CN101239962A - 蔓越莓中提取原花青素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从蔓越莓中提取原花青素的方法，包括如下步骤：原料处理，制得蔓越莓提取液；再进行脱脂处理；然后采用柱层析法进行分离提纯，即可。本发明的方法工艺流程简单、生产成本低，易于产业化。

Description

蔓越莓中提取原花青素的方法

技术领域

本发明涉及一种从蔓越莓中提取原花青素的方法。

背景技术

原花青素(Proanthocyanidins，PACs)是植物王国中广泛存在的一大类多酚化合物的总称，起初统归于缩合鞣质或黄烷醇类，随着分离鉴定技术的提高和对此类物质的深入研究，现已成为独树一帜的一大类物质，并称之为原花青素。原花青素(PACs)是黄烷-3-醇(flavan-3-ols)或黄烷-3，4-二醇的聚合物，也称缩合鞣质。即黄烷单体通过C-C键和C-O酯键连接成的聚合物。在可食用植物中，黄烷单体之间主要通过B型键合(B-type linkage)[C4-C8，和C4-C6]，和A型键合(A-type linkage)[C4-C8和C2-O-C7]方式连接聚合，聚合度可为二聚体、三聚体、直至十聚体以上。原花青素(PAs)已被证实具有多种生物学功能，如抗细菌黏附性、抗氧化性、抗肿瘤性等，具有广阔的应用前景。

原花青素广泛存在于天然植物中，如葡萄、沙棘、松树皮及越橘类植物中。目前报道的原花青素分离提取方法多针对我国产量较高的植物，如葡萄、松树皮等。其中蔓越莓虽原产于北美，但目前已在我国培育成功，其产业化种植指日可待；另外我国也有其他越橘类植物的天然资源，因此从越橘类植物，尤其是蔓越莓中提取原花青素有广阔的市场前景。并且越橘类植物中的原花青素由于其独特的结构，尤其是其所具有的A型键合(A-type linkage)结构，使具有较强的抗黏附作用。但目前针对越橘类植物，尤其是蔓越莓，提取分离原花青素的报道较少，已有的也要经过复杂的分离提取过程。如发明专利(专利号96192723.2)和文献(Phytochemistry，2005(66)：2281.)所述，前者使用蔓越莓果粉分离原花青素，需经过繁琐的原料处理过程，二者都需经两次柱层析，成本高、过程复杂。

发明内容

本发明的目的是提供一种工艺流程简单、生产成本低且易于产业化的从蔓越莓中提取原花青素的方法。

本发明的方法包括如下步骤：

(1)原料处理，制得蔓越莓提取液。

本发明中，所述的原料可采用蔓越莓果或其他蔓越莓原料品，如商品化的蔓越莓浓缩汁。

当采用蔓越莓果为原料时，可采用的原料处理的步骤为：将蔓越莓果在溶剂中进行研磨，再去除果肉，再蒸干溶剂，将提取物溶于水，即可。

其中，所述的溶剂较佳的为含有丙酮，甲醇和柠檬酸的溶液，较佳的配比为体积百分比70％丙酮、体积百分比30％甲醇，0.1g/100ml柠檬酸；所述的蔓越莓果与溶剂的重量体积比较佳的为2克∶1毫升～5克∶1毫升；所述的研磨的时间较佳的为2～15分钟；所述的研磨较佳的在4～30℃下进行；所述的去除果肉的方式可为离心后取上清液，或通过筛网过滤。

当采用蔓越莓浓缩汁为原料时，可采用的原料处理的步骤为：将蔓越莓浓缩汁用水稀释。所述的水的用量较佳的为蔓越莓浓缩汁体积的0.3～3倍。

(2)将蔓越莓提取液进行脱脂处理。

本发明中，所述的脱脂处理的方式可采用常用方法，如热脱脂、溶剂脱脂及超临界流体萃取等。较佳的采用溶剂脱脂：在蔓越莓提取液中加入脂溶性有机溶剂进行脱脂处理，之后蒸干，得蔓越莓提取物。

其中，所述的脂溶性有机溶剂较佳的为石油醚；所述的蔓越莓提取液与脂溶性有机溶剂的体积比较佳的为1∶1～1∶3；所述的脱脂处理的时间较佳的为1～3小时，次数较佳的为2～3次。

