CN101218259B - 制备低分子量肝素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于制备所具有的VLMWH的含量相对于总肝素含量为至少10wt％的极低分子量肝素(VLMWH)组合物的方法，所述方法包括以色谱或化学的方式或通过过滤，在从非哺乳类的、具有血管的海洋动物提取的肝素组合物中，减小分子量高于8000Da的肝素的相对比例。

Description

制备低分子量肝素的方法
技术领域
本方面涉及制备极低分子量肝素组合物的方法。 
背景技术
肝素是一类具有抗凝性质的硫酸化的葡糖胺聚糖的名称。肝素在医学上广泛用作医用介入设备(invasive medical equipment)的涂层剂例如导管和植入体的涂层剂，以及治疗剂和预防剂。此外，已经将肝素与体外循环血液透析一起使用，作为化疗药物和抗炎药物的助剂，作为生长因子的调节剂，并且用于治疗血液动力学紊乱(haemodynamoic disorder)、先兆子痫(pre-eclampsia)、肠炎疾病(inflammator bowel disease)、癌症(cancer)、静脉血栓疾病(venous thromboembolic)、不稳定的冠脉局部缺血疾病(unstablecoronary ischemic disease)和急性脑血管局部缺血(acute cerebravascularischemia)。
当前，哺乳动物的组织尤其是来自猪和羊的组织是市售肝素的一般来源。虽然以前最常见的来源是牛肺，但现在最常见的来源是猪肠。
肝素具有聚合结构，因而肝素组合物通常包含分子量通常为5kDa至40kDa的肝素(例如参见Mulloy et al.，Thromb.Haemost.84：1052-1056(2000))。分子量范围如此广的肝素通常是指未分级肝素(unfractionatedheparin，UFH)。如当前商业上所使用的那样，UFH的分子量通常地为5kDa至40kDa。近年来，人们对低分子量肝素(LMWH)即包含低分子量(通常小于8kDa)肝素的物质的用途非常感兴趣。
可通过多种方法例如通过借助于化学裂解或酶促分裂(enzymaticcleavage)的分级或解聚，例如通过亚硝酸解聚或肝素酶消化，由天然未分级肝素制备LMWH。当前可得到的LMWH由猪的肝素制备。LMWH的效力通常为：抗Xa因子活性为至少70单位/mg，而抗Xa因子活性与抗IIa因子活性的比值为至少1.5(参见European Pharmacopoeia Commission.Pharmeuropa 1991：3：161-165)。
相对于标准的未分级肝素(UFH)，LMWH具有以下几个优点：它更好地被吸收，并且可以进行皮下给药；在血流中保留更长的时间；具有更可预测的临床响应；可能引起更少的与UFH有关的不利副作用例如出血过多、血小板数量偏低、骨质疏松和刺激注射部位。尽管LMWH的价格要高得多，LMWH的这些好处使得越来越多的医生优先使用LMWH而不是UFH。
然而，鉴于认识到可能存在属间交叉病毒(cross-species viral)和朊病毒感染，对源自哺乳动物的UFH或LMWH的使用越来越关注。人们越来越热衷于极低分子量肝素(VLMWH)的合成产品。因而，可以利用分子量为约1.7kDa的最小五聚结构，以合成的方式制备具有生物活性的肝素。
如当前可得到的那样，合成的VLMWH可以以ArixtraTM从Sanofi-Synthelabo得到，或以Synthetic Heparin从Alchemia得到。
然而，这些解聚或合成方法的使用使LMWH和合成肝素的制备变得复杂，并且使终产品相对昂贵，因而使其更少为缺乏大量资金的健康机构所使用。因而，需要较简单并且较廉价的途径来获得有效LMWH或VLMWH。
发明内容
我们发现，从海洋动物尤其是鱼类提取的肝素天然地具有高含量的LMWH，并且令人惊奇地具有高含量的极低分子量肝素(VLMWH)即分子量小于3kDa的肝素。
