CN101270355B - 一种促进处于低氮条件下植物生长的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种促进处于低氮条件下植物的生长方法，包括：采用常规基因工程方法，使植物体内的AtLNTl基因失活或不表达。本发明方法能够增加处于低氮条件下植物的侧根数目，提高植物吸收氮营养元素的能力，并且还能够提高植物体的氮素含量，提高植物的光合作用，从整体来看，本发明方法对处于低氮条件下植物的生长具有明显的促进作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种促进植物生长的方法，尤其涉及采用基因工程手段促进处于低氮条件下植物生长的方法，属于植物基因工程领域。
背景技术
氮素是植物生长和发育所必需的大量元素，是植物体内许多重要有机物的主要成分。虽然氮素在生态圈中以多种形式存在，但是植物一般只能利用土壤中现成的有效态氮，包括无机氮(硝态氮和铵态氮)和有机氮(氨基酸)。土壤中这种有效氮含量是很低的，大部分耕地的土壤全氮含量都在0.2％以下，甚至低于0.075％，因此植物的生长发育经常受到氮素供应的严重不足，氮素胁迫已经成为限制植物生长发育的最大因子。虽然大量投入氮肥能暂时缓解这种不足，但是也造成了巨大的负面影响。因此，正如Clark等(2000)指出：人类在通过“施用氮肥改变土壤环境满足植物需要方面取得了巨大成绩”，但这种途径“并不是最实用和最经济的办法”，可以“运用遗传学方法提高植物对土壤环境逆境的适应性”，这样既可以“降低生产成本”，又可以“减少大量施用化肥所造成的环境污染”，而且对“动物和人类的营养有益”。
由于植物氮素养分主要来源于土壤，一般认为土壤全氮含量低于0.2％即属于缺氮，低于0.075％属于严重缺氮。我国土壤全氮含量的基本分布特点是：东北平原较高，黄淮海平原、西北高原、蒙新地区较低，华东、华南、中南、西南地区中等。大体呈现南北较高，中部略低的分布。但南方略高主要指水稻土，旱地含氮量很低。我国农田相对严重缺氮的土壤主要分布在我国的西北和华北地区。如果把土壤全氮含量等于0.075％作为严重缺氮的界限，严重缺氮耕地超过面积一半的有山东、河北、河南、陕西、新疆等五个省区。我国现有耕地20.16亿亩(约1.34亿公顷)，缺氮耕地4.7亿亩，占耕地33.6％，全国30％的省份耕地缺氮。
拟南芥(Arabidopsis thaliana)以其基因组很小、生长周期较短等优点成为研究高等植物的模式系统。随着近年来多项基因组计划的逐步实施和分子生物学的迅猛发展，基因表达芯片技术也得到快速发展，使得拟南芥的生物资源越来越丰富。
AtLNT1属于拟南芥MYB超级家族。MYB超级家族是拟南芥最大的基因家族，共有近200个成员，通常分为3个亚族：R2R3-MYB(具有两个相邻的MYB重复结构)，R1R2R3-MYB(具有三个相邻的MYB重复结构)和MYB类似基因亚族(该亚族成员间没有同源性，但都具有一个MYB重复结构)(Rosinski，J.A.and Atchley，W.R.1998.Molecular evolution of the Myb family of transcription factors：evidence forpolyphyletic origin.J Mol Evol.46：74-83；Jin，H.and Martin，C.1999.Multifunctionality and diversity within the plant MYB-gene family.Plant Mol Biol.41：577-585；Stracke，R.，Werber，M.and Weisshaar，B.2001.The R2R3-MYB gene familyin Arabidopsis thaliana.Curr Opin Plant Biol.4：447-456.)。AtLNT1(GenBankAccession NM_123085)属于MYB相关基因亚族。R2R3-MYB基因亚族参与许多生理和生化过程，包括次生代谢调节(Baudry，A.，Heim，M.A.，Dubreucq，B.，Caboche，M.，Weisshaar，B.and Lepiniec，L.2004.TT2，TT8，and TTG1 synergistically specify theexpression of BANYULS and proanthocyanidin biosynthesis in Arabidopsis thaliana.Plant J.39：366-80)、细胞形态发生调控(Higginson，T.，Li，S.F.and Parish，R.W.2003.AtMYB103 regulates tapetum and trichome development in Arabidopsis thaliana.PlantJ.35：177-192.)