CN101215560A - 一种具有抗白血病作用的miR-21反义寡核苷酸及其应用 - Google Patents

一种具有抗白血病作用的miR-21反义寡核苷酸及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN101215560A
CN101215560A CNA2007100328092A CN200710032809A CN101215560A CN 101215560 A CN101215560 A CN 101215560A CN A2007100328092 A CNA2007100328092 A CN A2007100328092A CN 200710032809 A CN200710032809 A CN 200710032809A CN 101215560 A CN101215560 A CN 101215560A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mir
amo
leukemia
cell
antisense oligonucleotide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CNA2007100328092A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101215560B (zh
Inventor
费嘉
兰菲菲
刘誉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangzhou Disheng Biological Medicine Technology Co Ltd
Original Assignee
Jinan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jinan University filed Critical Jinan University
Priority to CN2007100328092A priority Critical patent/CN101215560B/zh
Publication of CN101215560A publication Critical patent/CN101215560A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101215560B publication Critical patent/CN101215560B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Landscapes

  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明涉及一种具有抗白血病作用的miR－21反义寡核苷酸及其应用，本发明所述的具有抗白血病作用的miR－21反义寡核苷酸，包含如下所示碱基序列之一：5′－tcaacatcagtctgataagcta－3′。本发明所述的具有抗白血病作用的microRNA反义寡核苷酸能够有效地抑制白血病细胞K562中的miR－21和miR－181a这两种基因的表达，促进白血病细胞凋亡，从而能够有效地治疗白血病。并且对白血病细胞K562的抑制效果呈现明显的量效关系。

