CN101283985B - 渔用肠溶口服疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于渔用口服疫苗领域。渔用肠溶口服疫苗，包括外周喷涂疫苗层的颗粒或微丸、在疫苗层外逐层包衣隔离层和肠溶层，用于疫苗喷涂及隔离层包衣的干粉组合物A的组分及重量比分别为：成膜剂选用羟丙基甲基纤维素、聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮的一种或一种以上，重量比为40～60份；增塑剂选用三磷酸甘油酯、柠檬酸三乙酯或聚乙二醇的一种或一种以上，重量比为3～10份，防粘剂选用二氧化硅、硬脂酸镁、滑石粉或二氧化钛的一种或一种以上，重量比为30～50份，表面活性剂选用卵磷脂、吐温-80的一种，重量比为0～5份。本发明的疫苗能够在肠道中定点释放。

Description

渔用肠溶口服疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于渔用口服疫苗领域。

背景技术

养殖鱼类的疾病呈逐年增加趋势，所造成的经济损失巨大，严重阻碍了水产养殖业的发展。目前控制各种疾病的主要手段是广泛、大量的投入化学药物和抗生素，而长期大量使用化学药物和抗生素的结果，产生了环境污染问题，致病性和非致病性微生物耐药性问题，以及药物残留超标的食品安全问题；例如多宝鱼事件就是典型的例子，受到多方密切关注。目前，国家已明令禁止生产和使用危害严重的药物。提高水产养殖疾病防控能力迫在眉睫。随着绿色环保食品和环境保护的要求以及免疫学技术的发展，免疫防治技术在疾病防治中的应用已越来越受到重视。应用疫苗、免疫增强剂等活化或加强动物自身的特异性和非特异性免疫功能，提高抗病能力，是今后防治病害最为有效的途径之一，是我国科学研究重点支持的领域之一。

国内外相继开展了应用疫苗防治养殖鱼类疾病的技术研究，制备了多种渔用疫苗，有浸泡、注射、口服三种剂型。由于浸泡接种具有疫苗消耗量大，免疫效果差的缺点，注射接种疫苗要求有一定的操作技术，且操作过程繁琐，工作量大，均不适宜生产应用。口服接种具有免疫效率高，疫苗需求量适中，操作方便的优点，适宜在生产中大规模应用，成为当前研究热点。

目前的研究主要集中在微粒、微胶囊方面。一种研究用聚乳酸-乙醇酸共聚物PLG和聚乙烯醇(产品型号1788)采用复乳挥发法制备嗜水气单胞菌口服疫苗，但没有报道PLG、聚乙烯醇组合比例，产品相对免疫保护率为42.9％(丁诗华，《西南农业大学学报》2005年27卷6期)。一种研究采用海藻酸钠、6％PVP-30制备了银鲫嗜水气单胞菌微胶囊疫苗，产品相对免疫保护率61.1％(李新华，《水生生物学报》2007年第31期)。这两种研究均是希望实现递送疫苗有效作用于肠道粘膜免疫相关淋巴组织的目的。但是，以上技术没有进行相关鱼类胃肠道消化生理特性的研究，也没有进行肠溶性实验观察，不能建立起适宜的疫苗控释技术，缺少微粒、微胶囊疫苗体内、体外释放的观察，不能明确微粒、微胶囊疫苗在胃肠道中的释放部位。其制备技术所采用的材料不具备确定的pH依赖性，只能实现口服递送并发挥一定的缓释作用，不能有效实现肠道释放的目的，如果疫苗释放过早，将被胃酸、消化酶消化、破坏，不能有效保护疫苗作用于肠道粘膜免疫相关淋巴组织。而且以上技术制备过程中需要将疫苗混溶到高分子材料的有机溶剂中，有机溶剂的存在会破坏疫苗的免疫源性，导致疫苗免疫效果不稳定，进一步限制了其在生产中的应用。

