CN101291903B - 新的不饱和脂肪羟基酸衍生物及其皮肤美容用途 - Google Patents

新的不饱和脂肪羟基酸衍生物及其皮肤美容用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及通式(I)的不饱和脂肪羟基酸衍生物，其中Rn各自独立地为H或含有1-6个碳原子的直链或支链烷基，其可以被卤原子取代，特别是被氟原子取代，R1为H、F、Cl、Br或CF3，R为H或者含有1-6个碳原子的直链或支链烷基，其可以被卤原子取代，特别是被氟原子取代且3＝n＝14。所述衍生物适于制备抗自由基、抗炎、止痒的皮肤美容组合物，和/或适于治疗角质化或色素沉着的疾病，和/或适于促进愈合。

Description

新的不饱和脂肪羟基酸衍生物及其皮肤美容用途
技术领域
本发明涉及新的不饱和脂肪羟基酸衍生物及其皮肤美容用途。
背景技术
许多饱和脂肪羟基酸是已知的，而且文献中也针对它们的美容和药理性质进行了描述。例如，得自蜜蜂的蜂王浆的主要脂质成分是不饱和脂肪羟基酸，即羟基-10-癸烯2(反式)酸(Edward E.Smissman等人，1964.JOU.29 3517-3520)。
各种各样的现有技术文献描述了制备不饱和脂肪羟基酸及其酯的方法(Lee等人，1993，J.Org.Chem.，58卷，2918-2919页；Hurd和Saunders，1952，J.Am.Chem.Soc.，74卷，5324-5328页；Krishnamurthy等人，1989，Indian J.Chem.Sect.A，28卷，288-291页；Plettner等人，1995，J.Chem.Ecol.，21卷，1017-1030页)。
发明内容
更具体而言，本发明涉及通式(I)的不饱和脂肪羟基酸衍生物：
其中：
.Rn独立地代表一个或多个H或者含有1-6个碳原子的直链或支链烷基，其可以被卤原子取代，特别是被氟原子取代。
.R1代表H、F、Cl、Br、CF3。
.R代表H或者含有1-6个碳原子的直链或支链烷基，其可以被卤原子取代，特别是被氟原子取代，并且
.3≤n≤14。
根据本发明的一个特性，通式(I)的不饱和脂肪羟基酸满足下列标准：
.R代表H，
.Rn独立地代表一个或多个H或者含有1-6个碳原子的直链或支链烷基，其可以被卤原子取代，特别是被氟原子取代，
.R1代表H、F、Cl、Br、CF3。
.3≤n≤14。
然而，如果当n≠10时，R1基团和Rn基团中至少一个不代表氢。
根据本发明的一个特性，通式(I)的不饱和脂肪羟基酸衍生物满足下列标准：
.R1代表F、Cl、Br、CF3，
.Rn独立地代表一个或多个H或者含有1-6个碳原子的直链或支链烷基，其可以被卤原子取代，特别是被氟原子取代，
.R代表H或者含有1-6个碳原子的直链或支链烷基，其可以被卤原子取代，特别是被氟原子取代，并且
.3≤n≤14。
根据本发明的一个特性，通式(I)的不饱和脂肪羟基酸衍生物满足下列标准：
.Rn独立地代表一个或多个H或者含有1-6个碳原子的直链或支链烷基，其可以被卤原子取代，特别是被氟原子取代，
.R1代表H、F、Cl、Br、CF3，
.R代表H或者含有1-6个碳原子的直链或支链烷基，其可以被卤原子取代，特别是被氟原子取代，并且
.6≤n≤14。
然而，如果当n≠10时，R1基团和Rn基团中至少一个不为氢。
根据本发明的另一个特性，通式(I)的不饱和脂肪羟基酸衍生物满足下列标准：
.R1＝F、Cl、Br、CF3，
.Rn＝H，并且
.3≤n≤14。
根据本发明的另一个特性，通式(I)的不饱和脂肪羟基酸衍生物满足下列标准：
.R1代表F、Cl、Br或CF3，
.Rn基团中的至少一个为含有1-6个碳原子的直链或支链烷基，其可以被卤原子取代，特别是被氟原子取代，并且
.3≤n≤14。
根据本发明的另一个特性，通式(I)的不饱和脂肪羟基酸衍生物满足下列标准：
.R1＝F
.Rn＝H
.3≤n≤14。
根据本发明的另一个特性，通式(I)的不饱和脂肪羟基酸衍生物满足下列标准：
.R1＝F
.Rn＝H
.n＝13。
根据本发明的另一个特性，通式(I)的不饱和脂肪羟基酸衍生物满足下列标准：
.R1＝F
.Rn＝H
.n＝6。
根据本发明的另一个特性，通式(I)的不饱和脂肪羟基酸衍生物满足下列标准：
.R＝R1＝H
.Rn基团中仅一个代表甲基，其它为氢原子，并且
.n＝4。
根据本发明的另一个特性，通式(I)的不饱和脂肪羟基酸衍生物满足下列标准：
.R1＝Rn＝H，并且
.n＝10。
根据本发明的另一个特性，通式(I)的不饱和脂肪羟基酸衍生物满足下列标准：
.R1＝F
.Rn＝H，并且
.n＝10。
根据本发明的另一个特性，通式(I)的不饱和脂肪羟基酸衍生物满足下列标准：
.R1＝F
.Rn＝H，并且
.n＝8。
根据本发明，如上述所定义的通式(I)的不饱和脂肪羟基酸衍生物可用作活性成分，与合适的赋形剂联合制成皮肤美容组合物，该组合物具有抗自由基、抗炎、止痒活性，和/或用于治疗角质化和色素沉着的疾病，和/或用于促进愈合。
所述的通式(I)的不饱和脂肪羟基酸衍生物特别适用于组合物中，该组合物用于治疗银屑病、瘙痒症和/或特应性皮炎，以及治疗皮肤衰老和白色或棕色老年斑。
根据本发明，通式(I)的不饱和脂肪羟基酸衍生物更适用能美白皮肤的组合物中。
由于通式(I)的不饱和脂肪羟基酸衍生物具有抗自由基活性，因此它们也用于预防或扼制皮肤光致癌的早期阶段，并因此可用于预防和治疗各种皮肤肿瘤疾病。
可以如下制备通式(I)的不饱和脂肪羟基酸衍生物：
—通过维蒂希-霍纳反应(Wittig-Horner)与式(III)的磷酸盐反应
其中：
.R1如通式(I)所定义；
.R2代表具有1-6个碳原子的直链或支链烷基，优选乙基或甲基，所述R2基团可以与OR2基团的氧原子和邻位磷原子一起形成环状结构，并且
.R4代表具有1-6个碳原子的直链或支链烷基，且优选乙基，
—或者，当R1＝H时，使用Doebner-Knoevenagel反应与式R4OOC-CH2COOR的丙二酸衍生物反应，其中R如上述通式(I)中所定义，具有通式(II)的内半缩醛：
Rn和n如上述所定义，
