CN101252945A - 一种用于治疗前列腺癌的药物组合物 - Google Patents
一种用于治疗前列腺癌的药物组合物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种可用于治疗对象中前列腺癌的药物组合物，其中所述组合物包含治疗有效量的得自调料九里香(Murryakoenigii)和刺蒺藜(Tribulus terrestris)的任何植物部分的提取物。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于治疗对象中前列腺癌的药物组合物。其还涉及治疗对象中前列腺癌的方法。
本发明还涉及制备包含得自调料九里香(Murraya koenigii)和刺蒺藜(Tribulus terrestris)的叶或任何其它植物部分的提取物的用于治疗前列腺癌的药物组合物的方法。
背景技术
影响超过65岁男性的肿瘤的一种主要形式是前列腺癌。前列腺癌的致命性是由于向骨和淋巴结的转移。通过血清检验来早期检测前列腺特异性抗原(PSA)、外科手术介入的改进、放射治疗、雄激素阻断对遭受复发或残留癌症的患者没有效果(Chinni SR，Li Y，et.al.Indole 3 carbinol(I3C)induced cell growth inhibition，G1 cell cycle arrest and Apoptosis in prostate cancer cells.Oncogene；20：2927-2936(2001))。当今流行的雄激素阻断(androgen ablation)的治疗几乎总是导致酪氨酸激酶和相关配体的异常表达和相互作用。几项近来的研究已经表明，在前列腺癌中有组成型活性的促有丝分裂和细胞存活信号。细胞增殖和细胞凋亡之间的微妙联系受到这种细胞异常的挑战。主要机制即前列腺癌旁路凋亡是由于PI3激酶/Akt存活途径的上调(Li Y，Sarkar FH.Inhibition of nuclear factor κB activation in PC-3cells by genistin is mediated via Akt signaling pathway.Clin.Cancer.Res；8：2369-2377(2002)。在调节细胞存活的信号级联中的Akt相关的丝氨酸-苏氨酸在癌症的发病机理中是重要的(Chinni SR，Sarkar FH.Akt inactivation is a key event in Inole 3carbinol induced apoptosis in PC-3 cells.Clin.Cancer Res；8：1228-1236(2002)。其灭活一系列的促凋亡蛋白如Bad、叉头转录因子、胱天蛋白酶9(Green DR，Reed JC.Mitochondria andApoptosis.Science；281：1309-1312(1998)；Thornberry NA，Lazebnik Y.Caspases：enemies within.Science；281：1312-1316(1998)而激活Bcl-2(Adams JM，Cory S.The Bcl-2 protein family Arbitersof cell survival.Science；281：1322-1326(1998)、NFγB样抗凋亡蛋白(Datta SR，Brunet A，Greenberg ME.Cellular survival：A play inthree Akts.Genes and Dev；13：2905-2927(1999)。
发明目的
本发明的主要目的是提供用于治疗对象中前列腺癌的药物组合物。
本发明的另一个目的是提供治疗对象中前列腺癌的方法。
本发明的又一个目的是提供用于制备包含得自调料九里香和刺蒺藜的叶或任何其它植物部分的提取物用于治疗前列腺癌的药物组合物的方法，其中所述方法包括使用水匀浆调料九里香和刺蒺藜的干燥叶或任何其它植物部分，其中所用的比率是1∶1，然后进行冷冻干燥。