在WO 02/076475中，描述了海洋肝素(marine heparin)的提取，其内容在此引入作为参考。
因此发现，来自猪、牛和鲑鱼鳃及废物的未分级肝素的LMWH和VLMWH的含量如下表所示：
表1：UFH的LMWH和VLMWH**的含量
Figure 2006800249003A00800021
*来自Sigma
高抗凝血酶亲和力的VLMWH含量，使用来自Diagnostica Stago，Asnieres，France的Stachrom Heparin Kit测定
***来自LEO Pharma AS
如上所示，上表所列的海洋肝素的VLMWH含量是对纯化的牛抗凝血酶具有高亲和力的VLMWH的含量。低亲和力的VLMWH也可能存在，并且可能有助于产品的抗凝血作用。
与LMWH优于UFH的原因相同，VLMWH优于LMWH。
因而，尤其希望VLMWH具有延长的血液半衰期、减少的副作用(例如血小板减少)和提高的活性。
我们尤其发现，对于海洋LMWH，分子量为1至3kDa的肝素部分的抗Xa因子活性比分子量为3至8kDa的肝素部分高至少20％。而且，在1至3kDa的范围内，单一分子量的部分的抗Xa因子活性可以高至90U/mg。
因此，我们提出将海洋肝素用作制备VLMWH的原料。海洋肝素可以从鱼类或贝类废物提取。而且，由于VLMWH的含量如此之高，所以无需进行解聚，因而可以节约色谱和过滤技术的使用(对于哺乳动物的UFH，情况不是如此)。然而，如果需要的话，可以进行解聚。
因此，本发明一个方面提供用于制备VLMWH组合物的方法，相对于总肝素含量，该VLMWH组合物的VLMWH含量为至少10wt％，优选至少15wt％，更优选至少20wt％，尤其是至少25wt％，更加尤其是至少30wt％(例如至多100wt％，更典型地至多80wt％，例如至多30wt％)，所述方法包括以色谱、酶或化学的方式或通过过滤，减小肝素组合物中分子量高于8000Da(尤其是分子量高于3000Da)的肝素的相对比例，所述肝素组合物从非哺乳类的、具有血管的海洋动物优选地是鱼类或贝类提取，更优选在去除用作例如人们食物之后的肌肉组织由来自所述动物的废物提取。
以色谱、光谱的方式或使用试剂盒(test kit)如上述的Stachrom HeparinKit，可以对所制备的组合物中的VLMWH含量进行评价。
非哺乳类的海洋动物包括淡水及咸水鱼类和贝类。
用作哺乳动物食物来源或用作鱼粉(fish meal)、鱼饵(fish food)和鱼油原料的鱼类是优选的。特别优选使用养殖的鱼类。合适的鱼类的实例包括：鲤鱼(carp)、鲃鱼(barbell)和其它鲤科之鱼(cyprinid)；鳕鱼(cod)、狗鳕(hake)、黑线鳕(haddock)；鲽鱼(flounder)；大比目鱼(halibut)；鳎鱼(sole)；鲱鱼(herring)；沙丁鱼(sardine)；鲚鱼(anchovy)；鲹鱼(jack)；鲻鱼(mullet)；竹刀鱼(saury)；鲭鱼(mackerel)；杖鱼(snoek)；带鱼(cutlass fish)；鲉鱼(red fish)；鲈鱼(bass)；鳗鱼(eel)(例如河鳗(river eel)、康吉鳗(conger)等)；匙吻鲟(paddlefish)；罗非鱼(tilapia)和其它丽体鱼(cichlid)；鲔鱼(tuna)；鲣鱼(bonito)；旗鱼(bill fish)；洄游鱼(diadromous fish)等。特别合适的鱼类的实例包括：鲽鱼、大比目鱼、鳎鱼、鳕鱼、狗鳕、黑线鳕、鲈鱼、鲹鱼、鲻鱼、竹刀鱼、鲱鱼、沙丁鱼、鲚鱼、鲔鱼、鲣鱼、旗鱼、鲭鱼、杖鱼、鲨鱼、魟鱼(ray)、毛鳞鱼(capelin)、黍鲱(sprat)、蓄鱼(brisling)、鳊鱼(bream)、长身鳕鱼(ling)、狼鱼(wolf fish)、鲑鱼、鳟鱼(trout)、银大马哈鱼(coho)和chinock。尤其优选使用的鱼类有鳟鱼、鲑鱼、鳕鱼或鲱鱼，更尤其使用的鱼类为鲑鱼。
