CN101254194A - 人参皂苷-Re在神经细胞保护中的应用 - Google Patents

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CN101254194A CNA2008100106778A CN200810010677A CN101254194A CN 101254194 A CN101254194 A CN 101254194A CN A2008100106778 A CNA2008100106778 A CN A2008100106778A CN 200810010677 A CN200810010677 A CN 200810010677A CN 101254194 A CN101254194 A CN 101254194A
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徐峰
徐成
周晓棉
徐琲琲
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Abstract

本发明属于医药技术领域，公开了人参皂苷－Re人参皂苷－Re在神经细胞保护中的应用，提出人参皂苷－Re对脑缺血、脑缺血再灌注损伤、帕金森病小鼠、阿尔茨海默病、PC12细胞具有保护作用，为帕金森病、阿尔茨海默病、脑中风、脑缺血等神经系统疾病的预防和治疗提供了一种新的药物。对于小鼠模型，人参皂苷－Re的应用剂量为8－26mg/kg；对于大鼠模型，人参皂苷－Re的应用剂量为5－26mg/kg；对于细胞实验，人参皂苷－Re的应用剂量为10－5－10－8mol/L。

Description

人参皂苷-Re在神经细胞保护中的应用
技术领域：
本发明属于医药技术领域，涉及人参皂苷-Re在神经细胞保护中的应用。具体涉及人参皂苷-Re对帕金森病、阿尔茨海默病、脑中风、脑缺血等神经系统疾病及其所造成的神经细胞损伤保护作用，提示人参皂苷-Re可以预防和治疗多种脑和神经系统疾病。
背景技术：
神经细胞的损伤、衰老、死亡具有不可逆的特点，在目前众多的脑和神经系统疾病中，都存在神经细胞严重损伤并导致加速死亡的特点，如帕金森病、阿尔茨海默病、脑中风、脑缺血等。
帕金森病(PD)是一种常见的慢性神经退变性疾病，多发于50岁以上人群，并随着年龄的增长发病率逐渐增加，我国的PD患病率在50-60岁之间为0.5％，60岁以上为1％，80岁以上人群的发病率超过5％。PD病理改变主要黑质多巴胺能神经元的变性、脱失，研究表明帕金森病患者多巴胺神经元丧失50％以上。
阿尔茨海默病(AD)是一种原发性、退行性脑病，以获得性持续性记忆减退、认知功能障碍、行为异常以及人格改变为特征。其特征性病理变化为大脑皮质萎缩、β淀粉样蛋白沉积、神经元纤维缠结、大量记忆性神经元数目减少等。据流行病学统计，到2050年，全世界AD人口将超过1亿。因此，AD已成为老年人死亡的重要原因之一。
缺血性脑血管病(ICVD)是威胁人类健康与生存的主要疾病之一，是目前人类重点防治的一类疾病。在ICVD的治疗中重建血流或增强缺血区的血流供应是缺血脑组织修复损伤的必要条件，但同时带来的再灌注损伤也是目前最受关注的问题，脑缺血以及缺血再灌注后能引起一系列病理和生化变化，主要表现为脑能量耗竭，兴奋性氨基酸(EAA)释放增加，胞内Ca2+超载，毒性自由基产生，细胞膜功能受损，细胞肿胀，凋亡和坏死，炎性细胞损害等。它们之间互为因果、互相促进。
人参作为滋补珍品已有几千年的药用历史，人参皂苷为人参的有效成分之一，具有广泛的生物活性，表现为兴奋中枢，促进学习记忆，促进蛋白质、DNA、RNA合成，增加海马突触等作用。而在人参皂苷中，人参皂苷-Re，以下简称Re属于人参三醇型皂苷(结构如下所示)，约占总皂苷的30％。同时由于Re是人参茎叶中含量最多的皂苷，因此这使利用人参皂苷-Re研制新药成为可能。
目前，关于人参皂苷-Re的研究报道较多。药理方面实验表明，人参皂苷-Re具有较好的降低血糖，调节细胞膜的流动性，促进小鼠骨髓细胞增殖，增强心肌细胞的抗氧化以及改善心肌缺血等作用。但人参皂苷-Re对神经细胞的保护作用未见报道。通过研究，我们发现人参皂苷-Re对帕金森病小鼠具有较好的保护作用(已申请专利，公开号：CN1650876A)。进一步的深入研究表明，人参皂苷-Re是一个较好的神经细胞保护剂，对多种脑病以及神经细胞损伤具有保护作用。
