CN101282985B - 用透明质酸低聚衍生物覆盖的细胞表面 - Google Patents

用透明质酸低聚衍生物覆盖的细胞表面 Download PDF

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Abstract

公开了通过与脂类共价连接的方式来帮助透明质酸定位于生殖细胞表面的定位生殖方法。

Description

用透明质酸低聚衍生物覆盖的细胞表面
技术领域
本发明涉及将碳水化合物定位于细胞或多细胞结构表面的方法，和用于这种方法的碳水化合物-脂类结构。
特别是，本发明涉及用于将透明质酸定位于细胞或多细胞结构表面的碳水化合物-脂类结构，和其在体外受精和胚胎移植的方法中的用途。
背景技术
细胞和多细胞结构的发育受细胞外基质(ECM)的影响。透明质酸(HA)是ECM的主要糖胺多糖组分。
HA是一种在女性生殖道中最丰富的糖胺多糖(GAGs)(Lee和Ax(1984)；Toole(1991))。已经显示，用HA补充半合成与合成培养基可以提高体外成熟和受精牛胚胎发育至胚泡阶段，不会影响胚胎质量和冷冻后的存活。
为了提高从体外成熟牛卵母细胞中产生体外胚泡的效率，已经建议在培养基中包含HA(Furnus等人(1998))。实际上，在个别研究中，当HA是在培养基中的大分子时，可以观察到胚泡转移后，移植和胎儿发育的最高比例(Gardner等人(1999))。
一些补充有HA的商品胚胎移植培养基产品是可得到的(
Figure GSB00000643115200011
Vitrolife，UTM TM Medicult)。尽管可利用这些产品，但对于HA在移植和胎儿发育的有益效果的基础还没有充分地理解。
HA可以起到生物物理学作用，这种作用可以调节胚胎和子宫内膜表面之间的相互影响。Furnus等人(1998)提出，HA可以有益于胚胎发育本身，或调节胚胎所合成因子的作用，其以自分泌方式起作用。
Gardner等人(1999)提出，在他们已发生的研究中，当血清白蛋白和HA存在于相同培养基中时，获得了最高细胞数量和孵育率。这些作者建议，胚胎培养基应该含有血清白蛋白和HA两者，而转移培养基只需要含有HA。
发明内容
本发明的一个目的是提供用于将碳水化合物定位于胚胎表面的碳水化合物-脂类结构。
本发明的进一步目的是提供用于影响细胞和多细胞结构发育的碳水化合物-脂类结构。
本发明的更进一步目的是提供用于提高由辅助生殖技术得到成功结果的可能性的方法。
这些目的可分别理解，以便至少给公众提供有用的选择。
发明公开
在第一个方面，本发明提供了将透明质酸定位于细胞或多细胞结构表面的方法，包括下列步骤：
·使细胞或多细胞结构与结构为F-S1-S2-L的碳水化合物-脂类结构的分散体接触
其中：
F是透明质酸的低聚物或聚合物，透明质酸由β1-4连接的葡糖醛酸β1-3N-乙酰氨基葡萄糖(GlcUAβ1-3GlcNAc)的双糖单元组成；
S1-S2是连接F至L的间隔基；和
L是选自二酰基-或二烷基-甘油脂的脂类，包括甘油磷脂。
优选F、S1、S2和L共价连接。
优选F是15-20mer。
优选，选择S1-S2，以提供可稳定地引入脂双层的水溶性结构。
优选L选自下列构成的组：二酰基甘油脂、磷酸脂、卵磷脂、脑磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油，和衍生自下列一或多种的双磷脂酰甘油：反式-3-十六碳烯酸、顺式-5-十六碳烯酸、顺式-7-十六碳烯酸、顺式-9-十六碳烯酸、顺式-6-十八碳烯酸、顺式-9-十八碳烯酸、反式-9-十八碳烯酸、反式-11-十八碳烯酸、顺式-11-十八碳烯酸、顺式-11-二十碳烯酸或顺式-13-二十二碳烯酸(docsenoic acid)。更优选，脂类源自于一或多种顺式-不饱和脂肪酸。最优选L选自：1，2-O-二油酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇氨基(DOPE)，1，2-O-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇氨基(DSPE)和rac-1，2-二油酰基甘油(DOG)。
在本发明第一个方面的第一个实施方案中，L是甘油磷脂，碳水化合物-脂类结构包括下列子结构：
Figure GSB00000643115200031
其中n＝3至5，*不是H。优选n是3。
在本发明第一个方面的第二个实施方案中，L是甘油脂，碳水化合物-脂类结构包括下列子结构：
Figure GSB00000643115200032
其中*不是H，m＝3至5，n＝9至16。优选n是10。
在本发明第一个方面的优选第三个实施方案中，L是甘油磷脂，且碳水化合物-脂类结构包括下列子结构：
Figure GSB00000643115200041
其中n＝3至5，*不是H。优选n是3。
优选L是甘油磷脂。
优选F-S1是透明质酸的低聚物或聚合物，透明质酸由β1-4连接的葡糖醛酸β1-3N-乙酰氨基葡萄糖(GlcUAβ1-3GlcNAc)的双糖单元组成，其通过末端糖胺残基(gar)与S2连接。
在本发明第一个方面的具体实施方案中，碳水化合物-脂类结构具有下列结构：
Figure GSB00000643115200042
称为HA-gar-Ad-DOPE(IV)。
M典型地是H，但可以被另一种一价阳离子例如Na+、K+或NH4 +代替。
在第二个方面中，本发明在于结构为F-S1-S2-L的碳水化合物-脂类结构，其中
F是透明质酸的低聚物或聚合物，透明质酸由β1-4连接的葡糖醛酸β1-3N-乙酰氨基葡萄糖(GlcUAβ1-3GlcNAc)的双糖单元组成；
S1-S2是连接F至L的间隔基；和
L是选自二酰基-或二烷基-甘油脂的脂类，包括甘油磷脂。
优选F、S1、S2和L共价连接。
优选F是15-20mer。
优选，选择S1-S2，以提供可稳定地引入脂双层的水溶性结构。
优选L选自：二酰基甘油脂、磷酸脂、卵磷脂、脑磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油，和衍生自下列一或多种的双磷脂酰甘油：反式-3-十六碳烯酸、顺式-5-十六碳烯酸、顺式-7-十六碳烯酸、顺式-9-十六碳烯酸、顺式-6-十八碳烯酸、顺式-9-十八碳烯酸、反式-9-十八碳烯酸、反式-11-十八碳烯酸、顺式-11-十八碳烯酸、顺式-11-二十碳烯酸或顺式-13-二十二碳烯酸(docsenoic acid)。更优选，脂类源自于一或多种顺式-不饱和脂肪酸。最优选L选自：1，2-O-二油酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇氨基(DOPE)，1，2-O-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇氨基(DSPE)和rac-1，2-二油酰基甘油(DOG)。
