CN101297974B - 聚乙二醇化淫羊藿苷、制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种中草药有效成分—淫羊藿苷的聚乙二醇化制备方法及其应用。本发明所述的聚乙二醇化淫羊藿苷化合物，以淫羊藿苷为母体，针对其水溶性差的问题，用不同分子量的聚乙二醇进行修饰，得到了水溶性良好的聚乙二醇化淫羊藿苷化合物，解决了淫羊藿苷应用于临床的一些关键问题。本发明所述的聚乙二醇化淫羊藿苷化合物可用于制备治疗心脑血管疾病的药物。

Description

聚乙二醇化淫羊藿苷、制备方法及用途

技术领域

本发明属于药物领域，具体地说是涉及一种中草药有效成分—淫羊藿苷的聚乙二醇化制备方法及其在制备心脑血管疾病药物中的应用。

背景技术

淫羊藿苷(icariin，ICA)是从中草药淫羊藿茎叶中提取的总黄酮的主要有效成分。ICA具有广泛的药理作用，如：调节免疫、抗肿瘤、抗衰老、保护心脑血管系统等作用(综述文章见：中成药，2005，27，719-721；中国药房，2005，16，952-954)。其中，抗心肌缺血是近年来人们较为关注的研究热点之一。ICA的水溶性很差，给药剂型通常为口服制剂。在口服过程中苷类化合物易被胃酸水解，其生物利用度有不同程度降低，这限制了它在临床的应用。聚乙二醇(PEG)是中性、无毒且具有独特理化性质和良好的生物相溶性的高分子聚合物，也是经FDA批准的极少数能作为体内注射药用的合成聚合物之一。聚乙二醇化技术是一种改善药物溶解性及其在体内传输的有效方法，如美国FDA目前批准的聚乙二醇化治疗性蛋白有2种(Clin.Pharmacokinet.2001，40，539-551)；中国专利申请00109748.2报道了聚乙二醇支载的紫杉醇或多烯紫杉醇前药的发明。为了发展更为高效的给药方法，将难溶性ICA制成溶于水的粉针剂，解决其给药过程中溶解性的问题，提高其生物利用度，我们制备了聚乙二醇化淫羊藿苷，并研究了其在制备治疗心脑血管疾病药物中的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可以用于治疗心脑血管疾病的聚乙二醇化淫羊藿苷。

本发明是通过以下技术方案实现的：本发明所述的聚乙二醇化淫羊藿苷，其化学结构为如下通式I或II：

其中R＝Me或H

上述通式中，n＝10-450，所对应的聚乙二醇的分子量约为400-20000。

上述通式中丁二酸残基一端与聚乙二醇相连，另一端与淫羊藿苷分子中葡萄糖或鼠李糖环上的任一羟基相连。

上述通式中聚乙二醇与淫羊藿苷的摩尔比为1:1或1:2。

本发明还提供一种具有上述化学结构的聚乙二醇化淫羊藿苷化合物的制备方法，即：首先将mPEG(聚乙二醇单甲醚)或PEG活化，形成端基为羧基的mPEG或PEG化合物，然后在极性溶剂中使用缩合试剂将其与一个或两个淫羊藿苷分子通过酯键相连接，得到聚乙二醇化淫羊藿苷。以mPEG为起始原料，合成路线见图1。

本发明中所述的极性溶剂为N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、四氢呋喃(THF)等，优选为DMF。

本发明中所述的缩合试剂为N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)等，优选为DCC。

图1聚乙二醇化淫羊藿苷合成路线

本发明测试了尾静脉注射给药对垂体后叶素所致大鼠实验性心肌缺血、线栓法致大鼠实验性脑缺血以及大鼠动静脉旁路血栓形成的影响。实验结果显示：本发明制备的聚乙二醇化淫羊藿苷可降低T波变化绝对值和心率变化百分率，表明其具有抗心肌缺血的作用；可明显改善脑缺血大鼠神经缺损症状，减少脑梗死范围，表明其具有脑保护作用；能明显降低动静脉旁路血栓的湿重和干重，表明其具有抗血栓形成作用。因此，聚乙二醇化淫羊藿苷尾静脉注射给药对垂体后叶素所致大鼠实验性心肌缺血及线栓法致大鼠实验性脑缺血有预防保护作用，并具有显著的抗血栓形成作用，可应用于制备治疗心血管疾病以及脑血管疾病的药物。