、分裂组织形成和花、种子发育的调控(Steiner-Lange，S.，Unte，U.S.，Eckstein，L.，Yang，C.，Wilson，Z.A.，Schmelzer，E.，Dekker，K.and Saedler，H.2003.Disruption of Arabidopsis thaliana MYB26 results in male sterility due to non-dehiscentanthers.Plant J.34：519-528.)、细胞周期控制(Araki，S.，Ito，M.，Soyano，T.，Nishihama，R.and Machida，Y.2004.Mitotic cyclins stimulate the activity of c-Myb-like factors fortransactivation of G2/M phase-specific genes in tobacco.J Biol Chem.279：32979-88)，还参与防卫和逆境胁迫反应(Stockinger，E.J.，Mao，Y.，Regier，M.K.，Triezenberg，S.J.and Thomashow，M.F.2001.Transcriptional adaptor and histone acetyltransferaseproteins in Arabidopsis and their interactions with CBF1，a transcriptional activatorinvolved in cold-regulated gene expression.Nucleic Acids Res.29：1524-1533；Nagaoka，S.and Takano，T.2003.Salt tolerance-related protein STO binds to a Mybtranscription factor homologue and confers salt tolerance in Arabidopsis.J Exp Bot.54：2231-2237；.)，以及光和激素信号传导(Newman，LJ.，Perazza，D.E.，Juda，L.andCampbell，M.M.2004.Involvement of the R2R3-MYB，AtMYB61，in the ectopiclignification and dark-photomorphogenic components of the det3 mutant phenotype.Plant J.37：239-50.)等；R1R2R3-MYB只在细胞周期和分化方面具有保守的功能(Ito，M.，Araki，S.，Matsunaga，S.，Itoh，T.，Nishihama，R.，Machida，Y.，Doonan，J.H.andWatanabe，A.2001.G2/Mphase-specific transcription during the plant cell cycle ismediated by c-Myb-Like transcription factors.Plant Cell 13：1891-1905.)；MYB相关基因亚族的功能一直以来很少受到重视，只有少数CCA1类似基因研究表明与植物生理节律的维持相关(Kuno，N.，Moller，S.G.，Shinomura，T.，Xu，X.M.，Chua，N.-H.andFuruya，M.2003.The novel MYB protein EARLY-PHYTOCHROME-RESPONSIVE1is a component of a slave circadian oscillator in Arabidopsis.Plant Cell，15：2476-2488.)，以及CPC类似基因在细胞形态发生上具有功能(Kirik，V.，Simon，M.，Huelskamp，M.and Schiefelbein，J.2004.The ENHANCER OF TRY AND CPCl geneacts redundantly with TRIPTYCHON and CAPRICE in trichome and root hair cellpatterning in Arabidopsis.Dev Biol.268：506-13.)。尽管MYB超级家族的功能繁多，但是目前为止尚无具有在低氮逆境发挥功能的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种促进处于低氮条件下植物生长的方法。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