用作提取肝素的原料的鱼类废物通常选自头、皮、鳃和内脏，肝素提取步骤是本发明方法的任选先前步骤。单独使用鳃、使用头和使用内脏是尤其优选的。处理鱼类废物的方法可由文献例如WO 2004/049818已知。
如上所述，在本发明的方法中，可以进行化学(或酶促)解聚，例如使用酸(例如亚硝酸)、碱、亚硝酸异戊酯、氧化剂(例如过氧化氢或Cu(I))或肝素酶。在该方面，可以使用传统的解聚技术(例如参见Linhardt et al.，Seminarsin Thrombosis and Hemostasis 25(suppl3)：5-16(1999)和其中的参考文献，其内容在此引入作为参考)。然而，优选通过过滤(例如膜滤法)或使用色谱，尤其优选使用尺寸排阻色谱、离子交换色谱或样品置换色谱(sampledisplacement chromatography)，来获得VLMWH含量的相对增加。
膜滤法是成熟的技术，并且截留特定分子量的膜可以从Pall andMillipore商购。
尺寸排阻色谱(SEC)也是成熟的化学技术，并且合适的分离材料可广泛地获得，例如可以以SephadexTM或SephacrylTM从Amersham Biosciences得到，或以Bio-Gel P10、Bio-Gel P30或Bio-Gel P60从Bio-Rad得到。使用G-75 SephadexTM、SephacrylTM S-200 HR和SephacrylTM S-300 HR是尤其优选的。如果需要的话，SEC步骤可以进行至少两次。
样品置换色谱描述于美国专利6245238和美国专利6576134中，其内容在此引入作为参考。
具体实施方式
在本发明的优选实施方案中，对海洋肝素进行浓缩和脱盐，之后进行色谱步骤来提高VLMWH的相对含量。当使用SEC的时候，这是尤其重要的。例如，可通过将包含肝素的原料加载到离子交换柱(例如Dowex柱)上，随后使用盐水(例如4 M NaCl)将其释放，来将肝素与其它组分分离。然后，可例如使用Millipore/Amicon搅拌单元，通过Nanomax-50过滤器，对洗脱液进行脱盐，然后冻干。这个步骤除去了盐，并且使施加至SEC柱例如G-75Sephadex柱的再溶解的样品的体积最小化。
尤其优选地是，通常使用截留1kDa的膜(例如来自Filtron/Pall的Omega-1k Ultrasette)，对海洋肝素进行膜滤，以除去低分子量的组分，所述低分子量例如抗凝血酶结合的五聚物之前(MW 1728Da)的分子量。也尤其优选地是，例如使用截留分子量为3000Da的膜(例如使用来自Filtron/Pall的Omega Centramate Suspended Screen OS005C11P1)，对海洋肝素进行膜滤，以除去高分子量的组分。
使用离子交换色谱，在离子交换器容量充裕的情况下，通过将样品施加至交换器，可以特别容易地提高产品的LMWH和VLMWH的含量。由于低分子量肝素通常为结合最牢固的组分，它们在后续洗脱液中的含量相应地增加。
如果需要的话，在进一步处理之前，可以例如通过冻干对浓缩和脱盐了的肝素进行干燥。
可以对根据本发明的方法制备的VLMWH组合物进行干燥，也可以将其例如与稀释剂、载体或活性药物配制备用，并且优选地在与液态载体配制之后，可以将其作为涂层施涂于医疗设备的表面例如导管或植入体的表面。这些组合物和涂覆的设备形成本发明的其它方面，通过例如混合或涂覆制备它们的方法也形成本发明的其它方面。
根据本发明的方法制备的VLMWH组合物可以以与LMWH当前所用相当的浓度或剂量使用，例如对于具体适应症以20％推荐水平的LMWH使用。典型的适应症描述于本申请的背景技术部分。