(3)采用柱层析法进行分离提纯，即可。

本发明中，所述的柱层析法较佳的采用凝胶柱层析法，其具体实验步骤可为：

1)用平衡液将凝胶层析柱平衡。

其中，所述的凝胶层析柱可使用Pharmacia公司的LH-20柱；所述的平衡液较佳的为体积百分比50％的乙醇水溶液；平衡时间较佳的为过夜。

其中，所述的凝胶层析柱中凝胶的使用量较佳的为：当原料采用蔓越莓果时，凝胶与蔓越莓果的重量比为1∶20～1∶50；当原料采用蔓越莓浓缩汁时，凝胶与蔓越莓浓缩汁的体积重量比为1克∶1毫升～1克∶5毫升。

2)将蔓越莓提取物溶于溶剂，上样。

其中，所述的溶剂较佳的为平衡液。

其中，将蔓越莓提取物溶于溶剂后，较佳的将其充分旋涡振荡，再上样。

3)洗涤液洗柱，至洗涤液无色为止。

其中，所述的洗涤液较佳的为体积百分比50％的乙醇水溶液；所述的洗涤液洗柱的流速较佳的为0.5～5毫升/分钟。

4)洗脱液洗柱，并收集洗脱液，即可。

其中，所述的洗脱液较佳的为丙酮水溶液，较佳的混合比例为体积百分比70％丙酮和体积百分比30％水；所述的洗脱液的用量较佳的为2～8倍的柱体积；所述的洗脱液洗柱的流速较佳的为0.5～5毫升/分钟。

本发明中，在步骤(3)采用柱层析法进行分离提纯后，可将所得洗脱液蒸干，即得固体原花青素。

本发明的积极进步效果在于：本发明工艺流程简单、生产成本低，易于产业化。本发明方法所得的原花青素可用于食品、化妆品、保健食品、医药等的制备。

本发明的原料和所用试剂均市售可得。

附图说明

图1为标准品儿茶素和表儿茶素在280nm的高效液相色谱图，其保留时间分别为第9分钟(儿茶素)，第14分钟(表儿茶素)。

图2是实施例1分离产物在280nm的高效液相色谱图，显示不同聚合度的原花青素在不同保留时间的吸收峰，主要在第18分钟左右。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。

实施例1  从蔓越莓中提取原花青素的方法

1.原料处理：

将200克蔓越莓果在50ml溶剂中4℃研磨5分钟(溶剂为：体积百分比70％丙酮，体积百分比30％甲醇，0.1g/100ml柠檬酸)，离心后取上清液，将果肉除去，再将溶剂蒸干，将提取物溶于水，制得蔓越莓提取液。

2.溶剂脱脂：

在蔓越莓提取液中加等体积石油醚进行脱脂处理，重复一次，每次3小时。将脱脂后的蔓越莓提取液减压蒸发干燥，得蔓越莓提取物。

3.Sephadex LH-20凝胶柱层析分离提纯：

将LH-20柱(购自Pharmacia公司)用体积百分比50％乙醇水溶液平衡过夜；将蔓越莓提取物溶于体积百分比50％乙醇水溶液，旋涡震荡后立即上样(10克LH-20凝胶，柱体积为40ml)；用体积百分比50％乙醇水溶液洗柱，流速为2.5ml/min，直到流出的洗涤液变无色，弃洗涤液；然后用8倍柱体积的体积百分比70％的丙酮水溶液洗脱，收集洗脱液；用旋转蒸发仪35℃蒸干溶剂，冻干得到棕红色粉末。其中原花青素含量达80％。200克原果可分离得到约95mg原花青素。

HPLC(高效液相色谱)鉴定：用于校准的纯物质是儿茶素(9min)，表儿茶素(14min)(图1)。图2是实施例1分离产物在280nm的高效液相色谱图，显示不同聚合度的原花青素在不同保留时间的吸收峰，主要存在于第18分钟。

色谱柱：C18亲脂性柱

流动相：A：0.4％磷酸，；B：95％甲醇和5％0.4％磷酸；

流量：1ml/min；

进样量：10μl；

柱温：30℃；

检测波长：280nm；

洗脱梯度：

0-38min：79％A21％B到35％A65％B的双溶剂线性梯度；

38-60min：35％A65％B；

60-70min：100％的甲醇。

实施例2  从蔓越莓中提取原花青素的方法

1.原料处理：

将200克蔓越莓果在100ml溶剂中25℃研磨5分钟(溶剂为：体积百分比70％丙酮，体积百分比30％甲醇，0.1g/100ml柠檬酸)，筛网过滤将果肉除去，再将溶剂蒸干，将提取物溶于水，制得蔓越莓提取液。