由于受胃肠道因素的影响，多数蛋白类药物易失活且吸收差，致使生物利用度差，其口服给药系统仍面临挑战。(疫苗口服接种及其微粒传输系统，李凤前，费轶博等，药学学报，2007年，42(3)：322-328。口服疫苗传递系统研究进展，宋洪涛，张倩等，解放军药学学报，2005年，21(1)：47-50)。因此，口服疫苗需要解决的关键点之一是如何保证疫苗顺利地通过胃部，而不被胃酸、胃消化酶环境所破坏，在肠道中充分释放，有效作用于肠道粘膜免疫相关淋巴组织，高效激发免疫应答。

发明内容

本发明的目的是提供一种鱼用肠溶口服疫苗的制备方法，采用多层功能性包被技术，通过改变含有疫苗的丸芯或微粒及其包被层的结构以及包被层成分及其含量，使其可以在鱼胃液中起到保护疫苗的作用，在鱼肠道中释放出疫苗，发挥免疫作用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：渔用肠溶口服疫苗，其特征在于，包括外周喷涂疫苗层2的颗粒或微丸1、在疫苗层2外逐层包衣隔离层3和肠溶层4；用于疫苗喷涂及隔离层包衣的干粉组合物A，和用于肠溶层包衣的干粉组合物B的组分及重量比分别为：

干粉组合物A：成膜剂选用羟丙基甲基纤维素、聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮的一种或一种以上，重量比为40～60份；增塑剂选用三磷酸甘油酯、柠檬酸三乙酯或聚乙二醇的一种或一种以上，重量比为3～10份，防粘剂选用二氧化硅、硬脂酸镁、滑石粉或二氧化钛的一种或一种以上，重量比为30～50份，表面活性剂选用卵磷脂、吐温-80的一种，重量比为0～5份；

干粉组合物B：成膜剂是丙烯酸树脂、羟丙甲基纤维素酞酸酯或羧甲基纤维素钠的一种或一种以上，重量比为40～60份，增塑剂是邻苯二甲酸二乙酯或柠檬酸乙酰基三丁酯的一种或一种以上，重量比为10～20份，防粘剂是滑石粉、二氧化硅或二氧化钛的一种或一种以上，重量比为20～50份。

由于鱼用疫苗易受温度、酸碱度、胃蛋白酶影响，直接口服接种会损坏疫苗，降低疫苗免疫效果，无法口服给药。

养殖鱼类的胃液pH一般在2.0～5.5，胃排空时间一般在4～8小时，肠液pH一般在5.5～7.5。我们对牙鲆鱼的消化道进行了取样检测，其胃液pH为2.5～4.5，胃排空时间4～8小时，肠道pH为6.0～7.5。

在此基础上，依据牙鲆鱼胃肠pH变化，并结合丙烯酸树脂的溶解性具有pH依赖的特点，我们设计一系列以丙烯酸树脂为主的包衣材料组方和肠溶口服疫苗制备方案，既保护疫苗在鱼胃中不被破坏，又使疫苗在肠道中迅速释放，与肠道粘膜接触，产生粘膜免疫反应，获得高效免疫效果，解决疫苗口服给药的问题。

又由于灭活疫苗产品多对pH有一定的敏感性，在酸性环境下，疫苗活性降低。而且此类疫苗也易受有机溶剂的影响，使蛋白变性失活。而pH依赖的肠溶丙烯酸树脂本身呈现偏酸性特点，疫苗层与丙烯酸树脂直接接触会导致疫苗效价降低，同时丙烯酸树脂需要使用有机溶剂进行溶解，在包衣过程也容易影响疫苗活性。本技术采用了隔离层包衣，即在疫苗层与肠溶包衣层之间包覆一层非pH依赖的中性材料，并且使用水为溶剂，隔离疫苗与丙烯酸树脂接触和包衣过程的有机溶剂与疫苗接触，有效防止了疫苗本身的失活问题。

