CN101214200A - 皮肤外用液态和固态类肉毒素（六胜肽）复合纳米乳及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种皮肤外用液态和固态类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳及其制备方法。液态类纳米乳各原料重量配比是：肉豆蔻酸异丙酯10克、维生素E 2克、蛋黄卵磷脂0.8克、人参皂苷0.2克、红景天素0.01克、六胜肽0.005克、超氧化物歧化酶0.001克、还原型谷胱甘肽0.5克、胎牛血清5克、透明质酸0.05克、神经酰胺0.05克、蒸馏水40克、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯36克、聚甘油脂肪酸酯12克；固态类纳米乳各原料重量配比是：肉豆蔻酸异丙酯10克、维生素E2克、蛋黄卵磷脂0.8克、人参皂苷0.2克、红景天素0.01克、六胜肽0.005克、超氧化物歧化酶0.001克、还原型谷胱甘肽0.5克、胎牛血清5克、透明质酸0.05克、神经酰胺0.05克、蒸馏水40克、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯36克、聚甘油脂肪酸酯12克、甘露醇22克、甘氨酸3克。

Description

皮肤外用液态和固态类肉毒素（六胜肽）复合纳米乳及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物类皮肤美容保健制剂产品和技术，特别指可用于延缓皮肤衰老和美容抗皱的一种皮肤外用液态和固态类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳及其制备方法。

背景技术

关于皮肤皱纹的背景技术：

皮肤位于人体的表面，一般由表皮、真皮和皮下脂肪组织所组成，它是人体最大的器官，担负着重要的生理学功能。皮肤不仅具有十分重要的屏障作用和防御功能，而且还具有诸多的生理作用和代谢功能。然而，随着岁月的流逝、年龄的增长，人皮肤与其他组织器官一样，也逐渐开始出现衰老，皮肤衰老是不可改变的自然规律。皮肤衰老最直观、最主要的表现之一就是皱纹。甚至有学者认为，皱纹是肉眼观察皮肤老化最重要的标志之一。

皱纹是内因性和外因性皮肤老化最明显，最重要的特征，也是整体机能老化最直观，最易观察的外部征象和指标。人的皱纹一般从20岁左右开始出现，并随着年龄的增长而逐渐增多和加深，并进行性加重。有人观察认为，人体的皱纹从前额部开始出现，与此同时在外侧眼角部出现扇形展开的皱纹，接着围绕眼睑周围出现鱼尾纹和放射纹。由口至腭部皱纹深沟是45岁以后发展起来的，并不断向口的周围延伸。以后甚至向耳根部，颈部和全身发展。也有学者认为，皱纹主要由皮肤生理性老化或自然老化和光照老化等原因共同产生。自然老化在皮纹加深的同时，伴有皮肤变薄和弹性丧失，累及全身皮肤，光老化导致的皱纹是由于紫外线(UV)损害，在光暴露部位的皮肤常伴有皮肤干燥、粗糙、皮沟加深，皮嵴隆起，出现皮革样外观，伴毛细血管扩张，外观灰暗，无光泽，色素异常，甚至癌变等。

关于皱纹的分级，临床皮肤和医学美容界，曾有人将皮肤皱纹分为轻、中、重、严重四个等级，即I级为轻度皱纹，在面部表情静止时不易察觉，只有在面部作表情运动时才能隐约可见；II级为中度皱纹，在面部表情静止时隐约可见，而在面部作表情运动明显可见；III级为重度皱纹，在面部表情静止时皱纹就明显可见，但在用力伸展皱纹时可见皱纹明显减轻；IV级为严重皱纹，即使加力伸展皱纹时皱纹仍然清晰可见。当然，也有人将皱纹分为三个等级或按照皱纹的部位，多少，长短和深浅进行积分分级。

关于皱纹的分类，目前学术界倾向于将面部的皱纹分为三大类，即体位性皱纹、动力性皱纹和重力性皱纹。体位性皱纹大都是颈阔肌长期伸缩的结果，主要出现在颈部。体位性皱纹的出现并非都是皮肤老化，但随着增龄，横纹变得越来越深，而出现皮肤老化性皱纹；动力性皱纹是表情肌长期收缩的结果，主要出现在额肌的抬眉纹、皱眉肌的眉间纹、眼轮匝肌的鱼尾纹、口轮匝肌的口角纹和唇部竖纹、颧大肌和上唇方肌的颊部斜纹等；重力性皱纹主要是由于皮下组织脂肪、肌肉和骨骼萎缩、皮肤老化后，加上地球引力及重力的长期作用逐渐产生的。不过，也有人按照皱纹形成的病因分为生理性皱纹、病理性皱纹和光照性皱纹及老化性皱纹。

总体上讲，皮肤皱纹的产生是一个复杂的生物学过程及该过程产生在外部的特征性现象，与多种因素有关，包括真表皮连接变薄，层粘连蛋白-5减少，皮肤胶原，氨基葡聚糖及皮下脂肪的丢失，重力及肌肉、关节的运动也起了重要作用，还与激素、种族、遗传、氧化、压力及系统性疾病、空气污染、温度、吸烟、酒精有一定关系。

具体地说，皮肤皱纹的产生主要是因为：①水分丢失增多：随着增龄，表皮与真皮结构处变平，表皮变薄，表面积增大，使皮肤水分挥发加快，丢失增多，导致皮肤组织细胞皱缩和老化，出现组织形态学改变，而使皮肤出现细小皱纹；②皮肤角质层中水分含量减少：随着年龄的增长，天然保湿因子含量减少，使皮肤水合能力下降，由于水合能力降低，皮肤难以保持正常水分，而使皮肤逐渐出现细小皱纹，随着皱纹的进一步增多和加深，使皮肤表面积不断增加，水分丧失更加严重，此时皮肤干燥，皱纹加重。特别是皮肤水脂乳化物含量减少，使皮肤角质层中水分含量减少。皮肤水脂乳化物(HE)是由小汗腺分泌的汗液与皮脂腺分泌的皮脂在皮肤表面所形成的一层乳状膜，随着年龄增长，皮肤组织中的汗腺逐渐萎缩，数目减少，分泌功能也日趋下降，皮脂腺数目也明显减少，皮脂分泌下降导致皮肤角质层的HE含量也不断减少，其皮肤的滋润和保水功能降低，使皮肤干燥。随着HE减少，皮肤表皮相应失去其滋润和保水功能，特别是皮肤中和碱性物质的能力大为降低，使皮肤干燥程度增加，皮肤变粗变硬，出现明显粗糙；③表皮细胞更新速度减慢：随年龄的增长，表皮细胞的代谢能力减弱，更新速度开始减慢，新生细胞生成减少，角朊细胞增大，一些角朊细胞出现角化不全，表面轮廊不清，角质层屏障功能减弱，使皮下组织水分储备不足、皮肤干燥和皱纹增加；④表皮黑素细胞的改变：活化的黑素细胞的数目随年龄增加而减少，且其储备能力也在不断减少，使其光老化作用加强，真皮弹性纤维加快变性和破坏，使皱纹增多加深加重；而真皮胶原纤维和弹力纤维改变，决定了皮肤皱壁，松弛，萎缩，毛细血管扩张等老化外貌的发生和发展；⑤真皮胶原纤维的变性和合成减少是引起皮肤弹性和韧性下降及皱纹形成的重要原因之一，然而皮下组织中的脂肪组织的萎缩及功能改变在皱纹的形成和加重方面也起了重要作用。有报道认为，老年人的皮下脂肪组织减少，很大程度上是由于皮下脂肪组织萎缩的缘故。另外，由于老年人真皮纤维母细胞寿命缩短，分裂能力下降，致使老年期弹性蛋白的基因表达骤降，弹性蛋白基因表达下降，使功能性弹性纤维合成减少，加上真皮网状弹力纤维发生结构性变化，分裂能力下降，使功能性的弹性纤维合成减少，这些是形成皱纹的重要因素；⑥机体代谢废产物及毒素不断长期刺激积累，不仅加快了组织和细胞的损伤，而且导致真皮结构蛋白，结缔组织和酸性粘多糖的降解，促使皮肤进一步老化，皱纹加重；⑦紫外线辐射损害的慢性积累，造成暴露部位的皮肤老化。皱纹是皮肤光老化最明显的外在表现，是紫外线(UV)对皮肤直接或间接损伤的累积效应，在UV慢性辐射下，表皮首先受损，皮肤光滑度降低，皮肤纹理发生改变，继而胶原破坏，含量减少，皮肤失去正常支撑结构；同时，弹性纤维扭曲变性，功能丧失，皮肤失去弹性回缩力而松弛无弹性.皱纹不断加深；⑧主动或被动吸烟，低雌激素，生活压力，睡眠不足，皮肤不清洁，表情肌运动，地球引力也是皱纹形成的其中原因。有学者认为，主动或被动吸烟可引起维生素A水平及面部角质层水分减少，真皮中部及网状层弹性组织变性以及使外周血管收缩而致真皮局部缺血等，可能是香烟中的毒性成分参与了皮肤的老化及皱纹形成过程；女性比男性更明显，吸烟的数量(支/年)与皱纹和皮肤灰暗的程度直接相关。低雌激素因参与皮肤胶原减少过程从而促使皱纹产生。

关于皮肤皱纹防治的背景技术：

皱纹是皮肤在生命过程逐步形成和加重的，从某种意义上讲，皮肤的皱纹对人体健康和长寿并无大碍。然而，对于美容和人体外部形象却有着直接影响，因此，人们仍然希望了解皱纹的成因，以帮助解决皱纹出现的烦恼和问题。目前关于皮肤皱纹的防治主要从几个方面进行：第一是预防性措施；第二是合理化调理；第三是针对性治疗。

在皮肤皱纹预防性措施方面，目前主要通过：①平衡膳食：为保持肌肤的健美，延缓肌肤的衰老和皱纹产生，应坚持合理营养，平衡膳食，限制总热量和动物性脂肪及胆固醇和食盐的摄入，保持多样饮食，注意多食奶类、豆类、鱼类、蔬菜、水果及富含维生素A、B、C、E的食物。维生素A、E有抗氧化，抗辐射，抗角化功能，是抗皮肤衰老的良剂；B族维生素有抗氧化、积蓄骨胶原的作用；维生素C能帮助人体骨胶原的合成，修复创伤，防止老化，淡化色素等。②适量运动：科学锻炼，可使人体生命旺盛，促进人类健康长寿。长期有氧运动，可使线粒体产生适应变化，提高氧化磷酸化功能，从而延缓衰老过程中线粒体功能的退行性变化，还能降低胆固醇(TC)、高甘油三酯(TG)和血浆低密度脂蛋白胆固醇，增高血浆高密度脂蛋白胆固醇(HDL-G)。③良好心态：不良精神状态，也是引发皱纹的一方面，如忧虑，精神压力等不正常的生活环境，有的人心灵上的创伤，一夜间显得苍老许多，如皱纹的增加及白发等，因此要保持良好的心态，学会放松自己。④注意防晒：紫外线(UV)介导的光老化过程中，表皮损伤的发生先于真皮，表皮的角化过程受损，是早期皱纹形成的重要因素.外出时应避免日晒，如带草帽或遮阳伞，也可使用全波段防晒霜，既防UVB，又防UVA，防晒指数(SPE)15-30即可。

在皮肤皱纹的合理化调理方面，目前主要通过：

①采用中医中药疗法抗皱：中医理论认为，皮肤衰老以及整个机体衰老的直接原因是五脏虚损，气血失调。研究发现，许多中药含有各种氨基酸，维生素，微量元素，果酸，脂类多糖，生物碱，皂苷等，具有清除体内自由基，增强机体抗氧化能力，改善皮肤微循环，提高皮肤胶原纤维及胶原蛋白的含量，调节免疫功能等。应用中医临床辨证施治为基础，运用健脾补气血，温补肾阳，滋补肾阴，活血化瘀等法则治疗虚衰症，如补肾益精方(仙灵脾，何首乌，肉苁蓉，骨碎补等)；补肾复方(附子，肉桂，熟地，山茱萸，怀山药，仙灵脾，茯苓，炙甘草)等。自由基是衰老的重要启动因素，具有极强的氧化能力，可使生物膜中不饱和脂类发生过氧化，形成脂质过氧化物(LPO)，实验证明，多种中药具有一定的抗氧化能力，如黄芪多糖，阿魏酸，甘草次酸等，对羟自由基(.OH)以及超氧离子自由基均有较强的清除作用；红景天，人参能增强组织SOD活性，降低LPO，还有三七，丹参，肉苁蓉，枸杞，刺五加，菟丝子，巴戟天，淫阳藿等等，均具有养颜抗衰，除皱增白作用，中药延缓皮肤老化的作用是多方面的，相应的治疗措施也应是多样的。