本发明的另一个目的是使用得自调料九里香和刺蒺藜的提取物确定细胞死亡、细胞色素c的释放、活化胱天蛋白酶级联、PARPDNA修复酶的切割、以及Bcl-x1和pAkt的下调。
发明内容
本发明提供用于治疗对象中前列腺癌的药物组合物，其中所述组合物包含治疗有效量的得自调料九里香和刺蒺藜的任何植物部分的提取物。另外，其还涉及用于制备来自调料九里香的叶提取物或任何其它植物部分的提取物的方法，其有效地杀死依赖于和不依赖于雄激素的前列腺癌细胞。
附图说明
图1表示通过MTT法，与未处理的细胞(对照)相比，各自单独的叶提取物对PC-3细胞系的作用，以及单独调料九里香(200μg/ml)和单独刺蒺藜(200μg/ml)、以及调料九里香和刺蒺藜(100μg/ml+100μg/ml)合并的叶提取物对PC-3细胞系的剂量效应。
图2表示使用调料九里香和刺蒺藜进行的细胞活力评价。以相同剂量即100μg/ml调料九里香+100μg/ml刺蒺藜、总量达200μg/ml的合并提取物没有显示出对新生骨骼肌细胞、心肌细胞、肝细胞的任何毒性作用，这表明所述合并提取物对于在前列腺癌细胞中诱导细胞凋亡的特异性。
图3表示调料九里香和刺蒺藜对Akt磷酸化的抑制。所述双草药提取物以剂量和时间依赖的方式抑制Akt的磷酸化。其显示对Akt蛋白稳态水平没有影响，但其丝氨酸473磷酸化在24小时时受到抑制并且在36小时时其活化仍被阻断。
图4表示调料九里香和刺蒺藜对Bcl-xl表达的抑制。Bcl-xl是一种线粒体膜蛋白，其在存活信号途径中维持线粒体膜的完整性。
图5表示调料九里香和刺蒺藜对胱天蛋白酶3(caspase 3)的活化，其表明细胞凋亡途径的启动。Bcl-xl的下调导致线粒体外膜分解，这引起细胞色素c的泄露，从而引发胱天蛋白酶级联。检测到所述胱天蛋白酶3的活化。
具体实施方式：
因此，本发明提供了一种用于治疗对象中前列腺癌的药物组合物，其中所述组合物包含治疗有效量的得自调料九里香和刺蒺藜的任何植物部分的提取物。
来自调料九里香的叶提取成分在两种不依赖于雄激素的前列腺癌细胞系PC-3和依赖于雄激素的前列腺癌细胞系LNCaP中都显示出相当的诱导细胞凋亡的活性。
来自调料九里香的叶提取物以时间和剂量依赖的方式诱导不依赖于雄激素的和依赖于雄激素的前列腺癌细胞的凋亡。叶提取物以200μg/ml的剂量引起所有这些细胞系的显著凋亡(在96小时内75％的细胞死亡)。当用刺蒺藜提取物以同样剂量(200μg/ml培养基)进行同样处理时，其影响上述细胞系的细胞活力，但效果弱得多(在96小时时超过50％的细胞死亡)。然而，相对于调料九里香提取物，调料九里香和刺蒺藜提取物的组合显示了增加水平的细胞死亡，这表明当刺蒺藜提取物与调料九里香提取物合并时存在协同作用。来自调料九里香和刺蒺藜的合并的叶提取物以时间和剂量依赖的方式诱导不依赖于雄激素的和依赖于雄激素的前列腺癌细胞的凋亡。合并提取物在100μg/ml调料九里香+100μg/ml刺蒺藜、总量达200μg/ml的剂量下在96小时时引起所有这些细胞系的显著凋亡(约95％的细胞死亡)。图2显示了PC-3细胞系的数据。提取物和纯化化合物对其它细胞即新生骨骼肌细胞、心肌细胞、肝细胞作为对照细胞的效果也进行了检查。在上述剂量和时间下，没有细胞死亡的迹象(图4)。其还诱导胱天蛋白酶级联以及pAkt和Bcl-xl表达的下调，它们是癌细胞中最重要的存活信号。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含治疗有效量的得自调料九里香和刺蒺藜的任何植物部分的提取物以及任选地一种或多种药学可接受载体。
在本发明的另一个实施方案中，以至少10-15mg/kg体重的单位剂量施用所述组合物的剂量。
在本发明的又一个实施方案中，以至少0.1-5mg/kg体重的单位剂量施用所述组合物的剂量。
在本发明的又一个实施方案中，优选以水溶性形式施用所述组合物的剂量。
