CN1012712B - 甲型肝炎病毒的纯化及其三次克隆 - Google Patents

甲型肝炎病毒的纯化及其三次克隆

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Abstract

人类甲型肝炎病毒(HAV)可以经过一个处理过程被纯化。即将第20代、但最好至少是第20-30代的病毒，应用最终稀释法，通过三次克隆便获得甲型肝炎病毒HM-175株的繁殖病毒种。利用接种灵长类动物试验上述被纯化病毒的作用。结果引起很轻或完全没有引起肝炎。但产生明显的抗体反应。本发明也叙述了三次克隆接种物制备的方法。

Description

甲型肝炎病毒（HAV）具有世界性分布。在美国，每年高达10，000例的肝炎病与此类病毒感染有关。并且正如大部分发达国家一样，美国的甲型肝炎约占临床肝炎总病例的20-15%。在发展中国家，此类肝炎具有高度地区性。10岁前的人群中，实际感染率达100%。甲型肝炎病毒是一种微小核糖核酸病毒，但具有许多肠道病毒的特点，故以此进行分类。病毒传播方式主要通过粪-口腔。所以在许多情况下是通过污染的水源或食物进行传播。但最常见的传播方式还是人与人之间的接触。而胃肠道外的传染是很少的。
美国专利4，164，566（普罗沃斯特等）提出了生产甲型肝炎病毒体外细胞培养物的方法。但他们所用的HAV株与我们的不同。这种病毒株至少在接近人类的灵长类动物体内传代五次才能获得。而美国专利申请序号336，165发明人的目标是想证明可以直接从人类的临床标本中分离出HAV，并能在原代非洲绿猴肾细胞培养物中进行一系列传代。有关的文献有：
Daemer等人：Infection  and  Immunity，Vol.32，No.1，4月，1981年，PP.388-393。
Purcell等人，“Hepatitis  A  Virus，”在印刷中。
甲型肝炎病毒HM-175株已按照专利程序于1984年10月5日保藏在美国典型培养物保藏中心，保藏号为ATCC  VR2097，VR2098和VR2099。并于1985年11月17日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC  No.V8501，V8503和V8504。这样一方面可以永久性保存病毒株;同时一旦专利颁布，公众可以迅速获得该病毒株。
将甲型肝炎病毒HM-175的繁殖病毒种经过三次克隆，便可获得一种 优良的疫苗。这种疫苗可在黑猩猩或其他灵长类动物如狨体内产生抗体而不引起疾病。如再用野型病毒攻击，结果由于黑猩猩具有抗体而获得保护。这是疫苗作用的明显标志。
HM-175人类甲型肝炎病毒在原代非洲绿猴肾细胞内经过10和20代适应性培养后，用黑猩猩试验，证明此时病毒的毒性已减弱。其体内由于产生甲型肝炎抗体而使血清转阳性。但不伴有肝炎的生化指标阳性，参见表1。所以如果予先用HAV减毒株感染黑猩猩，则体内产生甲型肝炎抗体。此时再用可传染的HAV攻击，则由于上述抗体的保护而不发生肝炎。但再感染发生在原发免疫反应的恢复早期除外，见表2。同样方法在身上进行实验，则发生肝炎。不过其严重程度不如用野生型病毒感染后产生的肝炎（表1和图1）。为证明组织培养传代后病毒减毒效果的稳定性，可用予先接种过此种病毒动物急性期的粪便，再接种（皮肤透入，但最好用静脉注入）另外黑猩猩，见表3。此时，受体动物肝炎生化指标阴性，但抗甲型肝炎抗体阳性。
甲型肝炎病毒HM-175繁殖毒种株在分别在第10，20和30代时通过最终稀释法进行三次克隆（图2）。取第20代病毒的二株克隆在黑猩猩体内检查其减毒程度。结果只产生极轻度或甚至无肝炎。用克隆＃1接种的6只动物中3只产生抗体;克隆＃2接种的4只动物中有3只产生抗体。
上述结果证明甲型肝炎病毒HM-175株经三次克隆后对于黑猩猩是一种有效的活疫苗。
这种疫苗适用于哺乳类或高等灵长类，包括人，黑猩猩和狨。三次克隆（3X）所得的病毒在纯度上优于两次克隆（2X），是一种均匀的病毒制剂，适合作疫苗用。这里提到的病毒繁殖毒种是利用第10代和第20代的病毒用最终稀释法经三次克隆后取得的（Cunningham，A  Laboratory  Guide  in  Virology，5th  ed.，Burgess  pub，Co.）1963，PP. 144-145）。这种稀释的目的是使最大稀积阳性管内的病毒只来自一个病毒颗粒。这样取得的产品才具有生物性质上的纯粹性。
利用最终稀释法进行克隆方面，3X法对纯化病毒或疫苗似乎是最合适的。这种3X选择法与以下引用的文献一致：Lenntt  and  Schmidt，“Diagnostic  Procedure  for  Viral  and  Ricksettial  Infections，”American  Public  Health  Association，5  ed.，1979，102页;Dulbecco  and  Vogt，“plague  Formation  and  Isolation  of  pure  Lines  with  poliomyelitis  Viruses，”J.Exp.Med.，99：167-182，1954.