Figure A20081001067700041
发明内容：
本发明的目的在于提供人参皂苷-Re在神经细胞保护中的应用，人参皂苷-Re在多种脑病模型及神经细胞中具有保护作用，人参皂苷-Re对脑缺血、脑缺血再灌注损伤、帕金森病小鼠、阿尔茨海默病、PC12细胞具有保护作用，为帕金森病、阿尔茨海默病、脑中风、脑缺血等神经系统疾病的预防和治疗提供了一种新的药物。对于小鼠模型，人参皂苷-Re的应用剂量为8-26mg/kg；对于大鼠模型，人参皂苷-Re的应用剂量为5-26mg/kg；对于细胞实验，人参皂苷-Re的应用剂量为10-5-10-8mol/L。
具体实施方式：
实施例1
本实施例涉及的是人参皂苷-Re对小鼠脑缺氧、缺血、脑水肿的保护作用。
1.1结扎双侧颈总动脉和迷走神经小鼠存活时间测定
取健康昆明种小白鼠40只，雌雄各半，按体重、性别均衡分成4组，每组10只。即空白对照组(0.5％CMC-Na)，人参Re低、中、高剂量组(8、16、32mg/kg)，每天罐胃给药1次，连续给药7天，末次给药1小时后用5％水合氯醛(350mg/kg)麻醉，结扎双侧颈总动脉和迷走神经，观察小鼠存活时间(每分钟呼吸少于或等于5次为死亡)。
表1人参皂苷-Re对小鼠的存活时间的影响
  Group   Does(mg·kg-1)   n   Survival time(s)
  Control   -   10   386.0±86.4
  Re   8   10   548.0±183.8*
  16   10   563.9±28.1**
  32   10   646.0±82.9**
*P＜0.05；**P＜0.01与对照组比较
1.2结扎双侧颈总动脉小鼠脑指数和脑含水量测定
实验动物分组及给药方式同前。末次给药1小时后开始实验，受试动物用5％水合氯醛(350mg/kg)麻醉，结扎双侧颈总动脉，形成急性不完全性脑缺血模型。手术3小时后，断头取脑称重计算脑指数(脑指数＝脑湿重×100/体重)。然后一部分用于干湿法测脑含水量(含水量＝(湿重-干重)/干重)。
表2人参皂苷-Re对结扎双侧颈总动脉小鼠脑指数和脑含水量的影响
Group Dose(mg·kg-1) n Cerebral index   Cerebral watercontent(％)
  Control   -   10   1.148±0.063   5.873±1.131
  Re   8   10   1.146±0.053   5.456±0.396
  16   10   1.080±0.076*   4.781±0.325**
  32   10   1.012±0.041***   4.442±0.292**
*P＜0.05；**P＜0.01与对照组比较
1.3结扎双侧颈总动脉小鼠脑组织SOD和MDA的含量测定
实验动物分组及给药方式同前。末次给药1小时后开始实验，受试动物用5％水合氯醛(350mg/kg)麻醉，结扎双侧颈总动脉，形成急性不完全性脑缺血模型。手术3小时后，断头取脑匀浆后，测定组织中SOD和MDA的含量，测定方法根据试剂盒说明书进行。
表3人参皂苷-Re对结扎双侧颈总动脉小鼠脑组织SOD和MDA含量的影响
Group   Dose(mg·kg-1) n   SOD(Nu/mgprot)   MDA(nmol/mgprot)
  Control   -   10   30.30±11.01   2.78±0.45
  Re   8   10   39.05±7.96*   1.48±0.36***
  16   10   47.87±9.46**   1.26±0.44***
32 10 59.24±9.60** 0.72±0.36***
*P＜0.05；**P＜0.01与对照组比较
以上结果表明，人参皂苷-Re对脑缺氧、缺血、脑水肿具有明显的保护作用。
实施例2
本实施例涉及的是人参皂苷-Re对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用。