Description

一种具有抗白血病作用的miR-21反义寡核苷酸及其应用
技术领域
本发明涉及核苷酸，具体涉及一种具有抗白血病作用的miR-21反义寡核苷酸及其应用。
背景技术
MicroRNA(简称miRNA)是存在于真核生物中的一类长度约为22nt的非编码小分子RNA，参与基因转录后水平调控，呈现出组织特异性或发育阶段特异性表达特征。MicroRNA基因存在于基因组的基因间隔区或内含子中，通过与靶mRNA序列的3′非翻译区或编码区以碱基互补配对的方式来执行对靶mRNA的转录翻译抑制的功能，从而调控基因的表达。
随着生物信息学的迅猛发展和基因克隆技术的不断改进，已经在生物体内发现了大量的miRNA，并且建立了miRNA数据库(http://www.sanger.ac.uk)，其中包括了人类已经发现的533个miRNA。
miRNA能够通过两种不同的机制指导RISC下调目的基因的表达：mRNA剪切和翻译抑制。miRNA与其靶基因的互补程度决定了它以何种机制沉默靶基因。一旦miRNA组装进入效应复合物RISC，当其与靶mRNA几乎完全互补时就指导mRNA特异性切割，引发靶mRNA的降解；当互补程度较低时就指导mRNA翻译抑制。
反义技术(antisense technology)是一种根据碱基互补原理，用人工合成或生物体表达的特定互补的DNA或RNA片段(或其化学修饰产物)，阻断从基因到蛋白质的信息流，以达到抑制或阻断基因表达的目的。反义核酸主要指反义RNA、反义DNA(ASODN)以及核酶，反义技术是一种新的药物开发方式，利用这一技术研制的药物称反义药物，通常指反义寡核苷酸(antisenseoligonucleotide)。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有抗白血病作用的miR-21反义寡核苷酸，本发明所提供的具有抗白血病作用的miR-21反义寡核苷酸，包含如下所示的序列：5′-tcaacatcagtctgataagcta-3′(22bp)；
所述的具有抗白血病作用的miR-21反义寡核苷酸可以经过不同的化学修饰，如甲氧修饰、硫代修饰等。
本发明的另一目的是提供这种具有抗白血病作用的miR-21反义寡核苷酸在制备治疗白血病药物中的应用。所述的应用是将所述的核苷酸按本领域常用的方法制成各种制剂。
本发明所述的具有抗白血病作用的miR-21反义寡核苷酸的序列是根据白血病细胞K562中的miR-21序列设计的反义寡核苷酸序列(Antisense-microRNAs-oligonucleotides，AMO)。所以相对应地，5′-tcaacatcagtctgataagcta-3′在本发明中称为AMO-miR-21。
本发明所述的具有抗白血病作用的miR-21反义寡核苷酸能够有效地抑制白血病细胞中的miR-21和miR-181a这两种基因的表达，促进白血病细胞凋亡，从而能够有效地治疗白血病。并且抑制效果呈现明显的量效关系，经实验证明，AMO浓度为0.6μmol/L时对白血病细胞生长的抑制效果为最佳。
附图说明
图1为不同浓度AMO对白血病细胞K562的生长抑制作用(72h)图。
图2至图5为AMO(0.6μmol/L)作用于白血病细胞K562 24h对细胞周期的影响图(其中p2：sub G1；P3：G0/G1；P4：S；P5：G2/M，图2为随机对照组，图3为空白对照组，图4为AMO-miR-181a组，图5为AMO-miR-21组)。
图6至图9为AMO(0.6μmol/L)作用于白血病细胞K562 48h对细胞周期的影响图(其中P2：sub G1；P3：G0/G1；P4：S；P5：G2/M，图6为AMO-miR-21组，图7为AMO-miR-181a组，图8为空白对照组，图9为随机对照组)。
图10为miR-21的标准曲线图(CT值为8.30、13.00、17.07、20.98、25.36、28.57)。
图11是不同时间AMO对白血病细胞K562的生长抑制作用(0.6μmol/L)图。
具体实施方式
实施例1本发明的具有抗白血病作用的miR-21反义寡核苷酸(以下简称AMO)的制得
白血病细胞K562的miR-21序列为5′-uagcuuaucagacugauguugac-3′(23bp)；miR-181a序列为5′-aacauucaacgcugucggugagu-3′(23bp)。
针对白血病细胞K562的miR-21设计其反义寡核苷酸，并采用BLAST软件进行分析，比对后得序列如SEQ NO.1所示：5′-tcaacatcagtctgataagcta-3′(22bp)(以下称为AMO-miR-21)，针对白血病细胞K562的miR-181a设计其反义寡核苷酸，并采用BLAST软件进行分析，比对后得序列如SEQ NO.2所示：5′-actcaccgacagcgttgaatgtt-3′(23bp)(以下称为AMO-miR-181a)。以上两种反义寡核苷酸序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，全硫代修饰，PAGE纯化，于-20℃保存。用无血清的RPMI-1640培养基溶解配制成100μmol/L储存溶液，置-20℃备用，用时稀释成所需的使用浓度。
实施例2本发明的miR-21和miR-181a反义核苷酸对白血病细胞K562的抑制作用和诱导凋亡作用
1、主要试剂
LipofectamineTM 2000    invitrogen公司              美国
antisense microRNAs     上海生工生物工程有限公司        中国
琼脂糖                      Promega公司                 美国
羟乙基哌嗪乙磺酸            Gibco公司                   美国
RPMI-1640培养基粉           Gibco公司                   美国
RPMI-1640液体培养基         展晨生物公司                中国
新生牛血清              杭州四季青生物工程公可          中国
青霉素、链霉素              华北制药公司                中国
胰酶(Trypsin)               Sigma公司                   美国
CCK-8细胞计数试剂盒    日本同仁化学研究所               日本
台盼蓝(Typan Blue)               Sigma公司     美国
1000μL，200μL，10μL Tips      Axygen公司    美国
1.5mL，0.2mLEP                   Axygen公司    美国
RNA                              Sigma公司     美国
碘化丙啶(PI)                     Sigma公司     美国
2.试剂配制
2.1LipofectamineTM 2000：4℃保存。
2.2Antisense-microRNAs-oligonucleotides(AMO)：设计实施例1中所述的针对白血病细胞K562中miR-21和miR-181a的反义寡核苷酸序列AMO-miR-21和AMO-miR-181a：序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，全硫代修饰，PAGE纯化，于-20℃保存。用无血清的RPMI-1640培养基溶解配制成100μmol/L储存溶液，置-20℃备用，用时稀释成所需的使用浓度。