②采用现代医学疗法抗皱：合理补充抗氧化剂，清除自由基，可预防和减缓皮肤衰老的发生或改善已发生的症状。抗氧化剂的品种很多，如维生素A，C，E，胡萝卜素，番茄红素，茶多酚，谷胱甘肽，辅酶Q10，N-三丁基枽翓苯基硝酮，褪黑素，二巯基乙醇，微量元素硒，锌等。

③外用保湿类护肤品：皮肤中的含水量是皮肤滋润，丰满，亮丽的关键，角质层中水分含量约为10％-15％，而其水分含量的减少在皱纹产生中具有重要意义。随着年龄的增长，角质层中的天然保湿因子含量减少，使皮肤水含性能下降，导致皮肤组织萎缩和老化，出现组织学的改变，表现为皮肤细小皱纹的产生。合理应用保湿剂，对保持皮肤的水分和恢复皮肤屏障功能有着重要作用。保湿剂种类很多，如丙二醇，1-3-丁二醇，尿素，吡咯烷酮羧酸钠，透明质酸，甲壳素及其衍生物，氨基酸类，芦荟，胶原蛋白，泛醇，霍霍巴油，矿物油，凡士林油脂类等。甘油也称丙三醇，是化妆品中最早且最常使用的保湿剂，具有特定的功效，是化妆品优质保湿剂，它通过促进糜蛋白酶样蛋白酶的活性固定角质细胞的桥粒结构，促进干性皮肤角质层桥粒降解，促进脱屑，还可防止角质层脂质在湿度低的情况下结晶保持层状结构，起到皮肤保湿作用；而丙二醇，1-3-丁二醇也是常用保湿剂，可作为助添剂也是一种促渗剂，有类似甘油的角质松解作用。丙二醇最大用量不要超过15％，否则会引起刺激反应。还有尿素，它是一种无色梭柱状结晶或白色结晶性粉末，水溶液显中性反应，具有抗菌，止痒，增加蛋白质的水合作用，提高角质层含水量，使皮肤柔软，润泽，其皮肤保湿推荐用10％左右。胶原蛋白亦称胶蛋白，是人体内含量最多的蛋白质，主要存在于皮肤，骨骼，软骨，牙齿，肌腱，韧带和血管中，是结缔组织重要的蛋白质，起着支撑器官、保护肌体的功能。它是由3个α螺旋肽链绞合而成的大分子(分子量约30万)在每个肽链上约含1200个氨基酸。由于其水解物多肽链中含有氨基、羧基和羟基等亲水基，对皮肤有较大的亲和力并具有很好的保湿作用，其性质温和，补充人体流失的胶原蛋白，氨基酸，保持皮肤水分，刺激皮肤微循环，促进其新陈代谢，使皮肤光滑，亮泽，减少皱纹等。透明质酸(HA)也称玻璃糖醛酸或玻尿酸，广泛存在于机体各组织中，在机体内通过粘弹性(大分子网状结构)及高度水合性等物理学功能以及与受体作用的生理学功能来发挥其重要作用，是一种理想的天然保湿因子。将含HA的护肤品涂于皮肤时，可形成一层黏弹性水化膜，能润湿角质层，维持和加强角质层自身的吸水能力和屏障功能，促进皮肤对护肤品养份的吸收，防止皮肤干燥，使皮肤嫩滑，延缓和防止皮肤老化。氨基酸类中的三甲基甘氨酸(NMF-50)，是自然界中存在的天然分子，存在于水生贝类动物和植物的甜菜根，菠菜中。由于NMF-50具有很强结合氢原子的极性端分子，所以，它能与水和类似水的分子强烈结合，从而使它具有独特的理化性质。NMF-50是白色结晶状粉末或微球形，物理条件改变时，它很容易把水分子释放，让水分子可以被活细胞作用，涂擦于皮肤有良好的滋润清爽肤感(如丝绸般滑爽)和抗皱效果，还具有酸性缓冲功能和抗表面活性剂刺激等。霍霍巴油的主要成分是不饱和高级醇和脂肪酸，类似人类皮肤自身所产生的天然油分，有良好的稳定性，极易与皮肤融合，将其涂擦在皮肤上时，在皮肤上形成一层非常薄的无油膜，具有皮肤保湿和修复作用。实验结果表明，霍霍巴油可以将面部表层干纹在使用1h，4h和8h后有效减少到26％、18％、11％。外用含有霍霍巴油护肤品可以保持皮肤润滑8h以上，具有保湿和润滑皮肤的双重作用，给人以柔软而又不油腻的清爽感觉。

④外用抗氧化剂护肤品：随着年龄的增长，机体各器官保护机制下降，机体生理性损伤，引起的脂质过氧反应，即这些过多增强自由基能与多不饱和脂肪酸作用，形成过氧化脂质(LPO)及其衍生物丙二醛(MDA)，这些强氧化性物质又与磷脂、核酸及蛋白质反应，生成淀粉样不溶性化合物--脂褐素即老年斑(脂溢性角化病)，成为细胞老化的标志，因此抗氧化一直是防治皮肤老化的手段和方法。目前，常用的抗氧化剂包括酶类和非酶类，如超氧化物歧化酶(SOD)，木瓜巯基酶，辅酶Q10，金属硫蛋白(MT)，维生素E，C，A，谷胱甘肽，半胱氨酸，β-胡萝卜素，绿茶(茶多酚)等。超氧化物歧化酶(SOD)是一种重要的抗氧化酶，其皮肤抗衰老的重要作用已经得到广泛证实，它能够特异性清除超氧阴离子自由基。从人或哺乳动物血液或脏器、植物(刺梨和小白菜等)和微生物细胞中分离和纯化出，SOD注射10-30单位/克·体重，可降低紫外线对皮肤的光老化损伤，局部外用SOD能够降低皮肤中过氧化脂质(LPO)的含量。因此，能有效的防止自由基损伤，延缓皮肤衰老。SOD是带负电荷的可溶性酶，涂在皮肤表面很难使它较长时间保留在皮肤上，因此也难于在皮肤表面发挥良好的抗老化作用。利用基因工程技术中的基因连接、拼接、重组等技术重新合成或复制了一些SOD基因产品，如SOD复合酶及修饰SOD及其衍生物，这类高科技产品，含有高度生物活性的大分子和小分子氧自由基清除剂，在延缓皮肤老化和皱纹产生或加重方面有着更实际应用的价值和广阔前景。金属硫蛋白(MT)是一类低分子量，富含半胱氨酸及非金属离子的非酶蛋白质，分子量为6000-7000，富含活性巯基(-SH)，含60-63个氨基酸残基。MT在人体内参与各种代谢活动，它具有奇妙的生物学性性质，对有害的羟自由基有很强的清除作用，保护自由基引起的过氧化损伤，使丙二醛的生成明显减少，对成年人来说，外源性补充MT，能够清除体内自由基，防止脂质过氧化使细胞尤其是细胞膜中的不饱和脂肪酸得以保护，从而起到保护细胞膜的流动性，防止细胞衰老的作用，也能使丙二醛的产生减少，不仅可以使老化色素沉着减少，同时可以和人体内重金属络合，达到解毒、排毒作用，MT对各种不同金属的结合力不同，其结合力由强到弱的顺序为银(Ag)，汞(Hg)，镉(Ca)，铅(Pb)。有毒重金属与MT结合后，其毒性不能发挥。重金属毒性越强，MT的解毒作用也愈强。MT是一重要的抗氧化和清除自由基蛋白质，有减少皱纹产生或皱纹加重的作用。茶多酚为黄酮类化合物，它是茶叶的提取物，能清除活性氧自由基，对超氧阴离子与过氧化氢自由基清除率可达98％以上，其效果优于经典的天然抗氧化剂维生素E、C；用0.05％和0.1％浓度的茶多酚喂养家蝇，可使家蝇大脑的SOD活性升高，脂质过氧化降低，还能提高老大鼠体内谷胱甘过氧化酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)的活力，有抗过氧化质脂及延缓脂褐素生成作用。

而在皮肤皱纹的针对性治疗方面，目前主要通过：

①化学剥脱法，即用一定种类和剂量皮肤角质溶解剂或剥脱剂进行表皮或真皮浅层剥脱从而使皮肤皱纹消除或减轻。或利用各种酸或碱性化学物质使表皮腐蚀后再生的抗皱美容方法。化学剥脱法可根据其作用和治疗目的进行深浅不同的化学剥脱，维生素A酸(维甲酸)，α-羟基酸(AHA)使用较多。维生素A酸(RA)是一组化合物总称，包括与维生素A作用相似的所有天然和人工合成的化合物，维生素A酸分为三代，第一代为非芳香类(视黄醇，全反式维A酸)；第二代为单芳香类(阿维A酯，阿维A)；第三代为多芳香类(他扎罗汀，阿达帕林，芳维A胺乙酯)。维生素A酸(维甲酸)对皮肤老化的表皮粗糙和色素沉着及皱纹的形成均有明确作用。外用全反式维A酸能明显改善皮肤光老化的现象，消除或减少皱纹形成，减少或淡化色素沉着等，且组织学的改变也和临床的改善相对应，增加胶原的合成并减少紫外线诱导的胶原降解是其重要的作用机制，因此，外用全反式维A酸对皮肤光老化的形成还有预防作用，其外用浓度应从低浓度(如0.015％)开始，以后逐步过度到高浓度(0.05％-0.1％)，多采用霜剂型，可减少刺激，凝胶剂型适合于油性皮肤和潮湿环境，由于维A酸具有光敏性，最好在晚上使用，开始每天晚涂擦一次，等症状减轻后，改为每周23次，维持疗效；不良反应主要有皮肤干燥，脱屑、瘙痒，多于使用头一个月发生，以后逐渐耐受。它的不良反应发生主要看RA的种类、浓度、基质的性质等。α-羟基酸(AHA)，包括甘醇酸、柠檬酸、乳酸等，即我们通常说的果酸，使用后可使角质层变薄，通过抑制转移酶与激酶干扰离子键，细胞桥粒形成，减弱角质细胞间黏附且诱导细胞脱落，促进细胞更新；在真皮，其增加粘多糖在基低层的沉积，促进新的胶原合成，来替代胶原与弹性纤维的降解。故认为α-羟基酸可以改善皱纹及恢复真皮弹性。水杨酸(BHA)，又称B柔肤果酸，为脂溶性，具有优秀去角质，清洁毛孔的能力。对皮肤刺激较果酸低，不但有缩小毛孔，去除细小皱纹，改善日晒引起的老化，还有淡化色素斑作用。

②激光除皱法及光子嫩肤法：激光除皱法应用于治疗皮肤老化皱纹也较原来有了新的进展，如高能超脉冲CO₂激光除皱技术的应用，能使老化皮肤在瞬间即逝，且能使老化的胶原再生，皮肤弹性恢复，皮肤较术前明显细嫩光滑。但由于这种方法仍然容易出现皮肤色素沉着，近年来又出现铒激光除皱技术，这种激光治疗效果更显著，更安全，且组织损伤更小，恢复更快，更好。最近几年又相继出现几种无创，无损，无副作用的脉冲染料激光和半导体激光及其该激光除皱嫩肤仪器，这类特定谱段的强脉冲激光能够穿透皮肤，并通过其产生潜热效应改善皮肤微循环，刺激真皮胶原蛋白的再生和弹性纤维的重新排列以及真皮细胞外基质分泌增加，使皮肤弹性，韧性逐步恢复，粗大毛孔缩小，细小或较轻度皱纹减轻或消失。

