5에 기재된 바와 같이 수행하였다. 연구 결과는 α2 I-도메인의 3개의 아미노산이 L3008의 억제 기능을 위해 중요함을 밝혔다: 타이로신 285, 류신 286 및 류신 296. 이들 아미노산의 돌연변이는 α2β1을 발현하는 CHO 세포의 콜라겐 I로의 접착에서 테트라사이클릭 폴리케타이드 L3008, 설폰아미드 화합물 161 및 설폰아미드 화합물 434의 억제 효과를 상당히 감소시켰다(데이타는 나타내지 않음).
실시예 9
시험관내에서 억제제의 항암 잠재력을 입증하기 위한 세포 침투 분석
세포외 매트릭스 기저막과 상호작용하는 능력은 악성 암 세포 표현형 및 암 전이에 있어서 필수적이다. α2β1 수준은 종양 세포에서 상향조절되는 것으로 공지되어 있다. 과발현은 세포 접착 및 이동 및 세포외 매트릭스를 통한 침투를 조절한다. 콜라겐 및 α2β1과 같은 세포외 매트릭스 성분간의 상호작용을 차단함에 의해, 시험관내 암세포 이동 및 침투를 차단할 수 있다. 내생적으로 α2β1을 발현하는 전립선 암 세포(PC-3)를 사용하여 본 발명의 조절제의 시험관내 항암 잠재력을 시험하였다.
실험 과정. 매트리겔을 통한 PC-3 세포(CRL-1435, ATCC)의 침투는 BD 생피복물 침투 삽입체(BD Biosciences)를 사용하여 연구하였다. 삽입체는 -20℃에서 저장하였다. 실험 전에 삽입체를 실온으로 조정되게 방치하였다. 500 μl의 무혈청 배지(햄스 F12K 배지, 2 mM L-글루타민, 1.5 g/l의 중탄산나트륨)를 삽입체에 첨가하고 2시간동안 세포 배양기에서 37℃에서 재수화시켰다. 잔류 배지를 흡인 제거하였다. PC-3 세포를 탈착시키고 펠렛화하고 무혈청 배지에 현탁시켰다(50 000 세포 / 500 μl). 300 μl의 세포 현탁액을 본 발명에 따른 억제제의 부재(대조군) 또는 존재하에 삽입체에 첨가하였다. 삽입체를 24-웰 플레이트상에 놓았다; 각각의 웰은 화학 유인제로서 3%의 태아 소 혈청을 갖는 700 μl의 세포 배양 배지를 함유한다. 세포를 세포 배양기에서 37℃에서 72시간동안 침투하도록 방치하였다. 삽입체를 700 μl의 PBS로 세척하고 10분동안 4% 파라포름알데하이드로 고정화시켰다. 파라포름알데하이드를 흡인제거하고 세포를 700 μl의 PBS로 세척하고 삽입체를 1분동안 헤마톡실린으로 항온처리하여 염색시켰다. 삽입물을 700 μl의 PBS로 세척하여 염색을 제거하였다. 삽입체가 건조되도록 방치시켰다. 고정된 침투 세포를 현미경하에 계산하였다. 침투 %는 대조군과 비교하여 계산하였다.
당해 세포 침투 분석은 시험관내 암 전이 모델로서 사용하였다. 설폰아미드 분자는 시험관내 종양 세포 침투를 억제하는 것으로 나타났다(표 4). 몇몇 구조물은 서브마이크로 몰 농도에서도 침투를 억제한다.
실시예 10
α2β1 조절제의 혈전 억제 잠재력을 입증하기 위한 혈소판 기능 분석기 PFA-100의 사용
혈소판 기능 분석기 PFA-100을 사용하여 α2β1 조절제의 가능한 혈전 억제 효과를 입증한다. PFA-100는 소혈관 손상후 1차 항상성을 자극하는 고 전단 유도 장치이다. 당해 시스템은 콜라겐 + 에피네프린으로 피복된 생물학적 활성 막을 함유하는 시험-카트릿지를 포함한다. 응고 억제된 전혈 샘플을 일정한 진공하에 모세관을 통과하도록 하였다. 막상의 혈소판 효능제(에피네프린) 및 고전단 율은 혈소판을 활성화시켜 안정한 혈소판 플러그로 구멍을 폐쇄시킨다. 구멍을 완전히 폐쇄시키는데 요구되는 시간은 "폐쇄 시간"으로서 지정하였다. 각각의 화합물을 전혈 샘플에 첨가하고 폐쇄 시간을 PFA-100으로 측정하였다. 대조군 샘플과 비교하여 폐쇄 시간이 증가되는 경우 당해 화합물은 혈전 억제 활성을 갖는 것으로 제안되었다.
