CN101215608A - 一种辅助筛选籼稻和粳稻的方法及其专用引物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种辅助筛选籼稻和粳稻的方法。本发明所提供的辅助筛选籼稻和粳稻的方法，是检测待测水稻中是否缺失AC132003中自5’末端第122836－124566位核苷酸序列，若缺失，则待测水稻为候选籼稻，若不缺失则待测水稻为候选粳稻。本发明辅助筛选水稻籼粳亚种的方法可用于早期鉴定籼稻和粳稻品种或地方种，了解籼稻和粳稻的遗传分化程度，对籼、粳稻杂种优势的利用和培育高产、优质的杂交稻具有重要指导作用，从而优化杂交组合，加快育种速度，降低育种成本，具有操作简单，成本低廉，周期短的优点，适于推广应用，为水稻籼粳亚种种质的鉴定提供了一种快捷的选择方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种辅助筛选籼稻和粳稻的方法及其专用引物。
背景技术
栽培稻是世界上最重要的粮食作物之一，在其11,500多年的栽培稻驯化历史中，为适应不同的农业生态环境，栽培稻形成了丰富的遗传多样性和明显的遗传分化，产生了籼稻(indica)和粳稻(japonica)两个不同的生态型(Morishima H，Oka HI.Phylogenetic differentiation of cultivated rice.XXII.Numerableevaluation of the Indica-Japonica differentiation.Japanese Journal ofBreeding，1981，31：402-413；Glaszmann J C.Isozymes and classification ofAsian rice varieties.Theoretical and Applied Genetics，1987，74：21-30；Wang Z Y，Tanksley S D.Restriction fragment length polymorphism in OryzasativaL.Genome，1989，32：1113-1118；Blair M W，Panaud O，McCouch S R.Inter-simple sequence repeat(ISSR)amplification for analysis ofmicrosatellite motif frequency and fingerprinting in rice(Oryza sativa L.).Theoretical and Applied Genetics，1999，98(5)：780-782.))。它们之间在许多形态和生理性状上存在着明显的差异(Morishima H，Oka HI.Phylogeneticdifferentiation of cultivated rice.Numerical evaluations of theindica-japonica differentiation.Jpn.J.Breed，1981，31：402-413.WANGXiang-Kun，CHENG Kan-Sheng，HUAN Nai-Wei，LUO Jun，LU Yi-Xuan，LIUGuang-Rong.Study on two important rice types concerning the origin anddifferentiation of Asian cultivated rice.Acta Genetica Sinica，1987，14(4)：262-270.)。然而，水稻的籼-粳分化是一个缓慢的进化过程，在许多水稻地方种中存在着典型的籼稻或粳稻，但也存在籼粳分化不明显的中间型，对于这些类型很难用传统的方法来鉴定，更难研究水稻的籼粳分化程度。因此，开发新型的Marker基因及其分子标记来准确鉴定籼稻和粳稻，并且用其研究水稻的进化非常必要。
植物细胞色素P450是分子量为40-60KD、结构类似的一类血红素-硫铁蛋白。它以可溶性和膜结合两种形态存在于植物细胞内，可催化多种化学反应，在防御植物免受有害物质侵害方面具有重要作用。水稻中也含有水稻细胞色素P450基因，如基因LOC_Os11g27730。
发明内容
本发明的目的是提供一种辅助筛选籼稻和粳稻的方法。
本发明所提供的辅助筛选籼稻和粳稻的方法，是检测待测水稻中是否缺失AC132003中自5’末端第122836-124566位的核苷酸序列，若缺失，则待测水稻为候选籼稻，若不缺失则待测水稻为候选粳稻。
所述缺失具体可以通过PCR扩增进行检测。
其中，所述PCR扩增检测中所扩增的目的片段包括AC132003中自5’末端第122836-124566位核苷酸中至少1000bp的片段。
上述扩增中得到的PCR产物具体可用琼脂糖凝胶电泳进行检测。
所述PCR扩增检测中，所用到的引物具体可为如下的引物：其中的一条序列如序列表中序列1所示，另一条序列如序列表中序列2所示。
实际应用中，可采用的一种具体辅助筛选籼稻和粳稻的方法如下：以待测水稻的基因组DNA为模板，用核苷酸序列分别是序列表中序列1和序列2的一对引物进行PCR扩增，扩增得到的产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测，若产物在琼脂糖上显示1000-2000bp之间的一条带，则待测水稻为候选粳稻，若产物在琼脂糖凝胶上显示为没有1000-2000bp之间的一条带，则待测水稻为候选籼稻。
本发明的另一个目的是提供一种辅助筛选籼稻和粳稻的引物.