③水针及注射除皱法：水针及注射除皱技术也是改变皮肤老化皱纹的重要方法之一。由于这种方法不用开刀，出血少，痛苦小，不留疤，且操作简单，因此，目前很多美容机构和医学美容中心都在开展这些技术。可以说，注射消除皮肤老化皱纹，成为当今社会美容和对抗皮肤老化的热点，也有学者将其称之为软组织填充法。此法主要是在面部皱纹处注射填充一些软组织填充剂，通过软组织填充剂注射，可达到一定的抗皱效果。以往多采用液体硅胶、硅凝胶、水凝胶、生理盐水和植物油等。以后，又从国外引进聚丙烯酰胺凝胶，还又注射肉毒杆菌毒素、胶原蛋白、自体脂肪、Artecoll和Restylane等。最近，有专家将Artecoll中PMMA的表面制备成圆形光滑的微球，加入到一定浓度的胶原溶液中混合均匀，然后注射到皱纹部位；当机体吸收微粒体中的胶原蛋白后，PMMA会刺激皮肤产生新的胶原蛋白并逐渐取代注入的胶原；同时，PMMA还能起到支架的作用，可使自身纤维结缔组织增生并包裹PMMA微粒球，最终变为自体成分，既不会被机体吞噬细胞吞噬和消化吸收，也使PMMA对组织的刺激性和变态反应降低至最小，而且，看上去更显得光滑平整，达到永久性除皱的目的。据报道，在加拿大整形美容界常用它填充面部皱纹，包括额头纹、眼角纹、眉纹、口角纹等。Restylane是一种由合成透明质酸加工而成的软组织填充剂，为非动物源性物质。有报道，Restylane能够与人体皮肤组织自然融合，并能为营养物质提供有效的通道，注射用量很少，但除皱效果显著。在欧洲，Restylane用于皮肤除皱其保持时间是胶原蛋白的两倍。国外专家们预测，一旦Restylane获得美国FDA批准应用，将会出现一个注射Restylane除皱的高潮。

④机械磨削法：是一种手术性除皱法，通常在拟进行磨削术部位常规消毒，并同时进行浸润麻醉，后用水砂纸或牙台钻带动磨削砂轮，以1000-1500rpm/min的速度在面部严重皱纹处进行浅表性磨削，其深度一般为致创面出现密集点状出血为宜或磨削后出现白色平行线或隆线，表示已达到真皮乳头层。磨削后用纱布压迫止血，并取消毒凡士林纱布敷于患部加压包扎，或涂抗生素软膏防止创面感染，并使之自然干燥愈合。通过在皮肤皱纹出较表浅性的磨削，可刺激皮下胶原蛋白增生，新生皮肤再生，从而使面部严重皱纹得以消除或减轻。

⑤手术拉皱法：也被称之为面部皮肤提升术，或者也称为面部皮肤除皱术。随着年龄增长，皮肤本身老化，面部骨骼吸收或退缩，软组织萎缩，皮下组织减少或变性等，而使面部逐渐形成较为明显的皱纹。但由于整个面部的皮肤面积并未明显缩小，因此，皮肤显得多余而松弛形成皱纹。如果将多余的皮肤切除，然后再通过手术缝合将皮肤拉紧就能消除皱纹。过去，一般在发际线后侧切开皮肤，用钝器将皮肤剥离，向上和向两侧拉紧皮肤，再将多余皮肤切除即能将皱纹消除。

对于面部除皱方式的选择，在进行上面部除皱时，通常在内窥镜下或非内窥镜下通过小切口额部悬吊进行，只对额部皱纹严重者采用传统的冠状切口手术。颈部采用頦部脂肪抽吸、颈阔肌折叠等术式。颌下脂肪和頦下脂肪量多者，用细管进行抽吸；对皮肤衰老以中面部为主、颈部变化不明显的中老年患者，用减少瘢痕除皱方式，缩短切口至耳垂部位，对颈部衰老明显患者仍以传统的手术切口延长到乳突发际。

⑥手术重塑皮肤结构抗皱法：进行手术重塑皮肤结构抗皱前标记受术者外眦皱纹范围，对明显粗大的鱼尾纹重点作出标记，根据受术者选择重睑术，上睑松垂皮肤切除成形，下睑眼袋整形术。在完成皮肤缝合前，从已切开的上睑或者下睑外眦部皮肤切口，用眼科剪紧贴真皮下锐性剥离，潜性分离至已表记的外眦皱纹范围，将镰刀状手术刀伸入皮下创口，纵横网状切割真皮，切割深度达真皮乳头层，以不刺破表皮基底层为度，切割密度约1mm左右.对已标记的较粗大明显的鱼尾纹作重点切割。操作时皮肤切口要避免过度牵拉以及切割损伤，切割真皮注意用力及间隔尽量均匀一致，压迫止血，缝合皮肤，剥离创面加压包扎。外眦鱼尾纹属而部动力性皱纹，随着皮肤衰老，真皮变薄，弹性纤维，胶原纤维数量减少及断裂，使皱纹加深增粗，出现不可逆改变。30岁以下外眦鱼尾纹主要在面部肌肉活动时明显，认为皱纹发生主要是眼轮匝肌收缩所致；31-40岁受术者皱纹在肌肉静止时明显，面肌肉活动时更加深粗，认为这与肌肉收缩有关外，还与皮肤衰老有密切关系；40岁以上受术者皱纹静止时也粗深，一般伴有外眦角下垂，认为主要与皮肤衰老、真皮弹性胶原纤维减少断裂有关。真皮切割除皱基础为切割后真皮创面刺激弹性、胶原纤维以及其它细胞外基质增生合成，修复变薄断裂的真皮组织，使纤维重新排列而重塑皮肤结构。另外，真皮切割和切断一部分神经纤维减少了肌肉动力作用，但真皮切割除皱术操作技巧很重要，外眦皮肤剥离时，应紧贴真皮下进行，纵横切割真皮时应正确掌握深度及密度，对皱纹明显的位置应重点切割，如因术中及术后压迫止血不够，则可能形成轻度血肿；如因切口过度牵拉，则可能形成轻度瘫痕。特别是由于面部血运丰富，剥离真皮时有较多毛细血管渗血，术中应注意对剥离区域的压迫止血，确认无渗血后再缝合切口，且术后对除皱区域应加压包扎以避免渗血或血肿形成而影响愈后及恢复延迟，切割真皮时应避免对切口过度牵拉及损伤。真皮切割法除皱术或者说手术重塑皮肤结构抗皱法，对于四十岁以下受术者鱼尾纹消除满意，除皱术后皮肤柔软、平整、年青化改善明显。对于40岁以上受术者虽外眦皱纹较术前减少，但效果不甚满意，表明真皮切割法除皱术更适用于40岁以下中细皱纹去除。克服了磨削、化学学及注射等方法的许多不足点。

关于肉毒素的背景技术：

肉毒毒素(Botulinum toxin，BTX)是由厌氧性的革兰氏阳性(G⁺)芽胞肉毒梭状杆菌在生长繁殖过程中所产生的一种细菌外毒素，它具有极其强烈的毒性，通常0.05μg即可使人致死。因此，肉毒毒素是所有细菌毒素中毒性作用最强的毒素之一。按其抗原性的不同，它可分为A、B、C、D、E、F、G七种类型，其中A、B、E、F四种类型能引起或诱发人类中毒，而C、D、G三种类型尚未发现引起或诱发人类中毒的正式报道。虽然，各型肉毒毒素的抗原性和免疫性及其毒性作用机制不同，但其分子结构基本一致，都是由重链(H)和轻链(L)构成，而两者主要通过二硫键结合，但可以被蛋白酶裂解。肉毒毒素也是一类大分子蛋白复合物，其相对分子质量为15万道尔顿，其中，重链(H)相对分子质量为10万道尔顿，轻链(L)为5万道尔顿，各型肉毒毒素具有此相近的相对分子质量。重链(H)的羧基端与靶细胞受体具有高度特异性结合位点，重链(H)的氨基端则相关于细胞内吞转运活动：另一条轻链(L)，实质上是锌肽链的内切酶，为肉毒毒素的活性成分。

肉毒毒素溶液为无色、无臭、无味，如果温度在40℃以上、特别是在碱性环境中，肉毒毒素很容易发生热变性而失去其毒性作用。而且，在空气液体界面形成的气泡，也能够使肉毒毒素的伸展和形态结构发生变化，从而使其失去部分毒性。同时，过低浓度的稀释也可使肉毒毒素的稳定性降低，但加入PH≤6.8其它蛋白(如明胶、血清白蛋白等)缓冲液稀释可以防止这一效应。因此，肉毒毒素产品通常是以一种复合制剂的形式保存和运输。

过去，一直视肉毒毒素为剧烈、甚至是致命的细菌毒素。但随着上世纪70年代美国旧金山眼科研究所从肉毒毒素中毒患者最早出现眼症状、后缓慢恢复中得到的启示，大胆将肉毒毒素应用于斜视、眼睑痉挛等眼科疾病的治疗。在此基础上，临床上又逐步将肉毒毒素的应用扩展到面部肌肉痉挛、痉挛性斜颈及肢体肌张力障碍等症状的治疗，而且都取得了良好的效果。

事实上，早在1817年Justinus Kemer就首先发现在某些食物中携带的毒素能够导致骨骼肌和副交感神经功能麻痹；1897年就有学者从肉毒中毒患者尸体中分离出肉毒毒素；1920年有学者试图提取肉毒毒素。1946年Scott提取了纯肉毒毒素，1950年就有学者采用肉毒毒素治疗肌肉过度收缩。1973年Scott用猴眼肌作动物试验，证明肉毒毒素可导致肌肉无力。1979年美国眼力健(Allergan)公司正式生产肉毒毒素，其药名为保妥适(Botox)，1980年Scott用肉毒毒素治疗斜视和眼睑痉挛。1987年Carruthers等用肉毒毒素治疗眼部疾病患者，1989年12月美国FDA正式批准A型肉毒毒素作为临床合法治疗药物，也是国际上第一个将A型肉毒毒素用于临床治疗的国家，也是第一个细菌毒素被允许用于临床治疗。而英国生产的肉毒毒素的商品名为迪斯波特(Dysport)；1993年中国研制出肉毒毒素产品，其商品名为肉毒毒素(BTXA)；1997年2月中国卫生部也正式批准A型肉毒毒素作为临床合法治疗药物，这是继美英两国之后第三个能合法生产和应用A型肉毒毒素的国家。2001年加拿人批准可将肉毒毒素用于美容，2002年4月美国FDA也正式批准肉毒毒素应用于美容领域，之后，英国和法国等国家亦先后批准肉毒毒素用于美容。

目前，肉毒毒素中的A型肉毒毒素(BTXA)毒力最强，被研究也最多，很多基础和临床应用及其机制均较为清楚，其主要作用机制是：①神经毒素H链的羧基端受体识别位点与胆碱能神经末梢质膜上受体特异性结合；②在受体介导下，经能量依赖性细胞内吞作用完成神经毒素跨膜转运形成胞内体；③酸性环境的胞内体，神经毒素经一系列蛋白分解活动，形成L链一锌肽链内切酶并释放进入神经细胞胞质，裂解突触相关膜蛋白或突触融合蛋白，从而抑制了乙酰胆碱以囊泡为单位的“倾囊”式突触间隙释放，即所谓量子式释放。而肌肉化学性去神经支配效应则是肉毒毒素作用的最主要临床效应，即是乙酰胆碱突触间隙量子式释放抑制，从而阻断了有效性神经-肌接头的兴奋传递，致使肌肉失神经支配，临床则表现为肌肉弛缓性瘫，即所谓的肌肉化学性去神经支配。具体地说，A型肉毒毒素特异性地作用在运动神经终板的突触前膜，通过作用于胆碱运动神经末梢，阻断乙酰胆碱释放到突触间隙中，导致受累的神经不能刺激肌纤维支配肌肉的收缩，因而肌张力减低，肌痉挛缓解。它不阻断神经兴奋的传播，神经和肌肉都没有兴奋性和传导性的损害，这种作用也称为化学去神经作用。肉毒毒素的麻痹效果在注射后1-7天出现，7-14天达到高峰，持续12-24周不等，随时间推移，其作用逐渐减弱或消失。

A型肉毒毒素是一种神经毒素，也是一种肌肉松弛剂。正是应用A型肉毒毒素的作用特点，国内外已将肉毒毒素用于涉及眼科、神经科、康复科、消化科及皮肤科(多汗症、美容)等多个学科领域超过五十多种病症的治疗，包括用于斜视、眼睑痉挛、口及面部肌肉痉挛、痉挛性斜颈、肢体痉挛和畸形、职业性肌张力障碍、半侧面肌肉痉挛、小儿脑瘫、小儿麻痹、多汗症等，并取得了较好的临床疗效。