从而得到通式(IV)的羟基酯：
其中n、R和R1如上述所定义，
并且，当R代表如上述所定义的R4时，可以进行如上述所定义的通式(IV)羟基酯的皂化反应，从而得到通式(I)的相应羟基酸衍生物。
通过下面给出的合成实施例说明本发明：
具体实施方式
实施例1：合成DHA的操作方法
1.步骤1：氧杂环辛烷-2-酮(oxonan-2-one)的制备
将43.5g(345mmol)的环辛酮置于430ml的二氯乙烷溶液中。然后加入170g(985mmol)的间氯过氧化苯甲酸。将反应溶液加热至80℃持续48小时。在室温，加入400ml Na2S2O5和NaHCO3饱和溶液(1/1V/V)。将反应溶液剧烈搅拌18小时。分离有机相并与KI和H2O接触6小时。分离有机相并用饱和Na2S2O3溶液、饱和NaCl溶液洗涤，然后用MgSO4干燥，过滤并在真空下浓缩，得到36g粗产物。
通过在戊烷(60ml)中浓缩，然后过滤间氯过氧化苯甲酸沉淀物来纯化该内酯，w＝26.6g(54％)。
所得内酯为下式化合物
特征：
TLC：Rf＝0.3(庚烷/乙酸乙酯7/3)
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ1.42-1.49(m，4H)，1.65-1.75(m，6H)，2.30(t，J＝5.4Hz，2H)，4.30(t，J＝5.7Hz，2H)。
2.内半缩醛中的部分还原反应
在氮气下将26.6g(187.2mmol)的内酯稀释于210ml的甲苯中。将反应溶液冷却至-78℃，滴加156.4ml(189.1mmol)二异丁基氢化铝(Dibal-H)在甲苯中浓度为20％的溶液，同时保持温度在-78℃。在-78℃将混合物搅拌2小时。在-78℃加入200ml的饱和罗森(Rozen)盐溶液。在室温剧烈搅拌18小时后，将两相混合物在硅藻土上过滤，然后用乙酸乙酯萃取。将有机相用饱和NaCl溶液洗涤，用MgSO4干燥，过滤并在真空下浓缩，得到26g粗产物(该粗产物的25％为二醇衍生物，即72％的预计产率)。因此得到的内半缩醛(处于开环和闭状形式的平衡状态)可不经进一步纯化直接使用。
特征：
TLC：Rf＝0.4(庚烷/乙酸乙酯6/4)
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ1.34-1.68(m，10H)，2.45(t，J＝5.4Hz，2H)，3.66(t，J＝6.6Hz，2H)，9.78(t，J＝1.8Hz，1H)。
3.步骤3：维蒂希-霍纳反应
将19g(131.8mmol)的内半缩醛稀释于250ml乙醇中，在27.3g(197.5mmol)碳酸钾存在下将31.4ml(158.1mmol)磷酰基乙酸三乙酯加至反应溶液中。将反应溶液加热至40℃持续18小时。在室温，该反应溶液在200ml蒸馏水中水解并用乙酸乙酯萃取。将有机相用饱和NaCl溶液洗涤，用MgSO4干燥，过滤并在真空下浓缩，得到20g粗产物。
所得酯采用色谱法用庚烷/乙酸乙酯7/3洗脱进行纯化，得到15g产物(53％产率)。
所得酯为下式化合物：
特征：
TLC：Rf＝0.4(庚烷/乙酸乙酯7/3)
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ1.24-1.38(m，9H)，1.43-1.50(m，2H)，1.51-1.57(m，2H)，2.15-2.21(q，2H)，3.60-3.64(t，2H)，4.14-4.20(t，2H)，5.77-5.82(d，J＝15.6Hz，1H)，6.91-6.98(dt，J＝15.6Hz，1H)。
4.步骤4：皂化反应
将0.60g(2.81mmol)的羟基酯溶解于10倍体积的四氢呋喃中。缓慢加入3.4ml(6.75mmol)的2M苏打溶液。将反应溶液加热至65℃持续3小时。一旦反应结束，加入3M盐酸溶液水解反应溶液直到pH＝2。将混合物浓缩至干，并用乙酸乙酯萃取水相。将有机相用饱和NaCl溶液洗涤，用MgSO4干燥，过滤并在真空下浓缩，得到0.6g粗产物。
通过在乙腈中重结晶，得到呈白色固体的预期饱和羟基酸衍生物，w＝0.37g(71％)。
所得羟基酸衍生物为下列式化合物：
特征：
TLC：Rf＝0.1(庚烷/乙酸乙酯6/4)
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ1.33-1.37(m，6H)，1.45-1.49(m，2H)，1.55-1.58(m，2H)，2.20-2.25(q，2H)，3.62-3.66(t，2H)，5.79-5.84(d，J＝15.6Hz，1H)，7.03-7.10(dt，J＝15.6Hz，1H)。
质谱：[M-Na]+209(计算值186)
熔点：62.5℃±1℃
实施例2：合成10-羟基-2-氟-2癸烯酸的α-氟化DHA的操作方法：
(R1＝F，n＝6)
仅步骤3是不同的：使用内半缩醛(0.89g，7.7mmol)，在40℃于磷酰基氟乙酸甲基二乙基酯(methyldiethylphosphonofluoroacetate)(2.1g，9.2mmol)和碳酸钾(1.6g，11.5mmol)的乙醇(9ml)溶液存在下进行维蒂希-霍纳反应。依照前面的方法进行步骤4。重结晶后所得的产物为顺-反式的混合物。所得的羟基酸衍生物为下列通式化合物：
特征：
TLC：Rf＝0.1(庚烷/乙酸乙酯6/4)
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ1.36-1.62(m，20H)，2.27-2.30(m，2H，顺式)，2.50-2.58(m，2H，反式)，3.69(m，4H)，6.05(dt，J＝21.6Hz，1H，反式)和6.25(dt，J＝40.8Hz，1H，顺式)。
质谱：[M-Na]+227(计算值204)
实施例3：合成9-羟基-2反式(2t)-壬烯酸的操作方法
将DHA合成的方法用于环庚酮，从而得到9-羟基-2反式-壬烯酸。
特征：
TLC：Rf＝0.1(庚烷/乙酸乙酯6/4)