在本发明的又一个实施方案中，以不干扰所述调料九里香提取物部分的活性的方式选择所述载体。
在本发明的又一个实施方案中，其中所述载体选自蛋白质、碳水化合物、糖、滑石、硬脂酸镁、纤维素、碳酸钙、和淀粉-明胶糊以及药学可接受载体、赋形剂、稀释剂或溶剂。
在本发明的又一个实施方案中，所述施用途径选自口服、静脉内、肌肉内或皮下途径。
在本发明的又一个实施方案中，所述用于口服途径的形式选自胶囊、糖浆、浓缩物、粉末和颗粒。
另外，本发明提供了治疗对象中前列腺癌的方法，其中所述方法包括给所述对象施用包含治疗有效量的得自调料九里香和刺蒺藜的任何植物部分的提取物的药物组合物的步骤。在本发明的一个实施方案中，所述方法包括给所述对象施用包含治疗有效量的得自调料九里香和刺蒺藜的任何植物部分的提取物以及一种或多种药学可接受载体的药物组合物的步骤。
在本发明的另一个实施方案中，以至少10g-15mg/kg体重的单位剂量施用上述组合物的剂量。
另外，在本发明的一个实施方案中，所述方法包括给所述对象施用药物组合物的步骤。
在本发明的又一个实施方案中，以至少0.1-5.0mg/kg体重的单位剂量施用上述制剂的剂量。
在本发明的又一个实施方案中，优选以水溶性形式施用所述组合物的剂量。
在本发明的又一个实施方案中，所述载体选自蛋白质、碳水化合物、糖、滑石、硬脂酸镁、纤维素、碳酸钙、和淀粉-明胶糊以及药学可接受载体、赋形剂、稀释剂或溶剂。
在本发明的又一个实施方案中，所述施用途径选自口服、静脉内、肌肉内或皮下途径。
在本发明的又一个实施方案中，所述用于口服途径的形式选自胶囊、糖浆、浓缩物、粉末和颗粒。
在本发明的又一个实施方案中，不依赖于雄激素的细胞系PC-3和依赖于雄激素的细胞系LNCaP被所述组合物以剂量和时间依赖的方式杀死。
在本发明的又一个实施方案中，所述Akt的磷酸化被所述组合物以剂量和时间依赖的方式抑制。
在本发明的又一个实施方案中，其它细胞比如肝细胞、心肌细胞、和骨骼肌不被所述组合物杀死。
本发明还提供了用于制备包含得自调料九里香和刺蒺藜的叶或任何其它植物部分的提取物可用于治疗前列腺癌的药物组合物的方法，其中所述方法包括以水匀浆调料九里香和刺蒺藜的干燥叶或任何其它植物部分，其中所用的比率是1∶1，然后进行冷冻干燥。
在本发明的一个实施方案中，所述植物部分选自调料九里香和刺蒺藜的叶、茎、果实、或任何其它部分。
在本发明的另一个实施方案中，所述调料九里香和刺蒺藜的叶采自印度西孟加拉的不同地区。
在本发明的又一个实施方案中，所使用的叶取自调料九里香和刺蒺藜的新鲜的或/和阴干(sun shade dried)的叶。
此外，在本发明的另一个实施方案中，所述组合物通过以1∶1比率混合得自调料九里香和刺蒺藜的提取物而制备。
在本发明的又一个实施方案中，所述提取物的抗癌活性通过体内实验证实。
在本发明的又一个实施方案中，所述提取物的用途是用于治疗前列腺癌。
在本发明的另一个实施方案中，所述化合物的抗癌活性通过体内实验证实。
以下实施例通过举例说明本发明的方式提出，且不应视为限制本发明的范围。
实施例1至8涉及得自调料九里香(芸香科)和刺蒺藜的提取物及其活性。
实施例1
调料九里香(芸香科)和刺蒺藜的来源
调料九里香(芸香科Rutaceae)和刺蒺藜的叶采集于印度西孟加拉的不同地区。证明样品已保存于印度加尔各答的印度化学生物学研究所(Indian Institute of Chemical Biology)药物化学系。
实施例2
调料九里香(芸香科)和刺蒺藜的提取物的分离
将调料九里香(1.2Kg)的新鲜叶和所有其它植物部分在混合物混合器中用水(1.5升)匀浆并冷冻干燥。检验所述冻干材料对前列腺癌细胞系的活性。由所述材料引起的细胞死亡的详情已描述于以下图1中。以类似方式获得刺蒺藜的干燥粉末(0.5kg)并测试其生物活性。合并提取物在100μg/ml调料九里香+100μg/ml刺蒺藜、总量达200μg/ml培养基的剂量下在96小时引起所有这些细胞系的显著凋亡(约95％的细胞死亡)。
实施例3
人前列腺癌细胞系PC-3的培养