目前，国际上用于制备A型肉毒毒素的菌株通常采用A型肉毒梭状杆菌Hall株，并通过含有胰酪-酵母透析液-葡萄糖的培养基培养，然后，再通过硫酸沉淀、磷酸盐缓冲液提取、核糖核酸酶处理、DEAE A50层析、超滤浓缩、冷冻干燥结晶等过程制备A型肉毒毒素。按照美国的鉴定标准，纯净的A型肉毒毒素为单一针状结晶，将它溶解于磷酸盐缓冲液后，在278nm处有最大的光吸收；且OD₂₆₀/OD₂₇₈之比≤0.6；其特异毒性或纯度为3X10⁷LD₅₀(小白鼠)±20％mgpr；在1cm比色光路中，1mg/ml的毒素具有1.65的消光系数。A型肉毒毒素的稳定性及有效期与保存温度密切相关。关于A型肉毒毒素(BTXA)的效价，各国制品略有差别。中国产品和美国的A型肉毒毒素产品效价基本一致，即中国和美国的1单位BOTOX等于英国4单位Dysport。

A型肉毒毒素产品为结晶型粉末状针剂，至少要保存在-4℃以下的环境中，在-20℃的环境中可长期保存，且使用和操作过程中尽可能保持低温环境，以减少肉毒毒素生物活性的损失。关于保存温度，有报道认为，A型肉毒毒素冻干制品在-20℃下保存，3年内其毒性效价可保持稳定不变。而在2-8℃条件下，A型肉毒毒素的冻干制品2年内保持稳定，效价不变。在25℃条件下一周内保持稳定，效价不变。说明制品稳定性、效期与保存温度有关。因此，有条件时最好将A型肉毒毒素的冻干制品保存在-20℃以下的低温冰箱最为理想；普通冰箱冷冻室内一般温度在-15℃左右，也基木能达到同样效果。由于A型肉毒毒素的冻干制品在25℃保存一周其效价仍较稳定，所以用干冰或冰皇等制冷剂包装、运输，在数天内不会影响制品质量。

A型肉毒毒素在注射前应根据需要用不含防腐剂的注射生理盐水进行稀释才能使用。而关于A型肉毒毒素的冻干制品经稀释后的应用浓度，应根据不同国家的BOTOX制剂分别对待。而肉毒毒素的实际用药剂量主要依据注射位点及病种不同而酌情给药，有条件的可在肌电图的引导下给药，并根据肌电图的反应调整给药的部位和剂量。应用中国的产品时，使用时，用生理盐水稀释至所需浓度。一般地说，采用现用现配的方法，用生理盐水2-4ml将A型肉毒毒素的冻干制品稀释至2.5-5.OU/0.1ml的浓度进行应用。稀释应用时，应注意掌握好温度。温度不能过低，更不能过高。因为，A型肉毒毒素的冻干制品在室温状态下的溶解最好，温度过低将影响它的溶解性；而温度过高，则影响它的生物活性及药用效价。另外，配制好的肉毒毒素溶液最好一次用完；实在用不完，可置28℃冰箱之中，但最多只能保持4个小时，即要求在4小时内全部用完；且在进行稀释配制肉毒毒素注射液的过程中，应将注射器针头贴在安瓶内壁缓慢推入生理盐水以使药物全部溶解，不可用力冲注、摇晃、振荡，应尽量减少抽吸次数及泡沫形成，而且，A型肉毒毒素的冻干制品切勿反复冻融，以减少因为时间和温度等相关因素对肉毒毒素空间结构及稳定性的影响，降低其生物活性，造成肉毒毒素药效降低，影响治疗效果，同时增加机体产生肉毒素A抗体的机会，进一步导致A型肉毒毒素效价降低及其生物学功能的发挥。而且，，对于之前注射过A型肉毒毒素的患者，再次进行治疗时维持的时间会比较长些，因为注射过的肌肉有姜缩。而且，A型肉毒毒素消除皱纹的效果还和皮肤本身的弹性和厚度有关，所以相对年轻的人注射后效果会好些，而皮肤越松弛，效果越差。

在应用A型肉毒毒素BOTOX注射前，应核实受术者有无肉毒毒素的适应症和禁忌症，在确定准确无误后才能进行肉毒素的注射治疗。另外，在应用A型肉毒毒素BOTOX注射时，需要熟练掌握A型肉毒毒素的特性，熟悉面部神经、肌肉的解剖和眼眶部的结构，注意产品的正确保存、适合的稀释浓度、准确的剂量和精确到位的注射对于保证除皱疗效非常重要。同时，清楚了解A型肉毒毒素BOTOX应用后可能会出现的副作用也非常必要。而且，要严格注意肉毒毒素注射部位的消毒，用75％的酒精消毒注射部位皮肤，须待消毒酒精完全挥发后再进行注射，以免影响操作和消毒酒精降低肉毒毒素的生物活性。

A型肉毒素本质为异体蛋白、且分子量较大，因此，具有一定的免疫原性。肉毒毒素制剂在冻干过程中或多或少有毒力的丧失，受术者实际上接受的是毒素和类毒素的混合注射，因而其抗原性比生物活性检测所指示的更强。用肉毒毒素免疫的人可产生特异的高水平的抗毒素，在部分接受肉毒毒素重复注射的受术者已检测到抗体。肉毒毒素抗体的形成的临床表现现是，对再次注射肉毒毒素的治疗效果明显减弱。而大剂量、频繁注射是产生肉毒毒素抗体的主要因素。

一般来讲，A型肉毒毒毒素治疗是安全的，它对人的半数致死量(LD₅₀)为40U/kg体重。而一次美容除皱疗法通常用量在20-25U，属于微小剂量，且A型肉毒毒毒素注射后，会选择性与高亲和性地结合在神经末稍，尚无多余毒素进入血液或脑脊液，故毒副作用不会很大。然而，如果注射A型肉毒毒素出现技术方面的问题，或者A型肉毒毒素向注射部位周围组织的扩散，也可引起此局部的不良反应；其常见副作用如下：①呼吸道的反应：A型肉毒毒素在进行颈部的肌肉或喉部的肌肉注射后，可能出现短暂的声嘶、误吸，吞咽障碍、呼吸阻塞感和呼吸困难等；②眼部的反应：A型肉毒毒素眼部注射后的不良反应主要有：眼睑下垂、局部水肿和瘀斑、上睑下垂、眼睑闭合不全、眼眶脂肪疝、畏光流泪、视力模糊、眉毛下垂、眼睑下外翻以及暴露性角膜炎等；③面部的反应：A型肉毒毒素面部注射后的副反应主要有：上唇下垂、鼻唇沟变浅、表情不自然、额部紧绷感、邻近部位皱纹加深等；④远隔部位肌肉的反应：局部注射治疗剂量的A型肉毒毒素后，在远隔部位肌肉也发现了广泛轻度的单纤维肌电图异常，主要表现为：颤抖值和肌纤维密度增加，说明A型肉毒毒素注射后可以引发远隔部位肌肉的反应等；⑤肌肉组织学改变：在小鼠的腿部肌肉内注射A型肉毒毒素后，解剖注射部位的肌肉，发现肌纤维萎缩，神经纤维发芽。神经发芽呈现复杂的分支排列，肌肉萎缩通常为6周或更长，然后在数周内增粗；⑥全身反应：A型肉毒毒素注射后可出现一些全身反应，主要表现为：发烧，全身不适，疲倦，乏力和感冒样症状等；除此之外，A型肉毒毒素注射还有一些主要的禁忌证，如重症肌无力，Lambert Eaton综合征等全身性肌无力性疾病，使用影响神经肌接头传递药物时，孕妇及哺乳期妇女，注射部位感染，有A型肉毒毒素中毒史等。

关于肉毒素用于皮肤美容除皱的背景技术：

随着肉毒毒素临床应用的不断发展，特别是1986年加拿大温哥华不列颠哥伦比亚大学眼科教授在用A型肉毒毒素治疗眼睑痉挛时意外发现它的皮肤除皱作用后，便开始与皮肤科合作，大胆在美容抗皱领域应用。开始，他们先将A型肉毒毒素应用于眉间纹治疗，以后，扩大到鱼尾纹、额头纹等部位皱纹的治疗，均取得了意想不到的效果。1997年有关A型肉毒毒素治疗皱纹的综述发表在权威性的杂志上，使A型肉毒毒素正式在美容除皱方面应用。

此后，A型肉毒毒素美容除皱方法便开始在加拿大、美国、欧洲共同体国家逐步得到推广应用，特别是美国一些好莱坞影星们在应用A型肉毒毒素美容除皱治疗后，其面部皱纹消除，显得面部更加年轻漂亮、美丽动人，便开始轰动一时，使A型肉毒毒素除皱在美国美容界风靡开来，并不断波及到东南亚、中国乃至全世界，并被有关专家誉为“二十一世纪医学美容除皱的主要方法”，也被称之为“生物美容除皱的主要方法”。

实际上，最初将A型肉毒毒素用于面部除皱，主要是用在面部的上1/3除皱，如抬头纹、眉间纹、鱼尾纹等，以后才逐步将它用于面部的中部和下部除皱，如鼻背部皱纹、口周皱纹及面中部动力性皱纹如过深的鼻唇沟纹等；最后，用于颈部和上胸部(包括乳房)的除皱，如颈阔肌索条状畸形等。现在除了除皱，还有用A型肉毒毒素治疗面部不对称、眉毛不对称、面瘫、下眼睑轮匝肌肥厚、软组织移位等。除了单独使用A型肉毒毒素，还将它配合其他的除皱方法应用，以增加疗效和持续时间，如作为内窥镜额部提紧术、激光除皱术前、软组织充填术中的辅助性治疗。

A型肉毒毒素除皱方法是将一定剂量的肉毒毒素注射到面部对应部位皮下肌肉组织。如治疗额头纹，可采用“V”字形进行肉毒毒素注射，同时在“V”字形中间再适当增加一些注射点。治疗女性眉间纹，通常将一定剂量的肉毒毒素注射液注射在眉间5个点；而治疗男性眉间纹，则在治疗女性眉间纹方法的基础上于左右眉上各加1个点，即7个点同时注射一定剂量的肉毒毒素注射液。在进行鱼尾纹治疗时，则分别将一定剂量的肉毒毒素注射液于两侧外眼角各放射状注射3个点。具体方法是：①注射应用液准备：将每瓶50U或55U或100U的A型肉毒毒素从-20℃冰箱内取出，临用时，立即用注射生理盐水稀释成2.5U/ml，分装于1ml皮试注射器内，然后用4.5号针头注射。用注射生理盐水稀释后的A型肉毒毒素要求于4h内用完，且使用过的注射器及其相关物品一律销毁处理。②注射部位及剂量的选择：根据额纹及鱼尾纹数量多少及年龄大小确定。一般年龄偏小、皱纹少、皮肤柔软者，额纹注射3-4个点、鱼尾纹注射1-2个点，每点注射1.25U或2.5U。而年龄偏大、皱纹密集、皮肤僵硬者，可在额纹处注射5-6个点，鱼尾纹注射2-3个，每点至少注射2.5U，并于双侧皱眉肌内各注射2.5U。额纹注射位点距眉上缘2-3cm，鱼尾纹注射位点距外眦部1cm。③注射方法：令受术者仰卧，施术者坐于其头顶侧。将注射部位消毒后，右手持注射器，额纹从上向下、与皮肤成5°夹角进针深约5mm，根抓情况注射肉毒毒素0.05-0.1ml，即肉毒毒素用量1.25-2.5U。一般正中线一点两侧各对称性注射1-3点，两点相距1-2cm。或以中线为准等距离两侧各注射2-3个点。鱼尾纹注射方向是从内向外、与皮肤成5°夹角角度进针。以鱼尾纹的中线确定注射位点。一般为1-3点，剂量为0.05-0.1ml，即肉毒毒素用量1.25-2.5U。为防止过敏反应的发生，一般注射第1针后观察10-15min，若无反应，再继续进行后续注射。注射完毕后再观察30min方可离院。为防万一，治疗前应常规备用肾上腺素和肉毒毒素抗血清，以便抢救之用。④疗效判断：完全除皱，即注射肉毒毒素后额纹及鱼尾纹完全消失，皮肤饱满无痕迹，且持续3-6个月；部分除皱，即注射肉毒毒素后额纹及鱼尾纹明显变浅，但略有痕迹，持续3-6个月；除皱无效，即注射肉毒毒素后额纹及鱼尾纹等皱纹均无变化。

A型肉毒毒素在面部美容除皱方面的应用，目前主要是应用在治疗额纹、鱼尾纹、眉间纹。这是因为这几类皱纹在面部最明显处，且面部表情运动时更加清晰可见，并直接影响着人的美容，因此，急于处理干净。