本发明另一个方面提供非哺乳类海洋动物的VLMWH组合物，该VLMWH组合物的VLMWH含量相对于总肝素含量为至少10wt％，优选至少15wt％，更优选至少20wt％，尤其是至少25wt％，更加尤其是至少30wt％(例如至多100wt％，更典型地至多80wt％，例如至多30wt％)，该VLMWH组合物任选地包含生理上可接受的载体或赋形剂和/或药物，并且任选地涂覆到基质上。
本发明又一方面提供根据本发明的组合物或根据本发明的方法制备的组合物在医学中的用途，例如用于在对人或非人动物对象所进行的手术、治疗、预防或诊断时使用的组合物或设备中或用于血液接触的组合物或设备中。
下面参考以下非限制性的实施例进一步对本发明进行描述。
实施例1
制备海洋UFH
在组织研磨器(厨具型，Braun)中，对等量的组织(鲑鱼鳃或废物)和缓冲液(5mM NH4HCO3/NH3的0.1M NaCl溶液，pH为9.0)进行匀浆。典型地在300ml缓冲液中使用300g组织。将匀浆物在80℃温育1小时，并且以13000rpm离心。将上清液施加至Dowex(2×8，阴离子交换器)上，所述Dowex已经在上述缓冲液中平衡，并且用相同的缓冲液洗涤过。使用包含4M NaCl的相同缓冲液，对肝素进行洗脱。在搅拌单元(Amicon 8400)中，用Nanomax-50过滤器(截留分子量＝1000Da)对此洗脱液进行浓缩和脱盐。对浓缩和脱盐了的洗脱液进行冻干。
实施例2
制备海洋VLMH
使用Millipore Masterflex泵，在截留分子量为1000Da的膜(来自Filtron/Pall的Omega 1k Ultrasette膜)上，以1-2ml/min对来自实施例1的Dowex阴离子交换柱的肝素洗脱液(100ml，4M NaCl)(鲑鱼废物)进行过滤。此系统具有切向流动原理的优点。
将滤液(即经过该过滤器的液体)在pH为9.0的5mM NH4HCO3/NH3缓冲液中稀释10倍，并且用Nanomax-50过滤器(截留分子量为1000Da)在搅拌单元中，对其进行脱盐和浓缩。对脱盐的浓缩液进行冻干。将冻干并脱盐的滤液溶解在pH为9.0的1ml 0.025M NH4HCO3/NH3缓冲液中，用pH为9.0的0.025M NH4HCO3/NH3缓冲液作为流动相，在G-75 Sephadex(直径2.6cm，110ml，以Blue Dextran测定的空隙体积为42ml)上，使用尺寸排阻色谱对其进行纯化。
在最初的47ml洗脱液从柱洗脱之后，收集洗脱液，随后对所收集的洗脱液进行冻干，制备肝素，其中至少15wt％的分子量低于3000 Dalton。此富含VLMWH的肝素组合物的抗Xa因子活性为116U/mg。
实施例3
制备海洋VLMWH
根据实施例1制备废物提取物，所不同的是以超过树脂容量5.6倍的方式将其施加至Dowex阴离子交换器。然后，如实施例2那样将产品施加至尺寸排阻色谱。处理过的产品的28.6wt％(相对于总肝素)为LMWH，而22.0wt％为VLMWH。
实施例4
制备海洋VLMWH
使用Minim设备(Pall/Filtron USA)和截留分子量为3000Da的过滤器(Omega Centramate Suspended Screen，OS005C11P1)对如实施例1那样制备的废物提取物过滤。
为了在Minim设备上进行过滤，将流速设置为80ml/min，然后用管塞(tube-stopper)将流速限制为4ml/min，利用截留分子量为3000Da的过滤器，对洗脱液(废物)在pH为9.0的4M NaCl/5mM NH4HCO3/NH3缓冲液中的溶液进行切向流动过滤。
如上所述，在搅拌单元中，用截留分子量为1000Da的过滤器(Nanomax-50)对滤液进行浓缩和脱盐，并且进行冻干。如实施例2所述的那样，将冻干了的滤液施加至Sephadex G-75，进行分子量过滤。
利用Sephadex G-75，对滤液进行截留分子量为3000Da的过滤，该分子量过滤显示洗脱的肝素的分子量低于3000Da。
实施例5
输注研究