将来自美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA，USA)的人前列腺癌细胞系PC-3(PTEN-ve，不依赖于雄激素)在添加10％胎牛血清和1％抗生素-抗真菌剂的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中培养。细胞在37℃培养于5％CO2气氛中。
大鼠新生心肌细胞的原代培养
通过以前由Yoshihiro Kimura(1994)描述并加以改良的方法将2日龄新生大鼠的心肌细胞分离。简而言之，将心脏切除并在预先温热的(37℃)Ads缓冲液(1.2M NaCl、198mM HEPES、54mM KCl、8.3mM MgSO4、55.4mM葡萄糖、95mM NaH2PO4)中切碎，在0.05％的II型胶原酶和胰酶(Pancreatin)中消化，连续消化3次，每次15分钟。合并上清液并在2000g下离心细胞10分钟。将细胞重悬并在包被胶原的T-25瓶中在用10％胎牛血清和1％抗生素-抗真菌剂强化的Medium-199培养基中铺板培养。
大鼠新生肝细胞的原代培养
通过以前由William E Russell(1997)描述并加以改良的方法将2日龄新生大鼠的肝细胞分离。简而言之，通过门静脉用不含钙的由150mM NaCl、2.8mM KCl、5.5mM葡萄糖和25mMHEPES(pH 7.6)组成的溶液灌注肝脏10分钟，随后切碎并在含有0.05％IV型胶原酶的DMEM中消化30分钟。将细胞离心(2000g，10分钟)并分散于以10％胎牛血清和1％抗生素-抗真菌剂加富的DMEM中。
新生大鼠骨骼肌的原代培养
通过以前由William E Russell(1997)描述的并加以改良的方法将2日龄新生大鼠的骨骼肌分离。简而言之，分离并切碎比目鱼肌，并在pH7.4、0.15M NaCl的磷酸盐缓冲液(PBS)中用0.2％的II型胶原酶和0.05％胰酶消化。将分散的骨骼肌细胞离心(1000g，10分钟)，洗涤并重悬于含1％抗生素-抗真菌剂的磷酸盐缓冲液(PBS)中。将细胞在37℃、95％空气/5％CO2下预先培养30分钟。将漂浮的肌细胞在包被胶原的T-25瓶中在富含10％胎牛血清和1％抗生素-抗真菌剂的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中铺板培养。
实施例4
根据生产商的方案，通过MTT法(Cell titre 96 AQoueus Onesolution Cell Proliferation Assay细胞增殖分析(Promega，Corp.Madison，WI))测定处理后PC-3在指定时间的活力。简而言之，将10000个细胞一式三份铺板于96孔板中并在完全培养基中培养12小时。添加化合物MK-3，按指示将其更换为新鲜的完全培养基并培养不同的时间(至多96小时)。每孔加入20μl Cell titre 96AQoueus One solution试剂。在37℃下和加湿的5％CO2气氛中培养所述板1-4小时。在490nm用96孔板读数仪记录吸光度。使用630nm的参比波长以降低由于细胞碎片引起的非特异性光吸收而带来的背景。
实施例5
电泳和免疫印迹
使用完全培养基培养PC-3细胞(1×106个细胞)。使用来自Sigma Chemical company(St Louis，MO，USA)的细胞解离试剂将细胞分开。通过在1500g离心10分钟收集细胞并在十二烷基硫酸钠(SDS)缓冲液(pH 6.8)中煮沸5-7分钟。通过10％SDS-PAGE分离含60μg总细胞蛋白的试样并将其转移至PVDF膜(MILIPORE，Bedford，MA，USA)。将膜以封闭缓冲液在室温下封闭1小时并以以下的期望第一抗体在4℃过夜检测：胱天蛋白酶-9、Bcl-xl、pAkt1/2/3(ser473)、抗PARP、细胞色素C(Santa-CruzBiotechnology，Inc.USA)、识别胱天蛋白-3酶原(procaspase-3，32kDa)和有活性已切割胱天蛋白酶-3(17kDa)的抗胱天蛋白酶-3(BD Biosciences，Mountainview，CA)、Akt、已切割的胱天蛋白酶-9(Cell Signaling technology，Beverly，MA)，然后与偶联碱性磷酸酶的第二抗体孵育并检测。