실험 과정. 혈액을 혈관 천공을 통해 항응고제로서 3.2% 완충 나트륨 시트레이트를 함유하는 진공 혈액 수거 튜브로 공여체로부터 수거하였다. 혈액을 15ml 들이 튜브에 적가하고 억제 화합물 또는 대조군(DMSO)로 처리하였다. 샘플을 10분동안 회전시키면서 실온에서 유지시키고 이 후 혈액의 폐쇄 시간을 측정하였다.
장치의 측정 범위를 초과하는 폐쇄 시간(300초 초과)은 300초의 값으로 할당하였다. 평균 및 표준 오차는 각각의 처리를 위해 계산하였다. 스튜던트 t-시험을 수득한 데이터에 적용하였다.
화합물 434는 혈액의 폐쇄 시간을 증가시키는 것으로 나타났다(도 12).

Claims (25)

  1. Asp151 , Ser153, Ser155, Thr221, Asp254, Tyr285, Leu286 및 Leu296의 아미노산 배위를 특징으로 하는, α2β1 인테그린 I-도메인의 MIDAS의 세밀한 인 실리코(in silico) 모델.
  2. 제1항에 있어서, Asn154, Gly218, Asp219, Gly255, Glu256, Asn289, Leu291 및 Asp292의 아미노산 배위를 특징으로 하는 모델.
  3. 제2항에 있어서, 표 1에 나타낸 아미노산 배위를 특징으로 하는 모델.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, W514, W699, W701 , W700, W668, W597, W644 및 W506의 주요 물 분자를 특징으로 하는 모델.
  5. (a) 3차원 분자 모델링에 대한 알고리듬을 α2β1 I-도메인-함유 인테그린의 원자 배위에 적용하여 당해 인테그린의 금속 이온 의존성 접착 부위(MIDAS)의 공간적 배위를 결정하는 단계 및
    (b) 단계 (a)에서 결정된 당해 공간적 배위에 대응하는 후보 화합물 세트의 저장된 공간적 배위를 인 실리코 스크리닝하여 당해 인테그린의 MIDAS에 결합할 수 있는 화합물을 동정하는 단계
    를 포함하는, α2β1 인테그린을 조절하는 화합물을 동정하는 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    (c) 모델에 사용되는 아미노산 잔기를 함유하는, 인테그린 α2 I-도메인의 단편을 제공하는 단계;
    (d) 당해 단편을 후보 조절제와 접촉시키는 단계 및
    (e) 당해 잠재적인 억제제와 결합하는 펩타이드 단편의 능력을 결정하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 화합물이 인테그린 억제제인 방법.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 동정되거나 수득되는 α2β1 I-도메인-함유 인테그린 조절 화합물.
  9. 제8항에 있어서, 화학식 I의 화합물.