将50只健康雄性受试大鼠按体重均衡分为5组，每组10只。即假手术组(Sham surgery，SAM)、模型对照组(0.5％CMC-Na10mL/kg，Vehicle，VEH)、人参皂苷-Re低、中、高剂量组(5、10、20mg/kg)。各组实验动物连续灌胃给药7天，第6天给药后晚间禁食，自由饮水。末次给药后1h，采用栓线法阻断大鼠中动脉致局灶性脑缺血(MCAO)再灌注模型。MCAO再灌注24h大鼠与假手术组动物比较，脑功能出现明显障碍，并，出现明显的脑梗塞。人参皂苷-Re在所选剂量范围内连续灌胃给药7天，对MCAO再灌注24h大鼠行为障碍和脑梗塞面积有明显的改善作用。
表4人参皂苷-Re对MCAO再灌注大鼠行为障碍的改善作用
  Group   Dose(mg/kg)   The scores ofbehavioral disturbance
  SAM   0.0±0.0
  VEH   -   8.2±1.8++
  Re   5   7.0±1.3*
  10   6.7±1.0**
  20   5.6±1.2**
++P＜0.01与SAM组比较；*P＜0.05，**P＜0.01与VEH比较
表5人参皂苷-Re对MCAO再灌注大鼠脑梗塞的保护作用
Group Dose(mg/kg) The weight ofprocerbrum(g)   The weight ofinfarction part(mg)   Infarction part/Procerbrum(％)
  SAM   -   1.17±0.12   0.0±0.0   0.0
  VEH   -   1.18±0.09   124.3±15.6++   10.53
  Re   5   1.16±0.08   101.2±11.6*   8.72
  10   1.18±0.06   92.3±11.9**   7.82
  20   1.19±0.07   85.2±12.2**   7.16
++P＜0.01与SAM组比较；*P＜0.05，**P＜0.01与VEH比较
以上实验结果表明，人参皂苷-Re预防给药对脑缺血再灌注有显著的保护作用。
实施例3
本实施例涉及的是人参皂苷-Re对大鼠脑缺血再灌注海马CA1区神经细胞的保护作用。
实验方法和分组同实施例2。与假手术组神经细胞比较，MCAO再灌注24h大鼠CA1区神经细胞肿胀变形，胞膜结构不完整，并出现不同程度的胞核深染、核固缩、细胞间隙增大、间质水肿明显。不同浓度给药组则使神经细胞的核深染、核固缩程度减轻，神经细胞形态尚正常，细胞间质水肿减轻，核仁清晰可见，缺血中心区坏死的神经元减少。病理组织学检查结果提示：人参皂苷-Re在所选剂量范围内能改善脑缺血再灌注造成的神经细胞损伤，减少神经细胞死亡，从而起到抗脑缺血再灌注损伤的作用。
实施例4
本实施例涉及的是人参皂苷-Re对大鼠脑缺血再灌注后线粒体功能的影响。
线粒体被称为细胞内的动力工厂，是一个敏感而多变的重要细胞器，是细胞中能量储存和供给的场所。在脑缺血过程中最直接的损伤是脑内能量供应急剧减少，随着缺血时间的延长，线粒体的形态和结构均可呈现不同程度的破坏，从而进一步加剧产能功能的障碍。1995年，Siesjo等人提出脑缺血过程中细胞内钙超载。自由基的大量产生和乳酸酸中毒等作用均与细胞内能量的迅速减少密切相关，脑缺血引起的损伤和迟发性神经元坏死的最根本原因可能是能量的缺乏和脑的微循环障碍。已有越来越多的证据表明，线粒体功能障碍是导致脑缺血直接损伤和迟发性神经元坏死的主要原因，同时也是启动细胞凋亡的关键因素。本实验采用Merocyanine-540探针分子和DPH荧光探针考察了人参皂苷-Re对局灶性脑缺血再灌注后大鼠线粒体膜脂质堆积密度和线粒体膜流动性的影响。
表6人参皂苷-Re对大鼠脑缺血再灌注后脑组织中线粒体膜流动性的影响
  Group   Dose(mg/kg) average microviscosity(η)
  SAM   - 3.015±0.381
  VEH   - 6.582±0.821++
  Re   5 4.875±0.102**
  10 4.523±0.508**
  20 3.902±0.406**
++P＜0.01与SAM组比较；**P＜0.01与VEH比较
表7皂苷-Re对大鼠脑缺血再灌注后脑组织中线粒体膜脂质堆积密度的影响
Group Dose(mg/kg) lipid densiy
  SAM   -   60.2±7.1
  VEH   -   41.9±6.6++
  Re   5   49.8±5.9*
  10   53.2±8.5**
  20   58.7±8.2**