实施例6
为从印度的药用植物中寻找抗癌活性，我们选择了调料九里香和刺蒺藜的叶提取物并观察到其有效杀死不依赖于雄激素的前列腺癌细胞系PC-3(图1)。此处显示PC-3细胞系的数据。
调料九里香和刺蒺藜的合并提取物通过诱导凋亡而降低PC-3细胞活力
在相同剂量下，即以100μg/ml调料九里香+100μg/ml刺蒺藜、总量达200μg/ml培养基的合并提取物没有显示出对新生骨骼肌细胞、心肌细胞、肝细胞的任何毒性作用(图2)，这表明所述合并提取物对于在前列腺癌细胞中诱导凋亡的特异性。
证实体外结果的体内实验
根据WHO的指导原则进行急性毒性实验。
实验对象：Balb/C小鼠，雄性和雌性，25克体重(近似)。将16只小鼠分为两组。以2克/kg体重的剂量向8只动物给予合并提取物，向8只动物给予等体积的载体(DMSO)，其中所述剂量一次口服施用，然后在处理后15天处死动物并进行血液学参数检查。
表1：粗提取物的血液学检查
| RBC | WBC | Hb(克/dl) | |
| 对照 | 1029 | 92 | 10.69 |
| 处理 | 1032 | 89 | 10.713 |
在处理小鼠中没有任何毒性的指征(表1)。
实施例7
得自调料九里香和刺蒺藜的双草药提取物处理的PC-3细胞中的细胞存活途径的抑制作用
在细胞存活途径中，Akt激酶通过抑制细胞凋亡过程而发挥重要作用。Akt磷酸化下游效应分子比如促凋亡蛋白Bad，从而发挥其灭活作用。这不允许其与Bcl-xl发生导致凋亡过程受抑制的二聚化作用。所述双草药提取物以剂量和时间依赖的方式抑制Akt的磷酸化。这显示对Akt蛋白的稳态水平没有影响，但在24小时时其丝氨酸473的磷酸化受到抑制，并且到36小时其活化被完全阻断(图3)。基础水平的丝氨酸473磷酸化在PC-3细胞系中占优势。所述Akt磷酸化的失活可归因于细胞存活途径的失活，其导致随后在处理的PC-3细胞中诱导细胞凋亡。
然后已经研究了得自调料九里香和刺蒺藜的mahanine双草药提取物诱导PC-3细胞凋亡是否是通过Bcl-xl而实现的。Bcl-xl是一种在存活信号途径中维持线粒体膜完整性的线粒体膜蛋白。所述双草药提取物在36小时明显降低Bcl-xl的表达(图4)。
这表明随着Bcl-xl下调，细胞凋亡途径的启动使得线粒体外膜分解，这导致细胞色素c的泄漏，从而引发所述胱天蛋白酶级联。在48小时时检测到胱天蛋白酶3的活化，在60小时时可检测到活性峰值(图5)。
实施例8
对通过合并调料九里香叶和刺蒺藜种子提取物而开发的制剂用于治疗前列腺癌的临床评价(由注册的印度草药疗法医师(Auyrvedic practioner)进行)。每日口服施用3粒胶囊(每粒含有330mg)。
| 患者 | 治疗前前列腺重 | 治疗2个月后前列腺重 |
| ABCDEF | 39克46克34克42克29克41克 | 21克25克18克27克16克19克 |
所有以上患者报告在服用胶囊2个月后的日间和夜间均易于排尿。
实施例9至15涉及从调料九里香提取物中获得的化合物mahanine及其活性。
实施例9
将来自美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA，USA)的人前列腺癌细胞系PC-3(PTEN-ve，不依赖于雄激素)在添加10％胎牛血清和1％抗生素-抗真菌剂的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中培养。细胞在37℃培养于5％CO2气氛中。
大鼠新生心肌细胞的原代培养
