发明内容
本发明旨在提供一种白芷总香豆素提取物及其制备方法,药物组合物和用途。
本发明提供了一种白芷总香豆素提取物,其主要活性成分含量为:欧前胡素占10%~45%,优选为欧前胡素占10%~20%;异欧前胡素占5%~40%,优选为异欧前胡素占5%~10%;氧化前胡素占10%~40%,优选为氧化前胡素占10%~20%。以上均为重量百分含量。
本发明提供的白芷总香豆素提取物,其制备方法包括以下步骤:
(1)提取:取白芷药材酌予碎断,置提取罐中,加适当溶剂提取,合并提取液,滤过。
(2)分离纯化:上述滤液浓缩后,加适量溶剂溶解,滤过,滤液过层析柱,再用溶剂洗脱,收集含香豆素类成分的洗脱液,减压回收洗脱液至不含溶剂,得到白芷总香豆素提取物。
步骤(1)中提取溶剂可以为水、乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯中的一种或任意几种的混合溶剂,优选水和80%的乙醇溶液。
在已有文献报道中,提取白芷所用的溶剂通常都为乙醇或甲醇,很少用水来进行,通常认为用醇提取优于水提(中国中药杂志,2006,31(12),p1021),而在实际工艺研究过程中,本发明人发现选用水对本品进行提取时,不但可以确保白芷中的香豆素类成分可以被充分提取出来,而且提取溶液中的杂质少,便于分离纯化。选用80%的乙醇进行提取时,提取效率最高,经过两次30分钟的提取后,主要香豆素类成分就能基本够提取完全,但提取液中相对杂质较多。
步骤(2)分离纯化过程中,层析柱填料可以为硅胶、氧化铝或大孔树脂,优选为氧化铝柱或大孔树脂柱。
所用的硅胶可以为100~200目或200~300目;所用的大孔树脂型号可以为AB-8、D101、HPD400、HPD100、D1300,优选为HPD400、HPD100;所用氧化铝最优选为中性氧化铝,本发明人发现中性氧化铝不仅可以充分吸附上柱物中的非香豆素类成分杂质及其它色素,对本品纯化有着独到的效果,而且成本相对较低,操作较硅胶柱层析简易。
溶解提取物所用溶剂可以为水、乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚中的一种或任意几种的混合溶剂,优选为乙醇、乙酸乙酯,最优选为乙醇-乙酸乙酯(1∶1,V/V)混合溶剂。
柱层析过程中所用的洗脱溶剂可以为水、乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、石油醚中的一种或任意几种的混合溶剂,优选为乙醇、丙酮、乙酸乙酯,最优选为乙醇-乙酸乙酯(1∶2,V/V)的混合溶剂。
本发明还提供了一种白芷总香豆素提取物药物组合物。它包含治疗有效量的白芷总香豆素提取物和一种或多种药学上可接受的载体或赋型剂。由于白癜风疾病表现为体表症状,所以该药物组合物应该选用为外用制剂,优选为凝胶、软膏或乳膏,结合本品的溶解性等理化性质特征,最优选为将本品制成外用凝胶剂。
采用本领域公知的方法来制备本发明的药物组合物,如将上述白芷总香豆素提取物加入适量载体或赋型剂即可以得到软膏、乳膏或凝胶等外用制剂。