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ1.36-1.61(m，8H)，2.22-2.27(m，2H)，3.67(t，J＝6.3Hz，2H)，5.84(dt，J＝15.6Hz，1H)，7.09(dt，J＝15.6Hz，1H)。
质谱：[M-Na]+195(计算值172)
实施例4：合成11-羟基-2反式-十一烯酸的操作方法
将DHA合成的方法用于环壬酮，从而得到11-羟基-2反式-十一烯酸。
特征：
TLC：Rf＝0.1(庚烷/乙酸乙酯6/4)
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ1.33-1.61(m，12H)，2.20-2.28(m，2H)，3.66(t，J＝6.0Hz，2H)，5.84(dt，J＝15.9Hz，1H)，7.09(dt，J＝15.9Hz，1H)。
质谱：[M-Na]+223(计算值200)
实施例5：合成12-羟基-2反式-十二烯酸的操作方法
将DHA合成的方法用于环癸酮，从而得到12-羟基-2反式-十二烯酸。
特征：
TLC：Rf＝0.1(庚烷/乙酸乙酯6/4)
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ1.35-1.56(m，14H)，2.20-2.27(m，2H)，3.55(t，J＝6.6Hz，2H)，5.80(dt，J＝15.6Hz，1H)，6.96(dt，J＝15.6Hz，1H)。
质谱：[M-Na]+237(计算值214)
实施例6：合成12-羟基-2-氟-2反式-十二烯酸的操作方法
将合成2位氟化的DHA(实施例2)的方法用于环癸酮，从而得到12-羟基-2-氟-2-十二烯酸，为顺/反式混合物。
特征：
TLC：Rf＝0.1(庚烷/乙酸乙酯6/4)
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ1.34-1.56(m，14H)，2.24-2.27(m，2H顺式)或2.49-2.54(m，2H结构反式)，3.55(t，J＝6.6Hz，2H)，5.97(dt，J＝21.9Hz，1H结构反式)或6.10(dt，J＝55.2Hz，1H，顺式)。
质谱：[M-Na]+255(计算值232)
实施例7：合成13-羟基-2反式-十三烯酸的操作方法
将DHA合成的方法用于氧杂环十二烷-2-酮，从而得到13-羟基-2反式-十三烯酸。
特征：
TLC：Rf＝0.1(庚烷/乙酸乙酯6/4)
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ1.27-1.63(m，16H)，2.21-2.28(m，2H)，3.64(t，J＝3.6Hz，2H)，5.84(dt，J＝15.6Hz，1H)，7.09(dt，J＝15.6Hz，1H)。
质谱：[M-Na]+251(计算值228)
实施例8：合成14-羟基-2反式-十四烯酸的操作方法
将DHA合成的方法用于氧杂环十三烷-2-酮，从而得到14-羟基-2反式-十四烯酸。
特征：
TLC：Rf＝0.1(庚烷/乙酸乙酯6/4)
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ1.29-1.35(m，14H)，1.46-1.61(m，4H)，2.21-2.29(m，2H)，3.66(t，J＝6.6Hz，2H)，5.84(dt，J＝15.6Hz，1H)，7.09(dt，J＝15.6Hz，1H)。
质谱：[M-Na]+265(计算值242)
实施例9：合成14-羟基-2-氟-2-十四烯酸的操作方法
将合成2位氟化的DHA(实施例2)的方法用于氧杂环十三烷-2-酮，从而得到14-羟基-2-氟-2-十四烯酸，为顺/反式混合物。
特征：
TLC：Rf＝0.1(庚烷/乙酸乙酯6/4)
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ1.29(m，28H)，1.42-1.62(m，8H)，2.27-2.31(m，2H，顺式)，2.51-2.56(m，2H，反式)，3.68(t，J＝6.6Hz，2H)，3.70(t，J＝6.6Hz，2H)，6.04(dt，J＝21.3Hz，1H，反式)，6.27(dt，J＝33.0Hz，1H，顺式)。
质谱：[M-Na]+283(计算值260)
实施例10：合成17-羟基-2反式-十七烯酸的操作方法
将DHA合成的方法用于环十五烷内酯，从而得到17-羟基-2反式-十七烯酸。
特征：
TLC：Rf＝0.1(庚烷/乙酸乙酯6/4)
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ1.27-1.32(m，20H)，1.46-1.61(m，4H)，2.20-2.29(m，2H)，3.67(t，J＝6.6Hz，2H)，5.84(dt，J＝15.6Hz，1H)，7.08(dt，J＝15.6Hz，1H)。
质谱：[M-Na]+307(计算值284)
实施例11：合成17-羟基-2-氟-2-十七烯酸的操作方法
将合成2位氟化的DHA(实施例2)的方法用于环十五烷内酯，从而得到17-羟基-2-氟-2-十七烯酸，为顺/反式混合物。
结构特征：
TLC：Rf＝0.1(庚烷/乙酸乙酯6/4)
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ1.27(m，40H)，1.45-1.62(m，8H)，2.24-2.32(m，2H，顺式)，2.50-2.58(m，2H，反式)，3.69(t，J＝6.6Hz，4H)，6.05(dt，J＝21.6Hz，1H，反式)et 6.26(dt，J＝40.8Hz，1H，顺式)。
质谱：[M-H]+301(计算值302)
熔点：77℃±1℃
实施例12：合成18-羟基-2反式-十八烯酸的操作方法：(R1＝H，n＝14)
将DHA合成的方法用于环十六烷内酯，从而得到18-羟基-2反式-十八烯酸。
特征：
TLC：Rf＝0.1(庚烷/乙酸乙酯6/4)