额纹俗称抬头纹，位于眉和眉间的上方至邻近前额发际处，呈横向排列，为额肌收缩所致。额肌是前额的一块纵向大肌肉，起于帽状腱膜，止于眉和鼻根部皮肤，它的收缩可以产生抬头纹，同时额肌的下部有对抗眉毛下垂的作用。沟纹与肌纤维方向垂直，一般为3-6条，可分为正中组和外侧组。外侧组的产生乃因额肌直接收缩所致，中间组的产生则系两侧额纹共同牵拉正中皮肤的结果。注射位点的分布与额纹平行，且以前正中线为中心向两侧对称分布。注射的目标肌肉实际上是额肌肌腹。注射位点一般远离眉弓，以免出现双眼上睑上抬困难。

鱼尾纹呈粗细不等的条纹状，沿外眦部呈放射状排列，闭眼时因眼轮匝肌收缩致纹理更为明现。皱纹少者，选择中线为注射点，距外眦1cm左右；皱纹稍多，则可选中线上、下各1点为注射点；皱纹密集而多者，则可确定上、中、下三点为注射点，其目的使眼轮匝肌外眦部松弛。因为眼轮匝肌参与闭合眼睛的功能，环绕在睑板和眶膈前，它的对抗肌是提上睑肌，眼轮匝肌眶部的用力收缩可以引起外眦部放射状的皱纹一鱼尾纹。而且，颧肌和眶外侧眼轮匝肌的协同作用，在外眦部可加深鱼尾纹。眼轮匝肌外眦部松弛，则鱼尾纹可得到消除。

眉间纹也是肉毒毒素面部除皱首选的适应证。应注射皱眉肌、眼轮匝肌内侧缘和降眉肌。因为眼眶上内侧的部分肌纤维的功能可降低眉内侧部分，眶上外侧的眼轮匝肌收缩可降低眉外侧。皱眉肌起于眉弓内端，止于眉部皮肤，紧贴骨膜，在眼轮匝肌的下方，它向下内侧牵拉产生垂直方向的眉间纹。降眉肌是指眼轮匝肌眼眶部少数纤维，终止于眉，可向下牵拉眉头产生横行的鼻背部皱纹。降眉间肌起于鼻上皮肤，止于前额皮肤。女性眉采用5点注射，每点5个单位；男性水平型眉采用7个点注射，每点3-4个单位。如果肌肉块比较大，用量可以增加到每点5-7个单位。在A型肉毒毒素注射后，除了消除皱眉时产生的眉间纹，部分有前额紧张性头痛的患者在注射后头痛症状消失；此外由于内侧降眉肌麻痹，患者注射后内眉上抬，眉型改变。

与面部皮肤提紧除皱术、局部胶原注射术、激光除皱术、磨削术和化学剥脱术除皱等方法相比，A型肉毒毒素除皱美容具有简便易行、作用短、起效快、效果明显、非皮肤浸润性、无痛苦、副作用小、不需住院、无严重并发症和后遗症等优点。

A型肉毒毒素美容除皱虽然较其它针对性治疗方法有一定的优点，但A型肉毒毒素美容除皱的缺点也很突出，主要是：

①因为神经突触新芽形成和神经肌肉传导的重建，使A型肉毒毒素松驰肌肉的作用逐渐降低，从而会使治疗后的局部皱纹逐渐重现。因此，肉毒毒素除皱效果是暂时性的，除皱效果不能持久。通常，肉毒毒素除皱效果只能维持3-6个月时间，有些甚至只能维持1-2个月；而要维持除皱效果，则需要多次反复进行注射。一般情况下，按照每次注射肉毒毒素可维持3-6月除皱效果计算，则每年需注射2-3次。

②由于肉毒毒素属于浸润性美容治疗方法，具有一定的风险性，且多部位实施多点注射，较为痛苦，因此，A型肉毒毒素用于皮肤美容不是一般的美容行为(或行业行为)，而是一种医疗行为，且是高一级的医疗行为，不能在一般美容院可以进行的，一定要在从事医疗美容的单位进行，并由技术水平较高的医生操作，也就是使用单位和个人都要经资质认证，只有具备上述条件的单位和个人才能供药和用药。因此非一般美容院或普通美容师能合法应用，必须在具有国家卫生部批准的美容医疗单位和具有执业医师执照的专业医师才能组织实施。

③肉毒毒素是一类外源性异种蛋白，具有一定的免疫源性，反复注射或者大剂量注射肉毒毒素，机体有可能产生相应的抗肉毒毒素抗体。通常，注射肉毒毒素后约有3-10％产生了抗体，而一旦形成这种抗体，以后再次使用肉毒毒素用于美容除皱将会产生抗药性，从而影响治疗效果。大剂量、频繁注射是产生肉毒毒素抗体的主要因素，因此，只能采用适量注射和尽可能有较长时间间隔期注射，原则上注射间隔期不应短于3个月。

④局部注射A型肉毒毒素对额部除皱效果较为理想，其次为鱼尾纹、鼻背纹，但对于眉间纹的治疗效果较差。因为眉间纹由皱眉肌、降眉肌、眼轮肌内侧和额肌的下侧缘共同作用产生，且皱眉肌和降眉肌收缩力较大，位置较深，这给眉间注射A型肉毒毒素的位置准确性、合适的用量及合适用药浓度带来一定困难，从而会导致部分病例效果欠佳。因此，注射A型肉毒毒素后眉间纹效果相对较差；⑥注射A型肉毒毒素后眼袋明显增加，另外，鼻根较粗大患者眉间纹注射A型肉毒毒素后因皱眉肌及降眉肌松驰，可导致鼻根粗大，影响美观。

另外，A型肉毒毒素抗皱治疗的副作用也很糟糕，主要表现为：①部分人治疗部位出现前额绷紧感、沉重感、麻木感；②面肌无力，表情不自然、出现呆板现象；③双眼上睑活动不灵活；④眼睛畏光流泪；⑤少数出现鼻周围皱纹加深；⑥出现眉形改变或眉下垂；⑦上眼睑下垂、下眼睑外翻；⑧视力模糊或下降；⑨注射部位有轻度疼痛，局部出现水肿、红斑、淤斑；⑩暴露性角膜炎；而且，严重时，还可能出现复视、斜视、吞咽困难、心律失常、心脏病发作等不良反应。

特别是肉毒毒素引起的上睑下垂，是由于注射的肉毒毒素弥散，并通过眶膈膜使提上睑肌麻痹造成的。这与注射的手法关系密切，如果注射速度快，用力或过深(在骨膜周围)可以促进毒素扩散，易引起上睑下垂。上睑下垂通常在注射后710天出现；另BOTOX稀释体积过大时也易出现。同时，如多数的额头纹，则必须麻醉比较大范围的肌肉才能达到满意的效果，但额肌的下2.5-4cm部分参与眉毛的运动，如完全麻醉额肌会导致眉毛下垂，尤其是本身眉毛就比较低的人。甚至可使眉、眼睑下垂和表情失落等在眉外侧特别明显，严重的由于眉毛部位的软组织也下垂，甚至会挡住眼睛。鱼尾纹治疗不当，也可能使下眼皮松弛或眼袋突出，出现暂时性的外下眼睑下垂，如果肌肉麻痹的时间过长，可以导致角膜病变、眼干、浅表点状角膜角化，甚至角膜溃疡。在A型肉毒毒素进行鼻唇沟治疗时，在远离口角的颧大肌起始点，即下睑眼轮匝肌的下缘水平注射，不仅可以柔和鱼尾纹，且可以减轻鼻唇沟的皱折。但注射部位不是鼻唇沟上方的鼻翼侧，而是在颊正中注射，且注射后不当向下按摩可致提上唇肌麻痹，到致同侧唇下垂。

除此之外，A型肉毒毒素抗皱治疗还有严格的禁忌证，如下列情况之一的人就不适合用A型肉毒毒素注射治疗面部皱纹：①精神不稳定或有不现实目标的人；②孕妇或哺乳期妇女；③患有神经肌肉疾病的患者；④对毒素制品中任何成分(毒素、盐水、人血蛋白)过敏的人；⑤目前正在使用影响神经肌肉传导和毒素效果的药物治疗(如氨基糖甙类药物、青霉胺、奎宁和钙离子拮抗剂等)；⑥由于注射A型肉毒毒素后面部表情肌麻痹，表情会减少，一些需要靠面部表情的人如演员等也不适合注射；⑦年龄大、皮肤过度松弛，尤其是眼皮下坠的患者；⑧对于下眼皮过度松弛或眼袋突出的患者应该避免用A型肉毒毒素治疗鱼尾纹，以免下眼睑外翻或眼袋恶化。

关于胜肽的技术背景：

胜肽其化学本质就是肽(peptide)，民间也将其称之为小分子蛋白质。近年来，在美国等发达国家或地区，已有将胜肽添加到护肤品中已经很流行，因为它成分先进，效果显著，被很多药妆品牌使用。但是胜肽的价格很贵，所以添加了胜肽的产品也卖的比较贵。

胜肽实际上也是蛋白质的最小单位氨基酸的缩合物，生物化学上也称之为缩氨酸。按照胜肽中所含有氨基酸的数目不同可将其分为二胜肽(含两个氨基酸)，三胜肽(含三个氨基酸)，四胜肽(含四个氨基酸)，……，十胜肽(含十个氨基酸)，等等，依此类推。

在目前所发现或使用的胜肽中，按照美容化妆品的功效作用，可将它们的主要功效归纳为以下五个方面的功能：①面部神经传导抑制作用：抑制SNARE接受体的合成，抑制肌肤儿茶酚胺(catecholamine)和乙酰胆碱(acetylcholine)过度释放，局部阻断神经传递肌肉收缩讯息，影响皮肤神经传导，使脸部肌肉放松，达到平抚动态纹和静态纹及细纹的，与此有关的这类胜肽主要有六胜肽、五胜肽、七胜肽、八胜肽、二胜肽、十胜肽；②促进胶原蛋白，弹力纤维和透明质酸增生，提高肌肤的含水量，增加皮肤厚度以及减少细纹的作用，这类胜肽有五胜肽、六胜肽、寡胜肽；③抗羰化，保护胶原不会被活性羰基团损伤，促进III型胶原的生长，抗氧化，抗糖基化等作用，这类胜肽主要有二胜肽、三胜肽、铜胜肽；④抗水肿，改善微循环，加强血液循环，消除炎症等作用，这类胜肽主要有四胜肽；⑤阻断MSH(促黑激素)的传导，降低黑色素生成的作用，这类胜肽主要有九胜肽。

而目前与美容化妆品应用最为密切相关胜肽的主要有：

①六胜肽：据报道，最早是由南极湾冰河泥中所发现的菌种单胞绿脓菌所研发出的六胜肽，因其具有类似肉毒杆菌所分泌的肉毒毒素对肌肤神经传导的抑制作用，故也称之为类肉毒毒素。将六胜肽作为主要功效成分，并透过涂抹六胜肽，以胺基酸复合成类似肉毒毒素的结构，可阻断神经传递肌肉收缩讯息，影响皮肤肌肉神经传导，使脸部肌肉放松，达到平抚动态纹和静态纹及细纹的目的；并可预防儿茶酚胺过度释放所产生的皱纹，如肌肤脸部重复牵动所形成的皱纹。有效舒缓并抑制额头抬头纹、眼睛鱼尾细纹及皱纹周边肌肉的收缩与活动，帮助肌肉放松，使肌肤弹性组织回复柔顺平滑的线条，减少脸部细纹。六胜肽拥有肉毒毒素的效果，但没有注射用肉毒毒素的副作用。

②五胜肽：五胜肽具有促进真皮胶原蛋白合成，以及弹力纤维和透明质酸增生的作用，且还能提高皮肤组织的含水量，增加皮肤厚度及减少细纹的作用；同时增加一个长链脂肪酸还可以增加吸收效果。

③铜肽：被视为生长因子，刺激细胞生长，加速伤口修复，增加皮肤上皮组织再生；恢复肌肤年轻，皮肤细胞增殖，减少粗细皱纹，减少疤痕，改善肌肤弹性，增加角质细胞和纤维姆细胞增生，亦可让皮下组织增厚。同时，还具有刺激头发生长和减少落发，健全组织增加毛囊大小及阻止组织氧化伤害。