本发明针对淫羊藿苷水溶性差的问题，用不同分子量的聚乙二醇进行修饰，得到了水溶性良好的聚乙二醇化淫羊藿苷化合物，有效解决了淫羊藿苷应用于临床的一些关键问题。

具体实施方式

实施例1利用分子量为5000的聚乙二醇单甲醚制备聚乙二醇化淫羊藿苷ICA-mPEG5000。

称取5.0g(1.0mmol)的聚乙二醇单甲醚-5000溶于10mL吡啶中，而后再加入丁二酸酐0.11g(1.1mmol)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)61mg(0.5mmol)。50℃下搅拌反应5h。减压蒸除溶剂后，残余物真空干燥，直接用于下面的反应。取上面制备的聚乙二醇单甲醚-5000衍生物336mg(～0.067mmol)和淫羊藿苷50mg(0.074mmol)溶于2mL DMF中，而后加入DCC28mg(0.14mmol)和DMAP9mg(0.074mmol)。室温搅拌发应24h后，滤除反应液中的不溶物，加入无水乙醚，有白色沉淀产生，过滤得浅黄色固体。此产物进一步用透析的方法纯化：将其先用5mL去离子水溶解，不溶物滤除，然后用截止分子量为3500的透析膜透析3天。透析后的溶液冷冻干燥得淡黄色絮状物318mg即为ICA-mPEG5000，产率84％。室温下水中溶解度约为520mg/mL。此化合物结构经过质谱、核磁共振谱、红外光谱等确证。从¹H-NMR谱计算出其淫羊藿苷的含量为9％。经凝胶排阻色谱(GPC)分析，其Mn(数均分子量)为7548，Mw(重均分子量)为7810。

实施例2利用分子量为2000的聚乙二醇单甲醚制备聚乙二醇化淫羊藿苷ICA-mPEG2000。

重复实施例1的制备步骤，用聚乙二醇单甲醚-2000代替聚乙二醇单甲醚-5000，使用截止分子量为1000的透析膜纯化产物，制得ICA-mPEG2000，产率78％。室温下水中溶解度约为650mg/mL。此化合物结构经过质谱、核磁共振谱、红外光谱等确证。从¹H-NMR谱计算出其淫羊藿苷的含量为22％。经凝胶排阻色谱(GPC)分析，其Mn(数均分子量)为3398，Mw(重均分子量)为3708。

实施例3利用分子量为750的聚乙二醇单甲醚制备聚乙二醇化淫羊藿苷ICA-mPEG750。

重复实施例1的制备步骤，用聚乙二醇单甲醚-750代替聚乙二醇单甲醚-5000，使用截止分子量为500的透析膜纯化产物，制得ICA-mPEG750，产率85％。此化合物结构经过质谱、核磁共振谱、红外光谱等确证。从¹H-NMR谱计算出淫羊藿苷的含量为47％。室温下水中溶解度约为260mg/mL。此化合物经凝胶排阻色谱(GPC)分析，其Mn(数均分子量)为2134，Mw(重均分子量)为2383。

实施例4利用分子量为15000的聚乙二醇单甲醚制备聚乙二醇化淫羊藿苷ICA-mPEG15000。

重复实施例1的制备步骤，用聚乙二醇单甲醚-15000代替聚乙二醇单甲醚-5000，用DCM代替DMF，用HATU代替DCC，使用截止分子量为10000的透析膜纯化产物，制得ICA-mPEG15000，产率76％。室温下水中溶解度约为440mg/mL。此化合物结构经过质谱、核磁共振谱、红外光谱等确证。从¹H-NMR谱计算出其淫羊藿苷的含量为3％。