在本发明第二个方面的第一个实施方案中，L是甘油磷脂，碳水化合物-脂类结构包括下列子结构：
Figure GSB00000643115200051
其中n＝3至5，*不是H。优选n是3。
优选L是甘油磷脂。
优选，F-S1是透明质酸的低聚物或聚合物，透明质酸由β1-4连接的葡糖醛酸β1-3N-乙酰氨基葡萄糖(GlcUAβ1-3GlcNAc)的双糖单元组成，其通过末端糖胺残基(gar)与S2连接。
在本发明第二个方面的具体实施方案中，碳水化合物-脂类结构具有下列结构：
Figure GSB00000643115200061
称为HA-gar-Ad-DOPE(IV)。
M典型地是H，但可以被另一种一价阳离子例如Na+、K+或NH4 +代替。
在第三方面，本发明在于制备本发明第二方面的第一个实施方案的结构为F-S1-S2-L的碳水化合物-脂类结构的方法，包括下列步骤：
1.使激活剂(A1)与脂类(L)反应，提供活化脂类(A1-L)；
2.碳水化合物(F)的还原胺化，提供(F-S1)；和。
3.将A1-L与F-S1缩合，提供下面的分子；
F-S1-S2-L
其中：
A1是选自下列的激活剂，包括：C5-C7二元羧酸的二(N-羟基琥珀酰亚胺基)酯、二(4-硝基苯基)酯、二(五氟苯基)酯、二(五氯苯基)酯；
L是选自二酰基-或二烷基-甘油脂的脂类，包括甘油磷脂；和
F是碳水化合物。
优选，F是透明质酸的低聚物或聚合物，透明质酸由β1-4连接的葡糖醛酸β1-3N-乙酰氨基葡萄糖(GlcUAβ1-3GlcNAc)的双糖单元组成。
优选F是15-20mer。
优选S2是C5-C7脂族二酸。更优选S2是选自下列的C5-C7脂族二酸：-CO(CH2)3CO-，-CO(CH2)4CO-(己二酸)，-CO(CH2)5CO-和-CO(CH2)5NHCO(CH2)5CO-。
优选L选自：二酰基甘油脂、磷酸脂、卵磷脂、脑磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油，和衍生自下列一或多种的双磷脂酰甘油：反式-3-十六碳烯酸、顺式-5-十六碳烯酸、顺式-7-十六碳烯酸、顺式-9-十六碳烯酸、顺式-6-十八碳烯酸、顺式-9-十八碳烯酸、反式-9-十八碳烯酸、反式-11-十八碳烯酸、顺式-11-十八碳烯酸、顺式-11-二十碳烯酸或顺式-13-二十二碳烯酸(docsenoic acid)。更优选，脂类源自于一或多种顺式-不饱和脂肪酸。最优选L选自：1，2-O-二油酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇氨基(DOPE)，1，2-O-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇氨基(DSPE)和rac-1，2-二油酰基甘油(DOG)。
在优选实施方案中，L是甘油脂，碳水化合物-脂类结构包括下列子结构：
Figure GSB00000643115200071
其中n＝3至5，*不是H。优选n是3。
优选L是甘油磷脂。
在具体实施方案中，碳水化合物-脂类结构具有下列结构：
Figure GSB00000643115200072
称为HA-gar-Ad-DOPE(IV)。
M典型地是H，但可以被另一种一价阳离子例如Na+、K+或NH4 +代替。
在第四方面中，本发明在于按照本发明第三方面的方法制备的碳水化合物-脂类结构。
在第五方面，本发明广泛地在于辅助生殖的方法，包括下列步骤：
·使胚胎与本发明第二方面或第四方面的碳水化合物-脂类结构接触。
在第六方面，本发明广泛地在于胚胎的体外成熟方法，包括下列步骤：
·使胚胎与本发明第二方面或第四方面的碳水化合物-脂类结构接触。
在第七方面，本发明广泛地在于具有提高成功结果的可能性的将胚胎转移至子宫内膜的方法，包括下列步骤：
·使胚胎与本发明第二方面或第四方面的碳水化合物-脂类结构接触。
在第八方面，本发明在于一种培养基，该培养基包括本发明第二方面或第四方面的碳水化合物-脂类结构的分散体。
优选，培养基是ART或IVM培养基。
在第九方面，本发明在于一种药用制剂，该药用制剂包括本发明第二方面或第四方面的碳水化合物-脂类结构。
优选，制剂是适合于吸入的形式。更优选，制剂是适合于吸入的气雾剂形式。
在本说明书的上下文中，下列术语和短语具有以下所提供的含义：
“ART”是指辅助繁殖技术，包括但不限于IVF和IVM方法。
“HA”表示HA的低聚物或聚合物，HA由β1-4连接的葡糖醛酸β1-3N-乙酰氨基葡萄糖(GlcUAβ1-3GlcNAc)的双糖单元组成。
“分散体”是指关于碳水化合物-脂类结构，包含或不包含分散剂或洗涤剂的均匀悬浮液或溶液结构。
“IVF”是指一种方法，利用该方法，雄性和雌性配子能够在体外接触，实现受精。
“IVM”是指胚胎的体外成熟方法。
“提高成功结果的可能性”是指在将胚胎转移至子宫内膜方面，提高所移植胚胎的移植和发育以提供活产的可能性。
“稳定地引入”是指将碳水化合物-脂类结构引入脂双层或膜中，其引入时间足以引起所转化细胞或多细胞结构的生物活性的变化。
“水溶性”是指在没有有机溶剂或洗涤剂的情况下，当碳水化合物-脂类结构和水或生理盐水(例如PBS)接触时，形成稳定的单相系统(包括如上定义的“分散体”)。
附图说明
现在将参考附图来详细描述本发明示范性的实施方案。
图1-HA10-14mer的1H NMR谱(D2O，303K，δppm)(I)。
图2-嵌入HA-gar-Ad-DOPE(IV)之后的红细胞膜的显微荧光成像。
图3-嵌入HA-gar-Ad-DOPE(IV)之后的胚胎的显微荧光成像：对照物(上部)；嵌入之后的胚胎(底部)。
图4-用下列培养之后的胚胎的显微荧光成像：Vitrolife EmbryoGlue(胚胎胶)，20分钟(上部)；高分子量HA，在37℃下24小时(底部)。
图5-用下列培养之后的胚胎的显微荧光成像：HA-gar-Ad-DOPE(IV)，在37℃下24小时(上部)；只有培养基，在37℃下24小时(底部)。