④四胜肽：四胜肽具有抗水肿，改善微循环，加强血液循环，消除炎症等作用，故在美容上可用于抑制眼部水肿和眼袋加重等作用。

⑤寡胜肽：寡胜肽也有一定的皮肤抗皱效果，且能丰唇和健胸等。

综上所述，上述任何一种皮肤抗皱方法均存在着这样或那样的问题：如采用预防性措施(包括平衡膳食、适量运动、保持良好心态等)，只能对皮肤皱纹的产生起到一定的预防性效果，而无法达到减轻或消除皮肤皱纹的效果。如采用合理化调理(包括中医中药疗法抗皱、现代医学疗法抗皱、外用保湿类护肤品等)，虽能在一定程度上改善或减轻皮肤皱纹，特别是对一些轻度皱纹确有一定帮助、且方式安全无痛苦，但对于一些中重度皱纹或一些运动性皱纹、光老化性皱纹等作用效果非常之慢、且疗效极其有限。如采用针对性治疗方法(化学剥脱法、激光除皱法、光子嫩肤法、水针及注射除皱法、机械磨削法、手术拉皱法、手术重塑皮肤结构抗皱法等)，虽对各种原因引起的皮肤老化或皱纹具有较好的效果，且时间短、见效快，但这些方法均为创伤性方法，且可不同程度造成皮肤及组织直接或间接破坏或损伤，不仅风险性大、后遗症多、而且痛苦较大、愈合时间长、费用较高。特别是诸如皮肤磨削术、化学剥脱术等治疗容易形成疤痕疙瘩、严重色素沉着或色素脱失。另外，磨削深度或化学剥脱程度很难掌握，稍微疏忽，将很难避免毁容情况发生，而造成受术者终身遗憾和痛苦。

与面部皮肤提紧除皱术、局部胶原注射术、激光除皱术、磨削术和化学剥脱术除皱等方法相比，A型肉毒毒素除皱美容虽具有简便易行、作用明确、起效快速、效果明显、浅皮肤浸润性、痛苦较小、不需住院、且无严重并发症和后遗症等优点。但采用A型肉毒毒素注射美容除皱的缺点也很突出，如A型肉毒毒素注射时间过久后，其松驰肌肉的作用会逐渐降低，从而会使治疗后的局部皱纹逐渐重现。而要维持美容除皱效果，则需要多次反复注射或多位点注射，但间隔期太短的反复多次注射，不仅较为痛苦，花费更多，且容易产生相对应的抗体抵消作用效果，而且，具有更大的风险性和毒副作用。

同时，A型肉毒毒素毕竟是一种生物毒素，注射用于皮肤美容，不是一般美容院可以合法进行的，而一定要在从事医疗美容的单位，且由技术水平高超的专业医护人员操作，使其应用具有明显的局限性。除此之外，局部注射A型肉毒毒素也可能使眼袋明显增加，另外，鼻根较粗大患者眉间纹注射A型肉毒毒素后因皱眉肌及降眉肌松驰，可导致鼻根粗大，影响美观。

尤其是注射A型肉毒毒素抗皱治疗的副作用也很糟糕，不仅注射后容易出现治疗部位的绷紧感、沉重感、麻木感及面肌无力、表情不自然、呆板等现象，而且，有时出现双眼上睑活动不灵活、眼睛畏光流泪、视力模糊或下降、出现眉形改变或眉下垂及上眼睑下垂、下眼睑外翻，甚至注射部位有时会出现疼痛、过敏、局部水肿、红斑、淤斑，严重时，还可能出现复视、斜视、吞咽困难等不良反应。

除此之外，A型肉毒毒素抗皱治疗还有严格的禁忌证，如一些精神不稳定的人、孕妇或哺乳期妇女、患有神经肌肉疾病的患者、对毒素制品中任何成分过敏的人、正在使用影响神经肌肉传导和毒素效果的药物治疗(如氨基糖甙类药物、青霉胺、奎宁和钙离子拮抗剂等)；⑥由于注射A型肉毒毒素后面部表情肌麻痹，表情会减少，一些需要靠面部表情的人如演员等也不适合注射；⑦年龄大、皮肤过度松弛，尤其是眼皮下坠的患者；⑧对于下眼皮过度松弛或眼袋突出的患者应该避免用A型肉毒毒素治疗鱼尾纹，以免下眼睑外翻或眼袋恶化。

特别是A型肉毒毒素在常温(自然条件下)、特别是它稀释成液体后非常不容易保存(必须在四小时内使用完毕)、储存期很短、且很快失去生物活性，制备成皮肤外用精华素更加不容易保存，即使置于冰箱中保存也是如此。而且，由于A型肉毒毒素分子量较大(大于15万道尔顿)，因此，很难在皮肤上外用，或者通过皮肤作用途径而发挥其优势作用；如果采用不科学的态度强行进行皮肤外用，或皮肤外用过程中不慎进入眼内将会产生更加严重的影响和后果。由此可见，采用A型肉毒毒素注射治疗进行除皱有一定的风险和很多的局限性，配制成皮肤外用制剂因难以吸收和保持肉毒毒素活性又无法发挥其应有的皮肤肌肉神经麻痹作用而实现其皮肤肌肉松弛和美容抗皱的功效。

虽然，胜肽种类和功效甚多，且已有不少欧美、日韩等发达国家及港澳台地区用于高档美容化妆品之中，特别是将六胜肽作为肉毒毒素替代品用于皮肤美容和抗皱，但在应用中仍然存在一些缺陷和问题，如胜肽(包括六胜肽)均为水溶性，虽然分子量很小，但仍很难透过皮肤发挥其应有的生物学效应，即使采用一些能够促进其透皮吸收的促渗透剂等协助，其作用仍无法达到理论上的效果，临床试验表现为抗皱反应较为缓慢，疗效仍不十分显著；而且，即使一部分人群有效，但由于仍是通过类似肉毒毒素对面部肌肉神经传递的抑制和面神经的麻痹作用所发挥的抗皱作用，因此，面部表情仍显得有些不自然和不协调，特别是单纯采用六胜肽这种类似肉毒毒素的神经麻痹作用，其抗皱效果仍只是对一些由于表情肌运动所产生的皱纹有效，而对生理性老化和光老化所致的皱纹无实质性的改观和疗效，而且，对那些由于表情肌运动所产生的皱纹的有效也只是十分短暂且可逆的，并不能从根本上解决皮肤皱纹问题。

发明内容

本发明的目的是针对背景技术中存在的缺点和问题加以改进、创新，提供一种使用简单、来源方便、价格便宜、安全可靠、疗效显著的皮肤外用液态和固态类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳及其制备方法。

本发明液态类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳是由下述重量份配比的原料制成：

肉豆蔻酸异丙酯5-15克、维生素E2-10克、蛋黄卵磷脂0.5-5.0克、人参皂苷0.1-2.0克、红景天素0.003-0.03克、六胜肽0.001-0.01克、超氧化物歧化酶0.0002-0.002克、还原型谷胱甘肽0.2-2.0克、胎牛血清2-20克、透明质酸0.02-0.2克、神经酰胺0.02-0.2克、蒸馏水35-45克、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯30-40克、聚甘油脂肪酸酯10-15克；

固态类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳是由下述重量份配比的原料制成：

肉豆蔻酸异丙酯5-15克、维生素E2-10克、蛋黄卵磷脂0.5-5.0克、人参皂苷0.1-2.0克、红景天素0.003-0.03克、六胜肽0.001-0.01克、超氧化物歧化酶0.0002-0.002克、还原型谷胱甘肽0.2-2.0克、胎牛血清2-20克、透明质酸0.02-0.2克、神经酰胺0.02-0.2克、蒸馏水35-45克、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯30-40克、聚甘油脂肪酸酯10-15克、甘露醇15-30克、甘氨酸2-8克。

本发明液态类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳各原料最佳的重量配比是：

肉豆蔻酸异丙酯10克、维生素E2克、蛋黄卵磷脂0.8克、人参皂苷0.2克、红景天素0.01克、六胜肽0.005克、超氧化物歧化酶0.001克、还原型谷胱甘肽0.5克、胎牛血清5克、透明质酸0.05克、神经酰胺0.05克、蒸馏水40克、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯36克、聚甘油脂肪酸酯12克；

本发明固态类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳各原料最佳的重量配比是：

肉豆蔻酸异丙酯10克、维生素E2克、蛋黄卵磷脂0.8克、人参皂苷0.2克、红景天素0.01克、六胜肽0.005克、超氧化物歧化酶0.001克、还原型谷胱甘肽0.5克、胎牛血清5克、透明质酸0.05克、神经酰胺0.05克、蒸馏水40克、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯36克、聚甘油脂肪酸酯12克、甘露醇22克、甘氨酸3克。

本发明液态类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳的制备方法如下：

1)按液态类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳原料的配比，将肉豆蔻酸异丙酯、维生素E、蛋黄卵磷脂、人参皂苷、红景天素共同置于容器中；将容器内原料充分混合、溶解，不能溶解的部分加少许无水醇促进完全溶解，并将作为油相(A)备用；

2)按六胜肽、超氧化物歧化酶、还原型谷胱甘肽、胎牛血清、透明质酸、神经酰胺及适量蒸馏水混合使之完全溶解，再加蒸馏水使之作为水相(C)备用；

3)按辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯、聚甘油脂肪酸酯等于3∶1的比例，置于另一容器之中，充分搅拌均匀，使之形成S/C混合物(B)备用；

4)再按油相(A)∶S/C混合物(B)∶水相(C)等于15∶45∶40的比例，分别取S/C混合物(B)、水相(C)依此加入油相(A)容器中；

5)在室温条件下，选用定时恒温磁力搅拌器，并以200rpmmin^-1的转速磁力搅拌30min，即可得到可供皮肤外用的液态类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳。

本发明固态类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳的制备方法如下：

1)按固态类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳原料的配比，将肉豆蔻酸异丙酯、维生素E、蛋黄卵磷脂、人参皂苷、红景天素共同置于容器中；将容器内原料充分混合、溶解，不能溶解的部分加少许无水醇促进完全溶解，并将作为油相(A)备用；

2)按六胜肽、超氧化物歧化酶、还原型谷胱甘肽、胎牛血清、透明质酸、神经酰胺及适量蒸馏水混合使之完全溶解，再加蒸馏水使之作为水相(C)备用；

3)按辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯、聚甘油脂肪酸酯等于3∶1的比例，置于另一容器之中，充分搅拌均匀，使之形成S/C混合物(B)备用；

4)再按油相(A)∶S/C混合物(B)∶水相(C)等于15∶45∶40的比例，分别取S/C混合物(B)、水相(C)依此加入油相(A)容器中；

5)在室温条件下，选用定时恒温磁力搅拌器以200rpmmin^-1的转速磁力搅拌30min，再加入甘露醇和克甘氨酸，再以200rpmmin^-1的转速磁力搅拌30min，并进行冷冻干燥处理，即可得到可供皮肤外用的固态类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳。

本发明有以下有益效果：

第一，科学性加强：本发明的皮肤外用类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳，不仅克服肉毒毒素皮肤外用的诸多问题和局限性，且在最大限度保留六胜肽类似肉毒毒素对抗表情肌运动所产生的面部运动性皱纹的基础上，针对性地添加了一些能对抗或延缓皮肤自然老化所产生的生理性皱纹的辅助功效成分。两者有机结合，联合应用，作用途径和机制互补，即可相互协同，共济增效，可达到最佳的皮肤抗衰老和消除皮肤皱纹的效果，且科学性明显加强，抗皱复合纳米乳国际尚属空白。

第二，新颖性突出：本发明的皮肤外用类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳的最大特点和新颖性突出表现在：①将能对抗表情肌运动所产生的面部运动性皱纹的小分子类肉毒素(六胜肽)与能对抗或延缓皮肤自然老化所产生的生理性皱纹的辅助功效成分(如SOD-CCE等)有机结合和联合应用，国内外尚未见报道(尚属空白)；②将类肉毒素(六胜肽)与辅助功效成分(如SOD-CCE等)复配后，再与目前最先进的纳米载体系统-纳米乳复合应用，国内外尚未见报道(尚属空白)；③皮肤外用类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳按照不同的用途及使用条件和储存要求，不仅研制成功制备皮肤外用液态类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳的技术方法，而且还研制成功制备皮肤外用固态类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳的技术方法，该技术和产品国内外尚未见报道(尚属空白)。

第三，实用性明显：本发明的皮肤外用类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳，不仅可用在消除或减轻纯粹动力性皱纹和运动性皱纹，且可用在消除或减轻皮肤生理性性皱纹和光老化皱纹；不仅有短暂但较快的抗皱效果，且还有较长但缓慢的皮肤抗老化方面；不仅可用于治疗已形成的面部皱纹，且还可用于预防或延缓老化性和生理性皱纹；不仅可用于青年人面部的皱纹，也可用于中老年人面部的皱纹，其实用性更加明显，且此同步作用，国内外尚属空白；另外，本发明的实用性还体现在所使用的功效成分及相关原料均来源方便、价廉物美。在确保使用安全和作用效果基本一致的前提下，本发明可采用国产原料替代进口原料，这样不仅降低原料成本或生产消耗，而且这样也才能保证原料来源方便，使成品价格便宜，且产品制备也简单方便。还有，本发明可使功效成分用量的减少，降低了资源消耗和浪费，也使产品成本大大降低。尤其是本发明可按照需要任意匹配一些理化特性不同、溶解性各异、分子量大小不一的功效成分，使其工艺技术更方便和实用。