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ1.27-1.65(m，26H)，2.19-2.39(m，2H)，3.67(t，J＝6.6Hz，2H)，5.83(dt，J＝15.6Hz，1H)，7.09(dt，J＝15.6Hz，1H)。
质谱：[M-Na]+321(计算值298)
实施例13：合成16-羟基-2反式-十六烯酸的操作方法：
特征：
TLC：Rf＝0.1(庚烷/乙酸乙酯6/4)
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ1.27-1.32(m，18H)，1.46-1.61(m，4H)，2.21-2.28(m，2H)，3.66(t，J＝6.6Hz，2H)，5.85(dt，J＝15.6Hz，1H)，7.09(dt，J＝15.6Hz，1H)。
质谱：[M-Na]+293(计算值270)
使用氧杂环十三醇的Deobner-Knovenagel反应实施例
在氮气下于1.09g(10.5mmol)丙二酸和0.11ml哌啶存在下，将1.4g(7.0mmol)的杂环十三醇(通过内半缩醛的部分还原方法得到)溶解于4倍体积的吡啶中。将反应溶液加热至80℃持续1小时30分钟，然后回流2小时。在室温，将溶液倒入3M HCl(50ml)中。滤过的固体用水洗涤，然后在乙腈中重结晶(得到1.2g即70％产率)。
本发明的不饱和脂肪羟基酸衍生物经历多种实验证明了它们作为皮肤病学和/或美容组合物中的活性成分的益处。
针对活性氧(AOS)的抗自由基效果的研究
在正常代谢细胞过程中，当皮肤偶然暴露于应激试剂期间或在皮肤疾病过程中，就会生成称为活性氧(AOS)的活性氧化蔟(Y.M.W.Janssen等人，1993)。作为高活性代谢物的AOS在众多过程如炎症、衰老和肿瘤中起重要作用。
人们认为AOSs在与氧化应激有关的细胞信号过程中是二次信使，因此用作炎症过程的早熟介质(precocious mediator)(A.Van Der Vliet和A.Bast.1992)。
AOSs的过量生成会使细胞受相当大的破坏。因此某些细胞成分成为氧化应激的主要靶点：质膜的脂质成分(脂质过氧化)、蛋白质(变性和降解)和遗传物质或DNA(突变)可遭受改变。细胞可通过各种抗自由基防御系统(酶和非酶抗氧化剂)限制氧化破坏(B.P.Yu，1994；H.Steiling等人，1999)。
尽管如此，在某些条件下，AOSs的大量生成使得细胞抗氧化活性不足。这些AOSs因此成为触发炎症疾病和组织衰老的因子(Y.Miyachi等人，1986；M.Kress等人，1995)。
在体外有不同的能生成氧化应激的化学试剂(如：H2O2)或物理试剂(如：UVA)。生成的AOSs改变多种细胞靶点(膜、DNA或蛋白质)，且使用常规应用的生物方法例如针对脂质脂质过氧化的TBARS实验或使用H2DCF-DA探针的细胞内AOSs的体外实验可以分析这种改变。
我们建立由H2O2/铁诱导的氧化应激的体外研究模型，因为作为由膜脂氧化触发的链式反应的结果，H2O2会生成巨量的分子内AOSs。
本技术基于荧光探针的使用，一旦6-羧基-2′，7′-二氯二氢醋酸荧光素，二(乙酰氧基甲基酯)(H2DCF-DA)渗入细胞，其通过细胞内酯酶脱乙酰基，进而形成H2DCF。该产物通过细胞内AOSs氧化成高荧光化合物：2′，7′-二氯荧光素(DCF)(Suematsu M等人，1996，FreeRadicals Practical Approach，Punchard编辑，83-99页)。
细胞内AOSs的体外分析所使用的材料和方法在下面给出。
a)细胞工具
鼠皮肤纤维母细胞株L929。
b)材料
96孔平底微孔板。
Cytofluor II荧光读板机：参考PERCEPTIVE BIOSYSTEMS。
c)试剂
细胞培养试剂：
达尔伯克改良伊格尔培养基作为培养基(DMEM)
胎牛血清
磷酸盐缓冲液PBS pH 7.4
胰蛋白酶EDTA(1X)
荧光探针
6-羧基-2′，7′-二氯二氢醋酸荧光素，二(乙酰氧基甲基酯)(PM.675，43)
细胞刺激产物
过氧化氢(H2O2)3％参考GIFRER(Gifrer Barbezat实验室)
硫酸亚铁铵(Fe2+)
硫酸铁铵(Fe3+)
d)测试的产物：
测试浓度为无毒浓度。孵育该产物3小时后使用中性红方法进行细胞毒性测定。
抗自由基产物的参照物为维生素E或α生育酚(MW：430.7)(SIGMA，参考：T-1539)。
原液制备的浓度为DMSO中400mg/ml并在-20℃储藏。新鲜制备的预处理液浓度为在不含胎牛血清的培养基中400μg/ml。
为了评价不饱和脂肪羟基酸衍生物，在新鲜制备的培养基中配制稀释液，其浓度范围为0.02，0.2，2和20ng/ml。
e)方法
细胞培养：
将来自纤维母细胞株L929的细胞在96孔平底微孔板于添加含10％胎牛血清的100μl DMEM中培养。将其在含5％CO2的潮湿空气中于37℃孵育过夜。使用6个孔对无细胞空白板进行测定。
细胞预处理：
在不含胎牛血清的培养基中补充加入要测试的产物的稀释液和对照分子，然后放置在7个孔中，放置量为每孔100μl。
然后将细胞在含5％CO2的潮湿空气中于37℃孵育3小时。
将“空白”(细胞的自然荧光)，“对照”(AOS的基础产物)和“受激”细胞(氧化处理后生成AOSs)用100μl的DMEM覆盖。
“对照”细胞与探针一起孵育，但既不预处理也不处理。
“受激”细胞与探针一起孵育并处理，但不预处理。
“空白”细胞既不预处理，也不与探针一起孵育，也不处理。细胞与探针一起孵育和氧化应激：
在PBS 1X中以每孔100μl的等级洗涤细胞。然后将它们在含5％CO2的潮湿空气中于37℃与50μl的5μM H2DCF-DA探针一起孵育30分钟。
与探针单独接触30分钟后，将细胞在含5％CO2的潮湿空气中于37℃与25μl的800μM H2O2和25μl的8mM亚铁及三价铁溶液一起孵育30分钟，从而得到终浓度为200μM的H2O2和2mM的亚铁离子及三价铁离子。
用PBS 1X以每孔100μl的等级洗涤细胞，然后将它们在含5％CO2的潮湿空气中于37℃与100μl的PBS 1X一起孵育30分钟。