图6-除去卵明带并用下列培养之后的胚胎的显微荧光成像：HA-gar-Ad-DOPE(IV)，在37℃下2小时(上部和中部)；只有培养基，在37℃下2小时(底部)。
图7-下列时间之后用HA-gar-Ad-DOPE(IV)培养(2小时，在37℃)的胚胎的显微荧光成像：培养24小时后(上部)；培养5小时后(中部)；和培养2小时后(底部)。
图8-未修饰的胚胎的DIC成像。右图：相同成像，但以合并的WIB/WIG荧光成像形式观察。结果显示上皮细胞与胚胎(红色)没有连接。
图9-VVA修饰的胚胎的DIC成像。右图：相同成像，但以合并的WIB/WIG荧光成像形式观察。结果显示了子宫内膜细胞(绿色)与胚胎(红色)的阳性结合。连接数量从左至右是35、20和27。
图10-HA15-20mer-gar-Ad-DOPE(IV)修饰的胚胎的DIC成像。右图：相同成像，但以合并的WIB/WIG荧光成像形式观察。结果显示了10个子宫内膜细胞(绿色)与胚胎(红色)的阳性结合。
图11-HA15-20mer-gar-Ad-DOPE(IV)修饰的胚胎的DIC成像。右图：相同成像，但以合并的WIB/WIG荧光成像形式观察。结果显示了子宫内膜细胞(绿色)与胚胎(红色)的阳性结合。连接数量从左至右是15、8和9。
图12-HA15-20mer-gar-Ad-DOPE(IV)修饰的胚胎的DIC成像。右图：相同成像，但以合并的WIB/WIG荧光成像形式观察。结果显示了子宫内膜细胞(绿色)与胚胎(红色)的阳性结合。连接数量从左至右是8、8和5。
详细说明
透明质酸(HA)是线性聚合物，由重复的葡糖醛酸(GlcUA)和N-乙酰基-D-氨基葡糖(GlcNAc)的双糖组成。该聚合物可以达到几百万道尔顿的分子量，并且是细胞外基质的普遍存在的组分，其常常与结合粘蛋白的HA和结合蛋白质的HA有关。
CD44是广泛分布的细胞表面蛋白，据认为其介导细胞与细胞外基质组分或特定细胞表面配体的连接。CD44是HA的主要细胞表面受体。
HA在细胞表面的结合是多价结合活动的综合相互作用，受多价HA配体的尺寸影响。最小受体结合部位是多聚己糖，其由β1-4连接的葡糖醛酸β1-3N-乙酰氨基葡萄糖(GlcUAβ1-3GlcNAc)的双糖单元的三个重复单元组成。
HA聚合物的总尺寸影响结合。较长的HA聚合物导致更多的受体-配体相互影响，由此降低分离几率。虽然与多聚己糖(hexasaccharide)发生显著的结合，但认为HA和CD44之间的单价结合对于癸糖(decasaccharide)是最佳的。由20至24糖类组成的HA的结合亲和力的增加表明出现了与CD44二价结合的位点。
已知不同大小的HA低聚物和聚合物可以引起不同生物学活性。发明人预计选择不同大小的低聚物或聚合物将引起不同生物学反应。
已经描述了获得均一尺寸的HA低聚糖的方法(Tawada等人(2002))。通过用水解β1-4糖苷键的睾丸透明质酸酶分解HA聚合物来制备低聚糖。
发明人认为，通过将HA定位至细胞或多细胞结构的表面，可以引起各种生物学活性。其中多细胞结构是胚胎，可以实现下列一或多种改进：
·胚胎的生长特性；
·胚胎的存储特性；
·胚胎的存活；和/或
·转入子宫之后胚胎的移植可能性。
在后面的改进方面，能够与在受体宿主子宫内膜细胞表面上表达的CD44相互作用的、足够长度的HA低聚糖是想要的。实际上，较长的低聚糖可能促进与这些子宫内膜所表达受体更强的结合。
其它研究者的观察证实，发明人没有低估定位于胚胎表面的HA低聚糖在其他领域例如胚胎生长特性提供改进的可能性。实际上，本发明方法可以促进表面定位HA的内在化，同时对胞内信号和胚胎发育产生影响。
碳水化合物-脂类结构可以具有其它医学应用，在这种应用中，将碳水化合物定位于细胞或多细胞结构的表面是有利的。
例如，称为HA-gar-Ad-DOPE(IV)的碳水化合物-脂类结构特别适合用于制备药用制剂。该结构可溶于水培养基，但容易和稳定地引入细胞膜(例如红细胞)和多细胞结构(例如胚胎)中。
制备称为HA-gar-Ad-DOPE(IV)的碳水化合物-脂类的方法提供于反应路线I中。在利用下面讨论的其它方法来制备包含HA的碳水化合物-脂类结构的过程中，显示会产生困难。然而，发明人预料到了制备具有类似有利性能的大量包含HA的碳水化合物-脂类结构的可行性。
这些碳水化合物-脂类结构与利用下列说明书所描述方法制备的那些结构不同：国际申请No.PCT/NZ02/00214(WO 03/034074)和PCT/NZ03/00059(WO 03/087346)。
描述在这些说明书中的、将碳水化合物定位于细胞或多细胞结构表面的方法需要使用内源性制备(生物合成)的糖脂或使用首先引入脂双层中的生物素化脂类。
本发明的合成的碳水化合物-脂类结构可以外源性地制备，并且不包括生物素-卵白素桥作为将碳水化合物(F)连接至脂类(L)的间隔基(S1-S2)。碳水化合物-脂类结构的F、S1、S2和L是共价连接的，并且可以在将碳水化合物定位于细胞或多细胞结构表面的一步法中使用。
优选实施方式
碳水化合物-脂类结构的制备
材料和方法
甲醇、i-PrOH、CH2Cl2、乙醚、己烷和NH4OAc得自于Chimmed(俄罗斯)。乙腈得自于Cryochrom(俄罗斯)。硅胶60RP-18(40-63微米)和NaCNBH3得自于Merck(德国)。葡聚糖凝胶G-10和葡聚糖凝胶LH-20得自于Amersham Biosciences AB(瑞典)。
在硅胶60F254板(Merck)上进行薄层色谱。用8％磷酸水溶液染色、而后在200℃以上加热，或茚三酮作为指示物来检测化合物。
在Bruker DRX-500光谱仪上获取活化脂类的1H NMR谱。化学位移以相对于CD3OD的ppm(δ)形式给出。
HA-脂类结构1H NMR谱是在30℃、在Bruker WM 500MHz仪器上获取的，使用溶剂残余质子的信号作为参考([D2]H2O-4.750ppm)。
活化脂类是以甘油磷脂的己二酸衍生物(方法1)或二酰基甘油脂的[对硝基苯氧基羰基亚甲基(聚氧乙烯)]-氧基乙酰基衍生物(方法2)的形式制备的。
活化脂类的制备
方法1(1，2-O-二硬脂酰(distereoyl)-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇氨基(DSPE)和1，2-O-二油酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇氨基(DOPE)的己二酸衍生物的制备)