2.3含酚红RPMI-1640培养基：
RPMI-1640干粉(10.4g/包)，用三蒸水溶解，加入碳酸氢钠2.0g，HEPES5.0g，磁力搅拌仪充分搅拌，定容至1000mL，过滤除菌，分装，4℃保存。
2.4RPMI-1640液体培养基：过滤除菌，分装。
2.5新生牛血清：
56℃、30min灭活，分装于25mL小瓶中，-20℃保存。配制新鲜RPMI-1640液时，每180mL培养液加入血清20mL，使最终细胞培养液中血清的体积分数为10％。
2.60.2％台盼蓝工作液：
称取0.2g台盼蓝粉，用100mL PBS(pH7.2)溶解。
2.7RNA酶：
配制成10mg/mL的储存液，-20℃保存，使用时配制成工作液浓度。
2.8碘化丙啶(PI)染液：
称取20μg碘化丙啶，加入1000mL生理盐水，即20μg/L浓度，分装，4℃避光保存。
3主要仪器
3.1DL-2型台式低速离心机(北京医用离心机厂)
3.2CO2培养箱(Thermo Forma，美国)
3.3超净工作台(苏州净化设备厂)
3.4微量加样器(0.5-10μL，1-20μL，10-100μL，50-200μL，200-1000μL，Eppendorf，德国)
3.5DS-1B倒置显微镜(重庆光学仪器厂)
3.6Neubauer Improved细胞计数板(Carl Roth GmbH&Co.KG，德国)
3.7流式细胞仪(Elite，Coulter公司，美国)
4实验方法
(1)细胞培养：
白血病细胞K562用含10％新生牛血清RPMI-1640培养基于37℃、体积分数为5％CO2培养箱，饱和湿度条件下培养，0.25％的胰酶常规消化传代，2-3天传代一次。实验选用对数生长期、0.2％台盼蓝拒染率＞95％的细胞接种于培养板，加入LipofectamineTM2000-AMO反义核酸，每组药物均设3个复孔。
(2)LipofectamineTM2000与AMO复合物的配制：
单独的AMO-miR对细胞的转染效率不高，需要一种合适的转染载体介导才能提高AMO-miR的作用效果使之进入细胞发挥更好的作用效果。我们采用LipofectamineTM 2000来作为转染载体。
LipofectamineTM2000与AMO按质量比为2.5∶1配制，即取所需AMO量，计算所需LipofectamineTM2000的量，分别用无血清培养液配制，将LipofectamineTM2000缓慢加入AMO中，充分混匀，室温静置30min，即得LipofectamineTM2000-AMO复合物。
(3)台盼蓝拒染法检测AMO对白血病细胞K562生长的抑制作用：
取对数生长期白血病细胞K562，用无血清RPMI-1640培养基调整细胞浓度为5×104cells/mL接种于96孔培养板，每孔100μL(每孔5000个细胞)，加入药物后终体积为150μL。
实验分为4组：AMO-miR-21组、AMO-miR-181a组、随机对照组组、空白对照组LipofectamineTM 2000与AMO的质量比为2.5∶1，
白血病细胞株K562每组AMO终浓度均分别为0.1μmol/L、0.21μmol/L、0.3μmol/L、0.61μmol/L，空白对照组加入与药物同体积的血清RPMI-1640培养基，脂质体对照组加入与药物同体积同浓度的LipofectamineTM2000，置37℃，体积分数为5％CO2培养箱转染6h，加入含血清培养基分别培养24h、48h、72h。
选AMO终浓度均为0.6μmol/L，空白对照组加入与药物同体积的血清RPMI-1640培养基，脂质体对照组加入与药物同体积同浓度的LipofectamineTM2000，置37℃，体积分数为5％CO2培养箱分别培养72h。
(4)PI单染流式细胞仪检测经AMO作用后，K562细胞周期及亚二倍体峰百分率变化情况：
取对数生长期白血病细胞K562用无血清RPMI-1640培养基调整细胞浓度为1.2×105cells/mL，接种于24孔培养板，各组均设四复孔。加入无血清含AMO的RPMI-1640培养液后，每孔终体积500μL，置孵箱转染6h后，每孔加入500μL含20％血清RPMI-1640培养液继续培养。共设4组：AMO-miR-181a、AMO-miR-21组、随机对照组和空白对照组。LipofectamineTM2000与AMO的质量比为2.5∶1，每组AMO终浓度为0.6μmol/L，空白对照组加入与药物同体积的血清RPMI-1640培养基，脂质体对照组加入与药物同体积同浓度的LipofectamineTM2000，分另培养24h、48h、72h，倒置显微镜下观察后，用0.25％胰蛋白酶-EDTA消化收集细胞，预冷PBS洗涤3次后，用70％(v/v)乙醇于4℃固定过夜。上机前用预冷PBS洗涤3次后，加入碘化丙锭染色液(含RNA酶)，终浓度50μg/mL，避光染色30min，流式细胞仪分析细胞DNA含量的变化，每个样本随机分析5000个细胞，得到各组细胞亚二倍体峰百分率和各组细胞生长周期比例。
(5)统计学分析：
所有数据采用均数±标准差表示，使用统计软件SPSS 11.5，各组均数比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。P＜0.05表示差异有统计学意义。
(6)实验结果
实验发现，对于白血病细胞K562，AMO-miR-21和AMO-miR-181a在浓度为0.2μM时即发挥了抑制作用；0.3μmol/L，0.6μmol/L时抑制效果更明显，最佳作用浓度为0.6μmol/L，呈现出明显的量效关系。终浓度0.6μmol/L的AMO-miR-21和AMO-miR-181a转染白血病细胞K562 72h时，与随机对照组相比较，对细胞生长产生明显的抑制作用，且随着作用时间的增加，其抑制效果逐渐增强(如图1所示)。
终浓度为0.6μmol/L的AMO作用于白血病细胞K562，AMO-miR-21和AMO-miR-181a在培养48h时开始对细胞的生长出现抑制作用，且随着作用时间的增加，其抑制效果逐渐增强。72h时作用效果十分明显，有明显的时效关系(如图11所示)。
流式细胞仪分析各组DNA含量的细胞周期分析图中，P2峰代表亚二倍体峰，代表DNA含量不足二倍体的细胞，用来估计凋亡细胞的比例；P3峰代表处于G0/G1期的细胞，P4峰代表处于S期的细胞，P5峰代表处于G2/M期的细胞。AMO转染白血病细胞K562 24h、48h、72h后(AMO终浓度为0.6μmol/L)，与随机对照组相比，AMO-miR-21组和AMO-miR-181a组凋亡峰十分明显，有显著的统计学差异(P＜0.05)(见表1)，细胞周期中各时期所占细胞周期的比例如表2所示。
表1AMO(0.6μmol/L)作用于白血病细胞K562不同时间亚二倍体峰所占细胞周期的比例(％，
Figure S2007100328092D00071
n＝3)
Figure S2007100328092D00072
*与随机对照组相比较，P＜0.05
表2AMO(0.6μmol/L)作用于白血病细胞K562不同时间对细胞周期的影响(％，
Figure S2007100328092D00081
n＝3)
分组   subG1(p2)   G0/G1(P3)   S(P4)   G2/M(P5)
