CN101220063A

CN101220063A - 梓醇的制备新方法和含它的药物组合物及用途

Info

Publication number: CN101220063A
Application number: CNA2007101593358A
Authority: CN
Inventors: 姜波; 姜涛; 包永明; 赵荣国; 毕静; 安利佳
Original assignee: Dalian University of Technology
Current assignee: Dalian University of Technology
Priority date: 2007-12-29
Filing date: 2007-12-29
Publication date: 2008-07-16
Anticipated expiration: 2027-12-29
Also published as: CN101220063B

Abstract

本发明涉及通式(I)的梓醇的制备新方法，其中R₁为单糖，R₃，R₄，R₅，R₈为氢，R₆为OH，R₇为－OCH₂OH。本发明还涉及该化合物和含它的药物组合物在预防和治疗老年性痴呆病和帕金森病方面的应用。本发明为研究开发新的抗老年性痴呆和帕金森病药物提供了该化合物新的制备方法和含它的药物组合物，有利于进一步开发天然药物资源。

Description

梓醇的制备新方法和含它的药物组合物及用途

技术领域

本发明涉及梓醇的制备新方法以及它和含它的药物组合物在抗帕金森病和老年性痴呆病方面的应用。

背景技术

地黄(Rehmannia glutinosa Libosch.)为玄参科植物，主要分布在河南省，辽宁、河北、山东、浙江亦产。用地黄的新鲜或干燥块根入药始载于《神农本草经》，现代诸多典籍也有记载。鲜地黄性大寒，味甘、苦，具有清热凉血，润燥生津的功能；干地黄性寒，味甘、苦，具有清热养阴，凉血止血的功能。关于地黄化学成分的主要含有环烯醚萜类、水苏糖、β-谷甾醇、甘露醇、油菜甾醇及精氨酸等。近年来，国内外学者对地黄中含有的梓醇的制备方法亦有多种报道，但采用以80％乙醇溶液为溶剂进行平转式连续逆流提取与H103大孔吸附树脂进行分离的方法未见报道。对该化合物和含它的药物组合物用于抗帕金森病和老年性痴呆病方面的应用和机理研究未见报道。对地黄中梓醇提取制备方法的研究报道，主要有两种：其一为加60％乙醇溶液8倍量，回流提取2次，每次1.5小时；其二为加70％乙醇溶液12倍量，回流提取4次，每次1.5小时。但因在加热提取过程中梓醇易氧化，造成收率下降；同时因大量乙醇溶液的使用，使更多杂质被提出，增加了后期分离纯化的困难。地黄具有清热养阴，凉血止血的功能，国内对其所含的梓醇的生物活性研究主要集中在对血糖的影响方面，尚未见对帕金森病和老年性痴呆病方面的应用和机理研究的报道。

发明内容

本发明的目在于提供梓醇的制备新方法。本发明的另一目的是提供一种从地黄中提取制备梓醇的方法。本发明的进一步目的是提供本发明制备方法制备的梓醇和含它的药物组合物在治疗帕金森病和老年性痴呆病方面的用途。本发明人采用以80％乙醇溶液为溶剂进行平转式连续逆流提取、H103大孔吸附树脂进行分离纯化的新方法从地黄中制备梓醇，经证实该化合物具有抗帕金森病和老年性痴呆病的药物活性。

本发明的技术方案是：

1、梓醇的结构通式(I)如下：

(I)