向二(N-羟基琥珀酰亚胺基)己二酸(A)(70毫克，205μmol)的无水N，N-二甲基甲酰胺(1.5毫升)溶液中加入DOPE或DSPE(L)(40μmol)的氯仿(1.5毫升)溶液，而后加入三乙胺(7μL)。将混合物在室温下保持2小时，然后用醋酸中和，部分地真空浓缩。
将残余物通过柱色谱(葡聚糖凝胶LH-20，1∶1氯仿-甲醇，0.2％醋酸)，得到活化脂类(A-L)(37毫克，95％)的无色稠浆液；TLC(氯仿-甲醇-水，6∶3∶0.5)：Rf＝0.5(DOPE-A；III)，Rf＝0.55(DSPE-A)。
1H NMR(CDCl3/CD3OD，2∶1)，δ：
DSPE-A-5.39(m，1H，-OCH2-CHO-CH2O-)，4.53(dd，1H，J＝3.42，J＝11.98，-CCOOHCH-CHO-CH2O-)，4.33(dd，1H，J＝6.87，J＝11.98，-CCOOHCH-CHO-CH2O-)，4.23(m，2H，PO-CH2-CH2-NH2)，4.15(m，2H，-CH2-OP)，3,61(m，2H，PO-CH2-CH2-NH2)，3.00(s，4H，ONSuc)，2.81(m，2H，-CH2-CO(Ad)，2.48(m，4H，2x(-CH2-CO)，2.42(m，2H，-CH2-CO(Ad)，1.93(m，4H，COCH2CH2CH2CH2CO)，1.78(m，4H，2x(COCH2CH2-)，1,43，1.47(2bs，4OH，20CH2)，1.04(m，6H，2CH3)。
DOPE-A(III)-5.5(m，4H，2x(-CH＝CH-)，5.39(m，1H，-OCH2-CHO-CH2O-)，4.58(dd，1H，J＝3.67，J＝11.98，-CCOOHCH-CHO-CH2O-)，4.34(dd，1H，J＝6.61，J＝11.98，-CCOOHCH-CHO-CH2O-)，4.26(m，2H，PO-CH2-CH2-NH2)，4.18(m，2H，-CH2-OP)，3.62(m，2H，PO-CH2-CH2-NH2)，3.00(s，4H，ONSuc)，2.8(m，2H，-CH2-CO(Ad)，2.50(m，4H，2x(-CH2-CO)，2.42(m，2H，-CH2-CO(Ad)，2.17(m，8H，2x(-CH2-CH＝CH-CH2-)，1.93(m，4H，COCH2CH2CH2CH2CO)，1.78(m，4H，2x(COCH2CH2-)，1，43，1.47(2bs，4OH，20CH2)，1.04(m，6H，2CH3)。
方法2(制备rac-1，2-二油酰基-3-[对硝基苯氧基羰基亚甲基(聚氧乙烯)]-氧基乙酰基甘油)
将聚乙二醇的二羧甲基醚(9-16的聚合度)与苯共蒸发来进行干燥，随后真空储存。将亚硫酰氯(0.86毫升，12mmol)逐滴加入到二酸(0.6克，～1mmol)和加热的Na2CO3(0.42克，4mmol)的搅拌混合物中。
将反应混合物在室温下搅拌，直到气体逸出停止为止(～4小时)，蒸发，在乙醚中再悬浮两次，蒸发，除去残余的亚硫酰氯。将残余物在乙醚中再悬浮，通过硅藻土过滤。
将带有分离相的滤液的上相蒸发。将残余物溶于无水二恶烷中，蒸发，用NaOH真空干燥，得到羧甲基[聚(环氧乙烷)]氧基醋酸的二酸二氯化物(D)。
伴随着搅拌，将rac-1，2-二油酰基甘油(DOG；L)(90毫克，0.14mmol)和三乙胺(0.1毫升，0.72mmol)的无水氯仿(3毫升)溶液加入到二酸二氯化物(D)(0.59克，～0.89mmol)中。伴随着搅拌，在室温下进行反应24-36小时(TLC监测，在系统B和C中)，不定期地加入三乙胺(10μL份额，总计0.2毫升)。
将反应混合物用氯仿(～10毫升)稀释，用0.1N HCl(10毫升)洗涤(离心分离各相)。将水相用氯仿提取两次。将合并的有机提取物用水洗涤，蒸发。通过与苯共蒸发来干燥残余物，并施加到用溶剂系统A平衡的凝胶过滤柱(1x100cm)上，得到单和二-酰化产物的混合物。
通过硅胶柱色谱分离混合物，以10∶1甲醇-醋酸的氯仿溶液(从2到10％)的梯度，得到(D-L)无色油；Rf-0.6(B，拖长的斑点)；MS，m/z：1149.9m/z：1149.9[M+H2O-1]+(36)，1194.1[M+H2O-1]+(69)，1238.1[M+H2O-1]+(100)，1282.0[M+H2O-1]+(92)，1326.0[M+H2O-1]+(85)，1370.3[M+H2O-1]+(75)，1414.2[M+H2O-1]+(60)，和1458.1[M+H2O-1]+(42)；1H NMR(CD3OD)：1.09(6H，t，CH3)，1.50(40H，m CH2)，1.80(4H，br.五重峰，CH2CH2COO)，2.23(8H m，CH2CH＝CH)，2.52(4H，t，CH2COO)，3.83(52Hm，OCH2CH2O)，4.31(2H，s，OCH2COO-二甘油脂)，4.38(2H，s，OCH2COOH)，4.48和4.59(4H，一组多重峰，C1′和C3′)，5.48(1H，m，C2′)，5.54(4H，m，CH＝CH)。
将对硝基苯基三氟乙酸盐(52毫克，0.22mmol)的无水吡啶(0.2毫升)溶液加入到酸(D-L)(85毫克，～0.07mmol)中，并在室温下搅拌7小时。将反应混合物在用溶剂系统A(补充有1％CH3COOH)平衡的葡聚糖凝胶LH-20柱(0.8x50cm)上分离，得到(A2-D-L)浅黄色色谱均一的油；Rf 0.75(D；a，b，c)。
1H NMR：
DOG-D-A2-0.88(6H，t，CH3)，1.29(40H，m，CH2)，1.61(4H，m，CH2CH2COO)，2.01(8H，m，CH2CH＝CH)，2.31(4H，t，CH2COO)，3.65(52H，m，OCH2CH2O)，4.16(2H，s，OCH2COO-二甘油脂)，4.17(2H，s，t OCH2COONp)，4.22，4.29，和4.38(4H，一组dd，C1′和C3′)，5.27(1H，br.五重峰，C2′)，5.35(4H，m，CH＝CH)，7.34(2H，d，J2′3′＝J5′6′＝9.15，H2′，H6′)，8.29(2H，d，J3′2′＝J5′6′＝9.15，H3′，H5′)。
可以将方法1或方法2制备的活化脂类与碳水化合物衍生物的伯胺缩合，提供碳水化合物-脂类结构。
活化脂类与氨基丙基-HA的缩合
按照下列任何一个预言将不能获得碳水化合物-脂质结构或产率很低的方法，将活化的脂类与透明质酸的氨基丙基衍生物缩合。
方法3