本发明所述及的载体或赋型剂包括本领域内常用的所有辅料,如卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚乙烯醇、甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙甲纤维素、羧甲基纤维素钠、明胶、硬脂酸、石蜡、液状石蜡、凡士林、地蜡、蜂蜡、鲸蜡、胆固醇、羊毛脂、植物油、高级醇、甘油脂肪酸酯、聚甘油脂肪酸酯、蔗糖酯、失水山梨醇高级脂肪酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯缩合物、聚氧乙烯高级脂肪酸缩合物、聚氧乙烯高级脂肪醇缩合物、聚氧乙烯蓖麻油缩合物、聚氧乙烯氢化蓖麻油缩合物、十二烷基硫酸钠、十八烷基硫酸钠、聚甘油硬脂酸酯、硬脂酸聚烃氧脂、平平加O、月桂氮卓酮、油酸、磷脂、甘油、丙二醇、山梨醇、麦芽糖醇、乙醇、三氯叔丁醇、苯甲醇、山梨酸、山梨酸钾、苯甲酸、苯甲酸钠和蒸馏水等。
本发明提供的白芷总香豆素提取物及其药物组合物可有效治疗白癜风和具有增强免疫的功能。
薄层色谱法检测香豆素类成分的方法是本领域公知的,在此不予详述。主要活性成分欧前胡素、异欧前胡素和氧化前胡素的含量测定采用本领域公知的高效液相色谱法测定,也不予详述。
本发明使用的白芷药材为伞型科植物白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f或杭白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.etHook.f.var.formosana(Boiss.)Shan et Yuan的干燥根。
本发明所称的“香豆素类”(coumarins)是指本领域内公知的以顺式邻羟基桂皮酸内酯为母核的不同取代基化合物。
本发明与现有技术相比,具有以下显著的优点:
(1)本发明人经实验发现,白芷经上述特定的提取纯化后得到的白芷总香豆素提取物中保证了各有效成分相应的含量,从而保证了经过提取纯化后的总香豆素提取物可以增加酪氨酸酶含量和胆碱酯酶活力,减少单胺氧化酶活力,同时减少代谢产物丙二醛的产生;白芷总香豆素提取物可以明显的增加大鼠血中T细胞亚群CD4/CD8比值,增加正常小鼠单核吞噬细胞吞噬功能,还能促进正常小鼠鸡红细胞溶血素的生成,具有增强免疫的功能。
(2)本发明的提取和纯化方法简便易行,重现性好,适合工业化生产。
(3)以提取物为活性成分制成的药物组合物对白癜风的治疗效果显著,作用明确。
下面通过本发明提供的中药组合物的药效学和安全性研究结果,采用国内常用于治疗白癜风的中药复方制剂-复方卡力孜然酊(商品名是维阿露)作为阳性对照药比较,来进一步说明本发明的有益效果。
复方卡力孜然酊主要成份为驱虫斑鸠菊、补骨脂、何首乌、当归、防风、蛇床子、白鲜皮、乌梅、白芥子、丁香。
试验目的:通过对实验性白癜风模型豚鼠的酪氨酸酶、单胺氧化酶、胆碱酯酶、丙二醛、血流变和皮肤黑色素,以及对正常大、小鼠的免疫功能的影响等的实验研究,验证本发明所提供的白芷香豆素提取物制成的外用凝胶制剂(下面简称为“祛白凝胶”)对实验性白癜风模型动物的治疗作用以及对免疫功能的影响。
祛白凝胶的制备:
取白芷药材20kg,酌予碎断,置提取罐中,加80%乙醇提取3次,每次2h,合并乙醇提取液,滤过;滤液浓缩后,加乙醇2.0L溶解,滤过,滤液过硅胶层析柱,加混合有机溶剂乙酸乙酯-丙酮(8∶1,V/V)洗脱,薄层监测,收集含香豆素类成分的洗脱液,减压回收洗脱液至不含有机溶剂,得到白芷总香豆素提取物160g。经含量测定,其中含主要活性成分欧前胡素15.8%、异欧前胡素10.6%、氧化前胡素15.5%,以上均为重量百分含量。
取10g卡波姆,加丙二醇50g、水10ml使润湿后,再加入蒸馏水适量搅拌制成溶液,边搅拌边缓慢滴加三乙醇胺溶液适量调节pH至6.82,制成凝胶溶液,备用。