其中R₁为单糖，R₃，R₄，R₅，R₈为氢，R₆为OH，R₇为-OCH₂OH。

2、制备权利要求1所述的梓醇的新方法，该方法包括以下步骤：

a将地黄(Rehmannia glutinosa Libosch.)的新鲜或干燥块根放置于平转式连续逆流提取装置中在乙醇溶液中浸泡并渗漉；

b将地黄的乙醇提取液浓缩后用水分散，依次用石油醚，乙酸乙酯萃取除去杂质；

c将b中水溶液相用H103大孔吸附树脂柱层析，用水洗至色浅，换成10％、20％、30％、50％、80％乙醇溶液梯度洗脱，收集80％乙醇馏分；

d将c中收集馏分减压浓缩并干燥；

f将d中的干燥物用甲醇-乙醇反复多次重结晶处理，得到纯度为99％的该化合物。

本发明的化合物与水按质量百分比1∶1000000至1∶4的组合物；

本发明的化合物与植物油按质量百分1∶1000000至1∶5的组合物；

本发明的化合物与淀粉或/和蔗糖按质量百分1∶10000至100∶1的组合物；

本发明的化合物化合物与左旋多巴或/和卡比多巴或/和司米吉兰或/和硝替卡朋按质量百分1∶10000至10000∶1的组合物；

本发明的化合物与苯海索或/和丙环定或/和苯扎托品按质量百分1∶10000至10000∶1的组合物；

本发明的化合物与金刚烷胺或/和溴隐亭或/和培高利特按质量百分1∶10000至10000∶1的组合物；

本发明的化合物与他克林或/和哈伯因或/和美曲膦酯或/和加兰他敏按质量百分1∶10000至10000∶1的组合物；

本发明的化合物与占诺美林或/和Sabcomedine hydrochloride按质量百分1∶10000至10000∶1的组合物；

本发明的化合物化合物化合物与AIT082或/和盐酸乙酰L肉碱或/和丙戊茶碱按质量百分1∶10000至10000∶1的组合物；本发明的化合物及所述的组合物可作制备抗帕金森病和老年性痴呆病药物的用途。本发明经过活性筛选，确定以地黄的新鲜或干燥块根为原料，采用以80％乙醇溶液为溶剂进行平转式连续逆流提取、H103大孔吸附树脂进行分离纯化相结合的方法，最终获得梓醇的高收率和高纯度；由体外神经细胞和体内动物模型实验结果表明，梓醇具有抗帕金森病和老年性痴呆病的活性。本发明又从该化合物出发设计了一系列该化合物的药物组合物。本发明为研究开发新的抗帕金森病和老年性痴呆病药物提供了梓醇的制备新方法和含它的药物组合物，有利于进一步开发天然药物资源。

本发明的有益效果是，为研究开发新的抗老年性痴呆和帕金森病药物提供了该化合物新的制备方法和含它的药物组合物，有利于进一步开发天然药物资源。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的说明。

图1是梓醇在帕金森小鼠细胞模型上的作用(对照组)

图2是梓醇在帕金森小鼠细胞模型上的作用(MPP⁺)

图3是梓醇在帕金森小鼠细胞模型上的作用(梓醇组)

图4是梓醇对帕金森模型鼠的活性作用(对照组)

图5是梓醇对帕金森模型鼠的活性作用(帕金森模型)

图6是梓醇对帕金森模型鼠的活性作用(梓醇治疗组)

图7是梓醇对Aβ_1-42诱导的大脑皮层神经元损伤的保护的作用(对照组)

图8是梓醇对Aβ_1-42诱导的大脑皮层神经元损伤的保护的作用(Aβ_1-12组)

图9是梓醇对Aβ_1-42诱导的大脑皮层神经元损伤的保护的作用(梓醇组)

具体实施方式

下面的实施例可以使本专业人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1

梓醇的制备方法：

将100千克干地黄(Rehmannia glutinosa Libosch.)加入平转式连续逆流提取器的回转格中，加入10倍80％乙醇溶液，常温渗漉，控制渗漉流速为20ml/min；将地黄的乙醇提取液减压浓缩至浸膏状，按浸膏∶水(1∶2.5)的量用水分散，依次用5倍量石油醚、5倍量乙酸乙酯萃取除去杂质；水溶液相加到H103大孔吸附树脂柱上，浸膏与干树脂的比例为1∶25，充分吸附2小时后，用水洗至色浅，换成10％、20％、30％、50％、80％乙醇溶液各5000ml梯度洗脱，收集80％乙醇馏分；将收集馏分减压浓缩并至浸膏状，进行真空干燥；将干燥物用甲醇-乙醇(2；1)反复3次重结晶处理，得到纯度为99％的该化合物白色粉末。