向活化的DOPE(A1-L)(33μmol)的N，N-二甲基甲酰胺(1ml)溶液中加入30μmol HA的3-氨基丙基苷和5μL三乙胺。在室温下搅拌混合物2小时。柱色谱(葡聚糖凝胶LH-20，1∶1氯仿-甲醇，而后硅胶，乙酸乙酯-异丙醇-水，4∶3∶1(v/v/v)。
方法4
将酯(A2-D-L)(～6.25μmol)的无水DMSO(0.2ml)和TEA(3μL，20μmol)溶液加入到HA的3-氨基丙基苷(6.48μmol)中。在室温下搅拌反应混合物24小时，与一滴水混合，在用溶剂系统A平衡的凝胶过滤柱(0.6x35cm)上分离。
这些制备方法的不足在于HA的3-氨基丙基苷在溶液中不稳定。因此，开发了制备碳水化合物透明质酸的伯胺的另一个方法(反应路线I)。
HA的还原胺化，提供了带有末端糖胺残基(gar)的碳水化合物，然后其能够与活化脂类例如rac-1，2-二油酰基-3-[对硝基苯氧基羰基亚甲基(聚氧乙烯)]-氧基乙酰基甘油(DOG)缩合，提供一定范围的碳水化合物-脂类结构。
在下面示范性方法中，HA通过末端糖胺残基(gar)与N-氧基琥珀酰亚胺酯DOPE-Ad-Nos缩合。
HA-糖胺(II)的制备
将HA(HA15-20mer)(I)(36毫克)溶于5M NH4OAc(3.6毫升)中。将溶液在40℃保持21小时。分5批加入2M NaCNBH3水溶液之后(2M的NaCNBH340μL-3小时；80μL-18小时；160μL-8小时；160μL-21小时；160μL-21小时)，将混合物保持在40℃。
将反应混合物通过凝胶渗透色谱在葡聚糖凝胶G-10柱(1.8x40cm，洗脱液-0.1M Py·AcOH水溶液)脱盐，冷冻干燥，得到32.8毫克HA-糖胺(II)，其在与I的混合物中。
TLC(洗脱液i-PrOH/MeOH/MeCN/水4∶3∶6∶4)：HA-糖胺(II)(茚三酮(ninhydrine)-阳性)Rf＝0.2；HA低聚物(I)Rf＝0.31。
HA-gar-Ad-DOPE(IV)的制备
HA-糖胺(II)(32.8毫克)溶于i-PrOH(1.5毫升)和水(0.75毫升)的混合物中。向快速搅拌的II溶液中加入N-氧基琥珀酰亚胺酯DOPE-Ad-Nos(III)(34毫克，35μM)的CH2Cl2(0.2毫升)溶液，而后分两次加入1M Na2CO3水溶液(85和45μL)，每次间隔45分钟。将混合物搅拌45分钟，而后用乙酸(30μL)酸化。
将反应混合物在葡聚糖凝胶LH-20柱(1.8x35cm，洗脱液-MeCN/水2∶1，0.03M Py·AcOH)上进行凝胶-渗透色谱，得到42.5毫克HA-gar-Ad-DOPE(IV)，其在与I的混合物中。
HA低聚物(I)和EA-gar-Ad-DOPE(IV)的分离
将粗品水溶液慢慢地放在C18反相柱(1.2x7cm，水)上。用水和水/MeOH 10∶1洗脱，提供I(12.3毫克)。用水/MeOH 1∶3洗脱，而后用水/MeOH/CHCl35∶15∶1洗脱，得到IV。
将该部分蒸发，用己烷(2x2毫升)和醚(2x2毫升)提取残余物(在烧瓶壁上的薄膜)，然后溶于水(1.5毫升)中，冷冻干燥。
IV的产率是20.6毫克(～50％)。
TLC：Rf＝0.33，洗脱液：i-PrOH/MeOH/MeCN/水4∶3∶6∶4。
IV的1H NMR，Na-盐(500MHz，D2O，2mM NaHCO3，30℃)：δ＝5.473(m，DOPE的2-CH＝CH-)，5.328(m，DOPE的OCH2CHCH2O)，4.574和4.473(m，HA：GlcNAc的H-1，GlcA的H-1；DOPE的CO-OCHCHCH2)，4.246(dd，J＝12.3Hz，J＝6.8Hz，DOPE的CO-OCHCHCH2)，4.027(t，J＝5.7Hz，DOPE的POCH2CH2N)，3.95-3.34(HA：GlcNAc的H-2÷H-6，GlcA的H-2÷H-5；DOPE的POCH2CHCH2)，2.413(m，DOPE的2CH2COO)，2.302(m，2CH2CON)，2.049(m，DOPE的2CH2CH＝CHCH2)，2.039(m，GlcNAc的NCOCH3)，1.630(in，DOPE的2CH2CH2CON和2CH2CH2COO)，1.306(m，DOPE的-CH2-)，0.892(～t，DOPE的2CH3)ppm。
用于合成HA-gar-Ad-DOPE(IV)的HA低聚物尺寸的近似值
认为HA-gar-Ad-DOPE结构(IV)的HA低聚物的平均“n”值与起始HA低聚物(I)的相同。
对于HAn1-n2 mer，可以通过1H-NMR估算平均“n”值。假定GlcNAc将末端比例α/β降低至60/40(游离GlcNAc的正常比例)，计算HA10-14mer的平均“n”值是～12.2(图1)。对于HA15-20 mer(I)，该方法提供了～13的平均“n”值。
HA-gar-Ad-DOPE(IV)嵌入红细胞膜中
在试管中，通过将7倍量的PBS加入到RBC中，将聚集的O细胞用PBS洗涤三次。用经洗涤的Pasteur移液管平缓地将试管的内含物混合。将试管低速离心1分钟，以便使RBCs层积在管的底部。
使用塑料移液管，将上清液平缓地除去，并将细胞再悬浮在另一个7倍体积的PBS中。重复洗涤两次，直到上清液澄清为止。最后一次洗涤之后，除去上清液。
用PBS将10毫克/毫升IV溶液稀释到目标浓度，例如对于5毫克/毫升溶液，5μL+5μL PBS。
为了嵌入IV，将RBCs再悬浮在稀释(如果需要)溶液中，比例为1份溶液对3份层积细胞。对于试验的每个样品或对照物，将5μL样品或对照液加到15μL再悬浮的细胞(在1.5毫升微量离心管(eppendorf)中)中。
将混合物进行培养：
在21℃，3小时，每小时混合，然后在4℃，18小时；在37℃，2小时；
在37℃，4小时；
在4℃，过夜(O/N)；或
在37℃，过夜(O/N)。
通过加入1毫升PBS，将转化的RBCs洗涤3次，并低速离心1分钟。然后如上所述进行RBCs的洗涤。在Kimble玻璃试管中，通过将3μL洗涤的转化RBCs加入到97μL LPBS中，制备3％细胞悬浮液。
在Kimble玻璃试管中，将30μL 3％细胞悬浮液+30μL 1％BSA/PBS稀释的抗HA抗体(Biogenesis，cat.no.5029-9990)混合为试验样品，或将30μL 3％细胞悬浮液+30μL 1％-BSA/PBS单独作为对照物。在37℃培养混合物30分钟。然后将培养的混合物高速离心10s，并对于凝集进行评价。