++P＜0.01与SAM组比较；*P＜0.05，**P＜0.01与VEH比较
以上实验结果表明，人参皂苷-Re可减轻脑缺血再灌注后对线粒体的损伤，而对脑缺血再灌注引起的脑损伤有一定的保护作用。
实施例5
本实施例涉及的是人参皂苷-Re对PC12细胞损伤模型的保护作用。
阿尔茨海默病(AD)的特征性病理变化为大脑皮层萎缩，并伴有β-淀粉样蛋白(Aβ)沉积，神经元纤维缠结，大量记忆性神经元数目减少，以及老年斑的形成。研究表明，在AD的形成和发展过程中，Aβ的神经毒性作用是关键因素。其具体机制包括细胞内Ca2+稳态，促进自由基的生成，降低K+通道的功能，增加致炎细胞因子引起的炎症反应，激活补体系统，增加脑内兴奋性氨基酸，主要是谷氨酸的含量等。Aβ的神经毒性表现在两个方面，一是放大各种伤害性刺激如低血糖、兴奋毒素、自由基等的细胞损伤效应，二是直接的细胞毒性。
PC12细胞为大鼠髓质嗜铬细胞克隆化的细胞株。分化的PC12细胞具有较典型的神经内分泌细胞的特征，所包含的酶类、膜受体以及其递质合成方面具有神经细胞的一般特征，且具有可传代特点，因此被广泛用于研究神经细胞分化、离子通道、受体、递质分泌的实验，也是研究神经毒性的最常用的细胞株。
结合AD的发病机制和PC12细胞的特点，本实施例考察了人参皂苷-Re对缺糖、自由基、谷氨酸以及Aβ对PC12细胞损伤的保护作用。
表8人参皂苷-Re对PC12细胞缺糖损伤模型的影响
  Group   Content/(mol·L-1)   OD540   Inhibition rate/％   LDH/(U·mL-1)   Inhibition rate/％
  Control   -   2.01±0.08   60.1±172
  Model   -   1.62±0.08+   176.3±13.3+
  Re   10-5   2.11±0.04**   124.3   130.7±5.1**   39.7
  10-6   2.01±0.14**   99.7   140.3±10.2**   31.3
  10-7   1.94±0.11**   80.8   141.3±18.8**   30.4
  10-8   1.89±0.11**   69.1   130.7±5.1**   28.9
+P＜0.05与对照组较；**P＜0.01与模型组较
表9人参皂苷-Re对PC12细胞自由基损伤模型的影响
Group Content/(mol·L-1) OD540   Inhibitionrate/％ LDH/(U·mL-1) Inhibition rate/％
 Control   -   1.93±0.05   106.3±26.5
 Model   -   1.74±0.09++   215.9±30.9++
 Re   10-5   1.87±0.07**   68.4   117.1±33.1**   90.1
  10-6   1.83±0.05**   47.4   144.6±27.1**   65.1
  10-7   1.81±0.07**   36.8   171.3±29.3**   40.7
  10-8   1.77±0.04**   16.8   185.5±33.4**   27.7
++P＜0.01与对照组比较；**P＜0.01与模型组比较
表10人参皂苷-Re对PC12细胞谷氨酸损伤模型的影响
  Group   Content/(mol·L-1)   OD540   LDH/(U·mL-1)
  Control   -   0.94±0.02   121.6±30.1
  Model   -   0.78±0.08++   175.3±24.8++
  Re   10-5   0.89±0.06*   160.9±27.3*
  10-6   0.86±0.05*   162.7±29.1*
  10-7   0.83±0.07*   164.1±26.2*
  10-8   0.82±0.06   171.0±20.4
++P＜0.01与对照组比较；*P＜0.05与模型组比较
表11人参皂苷-Re对PC12细胞淀粉样蛋白(Aβ)损伤模型的影响
  Group   Content/(mol·L-1)   OD540
  Control   -   0.91±0.04
  Model   -   0.72±0.05++