在37℃进行1小时30分钟的孵育使分子内酯酶将探针脱乙酰基成H2DCF，通过细胞内AOSs将H2DCF氧化成DCF：这是一种荧光化合物，它的形成与细胞内AOSs的数量成正比。
通过荧光读板机在λ激发＝485nm和λ发射＝530nm读取荧光强度。它反映了生成的细胞内AOSs的量。
研究方法的图解：
计算抑制细胞内AOSs生成的保护％。
下面的比率使其能针对每个产品测试浓度计算抑制细胞内AOSs生成的保护％(因为荧光强度或IF反映了细胞内AOSs的释放)
下面表中给出的值为与“空白”细胞(100％)和“受激”细胞(0％)相比，在外源性氧化应激后，细胞内AOSs生成的抑制百分比。
下面表I中列出了13个测试的分子在4种浓度对细胞株L929的平均保护百分比。
表I衍生自不饱和脂肪羟基酸的13个分子抑制细胞内AOSs生成的保
                         护分析：
               细胞内AOS生成的抑制百分比
维生素E 400μg/ml     47％
预孵时间：3小时
测试次数＝全部化合物都是3次
测试次数＝维生素18次
体外在细胞水平，由于H2O2/Fe2+/Fe3+外源性应激可以触发细胞内AOSs的生成，该细胞内AOSs的生成可通过荧光探针检测。
结论认为，非氟化的短链(C9和C10)不饱和脂肪羟基酸衍生物显示作为抗自由基细胞保护特别有效。
抗自由基作用的研究 脂质过氧化的分析
此外，在正常代谢细胞过程中，当皮肤偶然暴露于应激试剂期间或在皮肤疾病过程中，就会生成称为氧自由基(OFRs)的活性氧化蔟(Y.M.W.Janssen等人，1993)。作为高活性代谢物的OFRs在众多过程如炎症、衰老和肿瘤中起重要作用。
人们认为OFRs在针对氧化应激的细胞信号过程中是二次信使，因此用作炎症过程的早熟介质(A.Van Der Vliet和A.Bast.1992)。
OFRs的过量生成会对细胞造成相当大的破坏。因此某些细胞成分成为氧化应激的主要靶点：质膜的脂质成分(脂质过氧化)、蛋白质(变性和降解)和遗传物质或DNA(突变)可遭受改变。细胞可通过各种抗自由基防御系统(酶和非酶抗氧化剂)限制氧化破坏(B.P.Yu，1994；H.Steiling等人，1999)。
尽管如此，在某些条件下，OFRs的大量生成使得细胞抗氧化活性不足。因此这些OFRs成为触发炎症疾病和组织衰老的因子(Y.Miyachi等人，1986；M.Kress等人，1995)。
为了评价本发明的各种羟基化衍生物的抗自由基活性，我们分析它们对由氧化应激(化学)触发的细胞膜改变的保护能力，与参照抗氧化剂(维生素E)对比。
脂质膜构成了OFRs的主要和原始的靶点，其富含脂质，该脂质是增加的过氧化作用的位点(A.W.Girotti，1985)。在该脂质氧化过程产生的过氧化物也有高活性，并且能破坏蛋白质和遗传物质。
为了评价膜的改变，我们通过体外分析脂质氧化产物和硫代巴比妥酸产物间的复合物来测定脂质过氧化。这些复合物称为TBARS(硫代巴比妥酸活性物质)，并给出了实验的名称：TBARS实验。
为了模拟化学氧化应激，我们用过氧化氢(H2O2)和铁(Fe2+/Fe3+)组成的复合物处理纤维母细胞株(L929)，因此重构Fenton反应，该反应是氧自由基特别是羟自由基(OHo)的来源(D.A Vessey等人，1992)：
H2O2+Fe2+→OHo+OH-+Fe3+
产物在鼠纤维母细胞株L929上进行评价。细胞用不同浓度的产物预处理16小时，然后用H2O2/Fe2+/Fe3+复合物(200μM-1mM)刺激1小时。
原液：100mg/ml乙醇，4℃
终溶液：0.02ng/ml。
通过测定TBARS分析膜脂过氧化(方法参考PLNo2，依据Morliere等人，1991)。
实验原则
在95℃酸性介质中，在脂质氧化产物(丙二醛或MDA)和硫代巴比妥酸(TBA)产物之间形成TBARS复合物(硫代巴比妥酸活性物质)，其通过使用荧光，对比标准MDA范围进行测定。因此TBARS实验表达pmol/μg的蛋白质。在细胞内介质中测定蛋白质和TBARS。
细胞膜保护百分比的计算
以pmol/μg蛋白质为单位，使用TBARS计算，我们计算各种产物抑制脂质膜氧化的保护效率。
进行四个独立实验。在这些实验中对数种化合物进行评价(该实验一次仅允许测定10个分子)。对这些化合物进行多次测定且选做为其它实验得到的结果的函数，所述其它实验也测定抗自由基活性(测定活性氧的实验)。
本实验使用的模型(Fenton反应)能触发可观的L929纤维母细胞株的脂质过氧化。这种羟自由基OHo的大量释放从而在细胞中，特别是在细胞膜中产生氧化应激。然而，在这种氧化反应的类型中，由脂质过氧化所得的产物在细胞中内化，因此在细胞内介质中测定TBARS。
400μg/ml的维生素E能降低由H2O2/Fe2+/Fe3+复合物触发的脂质过氧化，并非常有效地保护了细胞膜。
表II中列出了四个实验的结果。
非常清楚，这些羟基化衍生物具有稳定和可再生的抗氧化活性。具有短碳链的衍生物尤其如此。
       表II：各种羟基化衍生物对膜脂的保护作用
本研究的体外模型反映了主要氧化应激对主要细胞靶点的结果，该主要细胞靶点为质膜。因此脂质过氧化实验构成良好的氧化应激标记，并可以评价活性成分在细胞膜中抑制羟自由基的抗氧化作用。
维生素E，一种抗氧化分子，可以在有效保护细胞膜抑制氧化应激方面验证本模型。
角质形成细胞分化
最后，表皮在皮肤的主要功能中发挥作用，其抵抗环境并提供保护。它是不断更新的分层的鳞状上皮。内环境稳定和组织再生基于角质形成细胞、支持细胞、可溶性因子，具有细胞临近性的提高的细胞间相互作用(cell proximity enhancing intercellular interaction)以及与细胞外基质的相互作用。
角质层，其是表皮分化的最后阶段，从三个主要过程而来：角蛋白丝的形成、角质形成细胞角化和在片层结构中组织起来的分子间脂质粘合剂的形成。