在疫苗喷涂过程中，本研究采用了中性材料的隔离层包衣所用干粉组合物，有效避免了口服疫苗在制备过程中使用有机溶剂所带来的疫苗失活问题。采用高分子材料混悬液进行喷涂，疫苗被牢固有效地包裹于颗粒或丸芯表面，避免了疫苗加入的不均匀和疫苗附着不牢固的缺点。同时疫苗是通过喷涂技术附着于颗粒核心的表面，与制粒过程中加入疫苗相比，在肠道内只要外层包衣材料溶解，不再需要颗粒核心全部崩散或溶解，即可使疫苗迅速释放，作用于肠道粘膜免疫相关淋巴组织，发挥免疫作用。

渔用肠溶口服疫苗制备方法：渔用肠溶口服疫苗的制备过程分为疫苗喷涂、隔离层包衣、肠溶层包衣三个主要步骤：

疫苗喷涂：将适量的疫苗生理盐水溶液混入制备好的固含量(干粉组合物与总溶液量的重量百分比)为5～20％的干粉组合物A的水性混悬液中，制成含有疫苗10⁶～10¹¹CFU/ml的水性混悬液，使用高压喷枪均匀喷涂于10～30目的淀粉颗粒或微丸表面；活性疫苗含量为10⁶～10¹¹CFU/g。

隔离层包衣：将干粉组合物A溶于水中，制备成5～20％固含量的混悬液，使用高压喷枪均匀喷涂与疫苗层表面，包衣增重(干粉组合物的用量与包衣载体的重量比)为2％～10％；

肠溶层包衣：将肠溶层干粉组合物B溶于60～90％乙醇溶液中，制备成5～20％固含量的混悬液，使用高压喷枪均匀喷涂于隔离层表面，包衣增重为5～20％。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明所制备出的疫苗，能够控制口服疫苗在肠道中定点释放，保护疫苗顺利通过胃部消化环境不被胃酸及消化酶破坏，胃内肠溶层溶解率低于9％，肠道内疫苗层溶解释放率高于78％，即疫苗在胃内得到了有效的保护，在肠道内能够充分释放，疫苗有效作用于肠道黏膜免疫相关淋巴组织，高效激发免疫应答，显著提高口服疫苗免疫效率。以牙鲆腹水病肠溶型口服疫苗为例，经过口服免疫牙鲆实验，粘膜抗体效价最大达到1∶256，免疫保护率达到60％以上，最高达到80％。而且在制备过程中，疫苗喷涂采用水为溶剂，中性高分子材料增强疫苗附着牢固度，减少有机溶剂的影响，隔离层将疫苗与偏酸性的肠溶层隔离，有效避免了疫苗在制备以及储存过程中失活、效价降低的问题。

附图说明

图1是渔用肠溶口服疫苗的结构示意图，其中，1颗粒或微丸，2疫苗层，3隔离层，4肠溶层。

具体实施方式

鱼用肠溶口服疫苗结构见示意图1。

鱼用肠溶疫苗，包括带有疫苗层2的颗粒或微丸1、在颗粒或微丸外逐层设有隔离层3和肠溶层4；其中，用于疫苗喷涂及隔离层包衣的干粉组合物A，和用于肠溶层包衣的干粉组合物B的组分及重量比为：

干粉组合物A：成膜剂选用羟丙基甲基纤维素、聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮的一种或一种以上，重量比为40～60份；增塑剂选用三磷酸甘油酯、柠檬酸三乙酯或聚乙二醇的一种或一种以上，重量比为3～10份，防粘剂选用二氧化硅、硬脂酸镁、滑石粉或二氧化钛的一种或一种以上，重量比为30～50份，表面活性剂选用卵磷脂、吐温-80的一种，重量比为0～5份；

干粉组合物B：成膜剂是丙烯酸树脂、羟丙甲基纤维素酞酸酯或羧甲基纤维素钠的一种或一种以上，重量比为40～60份，增塑剂是邻苯二甲酸二乙酯或柠檬酸乙酰基三丁酯的一种或一种以上，重量比为10～20份，防粘剂是滑石粉、二氧化硅或二氧化钛的一种或一种以上，重量比为20～50份。