本发明所提供的辅助筛选籼稻和粳稻的引物，可以是PCR扩增AC132003中自5’末端第122836-124566位核苷酸中至少1000bp片段所用的任何一对核苷酸序列。
所述引物具体可为如下引物：其中的一条序列如序列表中序列1所示，另一条序列如序列表中序列2所示。
本发明辅助筛选水稻籼粳亚种的方法可在发育早期筛选籼稻和粳稻品种或地方种，了解籼稻和粳稻的遗传分化程度，对籼、粳稻杂种优势的利用和培育高产、优质的杂交稻具有重要指导作用，从而优化杂交组合，加快育种速度，降低育种成本，具有操作简单，成本低廉，周期短的优点，适于推广应用，为水稻籼粳亚种种质的鉴定提供了一种快捷的选择方法。
附图说明
图1为基因LOC_Os11g27730在日本晴和93-11中的基因组序列比对结果(来自TIGR网站)及引物MVRT1D所在基因组序列上的位置示意图。
图2为以日本晴和93-11的基因组DNA为模板，在引物MVRT1D引导下的PCR扩增产物的结果。
图3为以16个水稻品种和地方种的基因组DNA为模板，在引物MVRT1D引导下的PCR扩增产物的检测结果。
具体实施方式
下述实施例中所用实验方法如无特殊说明均为常规方法。
下述实施例中的水稻品种和地方种均来自国家种质资源库。
实施例1、基因LOC_Os11g27730在籼稻和粳稻中不同表达模式的发现
首先对籼粳稻在不同发育阶段和不同组织部位的芯片数据进行挖掘分析，结果表明，基因LOC_Os11g27730在籼稻中表达量极低甚至不表达，而在粳稻中的表达量极高。根据前人的研究结果，造成基因表达量差异的主要原因可能是碱基序列的插入/缺失(InDel)或受其它基因的调控。
实施例2、用于辅助筛选籼稻和粳稻的引物的设计
用比较基因组学的方法，首先对基因LOC_Os11g27730在籼稻品种93-11和粳稻品种日本晴中的基因组序列进行了核苷酸序列比对(Blast)分析，结果发现此基因在93-11中确实存在缺失(图1)。
为进一步验证93-11与日本晴间是否存在基因组水平上的差异，依据日本晴序列，在二者存在基因组差异的区域设计引物MVRT1D：MVRT1DF(序列如序列表中序列1所示)和MVRT1DR(序列如序列表中序列2所示)，并分别以日本晴和93-11的基因组DNA为模板进行PCR验证。PCR扩增的反应体系为：水稻基因组DNA模板20ng，Taq Plus DNA聚合酶0.5U，2.0μl 10×PCR缓冲液(100mM Tris·HCl pH9.0，500mM KCl，15mM Mg2+，1％Triton X-100)，100μM dNTPs，正向引物4μM，反向引物4μM，用DEPC水补充反应体系至20μl。PCR反应条件为：先94℃ 5min；随后94℃30sec，58℃45sec，72℃ 1min30sec，共35个循环；再72℃10min。通过浓度为1％～1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物中是否有目的条带。检测结果表明引物MVRT1D在日本晴中有扩增产物，扩增产物在琼脂糖凝胶上显示为1000-2000bp之间的一条带，而在93-11中却无扩增产物(图2，泳道1为以日本晴为模板扩增得到的产物，泳道2为以93-11为模板扩增得到的产物，3为阴性对照，Marker为普博欣生物科技有限公司的1Kb DNA Ladder，产品编号：PBZ0304-1)。
实施例2、用引物MVRT1D辅助筛选水稻籼粳亚种的可行性验证
水稻品种和地方种均来国家种质资源库：93-11，细麻柞谷，紫糯，Nepa(深水稻)，桂朝2号，Aus6538(Bamalaia)，IR24，特青，日本晴，矮大种，木理(光壳粳稻)，糯粳稻，越富，秋光，红光和云峰7号。
首先利用形态指标及相关文献检索分别随机挑选籼粳亚种各8个品种和地方种，如表1：
表1、16个水稻品种和地方种的籼粳亚种鉴定结果
| 品种名 | 所属亚种 | 产地 |
| 93-11 | 籼 | 中国浙江 |
| 细麻柞谷 | 籼 | 中国云南 |
| 紫糯 | 籼 | 中国云南 |
| Nepa(deep water rice，深水稻) | 籼 | 孟加拉 |
| 桂朝2号 | 籼 | 中国广州 |
| Aus6538(Bamalaia) | 籼 | 缅甸 |
| IR24 | 籼 | 国际水稻所 |
| 特青 | 籼 | 中国广州 |