将凝胶溶液与处方药物溶液研匀,得到本品的外用制剂-祛白凝胶。下述试验中,10%的祛白凝胶即取10g提取物溶于10ml的乙醇和2g吐温80中,与90g的凝胶溶液研匀;20%的祛白凝胶即取20g提取物溶于20ml的乙醇和4g吐温80中,与80g的凝胶溶液研匀;40%的祛白凝胶即取40g提取物溶于40ml的乙醇和8g吐温80中,与60g的凝胶溶液研匀。
1.试验药品:
1.1实验药品:
1.1.1祛白凝胶
1.1.2复方卡力孜然酊(新疆新时代制药有限责任公司提供)。
1.2用法用量一日3~4次,擦药30分钟后,局部日光浴。
1.3其他药品及试剂
1.3.1 CD4、CD8试剂盒:由英国serotec公司提供
1.3.2 CHE、MDA、MAO试剂盒:由南京建成生物工程研究所提供
1.3.3酪氨酸酶:sigma公司生产
1.3.4 L-多巴:由瑞士Fiuka公司生产
1.3.5对苯二酚(氢醌):由广东汕头市西拢化工厂生产
其余均为合肥市场购买。
2.试验动物:
豚鼠(黑色或黑花色)体重300~350g,雌雄兼用,由南京安立默科技有限公司提供。
昆明种小鼠和wistar大鼠均由南京安立默科技有限公司提供。
3.试验溶剂:凝胶溶液
4.试验条件:温度20~25℃,湿度55~65%,由空调控制。
5.试验仪器: XL-Md型流式细胞计数仪、YDA-IV血液粘度计、754紫外可见分光光度计
6.试验内容:
6.1对实验性白癜风模型豚鼠治疗作用
6.1.1对实验性白癜风模型豚鼠酪氨酸酶活力的影响
6.1.2对实验性白癜风模型豚鼠MAO(单胺氧化酶)活力的影响
6.1.3对实验性白癜风模型豚鼠CHE(胆碱酯酶)活力的影响
6.1.4对实验性白癜风模型豚鼠MDA(丙二醛)含量的影响
6.1.5对实验性白癜风模型豚鼠皮肤黑色素的影响
6.1.6对实验性白癜风模型豚鼠血流变的影响
6.2对正常大、小鼠免疫功能的影响
6.2.1对正常大鼠外周血T细胞亚群的影响
6.2.2对正常小鼠单核吞噬细胞吞噬功能的影响
6.2.3对正常小鼠鸡红细胞溶血素生成的影响
7.试验结果:
7.1对实验性白癜风模型豚鼠治疗作用
7.1.1对实验性白癜风模型豚鼠酪氨酸酶、MAO、CHE、MDA和皮肤黑色素的影响
7.1.1.1动物模型的制备、分组及给药方法:
取体重300~350g黑色和黑花色豚鼠60只,雌雄各半,按体重随机分为正常组、模型组、阳性药物组(复方卡力孜然酊)、祛白凝胶小、中、大剂量组(祛白凝胶浓度分别为10%、20%、40%),各剪去背部黑色皮肤区毛约4×4cm2,用8%的硫化钠脱毛,每四天1次,除正常组涂自来水外,其余各组在脱毛区每天涂5%的氢醌0.5ml两次,第10d开始各组分别每天在涂抹氢醌过后1小时按剂量分别涂药,其中正常组、模型组涂赋形剂1g,阳性组(复方卡力孜然酊)涂1ml、祛白凝胶小、中、大剂量组祛白凝胶1g,每天一次,连续40d,共50d。末次药后2h,以20%乌拉坦按照0.5ml/100g腹腔注射麻醉,于腹主动脉取血,分别放入抗凝和不抗凝试管中,取血清和血浆经各试剂盒处理后,用754分光光度计比色测酪氨酸酶、MAO、CHE、MDA的含量,并在脱毛区中心取1×1cm2皮肤做病理切片,观察皮肤黑色素的变化,结果如下。
7.1.1.2对实验性白癜风模型豚鼠酪氨酸酶含量的影响
7.1.1.2.1酪氨酸酶标准回归方程