下面实施例说明本发明的包衣组合物各种配方及肠溶口服的制备工艺参数，以及采用此组合物及方法制备的渔用肠溶口服疫苗应用效果检测结果。

实施例1

制备方法：选取10～30目的淀粉颗粒，备用。

第一步疫苗喷涂：将干粉组合物A溶于水中，配制成固含量为5％的水性混悬液，再向其中加入适量牙鲆鱼腹水病疫苗生理盐水溶液(10⁸CFU/ml)，制备成10⁶CFU/ml疫苗浓度的混悬液，使用高压喷枪均匀喷涂于颗粒表面。疫苗喷涂量10⁶CFU/g。

第二步隔离层包衣：将干粉组合物A溶于水中，制备成固含量5％混悬液，使用高压喷枪均匀喷涂于疫苗层表面。包衣增重为2％。

干粉组合物A配方组成为：

羟丙甲基纤维素E5       25g

羟丙甲基纤维素E15      22g

聚乙烯醇S205           13g

柠檬酸三乙酯           5g

聚乙二醇6000           5g

滑石粉                 29g

二氧化硅               1g

第三步肠溶层包衣：将干粉组合物B溶于60％乙醇溶液中，制备成固含量6％的混悬液，使用高压喷枪均匀喷涂于隔离层表面。包衣增重为5％。

干粉组合物B配方组成为：

丙烯酸树脂I           20g

丙烯酸树脂II          25g

丙烯酸树脂III         10g

羧甲基纤维素钠LF-100  5g

邻苯二甲酸二乙酯      15g

柠檬酸乙酰基三丁酯    5

二氧化钛              3g

滑石粉                17g

产品评价方法及检测结果：

口服疫苗如何顺利地通过胃酸、胃消化酶环境不被破坏，在肠道中充分释放，有效作用于肠道粘膜免疫相关淋巴组织，高效激发免疫应答是评价该肠溶口服疫苗的有效手段。

渔用肠溶口服疫苗可以保护疫苗顺利地通过胃酸、胃消化酶环境不被破坏，在肠道中充分释放，有效作用于肠道粘膜免疫相关淋巴组织，高效激发免疫应答。该研究设计了体内解剖观察的方法考察肠溶口服疫苗的耐胃酸性和肠溶性，并通过抗体效价检测和相对免疫保护率两项实验综合评价产品效果：

具体试验方法如下：1.耐胃酸、肠溶性检测

为了便于解剖观察肠溶层、隔离层、疫苗层溶解情况，在制备过程中选择白色丸芯或微粒，分别在肠溶层、隔离层、疫苗层加入绿色、黄色、蓝色食用铝色淀，将肠溶层、隔离层、疫苗层分别标记为绿色、黄色和蓝色。

随机取20尾体长10～12cm健康牙鲆，每尾灌服标记颜色的渔用肠溶口服疫苗20粒，正常条件下养殖。口服后4h、6h、8h、10h，分别随机取3尾实验鱼，解剖观察肠溶层、隔离层、疫苗层在胃肠道中溶解情况，记录胃中、肠道中产品的总颗粒数量，以及胃中肠溶层溶解(绿色消失)的总颗粒数，肠道中疫苗层溶解(暴露白色核芯)的总颗粒数。

耐胃酸性是指肠溶口服疫苗肠溶层在鱼胃中不溶解，可避免疫苗与胃酸、胃消化酶接触，有效保护疫苗抗原。耐胃酸性以肠溶层溶解(绿色消失)百分率表示，其数值越低表示胃中保护效果越好，计算公式为：