第四，先进性提高：本发明的皮肤外用类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳，不仅采用具有高效生物学作用为主导的生物制剂，而且，采用目前最为先进的纳米技术及其功效成分靶向载体系统。同时，本发明的皮肤外用类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳，不仅大大提高了类肉毒素(六胜肽)及其辅助功效成分的透皮吸收速率和转运效果，而且，大大提高了类肉毒素(六胜肽)及其辅助功效成分作用的趋向性和靶向针对性，这较目前将类肉毒素(六胜肽)及其辅助功效成分直接添加到传统的美容化妆品基质和产品中的技术水平大大提高。特别是美容功效成分的针对性或靶向性非常重要。目前传统美容化妆品制备技术尚只能保证含有相关美容功效成分，但并非所有的美容功效成分都具有针对性或靶向性，即使添加了一些促皮肤渗透剂也只能增加功效成分的透皮吸收，也无法使功效成分发挥靶向作用。而采用本发明制备的复合纳米乳，由于可将功效成分结合在某一载体上，且这种载体具有一定的针对性和靶向性，因此，可实现功效成分的针对性和靶向性，使其作用更加特异和直接，则相应功效将会更加明显和高效。

第五，安全性更好：理论上讲，无论哪种功效成分，在超过其使用剂量或多次反复时，均有可能引起皮肤的异常反应；特别是一些化学合成物质或异源性的生物大分子物质更是如此。如果不采用相关的制剂或载体处理，其产品自然无法保证其安全性，甚至出现严重的皮肤刺激或过敏或皮肤损伤。采用本发明复合纳米乳配制技术处理后，其功效成分添加浓度可大大降低，使用次数也明显减少，促皮肤渗透的化学合成或半合成物质基本剔除，则使应用的安全性得以提高。而且，本发明的皮肤外用类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳中的主要功效成分和辅助功效成分均不含有A型肉毒毒素和化学剥脱制剂，因此，理论上不会出现诸如肉毒毒素和化学剥脱制剂易于出现的毒副作用，刺激反应及临床合并症、禁忌症和后遗症等；除此之外，在使用效果相同的情况下，大大降低了主要或辅助功效成分的应用浓度，并减少了传统方法添加的浓度，使功效成分可能发生的皮肤刺激性、过敏反应、毒副作用大大降低，而安全性则大大提高。

第六，稳定性更高：本发明的皮肤外用类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳中的主要功效成分六胜肽及其辅助功效成分在美容化妆品中的稳定性至关重要。如功效成分不能在美容化妆品中保持稳定，且在有效期稳定存在，其产品自然无法保证质量。六胜肽及其辅助功效成分在应用本发明的纳米乳技术配制，其形成的功效纳米乳则可显著地提高其稳定性，大大延长其有效期，且肉眼观察外观清澈、透明、美观。按照纳米乳稳定性试验要求验证：①将复合纳米乳和传统美容精华素同时置于日光灯和自然光下连续照射0、5、10、15、30天取样测定证实，复合纳米乳较传统工艺配制的美容精华素对光照的稳定性大大提高；②将复合纳米乳和传统美容精华素同时置于0℃、4℃、25℃、40℃、60℃、80℃下，按0、5、10、15、30天取样测定证实，复合纳米乳较美容精华素对在不同温度条件下的稳定性更高；③将复合纳米乳和传统美容精华素同时置于空气中(室温条件温度为20-25℃，相对湿度为50％-75％)暴露，按0、5、10、15、30天取样测定证实，复合纳米乳较美容精华素对暴露在空气中和室温自然存放的稳定性试验更高；且置于自然室温空气中(室温条件温度为25~32℃，相对湿度为40~80％)存放30天取样测定也证实，复合纳米乳较美容精华素稳定性更高；④将复合纳米乳和传统的美容精华素分别置于高速离心机中，并以10000-16000rpmmin^-1的速度离心30min后测定证实，复合纳米乳较美容精华素稳定性更高；⑤将复合纳米乳和传统的美容精华素分别用马尔文粒径测定仪分别测定其粒径，证实复合纳米乳粒径全部在纳米级，且绝大部分在20纳米左右；而传统的美容精华素粒径基本在微米级，大多数在1-100微米。由此可见，复合纳米乳粒径较美容精华素乳滴粒径小得多，且复合纳米乳的粒径分布更集中，均匀性更好。

第七，合理性更优：本发明的皮肤外用类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳中的主要功效成分六胜肽及其辅助功效成分组合和配方比例的合理性显示出本发明的突出优势。如功效成分组合因制备工艺使其无法在美容化妆品中复配、且复配比例的合理性受到影响，其产品自然无法保证其作用。而本发明的主要功效成分六胜肽及其辅助功效成分在应用本发明纳米乳制备方法配制时，则可按照配方或复配的需要进行添加，不仅所形成的复合纳米乳能保持更好的稳定性，并大大提高或增强了作用效果。特别是主要功效成分六胜肽及其辅助功效成分在复合纳米乳中的溶解性直接影响其配制和效果。在美容化妆品配制和使用过程中，只有一定浓度的功效成分解决了溶解性，其功效成分协同才能发挥更好的效果。但是，传统的美容化妆品制备技术对完全解决功效成分的溶解性问题尚存在一定困难，导致因其功效成分溶解不好，产品稳定性和使用浓度降低，或者不同溶解性的功效成分无法协同增效而无法达到相应的剂量效应或共济协同作用，产品自然无法保证其疗效。本发明采用的复合纳米乳制备技术进行配制，其溶解性，流动性和分散性均好，且可促进不同溶解性的功效成分互溶和共溶。分别按照本发明的技术和传统的美容精华素制备方法，在完全相同的条件下将同种单一功效成分(如GSH)进行溶解性试验，发现本发明纳米乳的饱和溶解度明显高于传统的美容精华素产品；同时，在完全相同的条件下，再将同样种类的多种功效成分进行溶解性试验，发现皮肤复合纳米乳的饱和溶解度也明显高于传统的美容精华素产品。

第八，生物活性好：本发明的皮肤外用类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳中的主要功效成分六胜肽及其辅助功效成分大多数是生物活性成分，而生物活性物质通常需要在低温或常温下保存和使用才能发挥其生物学作用的优势；因此，在配制产品过程中，这些生物活性物质对最终反应温度要求甚高；如反应温度过高容易使功效成分结构改变而失去生物活性；而如反应温度过低，又无法达到各反应体系的溶解。但目前美容化妆品配制技术大多必须采用70-80℃条件下进行水相和油相成分的乳化溶解，这样是必使生物活性物质大量丢失或灭活，不仅导致其含量大大下降，而且功效作用明显降低，甚至失去其应有的作用效果。而本发明采用的复合纳米乳技术是在常温25℃左右条件下进行配制，使添加的功效生物活性物质得以大量保存或保活，生物利用度提高，这样能有效地发挥其应有的作用效果。生物活性测试：分别按照本发明的技术和传统的美容精华素制备方法，在完全相同的条件下将同种具有生物活性的功效成分(SOD)分别配制成SOD纳米乳和SOD精华素，在完全相同的存放条件下分别于放置30天前后分别测定SOD活性发现，SOD纳米乳较SOD精华素中剩余SOD活性明显高。

第九，透皮吸收更多：本发明的皮肤外用类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳中的主要功效成分六胜肽及其辅助功效成分大多数是水溶性成分，不利于皮肤的渗透吸收。而美容化妆品要想真正发挥功效作用，很重要的是生物活性物质或功效成分能够透过皮肤角质层屏障达到相应的作用部位、并在这些部位维持一定的效应时间。而传统的美容化妆品要实现生物活性物质或功效成分或天然药物的透皮吸收，需要添加一些有效的助剂、媒介、载体等协助才有可能使其透过表皮屏障而进入皮肤内发挥它们应有的生物学作用，且现有传统的美容化妆品制备技术及配方大多数是添加一些传统的促皮肤渗透剂，不仅产品功效成分的透皮吸收无法保证，且添加过多的化学合成或半合成的促皮肤渗透剂添还有可能发生皮肤刺激反应甚至出现过敏和致癌等。而本发明的复合纳米乳配制技术所得到的产品由于其粒径小、粒径分布均匀，加上乳化好，与皮肤屏障结构的相溶性好，因此，即使未添加任何促皮肤渗透剂，其功效成分也较易透过表皮吸收，甚至可穿透全层皮肤发挥其良好的皮肤抗皱效果。特别是因纳米乳明显提高了难溶性药物在水相中的溶解度，且纳米乳的粒径和皮肤组织亲合性，使功效成分或生物活性物质的经皮扩散速率明显增加，透皮吸收明显加快。

第十，疗效性更佳：功效成分应用的有效性与其共济协同和联合增效密切相关。目前，传统美容化妆品并非所有的美容功效成分都能发挥共济协同和联合增效的优势，即使添加了一些具有共济协同和联合增效的美容功效成分也未必能达到设计预期效果。而采用本发明制备的皮肤外用类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳，由于其分散性，流动性，均匀性，稳定性，透皮吸收性，针对性或靶向性及与皮肤接触的面积增大，作用时间延长等共同影响，使配伍以后的功效成分的共济协同性和联合增效性更加明显，实际应用效果将会更加明显和高效。其对皮肤皱纹的疗效性更佳主要表现在：①有效和痊愈率更高；②有效反应时间更快；③近期和远期效果更显著；④作用效果维持时间更持久；⑤多种生物学效应更明显；⑥预防和治疗周期更短等。⑨应用的有效性。应用本发明研制的复合功效纳米乳与传统工艺所配制的同类型同剂量功效成分的非纳米乳精华素临床试用的结果表明，前者较后者有效率高25-35％，且最快有效时间提高了一倍之多。

第十一，舒适性更好：本发明的皮肤外用类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳舒适性更好，而使用的舒适性是高质量美容化妆品的重要指标之一。但按照目前传统的美容化妆品制备工艺，其颗粒相对较大，分子粒径大多在微米级左右，而采用本发明制备的复合纳米乳，其分子或乳滴粒径绝大多数在纳米级(10-80纳米之间)，且清亮透明，流动性好，因此，使用起来感觉更加细腻，光滑，润泽和舒适。

第十二，高效性更突出：传统美容化妆品制备不仅生产工艺复杂，工艺流程繁琐，生产周期较长，且无论生产何种类型美容化妆品，因需使用多种原料，油相和水相成分复杂，特别是它们必须在高温条件下才能完成乳化等，因而严重破坏对热敏感生物活性物质的结构，甚至妨碍其应有生物学效应的发挥。而本发明所制备的皮肤外用类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳条件简单，工艺快捷，操作容易，制备高效，周期较短，不需特殊仪器设备，不需外界提供能量，不需加热乳化，且配制成一批产品的全部完成时间不过30分钟即可形成产品，因此，具有高效且易于产业化的优势，使其产业化技术水平也明显提高和改善；还在能量和原材料节省，降低环境污染等方面也有明显进步和改观。

本发明要解决的技术问题：

第一，克服A型肉毒毒素皮肤外用的问题，采用新的技术最大限度保留六胜肽类似肉毒毒素抗皱的生物学作用。

第二，解决六胜肽作为主要功效成分目前盲目添加和使用的问题，科学设计其作为皮肤外用抗皱制剂所添加的最佳有效浓度问题。

第三，解决六胜肽作为一种水溶性功效成分难以直接透过皮肤有效吸收的问题，从而，有效发挥和提高其皮肤抗皱作用的优势。

第四，解决六胜肽与其它辅助功效成分科学组方的问题，使其在真正意义上实现皮肤抗皱和延缓皮肤衰老相结合的目标。

第五，解决六胜肽及其它辅助功效成分在皮肤制剂及美容化妆品中应用的载体系统-纳米乳制备问题，从而使皮肤外用固态和液态类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳在更大程度上发挥和提高六胜肽及其它辅助功效成分在皮肤抗皱和延缓皮肤衰老方面的作用和优势。

第六，解决六胜肽及其它辅助功效成分与载体系统配伍的稳定性问题，使皮肤外用固态和液态类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳完全符合国家有关美容化妆品法规所要求的稳定性和保存期的问题。