HPLC条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-水(0.6∶99.4，v/v)为流动相，检测波长210nm；流速1.0ml/min；柱温25℃。

TLC条件：硅胶G薄层板，以氯仿-甲醇-水(14；8；1)为展开剂，10％硫酸乙醇为显色剂，90℃加热至斑点清晰，365nm紫外灯下观察检测。

分子式为C₁₅H₂₂O₁₀，分子量362.45，mp206-208℃。

ESI-MSm/z：360.9(M-1)^-，190(M-1-苷元)^-，181(M-1-苷元-OH)^-。

¹H-NMR(MeOH-d₃，400MHz)δ_H(ppm)：3.87，4.10(¹H each，d.H-10)，5.01(¹H，d.J＝9.7Hz，H-1⁹)，5.04(¹H，t.H-4)，6.33(¹H，d.J＝5.9Hz，H-3)。

13C-NMR(MeOH-d3，100MHz)δ_c(ppm)：

碳 ppm

1， 141.8

3， 104.0

4， 39.0

5， 77.6

6， 62.5

7， 66.1

8， 43.5

9， 61.6

10， 95.2

1’ 99.6

2’ 74.8

3’ 79.5

4’ 71.7

5’ 78.6

6’ 62.9

实施例2

梓醇对帕金森病细胞模型的作用：

1细胞形态学分析和免疫组织化学方法

①小鼠中脑纯神经元培养

无菌操作下取出胎龄14天的KM小鼠胚胎，分离出腹侧中脑，然后在DMEM/F12中轻柔的机械吹打以破碎组织。1500r离心机械分离后的细胞悬液10min，除去组织细胞碎片。弃上清液，计数重悬后的细胞并接种到多聚赖氨酸(20μg/ml)预包被的24孔培养板中，细胞接种密度为5×10⁵/孔。本研究选用DMEM/F12外加10％灭活胎牛血清、100U/ml青霉素，100U/ml链霉素作为细胞培养液。细胞培养48小时后，加入10μM Mβ-阿拉伯糖呋喃糖苷(β-D-arabinofuranoside)以抑制胶质细胞增殖。再过48小时，用新鲜的细胞培养液置换出旧的培养液。最初接种的第7天，细胞用于实验。此时，纯神经元培养体系中神经元≥95％。②免疫细胞化学染色与细胞计数

加药处理后的细胞用以PBS为溶剂的4％的多聚甲醛室温下固定20分钟，PBS洗3次，用含1％的过氧化氢的PBS处理20分钟以消除内源性过氧化氢酶；PBS洗3次，然后用固定剂固定20分钟，勿洗；加入用抗体稀释液稀释的一抗(TH 1/300)4℃过夜或37℃孵育2小时；然后用PBS震荡漂洗10min×3，加入生物素化的二抗(TH羊抗大鼠抗体1∶200)37℃孵育1小时，PBS震荡漂洗10min×3；加入ABC试剂孵育30分钟，PBS洗三次后用新鲜配置的0.05％的二氨基联苯胺(DAB)染色。适时终止反应。光学显微镜下观察、计数。细胞计数时，在24孔培养板中每孔选取16个代表性区域，在100×放大倍数下计数。测量神经突起长度时，每孔选50个代表性神经元，每个处理组有四孔。结果来自三次独立的实验，并表示为对照组细胞数目(或平均突触长度)的百分比。

③实验结果：

原代培养的中脑神经元体系用不同浓度的(0.01-0.5mM)梓醇预处理30分钟后，然后与MPP⁺(10μM)共同作用48小时。从形态学分析，与对照组相比(图2)，MPP⁺不仅极大的降低了TH-IR细胞的密度，而且神经突触的长度也受损缩短(图3)。梓醇预处理30分钟可以(图4)抑制MPP⁺的作用，与MPP⁺处理组比较，TH-IR细胞的密度明显提高，神经突触长度受损程度变低。