一种促进处于低氮条件下植物生长的方法，包括：按照本领域的常规基因工程方法，将处于低氮条件下植物的体内AtLNT1基因(SEQ ID NO：1)失活或不表达。其中，所述的将AtLNT1基因失活或不表达的方法是本领域技术人员所通晓的，例如，可以采用RNA干扰(RNA interference，RNAi)的方法(Liu Q，Singh A G.High-stearicand High-ohic cotton seed oils produced by hairpin RNA medlated post transcriptionalgene silencing.Plant Physiol.2002.129(4)：1732-1749；Marlna Byzova。ChrismphVerduyn.et al.Transformation Detals into sepaloid organ s in Arabidopsis and oilseedrape：implementation of the hairpin RNA mediated gene silencing technology in organ-specific manner.Planta.2004.218(4)：379-387；Fukusakl E，Kawasald K，Kaji 7 yarnaS，et al.Flower color odulations o Torenia IIy da by down regulation of chalconesynthaes genes with RNA interference.J Biotechnol.2004，111(3)：29～240；ogita s.，Uei H.，M orimoto M.，and SanoH.，2004，Application of RNAito confirmtheobmmineasthemajorintermediate for cafeine biosynthesis in cofee plan ts with potential forconstruction ofdecafeinated varieties，Plant Mol.Biol.，54(6)：931-94；Byzova M.，Verduyn C.，de Brouwer D.，and de Block M.，2004，Transforming petals into sepaloidorgan s in Arabidopsis and oilseed rape：implementation of the hairpin RNA-mediatedgene silencing technology in an organ-specific manner，Planta.218：379-387)，精确降解AtLNT1基因序列从而破坏AtLNT1基因的翻译和表达；也可以采用反义RNA(antisense RNA)技术(Hamilton AJ，Lyeett GW，Griemon D.Antisense gene thatinhibits synthesis of the hormone ethylene intransgenic plant Nature，1990，346：284；Oiler PW，Wong LM，Taylor LP，et al.Reversible inhibition of tomato fruit Csenescence by antisense RNA.Science，1991，254：43；Van der Krol AR，LentingPE，Veestra J，et al.An antisense chalcone synthase gene in transgenic plant inhibitsflower pigmentation[J].Nature，333：866；Knutzon DS，Thompson GA.Modificationof brassica seed oil by antisense expression of a stearoylacyl carrier protein desaturasegene.Proc Natl Acad Sci USA，1992，89：2624；Van der Meer IM，Stam ME.Antisenseinhibition of flavonoid biosynthesis in petunia anthers results in male sterilityl.PlantCell，1992，4：253)，通过小分子量的可扩散DNA转录物与AtLNT1基因特异性的碱基互补从而控制该基因的表达或参与该基因表达的调控。总之，不论采用哪种基因工程方法，只要使植物体内AtLNT1基因失活或不表达，均能达到促进处于低氮条件下植物生长的效果。