实施例5利用分子量为4000的聚乙二醇制备聚乙二醇化淫羊藿苷ICA-PEG4000。

称取4.0g(1.0mmol)的聚乙二醇-4000溶于10mL吡啶中，而后再加入丁二酸酐0.11g(1.1mmol)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)61mg(0.5mmol)。50℃下搅拌反应5h。减压蒸除溶剂后，残余物真空干燥，直接用于下面的反应。取上面制备的聚乙二醇-4000衍生物417mg(～0.1mmol)和淫羊藿苷135mg(0.20mmol)溶于2mL THF中，而后加入EDC·HCl19mg(0.10mmol)和DMAP12mg(0.10mmol)。室温搅拌发应24h后，滤除反应液中的不溶物，加入无水乙醚，有白色沉淀产生，过滤得浅黄色固体。此产物进一步用透析的方法纯化：将其先用5mL去离子水溶解，不溶物滤除，然后用截止分子量为3500的透析膜透析三天。透析后的溶液冷冻干燥得淡黄色絮状物即为ICA-PEG4000，产率81％。室温下水中溶解度约为490mg/mL。此化合物结构经过质谱、核磁共振谱、红外光谱等确证。从¹H-NMR谱计算出其淫羊藿苷的含量为6％。

实施例6利用分子量为4000的聚乙二醇制备聚乙二醇化二淫羊藿苷BisICA-PEG4000。

称取4.0g(1.0mmol)的聚乙二醇-4000溶于10mL吡啶中，而后再加入丁二酸酐0.22g(2.2mmol)和DMAP122mg(1.0mmol)。50℃下搅拌反应5h。减压蒸除溶剂后，残余物真空干燥，直接用于下面的反应。取上面制备的聚乙二醇-4000衍生物420mg(～0.1mmol)和淫羊藿苷150mg(0.22mmol)溶于4mL DMF中，而后加入DCC84mg(0.40mmol)和DMAP27mg(0.22mmol)。室温搅拌发应24h后，滤除反应液中的不溶物，加入无水乙醚，有白色沉淀产生，过滤得浅黄色固体。此产物进一步用透析的方法纯化：将其先用5mL去离子水溶解，不溶物滤除，然后用截止分子量为3500的透析膜透析三天。透析后的溶液冷冻干燥得淡黄色絮状物即为BisICA-PEG4000，产率62％。室温下水中溶解度约为380mg/mL。此化合物结构经过质谱、核磁共振谱、红外光谱等确证。从¹H-NMR谱图计算出其淫羊藿苷的含量为14％。经凝胶排阻色谱(GPC)分析，其Mn(数均分子量)为6052，Mw(重均分子量)为6311。

实施例7聚乙二醇化淫羊藿苷ICA-mPEG2000尾静脉注射给药抗心肌缺血药效学研究

试验一：聚乙二醇化淫羊藿苷ICA-mPEG2000尾静脉注射给药对垂体后叶素所致大鼠实验性心肌缺血的影响

将Wistar大鼠40只，随机分为4组，每组10只分别为：空白对照组，模型组，阳性药硝酸甘油注射液组(0.3mg/kg)和ICA-mPEG2000组(10mg/kg)。采用舌下静脉注射垂体后叶素建立大鼠急性心肌缺血模型，造模前30min各组采取尾静脉注射给药一次，以造模前后T波变化绝对值、心率及其变化百分率为观测指标，研究药物对该模型大鼠的影响。实验结果见表1、2。

表1聚乙二醇化淫羊藿苷ICA-mPEG2000尾静脉注射给药对垂体后叶素所致急性心肌缺血大鼠模型心率变化百分率(％)的影响(x±s)

注：与空白对照组比较，^▲P<0.05^▲▲▲P<0.001；

表2聚乙二醇化淫羊藿苷ICA-mPEG2000尾静脉注射给药对垂体后叶素所致急性心肌缺血大鼠模型II导联心电图T波变化绝对值的影响(x±s，单位：mV)