对如上所述制备的两种冻干提取物进行研究，一种(样品A)分子量＜8000，而另一种(样品B)＞8000。将两种提取物分别溶解在5mL蒸馏水中，并且过滤经过Millipore过滤器Millex GP过滤器单元0.22μm，得到透明淡棕色的提取物。使用来自Stago，Asnieres，France的Stachrom Heparin测定，借助于StaCompact装置，测定抗Xa因子活性(参见Teien et al.，Thromb Res10：399-410(1997))。样品A包含7.0抗Xa因子/ml，而样品B包含10.4抗Xa因子/ml。
对三只体重为4.3kg的用Hypnorm VET
Figure 2006800249003_2
麻醉了的健康雌兔上进行输注研究。编号为1的兔通过静脉接受4ml的样品A，总计28抗Xa因子单位，相当于6.5抗Xa因子U/kg体重。编号为2的兔接受3.8ml的样品B，总计39.5抗Xa因子单位，相当于9.2抗Xa因子U/kg体重。编号为3的兔接受相当于52抗Xa因子U/kg体重的Fragmin
Figure 2006800249003_3
 Pharmacia。在输注之前，并且在注射后的5、15、30、60和90分钟，将血液(1.8ml)抽取在包含0.2ml0.129M柠檬酸钠的真空采集管(vacutainer tube)中。将这些样品混合，在室温以2000g离心15min，在3.5h内进行该测定。
与人血浆相比，在没有外源性葡糖胺聚糖的情况下，兔血浆中的ΔOD/min稍微较低，这对应于较高的抗Xa因子的平均活性，即0.13U(范围为0.11-0.16)。因而所有测量值都减去0.13抗Xa U。下表2示出了对于三种制品的血浆浓度。所发现的血浆浓度的时间过程表明，与Fragmin
Figure 2006800249003_4
的半衰期相比，鱼GAGs的半衰期更长。
表2抗FXa的活性U/ml兔血浆

Claims (18)

1.制备分子量小于3kDa的肝素的肝素组合物的方法，其中所述肝素组合物中分子量小于3kDa的肝素的含量相对于总肝素含量为至少10wt％，所述方法包括：
以色谱或化学的方式或通过过滤，减小分子量高于8000Da的肝素在从鱼类提取的肝素组合物中的相对比例。
2.权利要求1的方法，其用于制备分子量小于3kDa的肝素的含量相对于总肝素含量为至少20wt％的肝素组合物。
3.权利要求1的方法，其用于制备分子量小于3kDa的肝素的含量相对于总肝素含量为至少25wt％的肝素组合物。
4.权利要求1的方法，其用于制备分子量小于3kDa的肝素的含量相对于总肝素含量为至少30wt％的肝素组合物。
5.权利要求1的方法，其用于制备分子量小于3kDa的肝素的含量相对于总肝素含量为至多100wt％的肝素组合物。
6.权利要求1的方法，其用于制备分子量小于3kDa的肝素的含量相对于总肝素含量为至多80wt％的肝素组合物。
7.权利要求1至6中任一项的方法，其中减小了分子量高于3000Da的肝素的相对比例。
8.上述权利要求中任一项的方法，其中所述肝素组合物进一步接受膜滤，除去分子量低于1kDa的组分。
9.上述权利要求中任意一项的方法，其是对从去除肌肉后的鱼类废物提取的肝素组合物进行的。
10.权利要求9的方法，其是对鲑鱼废物进行的。
11.上述权利要求中任意一项的方法，其以色谱的方式进行。
12.权利要求11的方法，其利用尺寸排阻色谱来进行。
13.权利要求11的方法，其利用离子交换色谱来进行。
14.权利要求11的方法，其利用样品置换色谱来进行。
15.权利要求1至10中任一项的方法，其利用过滤来进行。
16.权利要求15的方法，其利用膜滤来进行。
17.权利要求1至10中任一项的方法，其以化学的方式进行。
18.权利要求17的方法，其利用化学解聚来进行。
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