通过以前由Yoshihiro Kimura(1994)描述并加以改良的方法将2日龄新生大鼠的心肌细胞分离。简而言之，将心脏切除并在预先温热的(37℃)Ads缓冲液(1.2M NaCl、198mM HEPES、54mM KCl、8.3mM MgSO4、55.4mM葡萄糖、95mM NaH2PO4)中切碎，在0.05％的II型胶原酶和胰酶(Pancreatin)中消化，连续消化3次，每次15分钟。合并上清液并在2000g下离心细胞10分钟。将细胞重悬并在包被胶原的T-25瓶中在用10％胎牛血清和1％抗生素-抗真菌剂强化的Medium-199培养基中铺板培养。
大鼠新生肝细胞的原代培养
通过以前由William E Russell(1997)描述并加以改良的方法将2日龄新生大鼠的肝细胞分离。简而言之，通过门静脉用不含钙的由150mM NaCl、2.8mM KCl、5.5mM葡萄糖和25mMHEPES(pH 7.6)组成的溶液灌注肝脏10分钟，随后切碎并在含有0.05％IV型胶原酶的DMEM中消化30分钟。将细胞离心(2000g，10分钟)并分散于以10％胎牛血清和1％抗生素-抗真菌剂加富的DMEM中。
新生大鼠骨骼肌的原代培养
通过以前由William E Russell(1997)描述的并加以改良的方法将2日龄新生大鼠的骨骼肌分离。简而言之，分离并切碎比目鱼肌，并在pH7.4、0.15M NaCl的磷酸盐缓冲液(PBS)中用0.2％的II型胶原酶和0.05％胰酶消化。将分散的骨骼肌细胞离心(1000g，10分钟)，洗涤并重悬于含1％抗生素-抗真菌剂的磷酸盐缓冲液(PBS)中。将细胞在37℃、95％空气/5％CO2下预先培养30分钟。将漂浮的肌细胞在包被胶原的T-25瓶中在富含10％胎牛血清和1％抗生素-抗真菌剂的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中铺板培养。
实施例10
根据生产商的方案，通过MTT法(Cell titre 96 AQoueus Onesolution Cell Proliferation Assay细胞增殖分析(Promega，Corp.Madison，WI))测定处理后PC-3在指定时间的活力。简而言之，将10000个细胞一式三份铺板于96孔板中并在完全培养基中培养12小时。添加化合物MK-3，按指示将其更换为新鲜的完全培养基并培养不同的时间(至多72小时)。每孔加入20μl Cell titre 96AQoueus One solution试剂。在37℃下和加湿的5％CO2气氛中培养所述板1-4小时。在490nm用96孔板读数仪记录吸光度。使用630nm的参比波长以降低由于细胞碎片引起的非特异性光吸收而带来的背景。
实施例11
电泳和免疫印迹
单独使用完全培养基或按指示同时联合使用3μg/mlMahanine(MK-3)来培养PC-3细胞(1×106个细胞)。使用来自Sigma Chemical company(St Louis，MO，USA)的细胞解离试剂将细胞分开。通过在1500g离心10分钟收集细胞并在十二烷基硫酸钠(SDS)缓冲液(pH 6.8)中煮沸5-7分钟。通过10％SDS-PAGE分离含60μg总细胞蛋白的试样并将其转移至PVDF膜(MILIPORE，Bedford，MA，USA)。将膜以封闭缓冲液在室温下封闭1小时并以以下的期望第一抗体在4℃过夜检测：胱天蛋白酶-9、Bcl-xl、pAkt1/2/3(ser473)、抗PARP、细胞色素C(Santa-CruzBiotechnology，Inc.USA)、识别胱天蛋白-3酶原(procaspase-3，32kDa)和有活性已切割胱天蛋白酶-3(17kDa)的抗胱天蛋白酶-3(BD Biosciences，Mountainview，CA)、Akt、已切割的胱天蛋白酶-9(Cell Signaling technology，Beverly，MA)，然后与偶联碱性磷酸酶的第二抗体孵育并检测。
实施例12
免疫荧光