通过重复高速离心和再悬浮，将样品用PBS洗涤三次。然后加入30μL 1％BSA/PBS稀释的驴抗羊抗体(Invitrogen，cat.no.A-11015)。然后对于样品的凝集进行评价。
结果提供在表1和表2中。
Figure GSB00000643115200211
HA-gar-Ad-DOPE(IV)嵌入胚胎中
α-HA微滴的制备
将25μL α-HA(1∶20dil)溶液移液到4孔平皿的孔的中部。将液滴用0.8毫升矿物油覆盖。将另一份25μLα-HA(1∶20dil)溶液穿过矿物油移液到微滴上。
将微滴在37℃培养。
胚胎GlueTM的处理
将胚胎转入含有胚胎GlueTM的微滴中，在37℃培养(+5％CO2)20分钟。
链霉蛋白酶微滴的制备
将25μL 0.5％链霉蛋白酶溶液移液到4孔平皿的孔的中部。将液滴用0.8毫升矿物油覆盖。将另一份25μL 0.5％链霉蛋白酶溶液穿过矿物油移液到微滴上。将微滴在37℃培养(没有CO2)。
卵明带的去除
将洗涤的胚胎从KH培养基中转移到链霉蛋白酶微滴中，并在37℃、在热的平皿上培养(没有CO2)，直至除去所有的卵明带(c.5分钟)。然后在KH培养基中洗涤胚胎4次。
与初始抗体反应
将来自实验的胚胎在KH培养基中洗涤4次，在每个洗涤步骤之间仔细漂洗微量操作移液管。然后将胚胎放入带有α-HA抗体的微滴中，在37℃培养箱中培养(没有CO2)45到50分钟。
回收胚胎，并在MV洗液中洗涤4次。
Alexa Fluor(AF)α-羊微滴的制备
将25μL的AFα-羊(1∶100dil)溶液移液到4孔平皿的孔的中部。将液滴用0.8毫升矿物油覆盖。将另一份25μL的AFα-羊(1∶100dil)溶液穿过矿物油移液到微滴上。在室温下、在暗处培养微滴。
将洗涤的胚胎放置在带有AFα-羊抗体的微滴中。然后将四孔平皿在暗处放置，并在室温下(RT)培养30分钟。
回收胚胎，并在MV洗液中洗涤4次。
成像
将胚胎放置在玻璃载片上，并用矿物油覆盖。然后将载玻片在黑暗中储存，然后在Olympus BX51荧光显微镜上成像。
·实验1
将胚胎放入预热的脱气微滴中，所述微滴含有：
HA15-20mer-gar-Ad-DOPE(IV)
HA15-20mer-gar-Ad-DOPE(IV)+HA15-20mer
HA15-20mer
对照物(只有培养基)
只有KC培养基
然后将微滴中的胚胎在37℃培养(+5％CO2)24小时。
结果提供在图3中。
·实验2
将胚胎放入预热的脱气微滴中，所述微滴含有：
HA15-20mer-gar-Ad-DOPE(IV)(除去卵明带)；
高分子量(HMW)HA；
HA15-20mer-gar-Ad-DOPE(IV)；
带有胚胎GlueTM的KC培养基；
只有KC培养基(对照物)。
然后将微滴中的胚胎在37℃培养(+5％CO2)过夜。
结果提供在表2和图4和5中。
表2.HA-gar-Ad-DOPE(IV)嵌入胚胎中
·实验3
将胚胎放入预热的脱气微滴中，所述微滴含有：
HA15-20mer-gar-Ad-DOPE(IV)(除去卵明带)
只有KC培养基(除去卵明带)(对照物)
然后将微滴中的胚胎在37℃培养(+5％CO2)2小时。2、5和24小时之后，观察保留的HA15-20mer-gar-Ad-DOPE(IV)。
结果提供于图6和7中。
HA15-20mer-gar-Ad-DOPE(IV)体外鼠胚胎毒性研究
进行研究，以在鼠胚胎形态和发育方面评价过夜植入HA15-20 mer-gar-Ad-DOPE(IV)的效果。
小鼠胚胎的制备
在15:30和17:30之间，通过腹腔注射5IU FSH(Folligon，Intravet，NZ)、并在48小时后注射5IU人绒毛膜促性腺激素(Chorulon，Intravet，NZ)，使青春期前的C57/CBA F1代小鼠(21-30天大)超数排卵。
将每个供体小鼠与证明有生育力的CBA雄性小鼠放在一起，第二天早晨(交配后0.5天)检查精液塞。
交配后1.5天，通过颈部脱臼将供体小鼠杀死。从腹部切除包括输卵管的子宫角，并放置在无菌的陪氏培养皿中。
使用固有的操作培养基(HM)将两个细胞胚胎从输卵管中冲出，收集，在5％CO2中、在37℃、在人类胚胎培养培养基(HECM)中培养，直至达到实验时间。
制备实验微滴和对照物微滴
制备两组微滴，并在5％CO2中、在37℃平衡至少2小时，然后使用。
实验微滴是2毫克/毫升HA15-20mer-gar-Ad-DOPE(IV)。将30μLHECM放置在4孔培养皿的孔的中央。然后将液滴用0.9毫升无菌矿物油覆盖，加入20μL储备HA15-20mer-gar-Ad-DOPE(IV)(5毫克/毫升，在HECM中)(通过移液管逐渐地混合)。
按照类似的方式制备对照物液滴，但在无菌矿物油覆盖之后，加入20μL HECM(全部液滴含有HECM)。
胚胎的制备
交配后2.5天，将20个健康的、随机选择的胚胎放入每个组中，并在5％CO2中、在37℃、在含有HA15-20mer-gar-Ad-DOPE(IV)的培养基或对照物培养基中培养过夜。
将所有的胚胎(现在第3.5天)在37℃HM中洗涤，并放入1毫升HM(保持在37℃加热板上，在铝箔下)中(保持各组分开)。
将胚胎转移到HECM微滴中，并在5％CO2中、在37℃培养，进一步培养之后，评价胚胎形态或发育。
鼠胚泡的分级
在交配后第3.5天、4.5天和5.5天将胚泡分级。以两个独立的尺度将胚泡分级：
i)胚胎发育速率，通过填充囊胚腔的液体大小来预测；和
ii)胚胎的健康状态，其与目视观察的退化/破碎的量有关。
用于描述胚胎发育速率的分级系统如下：
用于预测胚胎发育健康状态的按字母顺序分级如下：
Figure GSB00000643115200262
将这两个尺度组合在一起，得到从最差的5C至最健康的1A的15个胚泡等级。
实际上，1A和2A常常归为一组，因为在这两者之间存在边缘视差，以及观测者平均记录的差异，将其归为一组在统计学上是更可信的。
结果
表3.在2毫克/毫升HA15-20mer-gar-Ad-DOPE(IV)中培养过夜之后，交配后的第3.5、4.5和5.5天对胚胎等级的总结
总结
结果表明，交配后体外培养至5.5天的HA15-20mer-gar Ad-DOPE(IV)修饰的鼠胚胎在形态或发育方面没有显示不良的后果。
使用鼠胚胎移植进行HA15-20mer-gar-Ad-DOPE(IV)体内毒性研究
进行研究，以评价用HA15-20mer-gar-Ad-DOPE(IV)修饰的鼠胚胎(当转移到假孕的小鼠中时)的在移植和存活上的效果。
方法学