在表皮内，脂质的组成和性质作为角质形成细胞分化状态的函数而变化。因此作为角质层中的基础细胞传递趋向的细胞，磷脂会有大量还原，在活性层，磷脂对质膜的完整性起重要作用。平行地，中性脂质(游离脂肪酸和甘油三酸酯)和甾醇(胆固醇)有所增加以及鞘脂，特别是神经酰胺有大幅增加。在角质层中，我们发现40-50％的鞘脂、20-27％的胆固醇和9-26％的游离脂肪酸。所述神经酰胺为共价键连接于外皮蛋白的谷氨酸残余部分，角膜外膜的前体。由于它们的疏水性，脂肪酸与皮肤不渗透性有关，而胆固醇与膜流动性有关。
角质层(该层参与表皮的屏障功能)的众多特定蛋白质形成于由最终角质形成细胞构成的颗粒层中，在伴随角化的细胞核裂解之前来显示转录和翻译活性。
角质形成细胞的分化主要基于结构蛋白如角蛋白的进化，角蛋白对表皮的结构完整性有贡献。它们的表达作为表皮细胞成熟度的函数而变化。上基层(superbasal layers)包含碱性角蛋白1和酸性角蛋白10，所谓的末端分化角蛋白。
角质层旁边，角蛋白与富含组氨酸的蛋白质相互作用形成相对均匀的填充角质层细胞的混合物。这些蛋白从前体(丝聚合蛋白原)衍生而来，丝聚合蛋白原为储藏在颗粒层中的大分子(MW＞450kDa)。它是末端N和C基团与钙连接的蛋白质，因此导致去磷酸化和部分蛋白水解从而产生中间丝相关蛋白。它催化在角蛋白丝之间形成二硫桥，并有助于它们进入角质层细胞基质中。此外，由于蛋白水解，这导致氨基酸和肽衍生物的生成，氨基酸和肽衍生物使角质层具有持水性质。
角质层中的角质层细胞基本上含有可插入稠密基质中的角蛋白丝，稠密基质被厚的耐久的蛋白墙即角膜外膜包围。该结构的前体蛋白排列在质膜的内侧，其通过来自棘皮层的角质形成细胞合成。然而，在酶(转谷氨酰胺酶)的作用下形成桥则发生在棘皮层和颗粒层之间。多种胞质蛋白，其与角质形成细胞的膜部分结合或储藏在透明角质颗粒中，对角膜层的发展有贡献。因此，我们提到外皮蛋白(68kDa)，它富含谷氨酰胺和赖氨酸。
角质层的不渗透性很大程度上归因于与角质层细胞相连的疏水分子间脂质粘合剂。表皮的脂质含量是角质形成细胞和皮脂脂肪生成的最终结果。在正常表皮中，中性和极性脂质的混合物在深层中占主体，并逐步被更多的非极性物包括神经酰胺代替。许多蛋白质都参与了脂肪生成的过程和神经酰胺合成。其中，已检测到蛋白质DES2(鞘脂C4-羟化酶/δ-4去饱和酶)。它具有氢化神经酰胺羟化酶活性，并参与植物神经酰胺合成。分化诱导它的表达(MIZUTANI Y.等人，2004)。通过角质形成细胞合成的脂质经板层体(角质小体)指向皮肤表面。它们分泌至细胞间，并以连续板的方式与分布于角质层细胞的细胞膜平行排列。在表皮分化过程中发生脂质重组，该脂质重组会得到一批来自ABC转运体家族(腺苷三磷酸结合盒转运体)的脂质转运体。在这些转运体中，一些表达为角质形成细胞分化的结果(ABCB1、ABCC1、ABCC3、ABCC4和ABCG1)，其它的则其表达受到抑制(ABCB9和ABCD1)，而另一些则不经历调节。人们研究了其表达受诱导的转运体的作用：例如，ABCG1参与在正经历分化的角质形成细胞中胆固醇的易位。在角质形成细胞分化过程中，另一类型转运体的一些成员，FATPs(脂肪酸转运蛋白)如FATP1、FATP3、FATP4和FATP5的表达受诱导。一般认为这些转运体参与中性脂质池的重组(KIELAR等人，2003)。
正常人角质形成细胞(NHK)会体外增殖和分化，形成模拟皮肤基础组织的分层。过量的0.1mM细胞外钙浓度引发基因组和非基因组事件的级联反应，该反应促使角质形成细胞由增殖期向分化期转变。然后通过研究数种标记物如角蛋白1和10、转谷氨酰胺酶1、去饱和酶DES2、外皮蛋白、FATP4和ABCG1转运体的表达可以评价角质形成细胞分化。因此，我们在体外培养模型中评价了某些羟基链烯(hydroxyalcene)羧酸的作用。
本研究设计可在下面解释：NHK体外分化和用于分析的样品。
培养和采样条件
从皮肤培植物中分离正常人角质形成细胞。将它们在具有低钙量(0.1mM)，含有25μg/ml的BPE(牛垂体提取物)和1.5mg/ml的EGF(上皮细胞生成因子)的KSFM培养基(Gibco)中培养。培养24小时后，加入钙(终浓度1.2mM)触发分化。在钙浓度为100和1μg/ml时，同时或不时地加入活性成分，从而测定它们对分化是否具有作用。加入钙和这些产物48小时后分析细胞。
实时提取RNA和RT-PCR
在冷态条件下从角质形成细胞提取总RNA。
将mRNA逆转录成cDNA后，在96孔板中加入PCRs(iCycler定量PCR设备，BioRad)。依照参照基因(GAPDH、UBC、HPRT)的表达规范转谷氨酰胺酶、去饱和酶(DES2)、ABCGl和FATP4的转录表达。用钙和活性成分处理的样品的表达水平对比仅用钙处理的样品的表达。
在下面表格中给出1μg/ml产物的结果：
  9   H   H   H   1.4   1.8   1.5   1.2
  10   H   H   F   1.4   1.6   1.4   1.0
  10   H   H   H   1.5   2.0   1.4   1.2
  13   H   H   F   4.2   9.0   4.8   2.2
  13   H   H   H   1.4   3.0   3.0   1.4
  14   H   H   F   1.7   2.8   4.0   1.0
1μg/ml剂量的产物对分化标记物的表达具有适当作用。
100μg/ml的产物的作用：
10μm的维生素D3诱导转谷氨酰胺酶1、DES2和ABCG1的转录表达，因子分别为8.3、11.1和3.1，对比仅用钙处理的对照。另一方面，用维生素D3处理没有改变FATP4的表达。
因此本发明的不饱和脂肪羟基酸衍生物已证明分化的作用。
在炎症的脂质介质中分析抗炎作用
角质形成细胞对所在环境存在的多种影响细胞外因素做出应答，其为表皮中最丰富的细胞，它释放名为前列腺素和白三烯的生物活性介质，这些介质在表皮炎症反应的起始和调整阶段起重要作用，并也参与免疫应答的调节。前列腺素PG6KF1α为通过受激角质形成细胞生成的主要代谢物，并代表代谢物生成的调节，该调节由花生四烯酸的代谢导致，花生四烯酸由环氧合酶通路生成。
方法：