2.溶剂脱脂：

在蔓越莓提取液中加等体积石油醚进行脱脂处理，重复两次，每次1小时。将脱脂后的蔓越莓提取液减压蒸发干燥，得蔓越莓提取物。

3.Sephadex LH-20凝胶层析：

将LH-20柱(购自Pharmacia公司)用体积百分比50％乙醇平衡过夜，将蔓越莓提取物溶于10ml体积百分比50％乙醇后立即上样(10克LH-20凝胶，柱体积为40ml)；用体积百分比50％乙醇洗柱，流速为1ml/min，直到流出的洗脱液变无色，弃洗涤液；然后用3倍柱体积的体积百分比70％丙酮洗脱，收集洗脱液；用旋转蒸发仪35℃蒸干溶剂，冻干得到棕红色粉末。其中原花青素含量达90％。200克原果可分离得到约70mg原花青素。

实施例3  从蔓越莓中提取原花青素的方法

1.原料处理：

将蔓越莓浓缩汁10ml(市购)，加水稀释至25ml，制得蔓越莓提取液。

2.溶剂脱脂：

在蔓越莓提取液中加等体积石油醚进行脱脂处理，重复一次，每次1小时。将脱脂后的蔓越莓提取液减压蒸发干燥，得蔓越莓提取物。

3.Sephadex LH-20凝胶层析：

将LH-20柱(购自Pharmacia公司)用体积百分比50％乙醇平衡过夜，将蔓越莓提取物溶于10ml体积百分比50％乙醇，旋涡震荡后立即上样(10克LH-20凝胶，柱体积为40ml)；用体积百分比50％乙醇洗柱，流速为2.5ml/min，直到流出的洗脱液变无色，弃洗涤液；然后用8倍柱体积的体积百分比70％丙酮洗脱，收集洗脱液；用旋转蒸发仪35℃蒸干溶剂，冻干得到棕红色粉末。其中原花青素含量达83％。10ml浓缩汁中提取分离得到约30mg原花青素。

实施例4  从蔓越莓中提取原花青素的方法

1.原料处理：

直接使用蔓越莓浓缩汁10ml(市购)，加水稀释至13ml。

2.溶剂脱脂：

加等体积石油醚进行脱脂处理，重复一次，每次1小时。将脱脂后的蔓越莓提取液减压蒸发干燥，得蔓越莓提取物。

3.Sephadex LH-20凝胶层析：

将LH-20柱(购自Pharmacia公司)用体积百分比50％乙醇水溶液平衡过夜，将脱脂后的原料溶于10ml体积百分比50％乙醇水溶液，旋涡震荡后立即上样(5克LH-20凝胶，柱体积为40ml)。用体积百分比50％乙醇水溶液洗柱，流速为1ml/min，直到流出的洗脱液变无色，弃洗涤液。然后用3倍柱体积的体积百分比70％丙酮水溶液洗脱，收集洗脱液。用旋转蒸发仪35℃蒸干溶剂，冻干得到棕红色粉末。其中原花青素含量达95％。10ml浓缩汁中提取分离得到约20mg原花青素。

实施例5  从蔓越莓中提取原花青素的方法

1.原料处理：

将200克蔓越莓果在40ml溶剂中4℃研磨15分钟(溶剂为：体积百分比70％丙酮，体积百分比30％甲醇，0.1g/100ml柠檬酸)，筛网过滤将果肉除去，再将溶剂蒸干，将提取物溶于水，制得蔓越莓提取液。

2.溶剂脱脂：

在蔓越莓提取液中加3倍体积石油醚进行脱脂处理，重复两次，每次3小时。将脱脂后的蔓越莓提取液减压蒸发干燥，得蔓越莓提取物。

3.Sephadex LH-20凝胶层析：

将LH-20柱(购自Pharmacia公司)用体积百分比50％乙醇水溶液平衡过夜，将蔓越莓提取物溶于10ml体积百分比50％乙醇水溶液，上样(4克LH-20凝胶，柱体积为40ml)；用体积百分比50％乙醇水溶液洗柱，流速为0.5ml/min，直到流出的洗脱液变无色，弃洗涤液；然后用3倍柱体积的体积百分比70％丙酮水溶液洗脱，收集洗脱液；用旋转蒸发仪35℃蒸干溶剂，冻干得到棕红色粉末。其中原花青素含量达85％。200克原果可分离得到约65mg原花青素。

实施例6  从蔓越莓中提取原花青素的方法

1.原料处理：

将200克蔓越莓果在100ml溶剂中30℃研磨2分钟(溶剂为：体积百分比70％丙酮，体积百分比30％甲醇，0.1g/100ml柠檬酸)，筛网过滤将果肉除去，再将溶剂蒸干，将提取物溶于水，制得蔓越莓提取液。