肠溶层溶解率(P₁)＝胃中肠溶层溶解的颗粒数/胃中疫苗总颗粒数100％

肠溶性是指肠溶口服疫苗在肠道中溶解，有效释放疫苗。以蓝色疫苗层开始溶解，暴露出白色颗粒核芯的百分率表示，数值越高表示疫苗释放越充分，计算公式：

疫苗层释放率(P₂)＝肠道中观察到白色核芯颗粒数/肠道中总疫苗颗粒总数*100％

肠溶口服疫苗耐胃酸、肠溶性解剖观察结果如下：

2.肠道粘膜抗体效价测定：

选择体长10～12cm健康牙鲆鱼20尾，按照免疫程序口服接种肠溶疫苗。在初免后4周，随机取3尾免疫鱼，活体解剖取肠道，无菌生理盐水冲洗后，小心刮取肠道粘膜，收集入无菌塑料管中，组织匀浆器匀浆，离心机离心后，取上清液，此即为微量凝集反应用抗体。根据抗原抗体凝集反应原理进行微量凝集反应实验，测定免疫鱼肠道粘膜抗体效价。以3尾鱼抗体效价全距和平均值表示群体粘膜抗体水平。

检测结果：全距1：128~256，均值1：170.7。

3.相对免疫保护率测定：

在免疫鱼抗体水平最高时，取免疫鱼20尾、未免疫鱼20尾，根据病原菌全致死量确定攻毒剂量进行攻毒试验，同时设正常养殖试验对照组，分别观察实验鱼死亡情况。正常养殖试验对照组在试验期间以相同饲养条件饲养而不附加任何实验条件。根据实验鱼死亡情况计算相对免疫保护率。

相对免疫保护率(RPS)＝(未免疫组死亡数-免疫组死亡数)/未免疫组死亡数×100％

检测结果：

实施例2

制备方法：选取10～30目的淀粉颗粒，备用。

第一步疫苗喷涂：将干粉组合物A溶于水中，配置成固含量为8％水性混悬液，再向其中加入适量牙鲆鱼腹水病疫苗生理盐水溶液液(10¹⁰CFU/ml)，制备成10⁷CFU/ml疫苗浓度的混悬液，使用高压喷枪均匀喷涂于颗粒表面。疫苗喷涂量10⁷CFU/g。(即每克喷涂完的颗粒含疫苗10⁷CFU)

第二步隔离层包衣：将干粉组合物A溶于水中，制备成固含量8％混悬液，使用高压喷枪均匀喷涂于疫苗层表面。包衣增重为4％。

干粉组合物A配方组成为：

羟丙甲基纤维素E5          30g

羟丙甲基纤维素E15     20g

聚乙烯吡咯烷酮VA64    7g

柠檬酸三乙酯          5g

聚乙二醇6000          5g

卵磷脂                0.1g

滑石粉                32.5g

硬脂酸镁              0.4g

第三步肠溶层包衣：将干粉组合物B溶于70％乙醇溶液中，制备成固含量8％的混悬液，使用高压喷枪均匀喷涂于隔离层表面。包衣增重为5％。

干粉组合物B配方组成为：

丙烯酸树脂I           15g

丙烯酸树脂II          37g

丙烯酸树脂III         5g

柠檬酸乙酰基三丁酯    18g

二氧化硅              3g

滑石粉                22g

产品检测结果：

1.耐胃酸性及肠溶性

2.抗体效价及相对免疫保护率检测结果

实施例3渔用肠溶疫苗的功能性干粉成膜组合物

制备方法：选取10～30目的淀粉颗粒，备用。

第一步疫苗喷涂：将干粉组合物A溶于水中，配置成固含量为5％的水性混悬液，再向其中加入适量牙鲆鱼腹水病疫苗生理盐水溶液液(10¹⁰CFU/ml)，制备成10⁸CFU/ml疫苗浓度的混悬液，使用高压喷枪均匀喷涂于颗粒表面。疫苗喷涂量10⁸CFU/g。