将角质形成细胞在DMEM10％胎牛血清中的混悬液分加至6孔板(1.2.106细胞/孔)并在37℃于含5％CO2的空气中孵育16小时。然后用PBS冲洗角质形成细胞，从而去除非附着细胞，然后与要测试的、在不含胎牛血清(该物质会干扰本实验)的DMEM中的产物接触。
在培养物中的待测试浓度为3μg/ml。针对细胞毒性(中性红)的初步评价实验后，将该浓度作为实验浓度保留，该浓度时是无毒的。
每次处理，测试三个孔。细胞和要测试的产物预孵60分钟，然后加入刺激剂刺激花生四烯酸级联反应(钙离子载体)，加入其持续5小时：钙离子载体A23187的使用浓度为1μM。
培养5小时后，回收每个孔的培养基，在3000rpm离心并在-80℃储藏。
使用EUROMEDEX Elisa Kit测定每个实验中的前列腺素6KF1α的生成情况。
结果：
结果表示为活性/受激对照的百分比。
抗炎特性：抑制促炎细胞因子IL8的合成
皮肤的屏障功能提供对抗外界环境的保护，且表层中的角质形成细胞对各种各样的刺激剂和致敏剂直接做出应答，并积极参与于皮肤炎症和免疫应答过程，特别是通过促炎细胞因子、蛋白起源的介质的生成来实现。在这些生物活性分子中，IL1α(白细胞介素1α)和TNFα(肿瘤坏死因子α)被认为是原发性细胞因子，它们的释放足够触发炎症，由于它们诱导内皮细胞周围和它们诱导的趋化因子周围的粘附分子。该趋化因子系统控制在炎症反应过程中的白细胞迁移，并为天然和获得性免疫应答作用所需。
在本研究中，我们尤其重视趋化因子(白细胞介素8)，其高度参与炎症反应的放大，因此它的主要作用为募集和激活多核中性粒细胞，即刺激它们释放促炎分子。
在本研究，我们使用96孔板，通过佛波酯PMA和钙离子载体A23187评价羟基炔烃酸(hydroxyl alkine acid)对在角质形成细胞中生成的白细胞介素8的活性。
方法：
将角质形成细胞在添加的KSFM中的混悬液分加至96孔板之间(3.104细胞/孔)并在37℃于含5％CO2的空气中孵育16小时。然后用PBS冲洗角质形成细胞，从而去除非附着细胞，然后与要测试的、在非添加的KSFM(干扰本实验)中的产物接触。
培养中的测试浓度为3μg/ml。针对细胞毒性(中性红)的初步评价实验后，将该浓度作为实验浓度保留，该浓度时是无毒的。
每次处理使用3个孔。细胞和要测试的产物预孵60分钟，然后受激，平行的阴性对照无刺激：佛波酯(PMA)0.1μM+钙离子载体(A23187)0.1μM。
在37℃于含5％CO2的潮湿空气中孵育6小时。
回收每个孔的培养基，在3000rpm离心并在-80℃储藏。
细胞因子实验：使用ELISA Kit免疫酶标法(immunotech)测定IL8。
结果：
结果表示为活性/受激对照的百分比。
  4   H   H   H   15
  4   H   CH3   H   无活性
  6   H   H   H   未确定
  8   H   H   H   无活性
  8   H   H   F   无活性
  9   H   H   H   16
  10   H   H   F   30
  10   H   H   H   30
  13   H   H   F   107
  13   H   H   H   62
  14   H   H   H   无活性
通过本发明化合物对受佛波酯PMA+钙离子载体A23187刺激的人角质形成细胞NHK释放白细胞介素8的抗炎活性来评价该化合物。
进行三个独立实验：对得到的数据进行综合分析显示下面的2个化合物特别具有抗炎活性：
n＝13，R＝Rn＝H，R1＝F
n＝13，R＝Rn＝R1＝H
对于每个分子的测定浓度和计算有效剂量50后，我们的结果显示在下面：
炎症和瘙痒症：刺激PAR2受体后分析钙通量
蛋白酶激活受体-2(PAR-2)参与一些具有炎症反应疾病的生理病理过程。PAR-2通过不同类型的皮肤细胞而表达，所述皮肤细胞包括：角质形成细胞、汗腺的肌上皮细胞、毛囊、真皮的树突状细胞和固有膜及真皮的上皮细胞和(Steinhoff等人，1999；Santulli等人，1995)。黑色素细胞没有表达该受体(Seiberg等人，2000)，虽然PAR-2在色素沉着中起重要作用，它促进黑色素从黑色素细胞向角质形成细胞转移(Sharlow等人，2000)。
通过表皮产生的丝氨酸蛋白酶发挥趋化作用，其诱导白细胞募集在皮肤中。丝氨酸蛋白酶在内环境稳定、有丝分裂和表皮分化调节中起到一定作用，且它们也调节皮肤屏障功能。另外，丝氨酸蛋白酶对与炎症、宿主防御、致癌、纤维化和神经刺激相关的皮肤疾病的生理病理学有贡献。
人们认为丝氨酸蛋白酶的生理和生理病理的皮肤性质是部分与PAR受体有关。事实上，在皮肤炎症疾病如特应性皮炎、扁平苔藓和银屑病的情况下，PAR-2受体在表皮、真皮和脉管中过度表达(Steinhoff等人，1999)。该PAR-2受体也对特应性皮炎病人患有的银屑病的恶化起作用(Steinhoff等人，2003)。
通过胰酶样蛋白酶(trypsin like protease)激活PAR-2触发了从角质形成细胞生成IL8(HaCaT)(Hou等人，1998)。最近，业已证明IL-8，针对白细胞的化学吸引趋化因子(chemo-attractive chemokine)，在患有银屑病的病人中允许中性粒细胞渗透入表皮(Iwakiri等人，2004)。
PAR-2受体的细胞内信号部分从某种程度上决定了细胞内外钙的流动。
因此我们考虑评价式I羟基酸衍生物对经PAR-2受体特定刺激后细胞内钙通量的抗PAR-2活性，，该受体针对的是从HaCaT细胞株生成人角质形成细胞中存在的胰蛋白酶。
本技术基于通过使用经AM基团酯化的荧光探针，AM基团改善了通过被动扩散进入细胞的渗透性。使用的探针为Fluo-4/AM。仅与钙离子连接的脱酯形式在荧光(在485nm)中是可激发的并在535nm处发射。
由胰蛋白酶诱导的钙通量的抑制百分比
胰蛋白酶刺激
针对源自细胞株HaCaT的角质形成细胞：
前面表中所述的通式I羟基酸衍生物对钙流动有抑制作用，钙流动由胰蛋白酶诱导，对于前者，胰蛋白酶的浓度为10μg/ml，对于后面两个化合物，胰蛋白酶的浓度为100μg/ml。
在体外，细胞水平，由胰蛋白酶诱导的PAR-2受体的特定刺激导致细胞内外钙的流动，该流通在荧光探针的帮助下检测。