24h 空白对照组随机对照组AMO-miR-21组AMO-miR-181a组  12.66±0.6515.39±0.8119.68±1.01*22.39±1.16*   52.24±2.7952.43±2.8149.39±2.6551.27±2.70   27.67±1.4725.94±1.3223.55±1.2520.96±1.11   7.63±0.416.72±0.368.12±0.465.11±0.27
48h 空白对照组随机对照组AMO-miR-21组AMO-miR-181a组  32.01±1.6733.27±1.7644.39±2.30*38.62±2.01*   49.12±2.6350.61±2.6847.64±2.5246.59±2.47   23.65±1.2619.87±1.0115.58±0.8115.01±0.78   7.99±0.455.68±0.314.33±0.263.39±0.19
72h 空白对照组随机对照组AMO-miR-21组AMO-miR-181a组  18.52±0.9424.03±1.2332.33±1.68*35.17±1.83*   40.01±2.1240.24±2.1338.16±2.0234.61±1.89   21.31±1.0918.38±0.9814.65±0.7818.13±0.98   6.57±0.376.34±0.362.67±0.148.04±0.45
从上述结果可以看出AMO-miR-21与AMO-miR-181a可以有效促进白血病细胞K562的凋亡，从而抑制白血病细胞的生长。
实施例3实时定量PCR技术检测AMO作用肿瘤细胞后microRNA的水平
一实验材料
1主要试剂
LipofectamineTM2000               Invitrogen公司              美国
antisense microRNAs               上海生工生物工程有限公司        中国
羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)               Gibco公司                   美国
RPMI-1640培养基粉                     Gibco公司                   美国
RPMI-1640液体培养基                   展晨生物公司                中国
新生牛血清                        杭州四季青生物工程公司          中国
青霉素、链霉素                     华北制药公司               中国
胰酶(Trypsin)                      Sigma公司                  美国
台盼蓝(Typan Blue)                 Sigma公司                  美国
1000μL，200μL，10μL Tips        Axygen公司                 美国
1.5mL，0.2mLEP管                   Axygen公司                 美国
实时定量PCR管                      Sigma公司                  美国
DEPC                               Sigma公司                  美国
Trizol                             Invitrogen公司             美国
MMLV逆转录酶                       Promega公司                美国
Rnase Inhibitornb                  Promega公司                美国
dNTP(10mM)                         Takara公司                 日本
RNase-free H2O                 Takara公司                 日本
Hairpin-itTMmiRNAsReal-Time   上海吉玛制药技术有限公司    中国
PCR Quantitation Kit
2试剂配制
2.1LipofectamineTM2000：4℃保存。
2.2Antisense-microRNAs-oligonucleotides(AMO)：
AMO序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，全硫代修饰，PAGE纯化，于-20℃保存。用无血清的RPMI-1640培养基溶解配制成100μmol/L储存溶液，置-20℃备用，用时稀释成所需的使用浓度。
2.3含酚红RPMI-1640培养基：
RPMI-1640干粉(10.4g/包)，用三蒸水溶解，加入碳酸氢钠2.0g，HEPES5.0g，磁力搅拌仪充分搅拌，定容至1000mL，过滤除菌，分装，4℃保存。
2.4RPMI-1640液体培养基：过滤除菌，分装。
2.50.2％台盼蓝工作液：
称取0.2g台盼蓝粉末，用100mL PBS(pH7.2)溶解。
2.60.25％胰酶-0.02％EDTA混合消化液：
称取0.5g胰酶于烧杯中，用100mL D-Hanks液溶解，称取EDTA 0.04g于烧杯中，用100mL D-Hank’s液溶解，将溶解的胰酶-EDTA液体等体积混合。在超净台内用0.20μm滤器过滤除菌，分装至小瓶，-20℃冻存。
2.7Hairpin-itTMmiRNAs Real-Time PCR Quantitation Kit-20℃保存。
3主要仪器
3.1DL-2型台式低速离心机(北京医用离心机厂)
3.2CO2培养箱(Thermo Forma，美国)
3.3超净工作台(苏州净化设备厂)
3.4微量加样器(0.5-10μL，1-20μL，10-100μL，50-200μL，200-1000μL，Eppendorf，德国)
3.5DS-1B倒置显微镜(重庆光学仪器厂)
3.6Neubauer Improved细胞计数板(Carl Roth GmbH&Co.KG，德国)
3.7实时定量PCR扩增仪(Bio-rad公司，美国)
3.8紫外分析仪(UVPupland，美国)
3.9超低温冰箱(Forma702，美国)
二实验方法
1实时定量PCR检测方法(Hairpin-itTM miRNAs Real-Time PCRQuantitation Kit)：
实验选用针对miR-21设计的实时定量PCR检测试剂盒，该试剂盒能够高度特异地检测miR-21在肿瘤细胞中的表达水平。Hairpin-itTM miRNAs qPCRQuatitation Assay包括两步：①Stem-loop RT②Real-time PCR。在Stem-loop RT这一步中，Stem-loop RT primer与miRNA分子的3′端结合，然后用逆转录酶将RNA逆转录成cDNA。Stem-loop RT primer是针对miR-21特殊设计的具有茎环结构的RT引物，由于设计的专一性，它只与miR-21结合而不与其他miRNA结合，保证了检测的高特异性。而且这种茎环状结构的RT引物只与成熟的miRNA结合，消除了miRNA前体的非特异性扩增。得到的RT产物与miR-21特异引物以及荧光标记的探针一起进行优化的Real-time PCR反应，根据标准曲线可以定量分析PCR反应中模板的拷贝数，从而反应miR-21的表达水平。