第二步隔离层包衣：将干粉组合物A溶于水中，制备成固含量10％混悬液，使用高压喷枪均匀喷涂与疫苗层表面。包衣增重为4％。

干粉组合物A的配方组成为：

羟丙甲基纤维素E5      25g

羟丙甲基纤维素E15     20g

聚乙烯醇S205          10g

三磷酸甘油酯          5g

聚乙二醇6000          4g

卵磷脂                0.1g

滑石粉                35.4g

硬脂酸镁               0.5g

第三步肠溶层包衣：将干粉组合物B溶于75％乙醇溶液中，制备成固含量10％的混悬液，使用高压喷枪均匀喷涂于隔离层表面。包衣增重为8％。

干粉组合物B配方组成为：

丙烯酸树脂II                32g

丙烯酸树脂III               10g

羟丙甲基纤维素酞酸酯HP55    13g

邻苯二甲酸二乙酯            15g

二氧化钛                     8g

滑石粉                       22g

产品检测结果：

1.耐胃酸性及肠溶性

2.抗体效价及相对免疫保护率检测结果

实施例4渔用肠溶疫苗的功能性干粉成膜组合物

制备方法：选取10～30目的淀粉微丸，备用。

第一步疫苗喷涂：将干粉组合物A溶于水中，配置成固含量为13％的水性混悬液，再向其中加入适量牙鲆鱼腹水病疫苗生理盐水溶液(10¹²CFU/ml)，制备成10⁹CFU/ml疫苗浓度的混悬液，使用高压喷枪均匀喷涂于颗粒表面。疫苗喷涂量10⁹CFU/g。

第二步隔离层包衣：将干粉组合物A溶于水中，制备成固含量13％混悬液，使用高压喷枪均匀喷涂与疫苗层表面。包衣增重为6％。

干粉组合物A的配方组成为：

羟丙甲基纤维素E5      20g

羟丙甲基纤维素E15     15g

聚乙烯醇S205          18g

三磷酸甘油酯          5g

吐温-80               1g

滑石粉                36g

二氧化钛              5g

第三步肠溶层包衣：将干粉组合物B溶于80％乙醇溶液中，制备成固含量12％的混悬液，使用高压喷枪均匀喷涂于隔离层表面。包衣增重为10％。

干粉组合物B配方组成为：

丙烯酸树脂I     10g

丙烯酸树脂II    20g

丙烯酸树脂III      20g

邻苯二甲酸二乙酯   15g

二氧化钛           8g

滑石粉             27g

产品检测结果：

1.耐胃酸性及肠溶性

2.抗体效价及相对免疫保护率检测结果

实施例5

制备方法：选取10～30目的淀粉微丸，备用。

第一步疫苗喷涂：将干粉组合物A溶于水中，配置成固含量为15％的水性混悬液，再向其中加入适量牙鲆鱼腹水病疫苗生理盐水溶液(10¹²CFU/ml)，制备成10¹⁰CFU/ml疫苗浓度的混悬液，使用高压喷枪均匀喷涂于颗粒表面。疫苗喷涂量10¹⁰CFU/g。

第二步隔离层包衣：将干粉组合物A溶于水中，制备成固含量15％混悬液，使用高压喷枪均匀喷涂与疫苗层表面。包衣增重为8％。

干粉组合物A的配方组成为：

羟丙甲基纤维素E5     20g

羟丙甲基纤维素E15    8g

聚乙烯醇S205     22g

三磷酸甘油酯     3g

吐温-80          1g

滑石粉           40g

二氧化硅         6g

第三步肠溶层包衣：将干粉组合物B溶于85％乙醇溶液中，制备成固含量15％的混悬液，使用高压喷枪均匀喷涂于隔离层表面。包衣增重为15％。

干粉组合物B配方组成为：

丙烯酸树脂II         30g

丙烯酸树脂III        15g

邻苯二甲酸二乙酯     12g

二氧化钛             10g

滑石粉               33g

产品检测结果：

1.耐胃酸性及肠溶性

2.抗体效价及相对免疫保护率检测结果

实施例6

制备方法：选取10～30目的淀粉颗粒，备用。

第一步疫苗喷涂：将干粉组合物A溶于水中，配置成固含量为20％的水性混悬液，再向其中加入适量牙鲆鱼腹水病疫苗生理盐水溶液(10¹²CFU/ml)，制备成10¹¹CFU/ml疫苗浓度的混悬液，使用高压喷枪均匀喷涂于颗粒表面。疫苗喷涂量10¹¹CFU/g。