作为本发明一个最优选的实施方案，优先采用RNA干扰的方法，破坏植物体内AtLNT1基因的功能。具体来说，可参考Liu等所公开的RNA干扰技术进行(RNAinterference，RNAi)的方法(Liu Q，Singh A G.High-stearic and High-ohic cottonseed oils produced by hairpin RNA medlated post transcriptional gene silencing.PlantPhysiol.2002.129(4)：1732-1749)。
本发明方法适用于所有的单、双子叶植物，例如各种经济作物(例如棉花、烟草)和粮食作物(例如水稻、小麦)等。
植物氮素养分主要来源于土壤，而我国大部分耕地的土壤全氮含量都在0.2％以下，我国土壤全氮含量的基本分布特点是：东北平原较高，黄淮海平原、西北高原、蒙新地区较低，华东、华南、中南、西南地区中等。大体呈现南北较高，中部略低的分布。但南方略高主要指水稻土，旱地含氮量很低。我国农田相对严重缺氮的土壤主要分布在我国的西北和华北地区。如果把土壤全氮含量等于0.075％作为严重缺氮的界限，严重缺氮耕地超过面积一半的有山东、河北、河南、陕西、新疆等五个省区。我国现有耕地20.16亿亩(约1.34亿公顷)，缺氮耕地4.7亿亩，占耕地33.6％，全国30％的省份耕地缺氮。
氮素是植物生长与发育需要量最大的无机养分，是植物体蛋白质、核酸和次级代谢物质的重要组成部分，其重要性对植物是不言而喻的，一般植物缺氮往往表现为生长缓慢，植株矮小，叶片薄而小，叶色缺绿发黄。禾本科作物则表现为分孽少。生长后期严重缺氮时，则表现为穗短小，籽粒不饱满。在增施氮肥以后，对促进植物生长健壮有明显的作用。往往施用后，叶色很快转绿，生长量增加。
本发明方法通过抑制植物AtLNT1内源基因的表达，与野生型植物相比，AtLNT1基因失活的植物在低氮胁迫下，其侧根数量显著增加，能从土壤中吸收更多的氮素营养以弥补土壤中氮素不足所造成的损害，叶片中氮素含量明显增加，植物整体的生物量累积也显著提高，而作为缺氮逆境相应的花青素积累则有所下降，叶绿素的破坏程度减轻，光合作用相对增强，具有较强的抗逆境胁迫能力，适应性更强，其整体生长状况要明显优于野生型植物。
附图说明
图1AtLNT1基因T-DNA插入突变体的鉴定结果。
图2promoterAtLNT1::GUS对全氮(FN)、低氮(LN)和低氮补氮(AN)GUS染色结果。
图3promoterAtLNT1::GUS对全氮(FN)、低氮(LN)和低氮补氮(AN)GUS活性测定(FNL、LNL、ANL分别表示全氮、低氮和补氮后地上部；FNR、LNR、ANR分别表示全氮、低氮和补氮后根部)。
图4野生型WT和突变体lnt1-1、lnt1-2在全氮(A)和低氮(B)侧根形成的比较。
图5野生型WT和突变体lnt1-1、lnt1-2在全氮(FN)、低氮(LN)主根长度和侧根数目的比较结果(每个数据代表9个植株、3次重复的平均值)。
图6野生型WT、突变体lnt1-1和互补株系lnt1+AtLNT1在全氮(A)和低氮(B)侧根形成的比较。
图7野生型WT和突变体lnt1-1、lnt1-2在全氮(FN)、低氮(LN)花青素的比较结果(每个数据代表3次重复的平均值)。
图8野生型WT和突变体lnt1-1、lnt1-2在全氮(FN)、低氮(LN)叶绿素含量的比较结果(每个数据代表3次重复的平均值)。
图9野生型WT和突变体lnt1-1、lnt1-2在全氮(FN)、低氮(LN)NO3-(A)和NH4+含量(B)的比较结果(每个数据代表3次重复的平均值)。
图10供氮水平对植株生物量积累的影响(上图：FN；下图：LN)。
图11供氮水平对开花前植株生物量积累的影响(左图：地上部；右图：根)。
图12低氮胁迫下开花后野生型与突变体的生物量积累的差异。
具体实施方式
以下通过实施例来进一步描述本发明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的范围。
实施例1
本实验中用了拟南芥野生型WT(Columbia生态型)、T-DNA插入突变体lnt1-1和lnt1-2，以及突变体互补材料AtLNT1+lnt1，promoterAtLNT1::GUS转基因株系。其中拟南芥突变体lnt1-1(SALK_074896)和lnt1-2(SALK_051843)购自Salk InstituteGenomic Analysis Laboratory(http://signal.salk.edu/)。
一、突变体互补材料AtLNT1+lnt1，promoterAtLNT1::GUS转基因株系的制备方法如下：
1、AtLNT1 RNA分离和cDNA反转录：