此实验结果表明梓醇在帕金森病细胞模型上有效。

实施例3

梓醇对帕金森病动物模型的作用：

ICR小鼠(雄性)，十周龄，随机分为3组。空白对照组、模型组和梓醇治疗组。在开始的1-7天，空白对照组和梓醇治疗组小鼠腹腔注射生理盐水；帕金森模型组小鼠注射MPTP(30mg/kg)。在8-14天，梓醇治疗组组小鼠腹腔注射梓醇(15mg/kg)，其它2组小鼠腹腔注射生理盐水。在末次注射药物24小时后麻醉后开胸、灌注、取脑。

实验结果如所示，注射生理盐水的对照组ICR小鼠黑质致密部(图5)可见大量的TH-ir阳性神经元，排列成致密的网状；与对照组相比，经注射MPTP的小鼠黑质致密部TH-ir阳性神经元明显减少(图6)，表明经MPTP腹腔注射7天的ICR小鼠出现了PD特征。与MPTP组相比，梓醇组小鼠黑质致密部TH-ir阳性神经元无明显减少，表明一定剂量的梓醇对MPTP导致的TH-ir阳性神经元减少产生了拮抗作用(图7)。动物实验结果显示，梓醇对帕金森模型鼠有一定治疗作用。

实施例4

梓醇对老年性痴呆细胞模型的作用：

1细胞形态学分析和免疫组织化学方法

①小鼠大脑皮层神经元细胞培养

无菌操作下取出胎龄15/16天的KM小鼠胚胎，分离出两侧大脑皮层，然后在DMEM/F12中轻柔的机械吹打以破碎组织。1000r离心机械分离后的细胞悬液10min，除去组织细胞碎片。弃上清液，计数重悬后的细胞并接种到多聚赖氨酸(20μg/ml)预包被的24孔培养板中，细胞接种密度为1×10⁵/孔。本研究选用DMEM/F12外加10％灭活胎牛血清、100U/ml青霉素，100U/ml链霉素作为细胞培养液。细胞培养48小时后，加入10μM β-阿拉伯糖呋喃糖苷(β-D-arabinofuranoside)以抑制胶质细胞增殖。再过48小时，用新鲜的细胞培养液置换出旧的培养液。最初接种的第7天，细胞用于实验。此时，纯神经元培养体系中大脑皮层神经元纯度≥95％。

②免疫细胞化学染色

加药处理后的细胞用以PBS为溶剂的4％的多聚甲醛室温下固定30分钟，PBS洗3次，用含3％的过氧化氢的PBS处理30分钟以消除内源性过氧化氢酶；PBS洗3次，然后用封闭剂封闭30分钟，勿洗；加入用抗体稀释液稀释的一抗MAP-2(1∶200)4℃过夜或37℃孵育2小时；然后用PBS震荡漂洗10min×3，加入生物素化的羊抗兔二抗37℃孵育1小时，PBS震荡漂洗10min×3；加入ABC试剂孵育30分钟，PBS洗三次后用新鲜配置的0.05％的二氨基联苯胺(DAB)染色。适时终止反应^[15]。光学显微镜下观察、计数。

③实验结果

大脑皮层神经-胶质细胞体外培养7天用于实验。先用梓醇500μM预处理神经细胞30分钟，后用Aβ_1-425μM共同作用72小时。药物处理完毕后，用抗MAP-2抗体对大脑皮层神经元细胞进行免疫组化染色，与对照组相比(图7)，经5μM Aβ_1-42作用72小时后，MAP-2-阳性皮层神经元数目大大减少，其相应的树突也呈现明显的回缩、变短现象，由神经突触交错形成的完整的神经网络结构遭到破坏(图8)。经500μM梓醇与处理后，受损的皮层神经元有所恢复，MAP-2-阳性皮层神经元数目有所增加，而且回缩、弯曲变短的退化的树突也明显伸长，逐渐重新形成交错连接的神经网络结构。至少从形态学意义上说明梓醇保护了Aβ_1-42直接损伤的皮层神经元(图9)。