2细胞培养：
白血病细胞K562用含10％新生牛血清的RPMI-1640培养基于37℃、体积分数为5％CO2培养箱，饱和湿度条件下培养，0.25％的胰酶常规消化传代，2-3天传代一次。实验选用对数生长期、0.2％台盼蓝拒染率＞95％的细胞接种于培养板，加入LipofectamineTM2000-AMO反义核酸，每组药物均设3个复孔。
3 LipofectamineTM2000与AMO复合物的配制：
LipofectamineTM2000与AMO按质量比为2.5∶1配制，即取所需AMO量，计算所需LipofectamineTM2000的量，分别用无血清培养液配制，将LipofectamineTM2000缓慢加入AMO中，充分混匀，室温静置30min，即得LipofectamineTM2000-AMO复合物。
4实时定量PCR技术检测经AMO作用不同时间，白血病细胞K562中microRNA的水平：
①细胞培养：取对数生长期白血病细胞K562，用无血清RPMI-1640培养基调整细胞浓度为1.2×105cells/mL，接种于24孔培养板，各组均设六复孔。24h后细胞贴壁达50％-70％时，吸尽培养液上清，更换无血清含AMO的RPMI-1640培养液，所有AMO复合物都是按质量比2.5∶1比例制备。每孔终体积500μL，置孵箱转染6h后，每孔加入500μL含20％血清RPMI-1640培养液继续培养。共设4组：AMO-miR-21组、AMO-miR-181a组、随机对照组和空白对照组。LipofectamineTM2000与AMO的质量比为2.5∶1，每组AMO终浓度为0.6μmol/L，空白对照组加入与药物同体积的血清RPMI-1640培养基，脂质体对照组加入与药物同体积同浓度的LipofectamineTM2000。
②RNA提取：分别培养48h、72h收集细胞，预冷D-hank’s液洗涤2次后，用0.25％胰蛋白酶-EDTA消化收集细胞，将每组细胞悬液收集到同一离心管中。1000r/min，离心8min，PBS洗二次，同样条件离心，去上清，每管加入TRIzol 1mL，加入200μL氯仿，充分震荡，室温静止放置10min，12000/转离心10min，吸取80％上清于另一EP管中，加入500μL异丙醇，混合均匀，10000r/min离心6分钟，去上清，沉淀用1mL75％(v/v)乙醇洗涤后，10000r/min离心6分钟，去上清，沉淀于超净台内干燥3-5min，加入20-50μL RNase freeH2O。提取后的各组总RNA经紫外分析仪测吸光度并计算浓度后，调整成相同的浓度用来进行下一步的RT反应。提取的RNA均放入超低温冰箱保存。
③RT反应合成cDNA：按照Hairpin-itTM miRNAs Real-Time PCRQuantitation Kit提供的说明书进行操作，反应为25μL体系。5×buffer 5μL；dNTP Mixture(10mM)0.75μL；MIR-RT Primers(1μM) 1.25μL；RNasin(40U/μL)0.25μL；MMLV Reverse Transcriptase(200U/μL)0.5μL；RNA sample 2μL；RNase free H2O 15.25μL。反应参数：16℃ 30min→42℃ 30min→85℃ 5min。反应产物于-20℃保存。
④Real-Time PCR检测各组cDNA样品中miR-21，miR-181a的表达情况：
按照Hairpin-itTMmiRNAs Real-Time PCR Quantitation Kit提供的说明书进行操作，反应为20μL体系。2×Real-Time PCR Master Mix 10μL；mir specificPrimer set(5μM)0.8μL；microRNA RT product 2μL；Taq DNA polymerase(5U/μL)0.2μL；ddH2O0.7μL。PCR反应参数：
1.Incubate at 94℃ for 00:03:00
2.Incubate at 94℃ for 00:00:20
3.Incubate at 50℃ for 00:00:25
4.Plate Read
5.Incubate at 72℃ for OO:00:20
6.Goto line 2 for 45 more times
7.Incubate at 37℃ forever
5统计学分析：
所有数据采用均数±标准差
Figure S2007100328092D00121
表示，使用统计软件SPSS 11.5，各组均数比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，P＜0.05表示差异有统计学意义。
6实验结果
终浓度为0.6μmol/L的AMO作用于白血病细胞K562 48h和72h，将所得到的模板同一批反应进行实时定量PCR检测。miR-21的标准曲线如图10所示，标准品的CT值分别为8.30、13.00、17.07、20.98、25.36、28.57，相关系数为0.998，相关性很好。均以miR-21的标准曲线为参照，K562细胞中不同AMO组miR-21 CT值如表3所示。经统计学分析，与随机对照组相比较，AMO作用于白血病细胞K562 48h和72h时，miR-21在白血病细胞K562中的表达量有显著的统计学差异(P＜0.05)，K562细胞中不同AMO组miR-21分子相应的摩尔数参看表4。
表3AMO作用于白血病细胞K562不同时间miR-21的CT值比较
Table 3 Comparison on miR-21 CT value of Leukemia cells after treatment withAMO at different times points(
Figure S2007100328092D00131
，n＝3)
Figure S2007100328092D00132
*与随机对照组组比，*P＜0.05
表4AMO作用于白血病细胞K562不同时间miR-21分子摩尔数比较
Table 4 Comparison on miR-21 moles of Leukemia cells after treatment with AMOat different times points(
Figure S2007100328092D00133
，n＝3)
Figure S2007100328092D00134
*与随机对照组组比，*P＜0.05
从表3和表4的实验结果可以看出，AMO-miR-21和AMO-miR-181a能够显著抑制白血病细胞K562的生长。
SEQUENCE LISTING
<110>暨南大学
<120>一种具有抗白血病作用的miR-21反义寡核苷酸及其应用
<160>2
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>AMO-miR-21序列
<400>1
tcaacatca gtctgataag cta                                     22
<210>2
<211>23
<212>DNA
<213>AMO-miR-181a序列
<400>2
actcaccgacagcgttgaatgtt                                      23