将细胞在盖玻片上培养。将对照细胞和处理细胞均在4℃以含有4％多聚甲醛的PBS固定2小时。将所述细胞以0.1％Triton X-100的PBS进行透化，然后与兔多克隆抗细胞色素c抗体(Santa cruz，USA，1∶50稀释)一起培养3小时，随后再与偶联FITC的第二抗体(山羊抗兔，Santa Cruz，1∶50)培养1小时，在所有前述步骤中均以PBS充分洗涤。在每一组中还加入1μg/ml的DAPI。在荧光显微镜(Olympus BX51 microscope，Tokyo，Japan)下观察染色细胞并使用cool Snap Pro照相机捕获图像。
确认体外结果的体内实验
根据WHO的指导原则进行急性毒性实验。
实验对象：Balb/C小鼠，雄性和雌性，25克体重(近似)。将16只小鼠分为两组。向8只动物给予2克/kg体重的所述化合物，向8只动物给予等体积的载体(DMSO)，其中所述剂量一次口服施用，然后在处理后15天处死动物并进行血液学和生化参数检查。
表2(a)：化合物mahanine的血液学检查
| RBC | WBC | Hb(克/dl) | |
| 对照 | 1029 | 92 | 10.69 |
| 处理 | 1032 | 89 | 10.713 |
优点：
本发明的主要优点是：
1.本发明提供了一种简化的生物活性提取方法和一种简化的快速而廉价的用于制备的方法，所述mahanine级分具有与治疗、缓解和补救前列腺癌的显著高的生物活性。
2.其还提供了一种非常适合人使用并能用于治疗、缓解和补救前列腺癌的药物组合物。
Claims (18)
1.一种用于治疗对象中前列腺癌的药物组合物，其中所述组合物包含治疗有效量的得自调料九里香(Murrya koenigii)和刺蒺藜(Tribulus terrestris)的任何植物部分的提取物，任选地以及一种或多种药学可接受载体。
2.权利要求1的药物组合物，其中所用的所述得自调料九里香和刺蒺藜的任何植物部分的提取物是按约1∶1的比率。
3.权利要求9的方法，其中所述组合物的施用剂量是至少10mg-15mg/kg体重的单位剂量。
4.权利要求1的药物组合物，其中所述组合物的所述剂量优选以水溶性形式施用。
5.权利要求1的药物组合物，其中所用的载体选自蛋白质、碳水化合物、糖、硬脂酸镁、纤维素、碳酸钙、和淀粉-明胶糊。
6.权利要求1的药物组合物，其中所述施用途径选自口服、静脉内、肌肉内或皮下途径。
7.权利要求6的药物组合物，其中所述用于口服途径的形式选自胶囊、糖浆、浓缩物、粉末和颗粒。
8.一种治疗对象中前列腺癌的方法，其中所述方法包括以下步骤：向所述对象施用包含治疗有效量的得自调料九里香和刺蒺藜的任何植物部分的提取物以及一种或多种药学可接受载体的药物组合物。
9.权利要求8的方法，其中所述方法包括向所述对象施用权利要求1的药物组合物的步骤。
10.权利要求9的方法，其中所述组合物的施用剂量是至少10mg-15mg/kg体重的单位剂量。
11.权利要求10的方法，其中所述不依赖于雄激素的细胞系PC3和依赖于雄激素的细胞系LNCaP被所述组合物以剂量和时间依赖性方式杀死。
12.权利要求11的方法，其中Akt的磷酸化被所述组合物以剂量和时间依赖性方式抑制。
13.一种制备用于治疗前列腺癌的包含得自调料九里香和刺蒺藜的叶或任何其它植物部分的提取物的药物组合物的方法，其中所述方法包括将所述调料九里香和刺蒺藜的干燥叶或任何其它植物部分用水匀浆，然后进行冷冻干燥，其中所用植物部分的比率是约1∶1。
14.权利要求13的方法，其中所述植物部分选自调料九里香和刺蒺藜的叶、茎、果实、或任何其它部分。
15.权利要求14的方法，其中所述调料九里香和刺蒺藜的叶采自印度西孟加拉的不同地区。
16.权利要求13的方法，其中所述组合物通过以约1∶1的比率混合得自调料九里香和刺蒺藜的提取物而制备。
17.权利要求14的方法，其中所述提取物的抗癌活性通过体内实验证实。
18.权利要求14的所述提取物的用途，用于治疗前列腺癌。
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