  Re   10-5   0.91±0.04**
  10-6   0.84±0.06**
  10-7   0.79±0.04**
  10-8   0.75±0.03**
++P＜0.01与对照组比较；**P＜0.01与模型组比较
以上实验结果表明，不同浓度的人参皂苷-Re(10-8、10-7、10-6、10-5M)能够显著保护缺糖、自由基、谷氨酸、Aβ等各种因素导致的体外培养的PC12细胞损伤或死亡。提示人参皂苷-Re具有一定的神经保护作用，而这种作用是通过上述诸多方面来实现的。实验结果还提示我们人参皂苷-Re对脑缺血后引起的中风、血管性痴呆、认知功能障碍、阿尔茨海默病等可能有一定的预防和治疗作用。
实施例6
本实施例涉及的是人参皂苷-Re对帕金森病小鼠多巴胺能神经元和γ-氨基丁酸(GABA)能神经元的保护作用。
在已申请的专利(公开号：CN1650876A)中，我们提到人参皂苷-Re对1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)致帕金森病模型小鼠具有保护作用。经过进一步的深入研究，我们发现人参皂苷-Re对黑质多巴胺能神经元和GABA能神经元具有保护作用。
帕金森病的主要病理改变是黑质致密部多巴胺能神经元发生进行性变性缺失，导致纹状体内多巴胺及其代谢产物的急剧下降。研究表明，帕金森患者脑内多巴胺能细胞至少80％以上发生凋亡，提示细胞凋亡可能是帕金森病患者黑质神经元变性的原因。
GABA能神经元广泛分布于中枢神经系统，其神经末梢释放的GABA是一种重要的抑制性神经递质。许多研究发现GABA与帕金森病密切相关，GABA能神经元功能的降低可失去对谷氨酸神经元的抑制作用，造成谷氨酸的神经毒性作用，损害多巴胺能神经元。
本实施例通过多项分组生物学技术考察了人参皂苷-Re的抗帕金森病小鼠黑质多巴胺神经元凋亡的保护作用以及对GABA能神经元的保护作用。
表12人参皂苷-Re对帕金森病小鼠黑质致密部细胞凋亡的影响
  Group   Dose(mg·kg-1)   TUNEL染色阳性率(％)
  Control   -   27.51±3.23
  Model   -   51.46±2.96+
  Re   6.5   42.97±3.14
  13   29.14±4.52*
  26   28.26±3.57*
+P＜0.05与对照组比较；*P＜0.05与模型组比较
表13人参皂苷-Re对帕金森病小鼠黑质GABA能神经元的影响
  Group   Dose(mg·kg-1)   GABA阳性神经元数目
  Control   -   20.12±4.13
  Model   -   13.73±3.74+
  Re   6.5   14.51±2.92
  13   18.64±3.07*
  26   19.56±3.22*
+P＜0.05与对照组比较；*P＜0.05与模型组比较
表14人参皂苷-Re对帕金森病小鼠纹状体GABA能神经元的影响
  Group   Dose(mg·kg-1)   GABA阳性神经元数目
  Control   -   57.31±17.28
  Model   -   39.56±15.31+
  Re   6.5   41.34±5.65
  13   45.32±6.11*
  26   51.65±10.92*
+P＜0.05与对照组比较；*P＜0.05与模型组比较
以上实验结果表明，人参皂苷-Re对帕金森病小鼠的多巴胺能神经元及GABA能神经元有保护作用。
将人参皂苷-Re和常用的药物辅料结合用常规手段可制备成临床上常用的各种剂型。

Claims (3)

1、人参皂苷-Re在神经细胞保护中的应用，其特征在于：人参皂苷-Re对脑缺血、脑缺血再灌注损伤、帕金森病小鼠、阿尔茨海默病、PC12细胞具有保护作用。
2、人参皂苷-Re在制备治疗帕金森病、阿尔茨海默病、脑中风、脑缺血病药物中的应用。
3、根据权利要求1所述的人参皂苷-Re在神经细胞保护中的应用，其特征在于：对于小鼠模型，人参皂苷-Re的应用剂量为8-26mg/kg；对于大鼠模型，人参皂苷-Re的应用剂量为5-26mg/kg；对于细胞实验，人参皂苷-Re的应用剂量为10-5-10-8mol/L。
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