取试管5支,分别加入1ml L-多巴溶液(2mg/ml)和2.8ml 0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.0),摇匀,放入25℃恒温水浴箱中预热10min,再向上述试管中分别加入不同浓度的酪氨酸酶溶液1ml,立即混匀,并准确计时,25℃水浴反应5min,迅速加入0.2ml硫脲-乙醇溶液,混匀,终止反应。以0.1M磷酸盐缓冲液为空白对照管,用754紫外可见分光光度计在波长475nm处测吸收值,根据吸收值求回归方程,结果见表1。
表1标准浓度酪氨酸酶吸收度
根据表1数据求回归方程为:y=0.3579x-0.0073 相关系数r=0.9938
7.1.1.2.2血浆中酪氨酸酶含量的测定
检测方法同上,将测得吸收值代入回归方程,求得酪氨酸酶含量,结果见表2。
表2祛白凝胶对实验性白癜风模型豚鼠酪氨酸酶含量的影响(x±s)
与正常组比较,*P<0.05 **P<0.01 与模型组比较,△P<0.05 △P<0.01
由表2可见,用5%的氢醌后,豚鼠血浆中酪氨酸酶含量明显减少,用药后,阳性组和祛白凝胶各剂量组豚鼠血浆中酪氨酸酶含量明显增加,与模型组比较,有显著性差异。说明祛白凝胶能够明显增加实验性白癜风模型豚鼠血浆中酪氨酸酶含量。
7.1.1.3对实验性白癜风模型豚鼠MAO活力的影响
取血清200ul,按MAO试剂盒要求进行,用754紫外可见分光光度计在242nm处比色,测定血清中MAO的活力。结果见表3。
MAO活力(u/h/ml)=测定管吸光度/0.01÷反应时间(h)÷取样量(ml)
表3祛白凝胶对实验性白癜风模型豚鼠MAO活力的影响(x±s)
与正常组比较 **P<0.01 与模型组比胶 △△P<0.01
由表3可见,用5%的氢醌后,豚鼠血浆中MAO活力明显增加,与正常组比,有显著性差异;用药后,豚鼠血浆中MAO活力明显减小,与模型组比较,祛白凝胶各剂量组均有显著性差异。说明祛白凝胶能够明显减少实验性白癜风模型豚鼠血清中MAO活力。
7.1.1.4对实验性白癜风模型豚鼠CHE活力的影响
按上述方法处理动物,取血浆50ul,按CHE试剂盒要求进行处理后,用754紫外可见分光光度计在520nm处比色,测得血浆中CHE活力。结果见表4。
CHE活力(U/ml)=(对照管OD值-测定管OD值)/对照管OD值×标准品浓度(8umol/ml)÷取样量(ml)
表4祛白凝胶对实验性白癜风模型豚鼠CHE活力的影响(x±s)
与正常组比较*P<0.05 **P<0.01 与模型组比较△P<0.05 △△P<0.01
由表4可见,用5%的氢醌后,豚鼠血浆中CHE活力明显减小,与正常组比,有显著性差异;用药后,豚鼠血浆中CHE活力明显增加,与模型组比较,阳性组和祛白凝胶中、大剂量组有显著性差异。说明祛白凝胶能够明显增加实验性白癜风模型豚鼠血浆中CHE活力。
7.1.1.5对实验性白癜风模型豚鼠MDA含量的影响
按上述方法处理动物,取血清100ul,按MDA试剂盒要求进行处理后,用754紫外可见分光光度计在532nm处比色,测得血浆中MDA含量。结果见表5。
MDA含量(nmol/ml)=(测定管吸光度-测定空白管吸光度)/(标准管吸光度-标准空白管吸光度)×标准品浓度(10nmol/ml)×样本测试前稀释倍数(1)
表5祛白凝胶对实验性白癜风模型豚鼠MDA含量的影响(x±s)
与正常组比较**P<0.01;与模型组比较 △△P<0.01
由表5可见,用5%的氢醌后,豚鼠血浆中MDA含量明显增加,与正常组比,有显著性差异;用药后,豚鼠血浆中MDA含量明显减少,与模型组比较,有显著性差异。说明祛白凝胶能够明显降低实验性白癜风模型豚鼠血清中MDA含量。
7.1.1.6对实验性白癜风模型豚鼠皮肤黑色素的影响