总RNA的分离和cDNA反转录可按照常规方法进行(《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克，科学出版社)。
2、突变体互补材料AtLNT1+lnt1的制备：
AtLNT1 cDNA用引物5′-AAGCTT CTATGCAGGAACGTTG-3’和5’-GTCGACCCACAAAGGATATGATAAT-3’扩增得到后，经过Hind III和SalI酶切消化后用T4连接酶与也用Hind III和SalI酶切消化的pJIT163-hGFP载体(Cell Research：2006，16：287-296)连接，得到转基因融合蛋白表达质粒CaMV35S::AtLNT1::GFP，再依次用该质粒转化E.coli DH10B、农杆菌GV3101，并最终通过抽真空法(BechtoldN，Ellis J，Pelletier G.In planta Agrobacterium gene transfer by infiltration of adultArabidopsis thaliana plants.CR Acad Sci(Paris)，1993，316：1194～1199)转化突变体lnt1-1。用纯合的T3种子进行分析。
3、promoterAtLNT1::GUS转基因株系的准备：
拟南芥基因组DNA用引物5’-CATGGTACCACTCAGAAAGGTATCAAG和5’-TTGAAGCTTGGTTGCAGAAG AAGAAGAAG扩增后得到长度1.6kb的基因AtLNT1的启动子promoterAtLNT1，用KpnI和HindIII酶切消化后连到也用KpnI和HindIII酶切消化pJIT166载体(从http://www.pgreen.ac.uk商业购买)，形成promoterAtLNT1::GUS质粒。同样依次用该质粒转化E.coli DH10B、农杆菌GV3101，并最终通过抽真空法(Bechtold et al.，1993)转化拟南芥野生型(Columbia生态型)，用纯合的T3种子进行分析。
二、AtLNT1基因T-DNA插入突变体的鉴定：
突变体lnt1-1用引物LP：5′-CCACTTCTGTTTCAGCGTTTTCTG-3’和RP：5′-TGAGGTTAATTTAGGGTTTGTTTTG-3’以及LBa1：5′-TG GTTCACGTAGTGGGCCATCG-3’进行PCR扩增。突变体lnt1-2用LP：5′-CAAGGATCTCAATTTCTAACTGG-3’，RP：5′-TGACTTTTGTTG GTTCTTCTATGG-3’及LBa1：5′-TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG-3’进行PCR扩增。AtLNT1在lnt1-1和lnt1-2的表达情况用引物5’-ATG GCTATGCAGGAACGTTGTGAG-3’和5’TCACCACAAAGATATGATAATTTTACATTG-3’进行扩增检测(图1)。检测结果表明，突变体lnt1-1和lnt1-2中的AtLNT1基因已失活。
三、分别收获拟南芥野生型WT(Columbia生态型)、T-DNA插入突变体lnt1-1和lnt1-2，以及突变体互补材料AtLNT1+lnt1，promoterAtLNT1::GUS转基因株系的种子；以上各种材料种子表面消毒后，点播在全氮(FN)培养基(含有4mM N)、低氮(LN)培养基(含有0.2mM N)。在4℃低温春化3天后放置在22度、70％湿度、连续光照的培养间生长。FN和LN培养基的配方参考文献(plant hysiology，2004，13：2483-2499)，具体为：
FN培养基：2mM KNO3，1mM NH4NO3，1mM Gln，3mM KH2PO4-K2HPO4，pH5.8，4mM CaCl2，1mM MgSO4，2mM K2SO4，3mM MES，pH5.8，0.5％(w/v)Suc，40mM Na2Fe-EDTA，60mM H3BO3，14mM MnSO4，1mM ZnSO4，0.6mM CuSO4，0.4mM NiCl2，0.3mM HMoO4，20nM CoCl2；
LN培养基：0.1mM KNO3，50mM NH4NO3，3mM KCl，无Gln，3mM KH2PO4-K2HPO4，pH5.8，4mM CaCl2，1mM MgSO4，2mM K2SO4，3mM MES，pH5.8，0.5％(w/v)Suc，40mM Na2Fe-EDTA，60mM H3BO3，14mM MnSO4，1mM ZnSO4，0.6mMCuSO4，0.4mM NiCl2，0.3mM HMoO4，20nM CoCl2。
四、拟南芥野生型WT、T-DNA插入突变体以及突变体互补材料的生长情况比较