在实验条件下并于测试浓度，前面表中所述的通式(I)化合物能显著调节抗PAR-2的活性。
脂肪羟基酸衍生物对体外黑色素合成的作用
黑色素细胞是星形细胞，少量存在于表皮基底层中。它们主要的作用是进行黑色素生成，凭借该过程在专门的细胞器中合成黑色素，合成的黑素体经过它们的树突被运输和分散至邻近的角质形成细胞中。与角质形成细胞的接触导致皮肤色素沉着，该机制保护表皮防护紫外线的诱变作用。每个黑色素细胞与周围的36个角质形成细胞接触，因此形成“表皮黑变单元(epidermal melanisation unit)”。
黑色素生成由一系列酶和自发反应组成，而前体是酪氨酸。在这个过程涉及三个主要酶：酪氨酸酶和酪氨酸酶相关蛋白1和2(TRP1和2)(1)。酪氨酸酶催化酪氨酸转化为多巴醌(dopaquinone)。此后，有两种可能的合成途径：真黑素生成和褐黑素生成。通过TRP-1和TRP-2参与的一系列连续氧化反应使多巴醌转化为真黑素。真黑素对应具有低硫含量的褐黑色素，并提供光保护。在褐黑素生成中，具有高硫含量的分子并入多巴醌得到褐黑素，在红发中显橙黄色。
黑色素合成的生理刺激是阳光，阳光导致黑色素细胞数量增加，黑色素的新合成(neosynthesis)和在黑色素细胞中形态学的改变，该改变伴随着增多的树状细胞(dendricity)和从黑素体向角质形成细胞转移的增多。在分子水平，暴露于阳光刺激了α黑色素细胞的合成与分泌，α黑色素细胞又刺激荷尔蒙。α-MSH增加了黑色素细胞内cAMP的浓度，激活了转录因子Mitf、TRP-1和TRP-2，Mitf反过来在其转变中刺激为酪氨酸酶编码的基因转录活性。
已知一些外源性分子具有黑色素生成的负调节作用。氢醌通过使其自身作为酪氨酸酶底物转移它的活性从而达到抑制黑色素生成的作用。
分析了不饱和脂肪羟基酸衍生物对黑色素生成的调节作用。要做到这一点，在鼠黑素瘤细胞株：细胞株B16-F10上通过比色实验进行黑色素合成测定。
产物的作用在基础条件中并在经α-MSH刺激后进行研究，从而决定褪色能力。
黑色素实验
依据Anob等人，1999所述的方法使用分光光度法在405nm波长测定细胞内外黑色素水平。使用标准黑色素范围并在Microwin分析软件(Berthold Biotechologies)上分析来决定色素的量。针对分子内黑色素样品的总蛋白实验分析通过BCA-Copper方法在540nm处进行。使用标准蛋白BSA(牛血清白蛋白)建立标准范围。
结果
在基础条件中，对比对照细胞，1μM的α-MSH 100％增加了黑色素的生成。
通过褪色剂如1μg/ml氢醌或40μg/ml维生素C对抗这种黑色素的增加，褪色剂能抑制60％的α-MSH活性。
在基础条件30μg/ml：
.具有n＝10，R＝Rn＝H，R1＝F的通式I化合物对黑色素合成的抑制率为30-45％，而无α-MSH时，相同的化合物30μg/ml的抑制率为45-60％。
.具有n＝10，R＝R1＝Rn＝H的通式I化合物在30μg/ml相比前一化合物具有较低活性，在基础条件中显示15％的抑制率，而无α-MSH时，这种化合物对黑促素物质(melanotropic substance)的抑制能力和前一化合物相似，换言之抑制率为45-60％。
在10μg/ml，这两个酸对通过α-MSH诱导的黑色素生成的抑制活性约为35％。

Claims (15)

1.一种通式为（Ⅰ）的不饱和脂肪羟基酸衍生物：
其中：
.Rn独立地代表一个或多个H或者甲基，
.R1为H、F、Cl或Br，
.R为H，并且
.3≤n≤14，
然而，如果当n≠10时，R1基团和Rn基团中至少一个不为氢。
2.根据权利要求1所述的通式（Ⅰ）的不饱和脂肪羟基酸衍生物，其中：
.R1代表F、Cl或Br，
.Rn和n与它们在权利要求1中的定义相同。
3.根据权利要求1所述的通式（Ⅰ）的不饱和脂肪羟基酸衍生物，其中：
.R、R1和Rn与它们在权利要求1中的定义相同，并且
.6≤n≤14，
然而，如果当n≠10时，R1基团和Rn基团中至少一个不为氢。
4.根据权利要求1所述的通式（Ⅰ）不饱和脂肪羟基酸衍生物，其中：
.R1代表F、Cl或Br，
.Rn=H。
5.根据权利要求1所述的通式（Ⅰ）的不饱和脂肪羟基酸衍生物，其中：
.R1代表F、Cl或Br，并且
.Rn基团的至少一个为甲基。
6.根据权利要求1所述的通式（Ⅰ）的不饱和脂肪羟基酸衍生物，其中：
.R1=F
.Rn=H，且
.n=3、4、6、8、10、13或14。
7.根据权利要求6所述的通式（Ⅰ）的不饱和脂肪羟基酸衍生物，其中：
.R1=F
.Rn=H
.n=13。
8.根据权利要求2所述的通式（Ⅰ）的不饱和脂肪羟基酸衍生物，其中：
.R1=F
.Rn=H
.n=6。
9.根据权利要求1所述的通式（Ⅰ）的不饱和脂肪羟基酸衍生物，其中：
.R=R1=H
.Rn基团中仅一个为甲基，其它为氢原子，并且
.n=4。
10.根据权利要求1所述的通式（Ⅰ）的不饱和脂肪羟基酸衍生物，其中：
.R1=Rn=H，并且
.n=10。
11.根据权利要求2所述的通式（Ⅰ）的不饱和脂肪羟基酸衍生物，其中：
.R1=F
.Rn=H，并且
.n=10。
12.根据权利要求2所述的通式（Ⅰ）的不饱和脂肪羟基酸衍生物，其中：
.R1=F
.Rn=H，并且
.n=8。
13.皮肤美容组合物，该组合物包括如权利要求1-12任何一项所述的通式（Ⅰ）的不饱和脂肪羟基酸衍生物以及皮肤病学上可接受的赋形剂。
14.通式（Ⅰ）的不饱和脂肪羟基酸衍生物在制备具有抗自由基、抗炎、止痒活性，和/或用于治疗角质化和/或用于促进愈合的皮肤美容组合物中的用途，
其中：
.Rn独立地代表一个或多个H或者甲基，
.R1为H、F、Cl或Br，
.R为H，并且
.3≤n≤14。
15.通式（Ⅰ）的不饱和脂肪羟基酸衍生物在制备用于治疗银屑病、瘙痒症和/或特应性皮炎的皮肤美容组合物中的用途，
其中：
.Rn独立地代表一个或多个H或者甲基，
.R1为H、F、Cl或Br，
.R为H，并且
.3≤n≤14。
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