将各组豚鼠在用药部位中心取皮肤1×1cm2,用10%甲醛固定,常规石蜡包埋切片,用硫酸亚铁Lillie法进行黑色素染色,观察表皮基底细胞和棘细胞黑色素分布,和毛囊有黑色素的豚鼠个数,结果见表6。
表6祛白凝胶对实验性白癜风模型豚鼠皮肤黑色素的影响(x±s)
观察指标程度分级:
“-”表示表皮基底细胞和棘细胞无黑色素
“±”表示表皮基底细胞和棘细胞偶见黑色素
“+”表示表皮基底细胞和棘细胞30~50%有黑色素
“++”表示表皮基底细胞和棘细胞51~85%有黑色素
“+++”表示表皮基底细胞和棘细胞85%以上有黑色素
由表6可见,正常对照组所有豚鼠表皮基底细胞和棘细胞黑色素达到85%以上,且都有黑色素毛囊,模型组豚鼠表皮基底细胞和棘细胞黑色素分布明显减少,其中无黑色素有6例,偶见黑色素3例,黑色素达30~50%有1例,说明涂5%的氢醌能明显增加豚鼠黑色皮肤的黑色素分解,而用祛白凝胶后各组豚鼠皮肤表皮基底细胞和棘细胞黑色素明显增多,说明祛白凝胶明显增加皮肤的黑色素生成。
7.1.2对实验性白癜风模型豚鼠血流变的影响
取体重200~250g黑色和黑花色豚鼠60只,雌雄各半,按体重随机分为正常组、模型组、阳性组(复方卡力孜然酊)、祛白凝胶小、中、大剂量组(祛白凝胶浓度分别为10%、20%、40%),各剪去背部黑色皮肤区毛约4×4cm2,除正常组外,其余各组在祛毛区每天涂5%的氢醌0.5ml两次,正常组涂自来水,第10d开始各组分别每天在涂抹氢醌过后1小时正常组、模型组涂赋形剂1g、阳性组涂复方卡力孜然酊1ml、祛白凝胶小、中、大剂量组涂祛白凝胶浓度分别为10%、20%、40%1g,每天一次。连续40d,共50d。末次药后2h,以20%乌拉坦按照0.5ml/100g 腹腔注射麻醉,于腹主动脉取血,用血液流变仪检测祛白凝胶对实验性白癜风模型豚鼠血流变的影响,结果表明,用5%的氢醌后,豚鼠血液低切、中切、高切、血浆粘度和纤维蛋白原明显增加,与正常组比,有显著性差异;用药后,祛白凝胶各剂量组的豚鼠血液流变性明显好转,与模型组比较,有显著性差异。说明祛白凝胶能够明显改善实验性白癜风模型豚鼠的血流变。
7.2对正常大、小鼠免疫功能的影响
7.2.1对正常大鼠外周血T细胞亚群的影响
取体重180~200g的大鼠50只,雌雄各半,按体重随机均分为正常组、阳性组(复方卡力孜然酊)、祛白凝胶小、中、大剂量组(祛白凝胶10%、20%、40%浓度)。
在各鼠背部用8%硫化钠脱毛4×4cm2,24h后各组按表8剂量分别外涂给药,1次/日,连续给药30天,其中每隔7天用8%硫化钠脱毛一次。于末次药后30min,各组称重,用20%乌拉坦按照0.5ml/100g腹腔注射,腹主动脉血管取血,分别用流式细胞计数仪测外周血CD4、CD8。结果见表7。
表7祛白凝胶对正常大鼠外周血T细胞亚群的影响(x±s)
与正常组比较, *P<0.05 **P<0.01
由表7可见,用药后,豚鼠外周血中CD4含量明显增加,而CD8含量基本保持不变,CD4/CD8比值增加。与正常组比,祛白凝胶大剂量组外周血中CD4/CD8有显著性差异;说明祛白凝胶对正常大鼠血中T细胞亚群CD4/CD8有明显的增加作用。
7.2.2对正常小鼠单核吞噬细胞吞噬功能的影响