已将人类甲型肝炎病毒HM-175株引入这个国家，同时在下列杂志中被提到：Infection  and  Immunity，32（1），4月，1981年，388-393页。
实施例1
病毒的克隆按如下方法进行：取未经克隆的混杂病毒，经过10-1至10-8的一系列稀释。将每种稀释液接种到9管原代非洲绿猴细胞培养液中。任其细胞生长繁殖。同时病毒亦在细胞内生长繁殖。8周后收获。检查每管中有无甲型肝炎病毒抗原存在。包括检查最高稀释度，即10-8稀释管。结果有些是阴性管，亦有阳性管。在最高稀释度管中，根据统计分析，阳性管是繁殖自一个病毒颗粒;阴性管不含病毒。选取每次最终稀释系列中的两个阳性管，用相同的方法进行第二和第三次克隆。在第三次克隆最终稀释管中获得二个阳性管和一个未接种病毒的对照管。由单个病毒颗粒繁殖起来的阳性管发展成为繁殖病毒种。随后将此病毒种繁殖并用于黑猩猩实验（图2）。
实施例2
繁殖病毒种的应用。将经过稀释或未经稀释的三次克隆的繁殖病毒种接种到黑猩猩体内。这些未经稀释的繁殖病毒种来自三次克隆管。将此种病毒再接种到另外细胞以增加其数量。收获这些接种培养物即组成一个较大的病毒库。也是一个扩大的繁殖病毒种库。以后可用它经10 倍稀释或不稀释接种到黑猩猩体内。
实施例3
动物接种。通过静脉注射或口服将上述制备的病毒接种入黑猩猩体内。以后4-6个月内每周取血检查肝脏的酶是否升高（ALT，丙氨酸氨基转移酶）和抗HAV抗体。如果血中肝脏酶增加，说明动物患甲型肝炎。而抗体的存在则说明有保护作用，不患肝炎（表4）。将克隆＃1（组织培养第20代或21代）通过静脉或口服接种感染15只易感黑猩猩中的11只。结果只有2只发生轻度肝炎。接种3-8周后，这11只感染过的黑猩猩皆产生保护性抗体。将克隆＃2（组织培养第20代）静脉注入4只易感黑猩猩，其中只有1只产生非常轻而可疑的肝炎。4只全部产生保护性抗体。同样，在2只经静脉接种克隆＃4（组织培养第9代）的易感黑猩猩中一只不发生肝炎，但产生了保护性抗体。
表1
甲型肝炎病毒HM-175株的减毒：动物试验
·组织培    黑猩猩
养代数    动    ALT    （范围）    动    ICD    （范围）
物    最高值    物    最高值
数    均数    数    均数
0    7    314    （109-419）    10    4777    （1，631-15，980）
10    7    62    （41-75）    未做
20    5    48    （37-61）    7    3516    （1，062-10，230）
20和21＊    10    60    （38-87）    3    2936    （2，263-3，799）
No HAV+6 57 （41-81） 4 610 （483-927）
＊三次克隆
+无感染性的HAV稀释液
表2
免疫后黑猩猩对野型HAV攻击的应答
黑猩猩    予刺激    刺激    剌激液＊
疫苗    抗HAV（P/N）    最高ALT值    抗HAV
（最高值）：P/N
A-8    TCP-10    9.5    64    22.8
947    TCP-20    9.1    65    28.3
A-53    TCP-20    11.4    280    28.1
A-54    TCP-20    4.8    57    14.3
A-55    无    1.3    402    26.0
＊HM-175野型 103CID
表3
黑猩猩体内的减毒HAV转移试验
接种物    来源    受体    最高ALT值    抗-HAV
急性期    黑猩猩922    黑猩猩A-136    57    -
粪便    （组织培养第10代）
急性期    黑猩猩947，A-11，
混合粪便    A-53，A-54    黑猩猩992    46    ＋
（组织培养第20代）
表4
黑猩猩对三次克隆HAV，HM-175株的应答
黑    组织培    接种后    接种前    酶值增    首次抗
猩    接种物    养感染    最高酶    最高酶    加持续    体出现
猩    量    值    值    时间    时间
（TCID）    （周）    （周）
Figure 85107525_IMG1

Claims (4)

1、制造均匀的甲型肝炎减毒活病毒组合物的方法，该方法包括使用连续传代的甲型肝炎病毒，其特征在于步骤有：对未经克隆的至少经过10-30次传代的甲型肝炎病毒HM-175进行连续稀释，将各稀释液分别接种到哺乳动物细胞培养液中培养该病毒，富集克隆过的病毒颗粒，从经过三次克隆产生的毒种株用于制备疫苗组合物。
2、按权利要求1的方法，其特征在于哺乳动物细胞培养物是原代非洲绿猴细胞培养物。
3、按权利要求1的方法，其中所制取的均匀的甲型肝炎减毒活病毒组合物可制成适用于注射给药的形式。
4、按权利要求1的方法，其中所制取的均匀的甲型肝炎减毒活病毒组合物可制成适用于口服给药的形式。
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