1、为比较拟南芥野生型WT、T-DNA突变体lnt1-1、lnt1-2和互补AtLNT1+lnt1的生长差异，这些材料种子经过表面消毒后点播在全氮(FN)和低氮(LN)培养基上，在4℃低温春化3d后进行垂直生长10d，统计各9株侧根(≥1mm)的数目。(主根长度：用直尺测量从根茎接合处到根尖生长点的长度(cm)；侧根数目：统计侧根(长度大于1mm)的侧根的数目)，重复3次。
试验结果见图4、图5和图6。从实验结果可以看出，在全氮水平时，LNT1基因T-DNA插入突变体(突变体lnt1-1、lnt1-2)和野生型之间生长不论是主根的长度还是侧根的数目都没有明显的差异。在低氮供应水平下，虽然主根长度在突变体与野生型之间上仍旧没有明显的差异，但是T-DNA插入突变体在受到低氮供应胁迫后，明显比野生型长出更多的侧根，总体上比野生型的侧根多70％左右，转基因互补株系的侧根产生最少，表明在突变体转入LNT1基因后能抑制了低氮胁迫下侧根的产生，从而互补突变体因为LNT1基因功能丧失而产生的表型。
2、AtLNT1对氮素水平的反应
分别用在FN平板萌发生长5d(天)的promoterAtLNT1::GUS纯合种子分别进行全氮2d和低氮(LN)2d再补氮(AN，即在全氮培养基上)0.5d，取各处理的材料用GUS染色液37℃染色，同时测定各处理地上部和根部的GUS活性。试验结果见图2和图3。
LNT1基因的启动子的GUS组织化学染色实验和GUS活性测定实验表明，当植株的氮素供应从全氮水平(4.0mM)转移到低氮水平(0.2mM)后，植株地上部和地下部的GUS蓝色信号都明显下降或者变弱，表明LNT1基因的启动子在受到低氮胁迫时活性下降。但是，当把生长于低氮下的植株再次移到全氮水平生长使植株的氮素供应恢复到正常水平后，植株地上部和地下部的GUS蓝色信号也增强，说明该基因启动子活性大大增加(地上部和根分别为低氮时的200％和300％)。表明LNT1基因的功能与植株的氮素供应水平密切相关。
4、花青素和叶绿素含量测定：
花青素和叶绿素含量的测定方法可参考文献(plant physiol.Vol.128，2002)，具体为：
叶绿素含量测定：分别称取全氮和低氮水平生长10d植株的地上部，用80％(体积比)丙酮室温黑暗浸泡过夜，用分光光度计(UV3000)分别测定663nm和645nm的光吸收值，从而测得相应的叶绿素含量。重复3次。
花青素含量测定：分别称取全氮和低氮水平生长10d植株的地上部，用液氮研成粉末，4℃低温用300μl 7％(盐酸甲醇体积比)过夜浸提，加入依次200μl灭菌去离子水、500μl三氯甲烷混匀，13000rpm离心2分钟。取上清(400μl)加入600μl 1％(盐酸甲醇体积比)再次离心。测定上清530nm和657nm光吸收值。花青素相对含量用单位鲜重530nm与657nm光吸收差值表示。
花青素的累积是植物对生存逆境胁迫的一个重要响应指标；植物花青素的积累程度可以反映植物对逆境的忍受能力。对低氮胁迫下野生型和突变体的花青素积累的比较后发现，经过2周低氮胁迫，野生型和突变体的花青素均比在全氮水平时有急剧的积累。而且，低氮胁迫逆境下，野生型比突变体积累更多花青素，它们的花青素含量分别为为2.17、1.37和1.32(花青素含量以OD530-OD657表示)，可见野生型的花青素积累几乎比两个突变体多一半(图7)。说明在相同的低氮供应水平下，野生型遭受了更严重的逆境胁迫，或者说野生型比突变体更不能忍受低氮的胁迫，对低氮胁迫更为敏感些。
与花青素的累积相对应，在低氮环境下野生型和突变体的叶绿素也受到破坏。首先，在全氮生长环境下，野生型和两个突变体植株叶绿素的含量并不存在明显差别(野生型、突变体lnt1-1和lnt1-2的叶绿素含量分别为312、321和316μg·g-1FW)。而在低氮胁迫2周后，野生型和突变体的叶绿素明显受到破坏而发生降解。野生型最为严重，叶绿素仅存171μg·g-1FW，为全氮时的60％；相对而言，突变体lnt1-1和lnt1-2在低氮后叶绿素破坏稍微弱些，分别为225和223μg·g-1FW。显然，低氮逆境胁迫后野生型比突变体的叶绿素含量存在显著差异(图8)。
5、NO3 -和NH4 +含量测定
硝态氮含量的测定
硝态氮含量的测定方法参考Munos等(2004)并作适当修改，具体为：
(1)标准曲线的制作
1)吸取500mg·L-1硝态氮(KNO3，Sigma)标准溶液0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml分别放入5ml试管中，用无离子水定容5ml，使之成10、20、30、40、60、80、100、120mg·L-1的系列标准溶液。
2)吸取上述系列标准溶液0.1ml，分别放入刻度试管中，以0.1ml蒸馏水代替标准溶液作空白。再分别加入0.4ml 5％水杨酸-硫酸溶液，摇匀，在室温下放置20min后，再加入8％NaOH溶液9.5ml，摇匀冷却至室温。