注：与空白对照组比较，^▲P<0.05或^▲▲P<0.01；与模型组比较，*P<0.05或**P<0.01

由表1可知，舌下静脉注射垂体后叶素后，与空白对照组比较，模型组在各时间点均显著降低心率，经统计学处理差异具有非常显著性(P<0.001)；与模型组比较，硝酸甘油注射液组和ICA-mPEG2000组在各时间点对心率变化百分率没有明显影响，经统计学处理差异均无显著性(P>0.05)。

表2显示，舌下静脉注射垂体后叶素后，与空白对照组比较，模型组在各时间点均显著升高T波变化绝对值，经统计学处理差异具有非常显著性(P<0.05或P<0.01)；与模型组比较，硝酸甘油注射液组在15s—15min时均显著降低T波变化绝对值，经统计学处理差异具有显著性(P<0.05)；ICA-mPEG2000组在15s、60s—15min时均显著降低T波变化绝对值，经统计学处理差异具有显著性(P<0.05或P<0.01)。

垂体后叶素能够收缩小动脉，使冠状动脉痉挛，造成急性心肌供血不足及外周阻力增加，导致心脏负荷加重，心电图可见心肌缺血的典型变化，类似于人体急性心肌缺血损伤，是研究防治心肌缺血药物的常用方法。本次实验结果提示ICA-mPEG2000尾静脉注射给药对垂体后叶素所致大鼠急性心肌缺血有显著的预防保护作用。

试验二：聚乙二醇化淫羊藿苷ICA-mPEG2000尾静脉注射给药对冠脉结扎致大鼠实验性心肌梗死的治疗作用

Wistar大鼠64只，体重260～280g，雌雄兼用。随机分为4组，每组16只，分别为：假手术组、模型组、阳性药组(盐酸地尔硫卓3mg/kg)、ICA-mPEG2000(10mg/kg)组。腹腔注射乌拉坦(1000mg/kg)麻醉，各组分别记录标准II导联ECG1min。胸部常规消毒，左锁骨中线第四肋间开胸，暴露心脏，距左冠状动脉前降支根部约2mm处结扎，送回心脏，关闭胸腔。记录冠脉结扎后II导联心电图，以T波高耸伴有ST段抬高为结扎成功的标志。结扎冠脉15min后记录ECG，作为给药前值，然后经舌下静脉给药一次，剂量如前所述。结扎后5h，处死大鼠，将心脏横切成5片置于0.1％的NBT(用pH7.4～7.8的0.2mol/L Tris液配制)溶液中，37℃水浴3～5min，洗去多余的染料可见梗死区不着色，非梗死区被NBT染为紫蓝色，将心脏切片并照相，用图形分析软件比较心肌梗死面积。实验结果如下：1.ICA-mPEG2000对冠脉结扎大鼠心电图T波变化绝对值的影响：见表3。

表3ICA-mPEG2000对冠脉结扎大鼠心电图T波变化绝对值的影响

(x±s，单位：mV，n＝10)

注：与假手术组比较，^▲P<0.05或^▲▲P<0.01；与模型组比较，*P<0.05或**P<0.01

由上表可见，冠脉结扎后，与假手术组比较，模型组在15m、30m、1h、2h各点均显著升高T波变化绝对值，经统计学处理差异具有显著性(P<0.05或P<0.01)；与模型组比较，地尔硫卓组在30min、1h各点均显著降低T波变化绝对值，经统计学处理差异具有显著性(P<0.01)。与模型组比较，ICA-mPEG2000(10mg/kg)组在30min、1h各点均显著降低T波变化绝对值，经统计学处理差异具有显著性(P<0.05或P<0.01)。

2.ICA-mPEG2000对冠脉结扎大鼠心肌梗死面积占全心面积的比例的影响：见表4。

表4ICA-mPEG2000对冠脉结扎大鼠心肌梗死面积占全心面积的比例的影响(n＝9)