按照如上所述方法(HA15-20mer-gar-Ad-DOPE(IV)体外的鼠胚胎毒性研究)制备小鼠胚胎的实验和对照微滴、和修饰的胚胎。
在交配后3.5天，从HA15-20mer-gar-Ad-DOPE(IV)修饰的胚胎中选择5个胚胎、和从未修饰的胚胎组中选择5个胚胎。
选择过程使用计算机产生的随机化列表(指定群组转移和副组转移到的胚胎、顺序)。
将胚胎放入1毫升保持在37℃加热板上、在铝箔下的HM中，直至转移。将群组保持在独立的孔中。
假孕受体小鼠的制备
为了在受体小鼠中获得受体子宫内膜，必须将受体与证明无菌的输精管切除的雄性小鼠交配。交配行为保持卵囊的黄体和用于移植的合适的黄体酮水平。
供体小鼠交配后第0.5天，从大量小鼠中选择大约8只CBA/C57F 1代雌性(60至100天大)且发情的小鼠，并与输精管切除的CBA雄性小鼠交配。
第二天早晨检查受体小鼠的精液塞，标志假妊娠(交配后0.5天)。特定的程序是指：与胚胎相比，通过减去1天而使受体小鼠保持不同步。基本原理是，胚胎将“等待”受体子宫内膜，但受体子宫内膜不会“等待”胚胎。
将小鼠在独立的笼中保管，直到转移当天为止。
在双角生育模型中的胚胎移植
在交配后第3.5天，将胚胎转移到交配后第2.5天的受体中。如上所述，通过计算机产生的随机化列表来测定每个群组的转移顺序和方向。
用0.8毫升阿佛丁(内部制备)使受体小鼠麻醉，并且在腹部的一边刚好在臀部上方进行切口。通过用serrafin夹具抓住卵巢上方的脂肪垫来固定卵巢，并且从身体中取出。
全部手术是在37℃加热板上进行的。
使用29g针头来形成穿过子宫角的孔。将五个胚胎加载到热拉伸并磨光的毛细吸管(直径大约为150-170μm)中，毛细吸管带有矿物油和用于稳定作用的空气缺口。
将移液管穿过预留孔插入子宫角中，排出，直到看得见空气隙为止。将子宫角和卵巢放回腹腔中，并紧密缝合体壁和皮肤。
穿过耳部标志鉴定并观测小鼠，直到有意识为止。
胎儿结果的评定
在胚胎移植后第15天，使受体安乐死。在腹部进行切口，暴露整个子宫。通过柔和地用钳子夹捏来检测每个胎儿的存活，而后切除子宫。
从子宫角中摘除每个胎儿，并与胎盘分离。将每个胎儿和其相应的胎盘称重。
结果
总结的结果提供于表4中。
表4.14个实验的总结，这些实验将2毫克/毫升HA15-20 mer修饰过夜的胚胎(实验)和未修饰的胚胎(对照)移植到受体小鼠的左或右角中。
Figure GSB00000643115200291
总结
当通过二元对数回归比较实验和对照组的移植速率时，得到0.530的p-值。由此，在两个群组之间没有显著差异。
当通过一般线性模型比较实验和对照组的胎儿重量时，得到0.140的p-值。由此，在两个群组之间没有显著差异。
这些结果表明，在能生育的动物中，HA15-20mer-gar-Ad-DOPE(IV)对于妊娠或子宫内发育进行修饰，没有不良的后果。
用单细胞HEC-1A人上皮细胞将植入HA15-20mer-gar-Ad-DOPE(IV)的鼠胚胎花环化(rosetting)
进行研究，以测定源于子宫内膜细胞系HEC-1A(人类子宫内膜癌亚粘附细胞系，ATCC HTB-112)的单细胞人上皮细胞与体外植入有HA15-20mer-gar-Ad-DOPE(IV)的鼠胚胎的粘附水平。
孵育至已孵育阶段的胚胎已将卵明带除去并用下列培养：
A)HA15-20mer-gar-Ad-DOPE(IV)(实验)；
B)只有培养基(空白-HECM，人类胚胎培养培养基)；或
C)凝集素VVA(Vicia villosa，Milton Adams BA 4601-2)。
然后用上皮细胞培养胚胎，并使用荧光显微术显现连接。
试验组C充当最大花环化(rosetting)的阳性对照。
胚胎用荧光染料SNARF(红标签，5-(和-6)-氯甲基
Figure GSB00000643115200301
-1，乙酸酯，分子探针#C6826)预染色，子宫内膜上皮细胞用荧光染料CMFDA(绿标签-CellTrackerTM Green CMFDA，5-氯甲基荧光素二乙酸酯，分子探针#C7025)染色，以便容易显现上皮细胞与胚胎的连接。
Figure GSB00000643115200302
鼠胚胎和微滴的制备
按照如上所述方法(HA15-20mer-gar-Ad-DOPE(IV)体外的鼠胚胎毒性研究)制备小鼠胚胎和微滴，但用HECM培养基(用或不用VVA)。
卵明带的除去
将胚胎转入0.5％链霉蛋白酶(Sigma#P8811)50μL微滴中，并放入37℃培养箱中6分钟，或直到除去卵明带(ZP)为止(每2分钟检测一次)。
将胚胎在50μL内部操作培养基(HM)液滴中洗涤3次，并转入HM容纳孔(1毫升)中。
用SNARF将胚胎染色
避光进行下列步骤。
将胚胎转入2μM SNARF 50μL微滴中，并在铝箔覆盖的容器中、在37℃培养箱中培养40分钟。
然后在HM培养基中洗涤胚胎2次。
将胚胎转入HM培养基微滴中，并在37℃培养箱中再培养40分钟。
胚胎的修饰
避光进行下列步骤。
将转入群组A微滴中的胚胎在37℃+5％CO2的条件下培养2小时。
将转入群组B微滴中的胚胎在37℃+5％CO2的条件下培养2小时。
将转入群组C微滴中的胚胎在37℃+5％CO2的条件下培养40分钟。
将处理的胚胎用HM培养基(1毫升)洗涤1次，转入HECM微滴中，并在37℃+5％CO2的条件下再培养1小时10分钟。
HEC-1A上皮细胞的染色
避光进行下列步骤。
将200g细胞离心10分钟，除去上清液。
将500μL 3μM CMFDA(在3％PVP(聚乙烯基吡咯烷酮，MedicultAB，#10890001)中)/1x PBS加入到细胞中，并将细胞平缓地再悬浮。
将细胞在振动水浴中、在37℃培养45分钟(偶而进行再悬浮)。
将200g细胞离心10分钟，除去上清液。
将细胞平缓地再悬浮在500μL不含钙和镁的Hanks平衡盐溶液(CMF-HBSS，Gibco-Invitrogen，#14170112)外加2％胎儿牛血清(FBS，Gibco-Invitrogen，#10091-130)中。
将细胞在振动水浴中、在37℃再培养30分钟。
然后通过将细胞再悬浮在CMF-HBSS-2％FBS中来洗涤上皮细胞2次，200g离心10分钟，除去上清液。重复洗涤。
Terasaki板的制备
将横行数字和竖栏字母分配给每个实验和对照组，进行明显标志。
将8μL HM培养基等分到每个经鉴定待用的孔中。
胚胎和HEC-1A上皮细胞的培养
尽可能地在暗处进行下列步骤。
以每毫升20-25x106个细胞来使用上皮细胞。