取体重18~22g小鼠50只,雌雄各半,按体重随机均分为正常组、阳性组(复方卡力孜然酊)、祛白凝胶小、中、大剂量组(祛白凝胶10%、20%、40%浓度)。第一天在各鼠背部用8%硫化钠脱毛,暴露2×2cm2大小的皮肤,24h后各组按表9剂量外涂给药0.4g/只,1次/日,连续7天,末次药后40min,称体重,然后各组小鼠尾静脉注射印度墨汁0.05ml/10g体重,分别于1、5min从眶后静脉丛取血20ul,溶于2ml0.1%Na2CO3溶液中摇匀,置754型紫外可见分光光度计在波长700nm处比色,测定光密度(OD)。最后将小鼠颈椎脱臼处死称取肝、脾重量。按照公式求出吞噬(廓清)指数K,求出吞噬活性(校正廓清指数)a,结果见表8。
K=logOD1-logOD2/t2-t1 a=K-3×体重/(肝重+脾重)
表8祛白凝胶对小鼠单核吞噬细胞吞噬功能的影响(x±s)
与正常组比较 *P<0.05**P<0.01
由表8中的数据可见,祛白凝胶对正常小鼠的单核吞噬细胞的吞噬指数和吞噬活性明显增加,祛白凝胶各剂量组吞噬指数与正常组比均有显著性的差异,祛白凝胶大剂量组与正常组比有显著性差异。说明祛白凝胶对正常小鼠的免疫功能有增强作用。
7.2.3对正常小鼠鸡红细胞溶血素生成的影响
取体重18~22g小鼠50只,雌雄各半,按体重随机均分为正常组、阳性组(复方卡力孜然酊)、祛白凝胶小、中、大剂量组(祛白凝胶10%、20%、40%浓度)。第一天在各鼠背部用8%硫化钠脱毛,暴露2×2cm2大小的皮肤,24h后每鼠腹腔注射5%生理盐水鸡红细胞混悬液0.2ml进行免疫,各组皮肤给药0.4g/只,1次/日,连续给药7天,末次药后40min,摘眼球取血,离心,取血清用生理盐水稀释100倍,取稀释血清1ml,与5%鸡红细胞悬液0.5ml、10%补体0.5ml混合,在37℃恒温箱中保温40min后,0℃冰箱中止反应。离心,取上清液与754分光光度计540nm出比色,检测光密度(OD),另设不加血清的空白对照组,取其上清液作为比色时调“0”的基准。以光密度(OD)读数作为判定血清溶血素的指标,比较各组的差异,结果见表9。
鸡红细胞悬液制备:从鸡翼下静脉取血10ml,去纤维蛋白后,用生理盐水洗涤三次,配成5%鸡红细胞混悬液备用;
补体制备:取3只豚鼠血清混合,用生理盐水配成10%即可。
表9祛白凝胶对鸡红细胞溶血素生成的影响(x±s)
与正常组比较, *P<0.05 **P<0.01
由表9可见,用药后,鸡红细胞溶血素生成明显增加,祛白凝胶大剂量组与正常组比有显著性的差异。说明祛白凝胶对正常小鼠免疫功能有增强作用。
8.药效学研究小结
采用5%的氢醌使黑色皮肤豚鼠的黑色皮肤的黑色素减少,酪氨酸酶含量减少,MAO活力增加,CHE活力减少,MDA含量增加,血液的粘稠度增加,与临床白癜风患者病理状况类似,说明采用5%的氢醌可复制实验性白癜风模型动物。
而模型动物每天应用祛白凝胶,结果显示:①明显增加实验性白癜风模型豚鼠皮肤黑色素,明显增加皮肤表皮基底细胞和棘细胞黑色素分布和皮肤毛囊中黑色素,血液中酪氨酸酶含量增加,MAO活力降低,CHE活力增加,代谢产物丙二醛的含量降低;还能显著改善模型动物的血液流变性指标;②对正常大、小鼠的免疫功能有一定的增强作用,明显的增加大鼠血中T细胞亚群CD4/CD8比值,增加正常小鼠单核吞噬细胞吞噬功能,还能促进正常小鼠鸡红细胞溶血素的生成,说明祛白凝胶能增加实验性白癜风模型动物皮肤黑色素生成,减少皮肤黑色素分解、改善血液流变性和减少代谢产物的生成,增强免疫功能等作用。
此外,毒理试验研究还表明,本发明所提供的中药组合物给予家兔正常和破损皮肤小大剂量组每天应用20%和40%祛白凝胶3g/只,1天2次,连续用药6个月,结果显示,家兔行动、毛发、体重、食量等均正常;血象、血脂、血糖、肝肾功能,及脏器系数等与对照组比,均无明显差别(除个别指标外),说明本品长期应用很安全。