注：与模型组比较，**P<0.01

由上表可见，冠脉结扎后，与模型组比较，阳性药组能显著降低梗死面积，梗死区实测值和所占全心面积百分率差异具有显著性(P<0.05)。与模型组比较，ICA-mPEG2000(10mg/kg)组能显著降低梗死面积，梗死区所占全心面积百分率差异具有显著性(P<0.01)。

综上所述：实验结果表明，ICA-mPEG200010mg/kg能减小冠脉结扎所致大鼠心肌梗死面积、降低心电图T波变化绝对值，对大鼠实验性心肌梗死具有较好的治疗作用。

实施例8聚乙二醇化淫羊藿苷ICA-PEG4000尾静脉注射给药抗脑缺血及血栓形成作用的研究

试验一聚乙二醇化淫羊藿苷ICA-PEG4000尾静脉注射给药对大鼠脑缺血/再灌注损伤的保护作用

SD大鼠随机分为假手术组、模型组、ICA-PEG40005mg/kg、10mg/kg、20mg/kg组、阳性对照药尼莫地平15mg/kg组。采用尾静脉注射途径给药，每日一次，连续2日。第3日手术前0.5h、手术后6h分别给药1次，假手术组及模型组注射等量生理盐水。手术造模方法为：大鼠麻醉，仰卧位固定。分离右侧颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉，穿线备用，结扎颈外动脉与颈总动脉，以动脉夹夹闭颈内动脉远心端后，于颈外动脉与颈内动脉分叉处作一切口，从切口处插入头端磨成球形的光滑尼龙线(直径0.285mm)，有阻力感时停止进线并记录缺血时间，插入深度18mm左右，实现大脑中动脉阻塞导致脑缺血。结扎切口处，缝合皮肤。3h后将尼龙线轻轻抽到近切口处，实现再灌注。假手术组只结扎右侧颈总动脉。

按Zea Longa5级评分法，分别于术后3h和再灌注21h进行评定，0分及昏迷不醒者剔除。评分标准：无明显神经病学症状，0分；不能完全伸展左侧前爪，1分；向左侧旋转，2分；行走时向左侧倾倒，3分；不能自行行走，4分。

于术后24h评分后断头取脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干后的剩余部分在4℃冠状切为6片，并迅速将脑片置于TTC染液中(每5mL染液中含4％TTC1.5mL，1M K₂HPO₄0.1mL，其余加蒸馏水至刻度)，37℃避光温孵30分钟，取出后置于10％甲醛液中避光保存24h。经染色后非缺血区为玫瑰红色，梗死区为白色。将白色组织仔细挖下称重，以梗死组织重量占全脑重量的百分比作为脑梗死范围。所有数值以x±s表示，组间比较采用t检验。结果如下：

1.ICA-PEG4000对大脑中动脉缺血再灌注大鼠神经症状评分的影响

假手术组大鼠没有神经功能缺损表现，造模后出现了不同程度的神经功能缺损症状。各给药组可明显改善模型大鼠神经缺损症状，尤以ICA-PEG400020mg/kg组和尼莫地平15mg/kg组改善最为显著。结果见表5。

表5ICA-PEG4000对tMCAO大鼠神经症状评分的影响(x±s)

注：与模型组比较，**P<0.01，*P<0.05；与假手术组比较，^▲▲P<0.01.

2.ICA-PEG4000对大脑中动脉缺血再灌注大鼠脑梗死范围的影响

TTC染色表明，模型组脑梗死范围达13.6％，各给药组均可减小tMCAO大鼠脑梗死范围。同模型组相比，ICA-PEG400010mg/kg组、ICA-PEG400020mg/kg组和尼莫地平15mg/kg组具有显著性差异。结果见表6。

表6ICA-PEG4000对tMCAO大鼠脑梗死范围的影响(x±s)

注：与模型组比较，**P<0.01，*P<0.05；与假手术组比较，^▲▲P<0.01.