3)绘制标准曲线：以空白作参比，在410nm波长下测定标准溶液的光密度。以硝态氮浓度为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线并计算出回归方程。
(2)植物样品硝态氮含量的测定
1)样品液的制备分别称取一定量的在全氮(FN)和低氮(LN)上生长10d的拟南芥小苗，分次加入5ml超纯水充分研磨后导入玻璃管中，封口，置入沸水浴中提取30min。到时间后取出，用自来水冷却，将提取液于5,000rpm离心10min。取上清液作为样品液进行植物样品铵态氮的含量测定。重复3次。
2)样品液的测定吸取样品液0.5ml分别于三支刻度试管中，然后加入5％水杨酸-硫酸溶液0.4ml，混匀后置室温下30min，再慢慢加入9.1ml 8％NaOH溶液，待冷却至室温后，以空白作参比，在410nm波长下测其光密度。在标准曲线上查得或用回归方程计算出硝态氮浓度，再用以下公式计算其含量。
NO3 --N(硝态氮含量)＝C*V/W
式中C-标准曲线上查得或回归方程计算得NO3 --N浓度；
V-提取样品液总量；
W-样品鲜重。
铵态氮含量测定
铵态氮含量的测定方法参考Garciarrubi等(1997)，并适当修改，具体为：(1)标准曲线的制作
本实验以亮氨酸作为标准样品。先把亮氨酸(Sigma)于80-90℃烘箱烘干至恒重。称取适量溶于无氨水中。配成浓度为5μg·ml-1作为母液。然后分别取0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、1.8和2.0ml，并于每个试管中补加无氨水到2ml，对照仅加2ml水。后在各个试管中加入3ml茚满三酮试剂。以测得的结果绘制标准曲线。
(2)植物样品铵态氮含量测定
称取适量在全氮和低氮培养基上生长10d新鲜拟南芥小苗，放入研钵中，加入5ml 10％醋酸，研磨后以水稀释到10ml，混匀，将提取液于5,000rpm离心10min。取0.9ml上清液放入试管中，加入3ml水合茚满三酮试剂(1.2g重结晶的茚满三酮放到锥形瓶中，加入15ml正丙醇，摇匀，使之溶解，后加入30ml正丁醇和60ml乙二醇，混匀。加入9ml pH5.4醋酸缓冲液，混匀。保存于棕色瓶中，至于冷暗处)和0.1ml 1％抗坏血酸，摇匀。盖紧放入沸水中加热20min。同时将盛有对照溶液(0.9ml水+3ml茚满三酮试剂+0.1ml 1％抗坏血酸)的试管加热。取出搅拌冷却15min。加热形成的红色水合茚满三酮被氧化而退色，茚满三酮与氨基酸形成的蓝紫色反应产物仍然存留并变得更加鲜明。冷却后的带色溶液以无水乙醇补到5ml，混匀。以分光光度计于波长580nm处测光密度值，并与对照溶液比较，根据标准曲线并按照下面公式计算铵态氮含量。重复3次
NH4 +-N(铵态氮含量)＝(0.1*5*C)/(2*n)＝25*C/n
其中：C为比色液中铵态氮浓度(μg·ml-1)；5为比色液体积(ml)；n为样品鲜重(g)；10为分析溶液总体积(ml)；0.1为μg换算成mg并折算成100g物质重含量的换算系数。
试验结果表明，在全氮水平下生长2周后，铵态氮和硝态氮含量在野生型与突变体之间没有显著差别，硝态氮含量在野生型、两个突变体lnt1-1、lnt1-2大约为94.8、92.6和96.7μmol·g-1FW；而铵态氮的含量在这3个材料中为78.1、82.4和84.5μmol·g-1FW。在低氮水平生长2周后，野生型和突变体的铵态氮和硝态氮含量都下降，尤其是硝态氮含量在低氮环境比全氮环境低的多。
进一步对低氮胁迫下野生型与突变体之间的铵态氮和硝态氮含量进行比较，发现这3个材料中的铵态氮的含量是没有差别的，分别为56.3、59.6和55.1μmol·g-1FW；但是，野生型植株的硝态氮含量显著低于两个突变体植株，它们的硝态氮含量分别为12.1，18.5和18.6μmol·g-1FW，两个突变体lnt1-1、lnt1-2中硝态氮含量比野生型高出近50％(图9)。
5、低氮胁迫下野生型与突变体生物量积累的比较
生物量积累是最能反映植物在生存逆境下的生活能力和适应性的指标。试验结果表明，与全氮水平时植株的生长相比较，在低氮水平生长时野生型和突变体的生物量积累都下降，尤其时植株的地上部下降尤其显著。进一步比较低氮水平时野生型与突变体生物量累积的差异，发现不论是植株地上部还是地下部根，两个突变体都比野生型积累了更多的生物量，并且差异达到显著水平，表明受到低氮胁迫后突变体比野生型生长的更好些。比较低氮环境植株开花以后野生型与突变体的生长差异发现，与植株开花前的生物量差异趋势相一致，突变体在植株开花以后比野生型累积了更多的生物量，不论是地上部还是地下根均有这个趋势(图10、11、12)。