Claims (5)

1.一种具有抗白血病作用的miR-21反义寡核苷酸，其特征是，包含如下所示碱基序列：5′-tcaacatcagtctgataagcta-3′。
2.根据权利要求1所述的一种具有抗白血病作用的miR-21反义寡核苷酸，其特征是，所述反义寡核苷酸经过化学修饰。
3.根据权利要求2所述的一种具有抗白血病作用的miR-21反义寡核苷酸，其特征是，所述的反义寡核酸经过硫代修饰。
4.根据权利要求2所述的一种具有抗白血病作用的miR-21反义寡核苷酸，其特征是，所述的反义寡核酸经过甲氧修饰。
5.权利要求1～4任意一项所述的具有抗白血病作用的miR-21反义寡核苷酸在制备治疗白血病药物中的应用。
CN2007100328092A 2007-12-26 2007-12-26 一种具有抗白血病作用的miR-21反义寡核苷酸及其应用 Active CN101215560B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2007100328092A CN101215560B (zh) 2007-12-26 2007-12-26 一种具有抗白血病作用的miR-21反义寡核苷酸及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2007100328092A CN101215560B (zh) 2007-12-26 2007-12-26 一种具有抗白血病作用的miR-21反义寡核苷酸及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101215560A true CN101215560A (zh) 2008-07-09
CN101215560B CN101215560B (zh) 2010-09-29