| 日本晴 | 粳 | 日本 |
| 矮大种 | 粳 | 中国安徽 |
| 木理(光壳粳稻) | 粳 | 中国云南 |
| 糯粳稻 | 粳 | 中国云南 |
| 越富 | 粳 | 日本 |
| 秋光 | 粳 | 日本 |
| 红光 | 粳 | 日本 |
| 云峰7号 | 粳 | 韩国 |
分别提取上述不同水稻品种和地方种的基因组DNA，在引物MVRT1D的引导下进行PCR扩增。反应体系如下：水稻基因组DNA模板20ng，Taq Plus DNA聚合酶0.5U，2.0μl 10×PCR缓冲液(100mM Tris·HCl pH9.0，500mM KCl，15mM Mg2+，1％TritonX-100)，100μM dNTPs，正向引物4μM，反向引物4μM，用DEPC水补充反应体系至20μl。PCR反应条件为：先94℃ 5min；随后94℃ 30sec，58℃45sec，72℃ 1min30sec，共35个循环；再72℃10min。反应结束，利用浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测。实验设3次重复。
三次重复实验的结果一致，检测结果如图3所示(泳道1-8分别籼稻品种和地方种93-11、细麻柞谷、紫糯、Nepa(deep water rice，深水稻)、桂朝2号、Aus6538(Bamalaia)、IR24和特青的扩增产物电泳结果；9-16分别为8个粳稻品种和地方种日本晴、矮大种、木理(光壳粳稻)、糯粳稻、越富、秋光、红光和云峰7号的电泳结果)。结果表明，引物MVRT1D在7个籼稻品种和地方种中，均未扩增出带型，与93-11的扩增结果相同，而在7个粳稻品种和地方种中，均能扩增出与日本晴相同的带型，扩增产物在琼脂糖凝胶上显示为1000-2000bp之间的一条带。以上结果表明，InDel引物MVRT1D鉴定籼稻和粳稻的准确性均达到了100％。因此，MVRT1D可用于水稻籼粳亚种辅助筛选标记。
序列表
<160>2
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
cctcatgttcctccgacttg 20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
tgccgctttgcttatcttct 20
Claims (8)
1.一种辅助筛选籼稻和粳稻的方法，是检测待测水稻中是否缺失AC132003中自5’末端第122836-124566位的核苷酸序列，若缺失，则待测水稻为候选籼稻，若不缺失则待测水稻为候选粳稻。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述缺失通过PCR扩增检测。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增检测中所扩增的目的片段包括AC132003中自5’末端第122836-124566位核苷酸中至少1000bp的片段。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增检测中用琼脂糖凝胶电泳进行检测。
5.根据权利要求2、3或4所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增检测中所述扩增中用到的引物序列如序列表中序列1和序列2所示。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增检测中，扩增得到的产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测，若产物在琼脂糖凝胶上显示为1000-2000bp之间的一条带，则待测水稻为候选粳稻，若产物在琼脂糖凝胶上显示为没有1000-2000bp之间的一条带，则待测水稻为候选籼稻。
7.辅助筛选籼稻和粳稻的引物，是PCR扩增AC132003中自5’末端第122836-124566位核苷酸中至少1000bp片段所用的一对核苷酸序列。
8.根据权利要求7所述的引物，其特征在于：所述引物中的一条序列如序列表中序列1所示，另一条序列如序列表中序列2所示。
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