将源于每个群组的胚胎放置在Terasaki托盘上的相应孔中，保证每个孔中的胚胎不超过3个，且胚胎是分离的。
使用大口径的操作移液管，将再悬浮的上皮细胞平缓地吸到(在使用之前平缓地混合，以除去凝块)胚胎上，保证上皮细胞包围胚胎，并将孔底部覆盖。
将盖板稳定地放置在Terasaki托盘上，并在室温下培养细胞(用铝箔遮盖)30分钟。
10分钟之后，检测各孔，之后每5分钟检测一次，确保细胞没有干透。
“花环化”的胚胎的显像
尽可能地在暗处进行下列步骤。
使用大口径操作移液管，将胚胎和上皮细胞平缓地转入1毫升HM培养基(预先温热)中。
将5μL HM培养基液滴放置到载玻片上。
将胚胎移植到载玻片上的HM培养基液滴中(当心不要移植游离的上皮细胞)，并通过放置在培养基周围而用矿物油(＜10μL)覆盖，而后平缓地覆盖培养基的上部。
在Olympus BX51荧光显微镜下(100x放大倍数)观察每个载玻片，取得每个胚胎的三个图片；一个是DIC(差示涉差显微镜术)，两个是荧光(WIB和WIG滤光镜，分别为550nm和620nm)。
使用Olysia BioReport将两个荧光成象合并。(图8至12)
粘附的记分
对于每个胚胎，记录位点的中心平面处附着的每个胚胎的子宫内膜细胞数目。结果提供在表5至7中。
表5
Figure GSB00000643115200331
表6
Figure GSB00000643115200332
表7
Figure GSB00000643115200341
花环试验显示，上皮细胞与HA15-20mer-gar-Ad-DOPE(IV)所修饰胚胎的粘附至少增加四倍。
用HMW HA、牛血清白蛋白溶液或人类血清培养HA15-20 mer-gar-Ad-DOPE(IV)转变的红细胞
进行研究，以试验HA15-20mer-gar-Ad-DOPE(IV)转变的红细胞(RBCs)是否与高分子量HA(HMW HA)、白蛋白或相容性血清有关，这将引起它们凝聚/聚集。
将HA15-20mcr-gar-Ad-DOPE(IV)植入到RBCs中
以10毫克/毫升至5毫克/毫升将HA15-20mer-gar-Ad-DOPE(IV)在Celpresol(CSL#063321301)中稀释。
将15μL洗涤的O型RBC、然后5μL HA15-20mer-gar-Ad-DOPE(IV)或Celpresol(未处理过的)加入到微量离心管中，并混合。
将试管在室温下培养3小时，然后在4℃培养过夜，偶尔进行混合。将转化的RBCs用PBS洗涤两次，而后以5％悬浮在Celpresol中。
高分子量HA(HMW HA)、牛血清白蛋白(BSA)和血清溶液。
HMW HA是源于马链球菌Streptococcus equi(源于FlukaBioChemika Cat#_53747)的透明质酸钠盐(MW 1.5-1.8x106Da)。在Celpresol中制备0.5和2.5毫克/毫升的溶液。
BSA是牛血清白蛋白Gibco Cat#30063-572。在PBS中制备2％、4％、6％、8％和10％(w/v)的溶液。
血清是不含有直接针对O型细胞抗体的人类血清。
用HMW HA溶液培养转化的RBCs
由洗涤的转化的O型RBCs制备5％悬浮液。
将30μL HA15-20mer-gar-Ad-DOPE(IV)RBC或未处理过的RBC加入到60μLHMW HA、牛血清白蛋白溶液或人类血清中，一式两份。
样品是下列中的任何一个：
在immufuge(一种离心机)中离心10s，然后评价凝集；或
在37℃培养30分钟，离心，而后评价凝集。
结果表明，在高分子量蛋白(白蛋白)或高分子量HA的存在下，通过非抗体介导的相互作用而产生凝集，能够目视观察到用HA15-20 mer-gar-Ad-DOPE(IV)形式的HA涂敷的细胞的相互作用。
尽管通过典型的实施方案描述了本发明，应该理解，在没有背离本发明范围的情况下，可以对本发明进行改变和改进。此外，如果对于特定特征存在已知的等效内容，可以象该说明书所具体提到的一样引入这种等效内容。
工业实用性
本发明在制备培养基和药用制剂中具有应用性。
表8.凝集评分-HA15-20mer-gar-Ad-DOPE(IV)RBC直接离心
表9.凝集评分-将HA15-20mer-gar-Ad-DOPE(IV)RBC在37℃培养，然后离心
Figure GSB00000643115200352
表10.凝集评分-BSA直接离心
Figure GSB00000643115200361
表11.凝集评分-BSA，在37℃培养，然后离心
Figure GSB00000643115200362
表12.凝集评分-血清直接离心
Figure GSB00000643115200371
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Claims (9)

1.结构为F-S1-S2-L的碳水化合物-脂类化合物，具有如下子结构：
Figure FSB00000978727200011
其中*不是H，F-S1是透明质酸的低聚物，透明质酸由β1-4连接的葡糖醛酸β1-3N-乙酰氨基葡萄糖(GlcUAβ1-3GlcNAc)的双糖单元组成，其通过末端糖胺残基(gar)与S2连接，S2选自-CO(CH2)3CO-、-CO(CH2)4CO-或-CO(CH2)5CO，其中n是3、4或5，L是磷脂酰乙醇氨基；以及F、S1、S2和L是共价连接的。
2.权利要求1的碳水化合物-脂类化合物，其中F是15-20mer。
3.权利要求2的碳水化合物-脂类化合物，其中L选自：1，2-O-二油酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇氨基和1，2-O-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇氨基。
4.下列结构的碳水化合物-脂类化合物：
Figure FSB00000978727200012
其中M是一价阳离子，选自H+、Na+、K+或NH4 +。
5.一种培养基，包括权利要求1-4的任一项碳水化合物-脂类化合物的分散体。
6.权利要求5的培养基，其中培养基是ART或IVM培养基。
7.一种药用制剂，包括权利要求1-4的任一项碳水化合物-脂类化合物。
8.权利要求7的制剂，其中制剂是适合于吸入的形式。
9.权利要求8的制剂，其中制剂是适合于吸入的气雾剂形式。
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