此实验结果表明梓醇在老年痴呆细胞模型上有效。

实施例5

梓醇与水组合物的制备：

取梓醇100mg加入1000ml注射用水，搅拌使溶解，用3号垂熔玻璃滤器滤过，再通过0.6μm微孔滤膜，分装入安瓿瓶中，每支2ml，灭菌，即得。

实施例6

梓醇与淀粉组合物的制备：

取梓醇10g与淀粉990g混合，搅拌均匀，在湿法混合颗粒机上制成颗粒，于60℃热风干燥至水分为4％左右，装胶囊，每粒0.25g，即得。

实施例7

梓醇与左旋多巴组合物的制备

取梓醇10g、左旋多巴140g与淀粉850g混合，搅拌均匀，在湿法混合颗粒机上制成颗粒，于60℃热风干燥至水分为4％左右，装胶囊，每粒0.25g，即得。

实施例8

梓醇与左旋多巴和硝替卡朋组合物的制备：

取梓醇2g、左旋多巴10g、硝替卡朋8g与淀粉980g混合，搅拌均匀，在湿法混合颗粒机上制成颗粒，于60℃热风干燥至水分为4％左右，装入PE袋中，封口，每袋5g，即得。

实施例9

梓醇与苯海索和苯扎托品组合物的制备：

取梓醇10g、苯海索15g、苯扎托品25g与淀粉950g混合，搅拌均匀，在湿法混合颗粒机上制成颗粒，于60℃热风干燥至水分为4％左右，压制成片，每片0.3g，包薄膜衣，即得。

实施例10

梓醇与他克林组合物的制备：

取梓醇50mg和他克林20mg，加入1000ml注射用水，搅拌使溶解，用3号垂熔玻璃滤器滤过，再通过0.6μm微孔滤膜，分装入安瓿瓶中，每支2ml，灭菌，即得。

Claims

1.梓醇的结构通式(I)如下：

2.制备权利要求1所述的梓醇的新方法，该方法包括以下步骤：

a将地黄的新鲜或干燥块根放置于平转式连续逆流提取装置中在乙醇溶液中浸泡并渗漉；

d将c中收集馏分减压浓缩并干燥；

3.按照权利要求1所述的梓醇，其特征在于，所述的化合物与水按质量百分比1∶1000000至1∶4的组合物；

4.按照权利要求1所述的梓醇，其特征在于，所述的化合物与植物油按质量百分1∶1000000至1∶5的组合物；

5.按照权利要求1所述的梓醇，其特征在于，所述的化合物与淀粉或/和蔗糖按质量百分1∶10000至100∶1的组合物；

6.按照权利要求1所述的梓醇，其特征在于，所述的化合物化合物与左旋多巴或/和卡比多巴或/和司米吉兰或/和硝替卡朋按质量百分1∶10000至10000∶1的组合物；

7.按照权利要求1所述的梓醇，其特征在于，所述的化合物与苯海索或/和丙环定或/和苯扎托品按质量百分1∶10000至10000∶1的组合物；

8.按照权利要求1所述的梓醇，其特征在于，所述的化合物与金刚烷胺或/和溴隐亭或/和培高利特按质量百分1∶10000至10000∶1的组合物；

9.按照权利要求1所述的梓醇，其特征在于，所述的化合物化合物与他克林或/和哈伯因或/和美曲膦酯或/和加兰他敏按质量百分1∶10000至10000∶1的组合物；

10.按照权利要求1所述的梓醇，其特征在于，所述的化合物化合物与占诺美林或/和Sabcomedine hydrochloride按质量百分1∶10000至10000∶1的组合物；

11.按照权利要求1所述的梓醇，其特征在于，所述的化合物化合物与AIT082或/和盐酸乙酰L肉碱或/和丙戊茶碱按质量百分1∶10000至10000∶1的组合物；

12.按照权利要求1所述的梓醇，其特征在于，所述的化合物用作制备抗帕金森病和老年性痴呆病药物的用途。

13.按照权利要求3-11其中之一所述的梓醇，其特征在于，所述的组合物用作制备抗帕金森病和老年性痴呆病药物的用途。