Family

ID=39622069

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2007100328092A Active CN101215560B (zh) 2007-12-26 2007-12-26 一种具有抗白血病作用的miR-21反义寡核苷酸及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN101215560B (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2187895A1 (en) * 2008-07-23 2010-05-26 National Cancer Center Composition containing microrna-21 inhibitor for enhancing radiation sensitivity
CN110747266A (zh) * 2018-07-23 2020-02-04 深圳先进技术研究院 miR-21和miR-21拮抗剂在抑制预防/治疗1型糖尿病中的应用
US10758619B2 (en) 2010-11-15 2020-09-01 The Ohio State University Controlled release mucoadhesive systems
CN113584166A (zh) * 2021-07-05 2021-11-02 暨南大学 miR-31-5p在急性髓系白血病中的应用

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2487260B1 (en) 2006-01-05 2015-07-08 The Ohio State University Research Foundation Microrna-based methods and compositions for the diagnosis and treatment of solid cancers
EP2173908B1 (en) 2007-08-03 2016-01-06 The Ohio State University Research Foundation Ultraconserved regions encoding ncrnas
CA2781547A1 (en) 2009-11-23 2011-05-26 The Ohio State University Materials and methods useful for affecting tumor cell growth, migration and invasion
AU2011326032B2 (en) * 2010-11-12 2016-10-06 The Ohio State University Research Foundation Materials and methods related to microRNA-21, mismatch repair, and colorectal cancer
CN104364390B (zh) 2011-10-14 2016-08-24 俄亥俄州立大学 与卵巢癌相关的方法和材料
JP2015501843A (ja) 2011-12-13 2015-01-19 オハイオ・ステイト・イノベーション・ファウンデーション ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａ、エキソソーム阻害、およびがん転移に関する方法および組成物
US8859202B2 (en) 2012-01-20 2014-10-14 The Ohio State University Breast cancer biomarker signatures for invasiveness and prognosis