    화학식 I
    Figure 112008027205154-PCT00014
    상기식에서,
    Rc는 디알킬아미노, NO2, CN, 아미노카보닐, 모노알킬아미노카보닐, 디알킬아미노카보닐, 알카노일, 옥사졸-2-일, 옥사졸릴아미노카보닐, 아릴, 아로일, 아릴-CH(OH)-, 아릴아미노카보닐, 푸라닐(여기서 아릴, 아로일 및 푸라닐 잔기는 치환될 수 있다), 구아니디닐-(CH2)z-N(R')-, Het-(CH2)Z-N(R')-, Het-CO-N(R')-, Het-CH(OH)- 및 Het-CO-로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 이때, Het는 N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 함유하는 임의로 치환된 4 내지 6원 헤테로사이클릭 환이고, R'는 수소 또는 알킬이고 z는 1 내지 5의 정수이고;
    RA는 하기 화학식 A, B, C 또는 D의 그룹이고;
    화학식 A
    Figure 112008027205154-PCT00015
    화학식 B
    Figure 112008027205154-PCT00016
    화학식 C
    Figure 112008027205154-PCT00017
    화학식 D
    Figure 112008027205154-PCT00018
    여기서,
    R3 및 R4는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 아릴, 알콕시, 카복시, 하이드록시, 알콕시알킬, 알콕시카보닐, 시아노, 트리플루오로메틸, 알카노일, 알카노일아미노, 트리플루오로메톡시 또는 임의로 치환된 아릴 그룹이고;
    RB는 수소, 알킬, 알카노일, 하이드록시알킬, 알콕시알킬, 알콕시카보닐, 알콕시카보닐알킬, 아미노알킬, 모노- 또는 디알킬아미노알킬 또는 Het-알킬이고, 이때, Het는 상기 정의된 바와 같고, 단,
    (iv) Rc가 디알킬아미노인 경우, RB는 수소 또는 알킬이 아니고;
    (v) RA가 화학식 C의 그룹이고 R3이 수소이고 R4가 메톡시인 경우, Rc는 Het-CO-N(R )-이 아니고;
    (vi) RA가 화학식 C의 그룹이고 R3 및 R4가 수소 또는 할로겐인 경우, Rc는 니트로가 아니다.
  10. 제7항에 있어서, 인테그린 억제제인 화합물.
  11. 제8항에 있어서, 4'-플루오로-바이페닐-3-설폰산(4-벤조일-페닐)-아미드인 화합물.
  12. 제8항에 있어서, 4'-플루오로-바이페닐-3-설폰산(3-벤조일-페닐)-아미드인 화합물.
  13. 제8항에 있어서, 4'-플루오로-바이페닐-3-설폰산(α-하이드록시벤질-페닐)-아미드인 화합물.
  14. 제8항에 있어서, 2 옥소 이미다졸리딘 1 카복실산{4-[(4'-플루오로-바이페닐-3-설포닐)-메틸-아미노]-페닐}-아미드인 화합물.
  15. 제8항에 있어서, 테트라사이클릭 폴리케타이드인 화합물.
  16. 제14항에 있어서, 메틸 2-에틸-2,5,7,12-테트라하이드록시-4,6,11-트리옥소-1,2,3-트리하이드로-나프타센-카복실레이트의 화학식을 갖는 화합물.
  17. 제14항에 있어서, 메틸 2-에틸-4,5,7,12-테트라하이드록시-6,11-디옥소나프타센카복실레이트의 화학식을 갖는 화합물.
  18. 제14항에 있어서, 메틸 4,5,7,12-테트라하이드록시-2-(메틸에틸)-6,11 -디옥소나프타센카복실레이트의 화학식을 갖는 화합물.
  19. 제14항에 있어서, 메틸 2-에틸-4,5,7-트리하이드록시-6,11-디옥소나프타센카복실레이트의 화학식을 갖는 화합물.
  20. 혈전증, 혈관 질환, 암, 섬유증 및 염증 치료용 약제학적 조성물을 제조하기 위한 제8항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 용도.
  21. 제19항에 있어서, 전립선암, 위암, 췌장암 또는 난소암, 또는 흑색종 치료용 및 암 혈관형성 예방용 약제학적 조성물을 제조하기 위한 용도.
  22. 제10항에 있어서, 전이의 예방 또는 치료용 악제학적 조성물을 제조하기 위한 용도.
  23. 제19항에 있어서, 뇌졸중, 심근경색, 당뇨 망막증 또는 망막 정맥 폐색증 치료용 약제학적 조성물을 제조하기 위한 용도.
  24. 제19항에 있어서, 섬유증 및 골절과 연관된 염증 질환 치료용 약제학적 조성물을 제조하기 위한 용도.
  25. 유효량의 제8항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 혈전증, 암, 섬유증 또는 염증의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여함에 의해, 혈전증, 암, 섬유증 또는 염증을 치료하는 방법.
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