2.溶剂脱脂：

在蔓越莓提取液中加2倍体积石油醚进行脱脂处理，重复两次，每次1小时。将脱脂后的蔓越莓提取液减压蒸发干燥，得蔓越莓提取物。

3.Sephadex LH-20凝胶层析：

将LH-20柱(购自Pharmacia公司)用体积百分比50％乙醇水溶液平衡过夜，将蔓越莓提取物溶于10ml体积百分比50％乙醇水溶液，旋涡震荡后立即上样(2.5克LH-20凝胶，柱体积为40ml)；用体积百分比50％乙醇水溶液洗柱，流速为1ml/min，直到流出的洗脱液变无色，弃洗涤液；然后用3倍柱体积的体积百分比70％丙酮水溶液洗脱，收集洗脱液；用旋转蒸发仪35℃蒸干溶剂，冻干得到棕红色粉末。其中原花青素含量达75％。200克原果可分离得到约62mg原花青素。

实施例7  从蔓越莓中提取原花青素的方法

1.原料处理：

将蔓越莓浓缩汁10ml(市购)，加水稀释至40ml，制得蔓越莓提取液。

2.溶剂脱脂：

在蔓越莓提取液中加等体积石油醚进行脱脂处理，重复两次，每次2小时。将脱脂后的蔓越莓提取液减压蒸发干燥，得蔓越莓提取物。

3.Sephadex LH-20凝胶层析：

将LH-20柱(购自Pharmacia公司)用体积百分比50％乙醇水溶液平衡过夜，将蔓越莓提取物溶于10ml体积百分比50％乙醇水溶液，旋涡震荡后立即上样(2克LH-20凝胶，柱体积为40ml)；用体积百分比50％乙醇水溶液洗柱，流速为5ml/min，直到流出的洗脱液变无色，弃洗涤液；然后用2倍柱体积的体积百分比70％丙酮水溶液洗脱，收集洗脱液；用旋转蒸发仪35℃蒸干溶剂，冻干得到棕红色粉末。其中原花青素含量达64％。10ml浓缩汁中提取分离得到约16mg原花青素。

以上实施例得到的原花青素产物，经MALDI-TOF MS(基质辅助激光解析电离飞行时间质谱)和DI/ESI MS(电喷雾电离质谱)分析(分析条件为常规参数)，主要为聚合度4-10的聚合物混合物，单体为儿茶素、表儿茶素、没食子酰儿茶素和没食子酰表儿茶素，聚合方式包括B型和A型键合。

Claims (14)

1. 一种从蔓越莓中提取原花青素的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)原料处理，制得蔓越莓提取液；

(2)将蔓越莓提取液进行脱脂处理；

(3)采用柱层析法进行分离提纯，即可。

2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)所述的原料处理的方式为：将蔓越莓果在溶剂中进行研磨，再去除果肉，再蒸干溶剂，将提取物溶于水即可；或用水稀释蔓越莓浓缩汁即可。

3. 如权利要求2的所述的方法，其特征在于：所述的溶剂含体积百分比70％的丙酮和体积百分比30％的甲醇，以及0.1g/100ml柠檬酸。

4. 如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的蔓越莓果与溶剂的重量体积比为2克∶1毫升～5克∶1毫升。

5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)所述的溶剂脱脂处理的方式为：在蔓越莓提取液中加入脂溶性有机溶剂进行脱脂处理，之后蒸干，得蔓越莓提取物。

6. 如权利要求5的所述的方法，其特征在于：所述的脂溶性有机溶剂为石油醚。

7. 如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述的蔓越莓提取液与脂溶性有机溶剂的体积比为1∶1～1∶3。

8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的柱层析法为凝胶柱层析法。

9. 如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述的凝胶柱层析法的具体步骤为：

1)用平衡液将凝胶层析柱平衡；

2)将蔓越莓提取物溶于溶剂，上样；

3)洗涤液洗柱，至洗涤液无色为止；

4)洗脱液洗柱，并收集洗脱液，即可。

10. 如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述的凝胶层析柱中凝胶的使用量为：当原料采用蔓越莓果时，凝胶与蔓越莓果的重量比为1∶20～1∶80；当原料采用蔓越莓浓缩汁时，凝胶与蔓越莓浓缩汁的体积重量比为1克∶1毫升～1克∶5毫升。

11. 如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述的平衡液和洗涤液为体积百分比50％的乙醇水溶液。

12. 如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述洗涤液洗柱和洗脱液洗柱的流速为0.5～5毫升/分钟。

13. 如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述的洗脱液为体积百分比70％的丙酮水溶液。

14. 如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述的洗脱液的用量为2～8倍的柱体积。

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