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2187895A1 (en) * 2008-07-23 2010-05-26 National Cancer Center Composition containing microrna-21 inhibitor for enhancing radiation sensitivity
EP2187895A4 (en) * 2008-07-23 2014-10-01 Nat Cancer Ct COMPOSITION COMPRISING A MICROARN-21 INHIBITOR FOR AMPLIFYING RADIATION SENSITIVITY
US10758619B2 (en) 2010-11-15 2020-09-01 The Ohio State University Controlled release mucoadhesive systems
US11679157B2 (en) 2010-11-15 2023-06-20 The Ohio State University Controlled release mucoadhesive systems
CN110747266A (zh) * 2018-07-23 2020-02-04 深圳先进技术研究院 miR-21和miR-21拮抗剂在抑制预防/治疗1型糖尿病中的应用
CN113584166A (zh) * 2021-07-05 2021-11-02 暨南大学 miR-31-5p在急性髓系白血病中的应用
CN113584166B (zh) * 2021-07-05 2024-03-26 暨南大学 miR-31-5p在急性髓系白血病中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN101215560B (zh) 2010-09-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101215560B (zh) 一种具有抗白血病作用的miR-21反义寡核苷酸及其应用
CN111500734B (zh) 一种肝癌诊断标志物及其应用
WO2008029790A1 (fr) Nouvel acide nucléique
CN104498521A (zh) 黄瓜绿斑驳花叶病毒的侵染性克隆载体和农杆菌菌株及其制备方法和应用
CN114432452B (zh) 一种抗食管鳞状细胞癌的药物
CN103361346A (zh) 胡杨microRNAs前体的克隆与分析方法
CN110894488A (zh) 全反式维甲酸在间充质干细胞分化调节中的应用
CN101215561B (zh) 一种具有抗白血病作用的miR-181a反义寡核苷酸及其应用
CN101457224A (zh) miR-21反义寡聚核苷酸及其应用
CN101418293A (zh) 微小rna-21的反义寡聚核苷酸及其应用
CN102031256B (zh) 人miR-485-5p反义核酸及其应用
CN102181482A (zh) 一种快速调控水稻内源miRNA活性的方法
CN106676110A (zh) 一种与卵巢癌和子宫内膜癌相关的长链非编码RNA ABHD11‑AS1的siRNA和应用
CN102586237B (zh) 一种多聚核酸分子及其应用
CN100532390C (zh) 缺氧诱导因子1反义寡核苷酸及其用途
CN111411155B (zh) lncRNA IGFL2-AS1作为结肠癌诊断标志物的应用
CN104946654A (zh) 抑制鸭MSTN基因表达的shRNA序列及其应用
CN111808861B (zh) 一种lncRNA在氧化应激引起的脐血间充质干细胞凋亡中的应用
CN102657878A (zh) Ints6基因小激活rna在制备抗前列腺癌药物中的应用
CN102899352B (zh) 一种利用反义寡核苷酸沉默拟南芥内源miRNA的方法
CN102031254B (zh) 人miR-150反义核酸及其应用
CN102031255B (zh) 人miR-223反义核酸及其应用
CN112941183B (zh) 非编码基因miR-187-5p在原发性肝癌诊疗中的应用
CN108220303A (zh) 大豆bi-1基因及应用
CN101787368B (zh) 抑制人Z38基因表达的siRNA及其在制备抗乳腺肿瘤药物中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20180117

Address after: 510515 A12 street, 28 A12 street, Baiyun District, Guangzhou, Guangdong Province, room 19

Patentee after: Guangzhou Panyang biological research Co., Ltd.

Address before: 510632 West Whampoa Road, Guangdong, Guangzhou, No. 601

Patentee before: Jinan University

TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20180528

Address after: 510000 201, 2 floor, 35 Huajing Road, 105 Zhongshan Avenue, Guangzhou, Guangdong, Tianhe District.

Patentee after: Guangzhou Disheng Biological Medicine Technology Co Ltd

Address before: 510515 self compiled 19 rooms at A12 street, 28 Tonghe Middle Road, Baiyun District, Guangzhou, Guangdong.

Patentee before: Guangzhou Panyang biological research Co., Ltd.