以上试验结果表明，LNT1基因通过在低氮胁迫逆境下基因表达水平的下降，从而促进对外界硝态氮的吸收、和抑制花青素的累积、叶绿素的降解破坏，最终促进了植物低氮供应时生物量的积累，是植物对氮胁迫逆境响应的负调控因子，可以看出，将拟南芥AtLNT1失活后，在低氮条件下，不表达AtLNT1的突变体植物的整体生长情况要明显优于拟南芥野生型和过量表达AtLNT1的转基因拟南芥。
本发明虽然只用了模式植物-拟南芥这样一种材料作试验，并且是采用T-DNA插入使AtLNT1基因失去功能，从而促进处于低氮条件下植物生长，但是RNA干扰(RNAi)和反义RNA(antisense RNA)等使AtLNT1基因失活的技术是一项非常成熟和稳定的技术，具有高度特异性、高效性和高成功率等优点，为本领域普通技术人员所熟知。此外，许多植物(农作物或经济作物等)中均有AtLNT1的同源基因，有的甚至有非常高的相似性(Oryza sativa 45％～58％、Solanum demissum 52％、Mesembryanthemum 67％等)，因此当这些作物生长在低氮条件的土壤上，采用本领域的常规的分子生物学方法将其体内的AtLNT1基因失去功能，必然能够促进植物的抗逆性，保证其正常生长，显然，这些都是在本发明的保护范围之中。
序列表
<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所
<120>一种促进处于低氮条件下植物生长的方法
<130>P048
<160>1
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>864
<212>DNA
<213>Arabidopsis thaliana
<400>1
atggctatgc aggaacgttg tgagagttta tgttctgatg aacttatatc ttcctcagat 60
gccttttacc tcaagacaag aaagccttat accatcacta aacaaagaga gaaatggaca 120
gaagcagagc atgagaagtt tgtagaagca ttgaaactct atggcagagc ttggagacga 180
atcgaagaac atgttggaac aaaaactgca gttcagattc gaagccatgc gcagaagttc 240
tttactaagg ttgctcgcga ttttggtgtt agctctgagt ccattgagat cccgcctcca 300
aggccaaaga gaaagccgat gcatccttac cctagaaagc ttgtgattcc tgatgcaaaa 360
gagatggtat acgctgaact aaccggatcc aagctgattc aggatgaaga taaccgatct 420
ccaacatcgg ttttatcagc tcatggctca gatggattag gttccattgg ttcaaattca 480
cctaactctt cttcagctga gttatcatct cacacagagg aatcattgtc tctagaagca 540
gagaccaaac agagccttaa gctctttgga aaaacttttg tagttggtga ttacaactct 600
tcaatgagtt gtgatgattc tgaagatggc aagaagaagc tatactcaga aacacagtct 660
cttcaatgtt cttcttctac ttcagaaaac gctgaaacag aagtggtagt gtcggagttc 720
aaaagaagtg agagatcagc tttctctcag ttaaaatcgt cggtgactga gatgaacaac 780
atgagagggt tcatgcctta caaaaagaga gtaaaggtgg aagaaaacat tgacaatgta 840
aaattatcat atcctttgtg gtga 864
Claims (4)
1.一种促进处于低氮条件下植物的生长的方法，包括：采用常规基因工程方法，使生长在低氮条件下植物体内的AtLNT1基因失活或不表达；所述的AtLNT1基因序列为SEQ ID NO：1所示的碱基序列。
2.按照权利要求1的生长的方法，其特征在于：使植物体内的AtLNT1基因家族失活或不表达的基因工程方法是RNA干扰方法或反义RNA方法。
3.按照权利要求2的生长的方法，其特征在于：使植物体内的AtLNT1基因失活或不表达的基因工程方法是RNA干扰方法。
4.按照权利要求1的生长的方法，其特征在于：所述的植物是拟南芥(Arabidopsisthaliana)。
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