第二步隔离层包衣：将干粉组合物A溶于水中，制备成固含量20％混悬液，使用高压喷枪均匀喷涂与疫苗层表面。包衣增重为6％。

干粉组合物A的配方组成为：

羟丙甲基纤维素E5       20g

羟丙甲基纤维素E15      10g

聚乙烯醇S205           10g

三磷酸甘油酯           5g

吐温-80                5g

滑石粉                 40g

二氧化硅               10g

第三步肠溶层包衣：将干粉组合物B溶于90％乙醇溶液中，配制成固含量20％的混悬液，使用高压喷枪均匀喷涂于隔离层表面。包衣增重为20％。

干粉组合物B配方组成为：

丙烯酸树脂II         32g

丙烯酸树脂III        8g

邻苯二甲酸二乙酯     10g

二氧化钛             10g

滑石粉               40g

产品检测结果：

1.耐胃酸性及肠溶性

2.抗体效价及相对免疫保护率检测结果

采用本发明的材料组合并通过疫苗喷涂、隔离层包衣、肠溶层包衣的工艺技术，产品完全能够达到渔用口服给药的目的，同时口服疫苗在肠道中定点释放，保护疫苗顺利通过胃部消化环境不被胃酸及消化酶破坏，有效作用于肠道黏膜免疫相关淋巴组织，高效激发免疫应答，显著提高了口服疫苗的免疫效率。

Claims (3)

1.渔用肠溶口服疫苗，其特征在于，包括外周喷涂疫苗层的颗粒或微丸、在疫苗层外逐层包衣隔离层和肠溶层；用于疫苗喷涂及隔离层包衣的干粉组合物(A)，和用于肠溶层包衣的干粉组合物(B)的组分及重量分别为：

干粉组合物(A)：成膜剂选用羟丙基甲基纤维素、聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮的一种以上，重量为40～60份；增塑剂选用三磷酸甘油酯、柠檬酸三乙酯或聚乙二醇的一种以上，重量为3～10份，防粘剂选用二氧化硅、硬脂酸镁、滑石粉或二氧化钛的一种以上，重量为30～50份，表面活性剂选用卵磷脂、吐温-80的一种，重量为0～5份；

干粉组合物(B)：成膜剂是丙烯酸树脂、羟丙甲基纤维素酞酸酯或羧甲基纤维素钠的一种以上，重量为40～60份，增塑剂是邻苯二甲酸二乙酯或柠檬酸乙酰基三丁酯的一种以上，重量为10～20份，防粘剂是滑石粉、二氧化硅或二氧化钛的一种以上，重量为20～50份。

2.根据权利要求1所述的渔用肠溶口服疫苗，其特征在于，所述的颗粒或微丸选用10～30目的淀粉颗粒。

3.一种制备如权利要求1所述渔用肠溶口服疫苗的方法：主要包括疫苗喷涂和隔离层包衣及肠溶层包衣三个步骤：

疫苗喷涂：将适量的疫苗生理盐水溶液混入制备好的固含量为5～20％的干粉组合物(A)的水性混悬液中，制成含有疫苗10⁶～10¹¹CFU/ml的水性混悬液，使用高压喷枪均匀喷涂于10～30目的淀粉颗粒或微丸表面；活性疫苗含量为10⁶～10¹¹CFU/g；

隔离层包衣：将干粉组合物(A)溶于水中，制备成5～20％固含量的混悬液，使用高压喷枪均匀喷涂于疫苗层表面，包衣增重为2％～10％；

肠溶层包衣：将肠溶层干粉组合物(B)溶于60～90％乙醇溶液中，制备成5～20％固含量的混悬液，使用高压喷枪均匀喷涂于隔离层表面，包衣增重为5～20％；

所述固含量是干粉组合物与总溶液的重量百分比，所述的包衣增重为干粉组合物的用量与包衣载体的重量百分比。

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