大脑中动脉是脑卒中发生的常见部位，其阻断模型被普遍认为是局灶性脑缺血的代表性动物模型。本部分采用线栓法致大鼠暂时性大脑中动脉阻塞模型观察ICA-PEG4000对脑缺血再灌注大鼠神经病学评分、脑梗死范围的影响。结果表明大鼠造模后出现了明显的神经缺损症状和大面积脑梗死。ICA-PEG400010mg/kg、20mg/kg可明显改善模型大鼠神经缺损症状，减少脑梗死范围，显示出一定的脑保护作用。

试验二：聚乙二醇化淫羊藿苷ICA-PEG4000尾静脉注射给药对大鼠动静脉旁路血栓形成的影响

雄性SD大鼠随机分为5组，即空白组、阿斯匹林40mg/kg组、ICA-PEG40005mg/kg、10mg/kg、20mg/kg组，采用尾静脉注射途径给药，每日一次，连续3日。第4日手术前0.5h给药1次，空白对照组给予等容积蒸馏水。动静脉旁路血栓制作手术方法如下：大鼠以10％水合氯醛溶液(0.35g/kg)麻醉，仰卧位固定，分离右侧颈总动脉和左侧颈外静脉，将三段聚乙烯管相连，一端插入右颈总动脉，另一端插入左颈外静脉，中间段长10cm，放入一根长为8cm的0号手术线(已称重)，管内注满生理盐水，建立动静脉旁路。20min后取下套管，取出血栓，去除多余浮血，置已称重的硫酸纸上称取血栓湿重。然后置于烘箱内60℃烘烤1h至恒重，冷却后称量血栓干重。结果如下：

ICA-PEG400010mg/kg、20mg/kg能明显降低动静脉旁路血栓的湿重和干重。结果见表7。

表7ICA-PEG4000对大鼠动-静脉旁路血栓形成的影响(n＝12，x±s)

注：与空白组比较，**P<0.01，*P<0.05.

血栓形成是缺血性脑血管病的重要病理过程之一。本实验采用的大鼠颈总动脉-颈外静脉血流旁路法形成的血栓结构类似于血小板血栓。动脉血流中的血小板，接触到丝线的粗糙面时粘附于丝线表面而形成血栓，故从血栓的重量可以测知血小板的粘附聚集功能。结果表明ICA-PEG400010mg/kg、20mg/kg均能明显降低动静脉旁路血栓的湿重和干重，显示出其抗血栓形成作用。

Claims (8)

1.一种聚乙二醇化淫羊藿苷化合物，其特征在于，其化学结构为以下通式I或II：

其中R＝Me或H，化合物I或II结构中的n＝10-450，所对应的聚乙二醇的分子量约为400-20000，其中丁二酸残基一端与聚乙二醇相连，另一端与淫羊藿苷分子通过酯键相连。

2.如权利要求1所述的聚乙二醇化淫羊藿苷化合物，其中丁二酸残基一端与聚乙二醇相连，另一端与淫羊藿苷分子中葡萄糖或鼠李糖环上的任一羟基相连。

3.如权利要求2所述的聚乙二醇化淫羊藿苷化合物，聚乙二醇与淫羊藿苷的摩尔比为1∶1或1∶2。

4.如权利要求1所述的聚乙二醇化淫羊藿苷化合物，其特征是所述聚乙二醇为聚乙二醇750、2000、4000、5000或15000。

5.一种如权利要求1所述的聚乙二醇化淫羊藿苷化合物的制备方法，其特征在于：首先将聚乙二醇单甲醚或聚乙二醇活化，形成端基为羧基的聚乙二醇单甲醚或聚乙二醇化合物，然后在极性溶剂中使用缩合试剂将其与一个或两个淫羊藿苷分子通过酯键相连接，得到聚乙二醇化的淫羊藿苷，其中，极性溶剂选自N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷或四氢呋喃，缩合试剂选自N，N’-二环己基碳二亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺或2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯。

6.如权利要求5所述的制备方法，其中的极性溶剂为N，N-二甲基甲酰胺。

7.如权利要求5所述的制备方法，其中的缩合试剂为N，N’-二环己基碳二亚胺。

8.权利要求1所述的聚乙二醇化淫羊藿苷化合物在制备治疗心脑血管疾病药物中的应用。