第七，解决六胜肽及其它辅助功效成分与载体系统配伍的安全性问题，使皮肤外用固态和液态类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳完全符合国家有关美容化妆品法规所要求的使用安全性问题。

第八，降低六胜肽及其辅助功效成分与载体系统配伍后的成本问题，使皮肤外用固态和液态类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳价廉物美。

本发明的技术原理：

本发明复合纳米乳制备的原理：复合纳米乳是以空白纳米乳和皮肤抗皱功效成分配制而成。空白纳米乳则由油相、水相、表面活性剂或乳化剂、助表面活性剂或助乳化剂四个体系组成，而皮肤抗皱功效成分则由主要功效成分和辅助功效成分组成。油相和水相是空白纳米乳形成的基本条件；乳化剂有助于油相和水相交融并形成乳滴；助乳化剂也是纳米乳形成的重要条件，它可以插入到乳化剂的界膜中，使之形成复合凝聚膜，提高膜的凝固性和柔顺性，并可增加乳化剂的溶解度，进一步降低界面张力，有利于纳米乳形成后更加稳定。本发明中，肉豆蔻酸异丙酯作为油相，辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯作为表面活性剂或乳化剂，聚甘油脂肪酸酯为助表面活性剂或助乳化剂，蒸馏水作为水相。由于乳化剂辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯有助于油相肉豆蔻酸异丙酯和水相蒸馏水的相互交融并形成乳滴，而助乳化剂聚甘油脂肪酸酯也是皮肤外用空白纳米乳形成的重要条件，特别是由于聚甘油脂肪酸酯与辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯各自特殊的理化特性，使助乳化剂聚甘油脂肪酸酯可以插入到与乳化剂辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯的界膜中，形成复合凝聚膜，以提高膜的凝固性和柔顺性，并可增加与辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯的溶解度，且进一步降低界面张力，有利于形成更加稳定的皮肤外用空白纳米乳。辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯常受溶解度的限制，而聚甘油脂肪酸酯能使辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯的溶解度增大，纳米乳的乳滴更容易进一步分散，特别是辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯和聚甘油脂肪酸酯在肉豆蔻酸异丙酯和蒸馏水相界面进一步大量吸附，使两者在连续相内的浓度降低，界面张力重新成为正值，使之逐步形成稳定的皮肤外用空白纳米乳。理论上讲，皮肤外用空白纳米乳仅仅只是作为功效成分的载体系统，单独使用尚未发现其有明显的皮肤抗皱和延缓皮肤衰老的作用和功效，而添加的相关皮肤抗皱功效成分，才是发挥皮肤抗皱和延缓皮肤衰老的主要成分。在实际配制皮肤抗皱和延缓皮肤衰老的复合纳米乳的过程中，应根据各个成分各自水溶性或油溶性等理化特点，分别将皮肤抗皱功效成分，即皮肤抗皱主要功效成分面部表情肌抑制剂(六胜肽)和辅助功效成分--自由基清除剂(SOD和GSH)、皮肤营养剂(维生素E和蛋黄卵磷脂)、促细胞生长剂(胎牛血清)、天然保湿因子(透明质酸和神经酰胺)、天然植物或中药提取物(人参皂苷和红景天素)等按一定比例先溶解，然后，再按照伪三相图计算油相、水相及表面活性剂或乳化剂/助表面活性剂或助乳化剂的添加比例，并按照此比例进行配制，即可得到皮肤外用液态类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳；如再将一定剂量的冻干保护剂--甘露醇和甘氨酸适时添加至其中，并经冷冻干燥处理，即可得到皮肤外用固态类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳。

本发明的作用原理：

皮肤外用液态和固态类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳中的主要功效成分主要是由6个氨基酸缩合的具有类似肉毒毒素作用的六胜肽，以及能够辅助和增强六胜肽皮肤抗皱和延缓皮肤衰老的辅助功效成分自由基清除剂(SOD和GSH)，促细胞生长剂(胎牛血清)，皮肤营养剂(维生素E和蛋黄卵磷脂)，天然保湿因子(透明质酸和神经酰胺)，天然植物或中药提取物(人参皂苷和红景天素)等组成。

六胜肽为生物制剂，又称之为类肉毒毒素，其皮肤抗皱机制与注射抗皱所使用的A型肉毒毒素基本相同，即六胜肽类似面部皮肤肌肉的松弛剂，能选择性作用于外周胆碱能神经(运动神经)末稍，在神经肌肉接点突触处(作用最强点)，抑制突触前膜释放神经介质乙酰胆碱，有效阻断神经介质的传递，而引起肌肉松弛性麻痹，使肌纤维不能收缩，肌肉张力下降，肌痉孪缓解，面部表情肌无法发挥作用，从而，使脸部肌肉放松，减少或消除面部表情肌运动形成的皱纹，达到平抚动态纹、静态纹及细纹的目的。同时，类肉毒毒素六胜肽还能有效预防儿茶酚胺过度释放所产生的皱纹，减少面部肌肉重复牵动所形成的皱纹，从而，有效舒缓并抑制额头抬头纹、鱼尾纹、眉间纹、鼻横纹、鼻背纹及皱纹周边肌肉的收缩与活动，帮助肌肉放松，使肌肤弹性组织回复柔顺平滑的线条，进一步减少或消除脸部细纹。随着年龄的增长，老化皮肤的胶原纤维变直，纤维蛋白束与皮肤表而越加平行，皮肤伸展余地大为减少，弹性减低，皮肤变得松垂无张力而出现皱纹。

自由基清除剂中超氧化物歧化酶(SOD)属于自由基清除剂，能清除超氧阴离子自由基，具有明显而有效的抗氧化作用，能够预防和修复由于氧自由基所导致的皮肤组织过氧化损伤出现的皮肤细胞及亚细胞结构破坏、细胞合成与分泌代谢障碍、生物大分子(蛋白质和核酸)变性、酸性粘多糖降解、胶原纤维交联、弹性纤维断裂等引起的老化性皱纹的再形成和进行性加重。谷胱甘肽(GSH)是属于含有巯基的小分子肽类物质，具有三种重要的生理作用，即抗衰老、抗氧化和整合解毒作用。它由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸通过肽键缩合而成的三肽化合物，半胱氨酸上的巯基为其解毒的活性基团；由于谷胱甘肽的化学本质是小分子肽(分子量为307)，容易透过细胞膜而被皮肤吸收。由于还原型谷胱甘肽本身易受某些物质氧化，所以它在体内能够保护许多蛋白质和酶等分子中的巯基不被如自由基等有害物质氧化，从而让蛋白质和酶等分子发挥其生理功能；它还能直接将SOD转化的过氧化氢等氧化剂生成无毒的水，从而提高SOD生物学作用，减少皱纹形成，延缓皮肤衰老，被美国著名营养保健专家艾尔·敏德尔博士称之为三倍效能的抗衰老氨基酸。

表皮和真皮细胞数量减少，细胞增殖和更新减慢，皮肤细胞内量减少，细胞DNA和蛋白质以及胶原和弹性纤维合成的能力降低是皮肤衰老和皱纹形成的重要原因之一。促细胞生长剂(胎牛血清)是滋养皮肤组织和细胞的重要物质，系采用健康母牛怀孕八月龄胎牛血液为原料制备而成。它相对其它牛血清品质更高，因胎牛尚未接触外界，血清所含抗体和补体等对细胞有害成分更少，而血浆蛋白、多肽、氨基酸、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、核酸衍生物、无机物、维生素等，特别是胎白蛋白和胎球蛋白及细胞生长因子和激素更丰富，更适合皮肤细胞的培养和生长。胎牛血清皮肤外用，不仅可提供皮肤组织和细胞生命活动必需的营养物质，且可提供促进皮肤细胞分裂、增殖和生长所需的多种激素和各种生长因子(如成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板生长因子等)；同时，还可提供细胞代谢过程中起重要作用的结合蛋白(结合蛋白作用是携带重要地低分子量物质，如白蛋白携带维生素、脂肪及激素等，转铁蛋白携带铁)；胎牛血清蛋白形成血清的粘度，可保护细胞免受机械损伤，其中一些微量元素和离子，在细胞代谢和解毒中也起重要作用，这些无疑对促进表皮细胞和真皮细胞不断分裂和增殖，形成大量新生年轻细胞有益；同时，这些新生细胞在代谢过程中又不断合成并分泌新的细胞外基质及新生胶原蛋白和弹性蛋白，使面部皮肤出现年轻化趋势，皱纹得以减轻或消除。

皮肤营养剂(维生素E和蛋黄卵磷脂)，则能够提供给皮肤组织和细胞新陈代谢所需要的充足营养供应；同时，能够有效地维护皮肤细胞膜结构的稳定性和完整性，延缓细胞的凋亡，并及时修复受损的细胞，减少细胞损伤和破坏所导致的皱纹形成或加重。

表皮和真皮水分大量丢失，表皮细胞层次变薄，真皮内胶原纤维减少，排列紊乱。表皮和真皮均变薄，含水量减少。皮肤缺少水的滋润，皮肤干燥、萎缩，出现皮肤老化，缺乏弹性，出现皱纹。透明质酸(简称HA)是由N-乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸的双糖重复单元构成的黏多糖类物质，白色无定形固体，有极强的吸湿能力。它是人体皮肤组成成分之一，也是细胞间质中重要的成分。由于它的高粘稠度和向空间伸展度以及疏松、膨大的分子形态，使它在溶液中占据较大的空间，能结合大量水分，而皮肤水分决定着其湿润水平，这都与HA含量密切相关。随着年龄的增长，皮肤中HA含量降低，使皮肤保水功能减弱，产生皱纹。HA具有较强的黏弹性和润滑性，涂于皮肤表面，可形成一层保湿透气膜，保持皮肤滋润，有利于皮肤对营养物质的吸收，增加皮肤弹性，对皮肤老化、触觉和外观都有重大改善作用；HA在保湿的同时又是良好的透皮吸收促进剂，部分低分子量的透明质酸还可渗透到皮肤的真皮层，改善和调节皮肤中间代谢，使皮肤湿润光滑、细腻柔嫩、富有弹性，从而起到延缓皮肤衰老、防皱抗皱和美容保健的作用。

神经酰胺是一种水溶性脂质物质，它占皮肤角质层脂质的主要成分，在保持角质层水份平衡上起重要的作用。由于它和构成皮肤角质层的物质结构相近，因此能很快渗透进皮肤与角质层中的水结合，形成一种网状结构，并通过氢键形成层状结构的分子复合体，促进表皮层的水合作用，从而改善皮肤保持水分的能力，维持皮肤水分的平衡。但随着年龄增长进入老年期，皮肤中存在的神经酰胺逐渐减少，干性皮肤和粗糙皮肤型等皮肤异常症状的出现亦是由于神经酰胺量减少所致。神经酰胺是高效保湿剂易被皮肤吸收，在皮肤应用有改善和调节皮肤细胞间质的组成和功能，并能促进其他营养物质渗透，适用于粗糙、干燥多屑皮肤，尤其适合对老年干性皮肤保湿。同时，神经酰胺能增强表皮细胞的内聚力，修复皮肤屏障功能，从而缓解角层的脱屑症状，帮助皮肤再恢复，改善皮肤外观，令皮肤光滑有弹性，也可避免或减少因紫外线照射而引起的表皮剥落，从而有助于皮肤抗衰老。神经酰胺并有助于减轻或消除皮肤上的皱纹，除去皮肤皮炎，保持皮肤的弹性。而这些天然皮肤保湿因子(透明质酸和神经酰胺)联合应用，不仅能通过吸收空气中的水份保持皮肤的水份，而且还能有效地防止皮肤组织中水份的挥发或丢失，从而，发挥出良好的皮肤保湿效果。通常面部许多细小皱纹是由于皮肤组织短暂性缺水所致，因此，通过天然皮肤保湿因子(透明质酸和神经酰胺)的保湿或补水作用，可使因皮肤缺水而导致的细小皱纹得以减轻或消失。

天然植物或中药提取物(人参皂苷和红景天素)均是天然生物活性物质，且人参皂苷和红景天素的皮肤抗老化作用已得到大量动物和人体试验证明。人参和红景天均有滋阴壮阳，促进细胞增殖，组织修复再生之功效。有实验证实，人参皂苷和红景天素能增强组织SOD酶活性，降低LPO含量，还有促进细胞生长增殖作用和增强皮肤细胞抗衰老能力。外用人参皂苷和红景天素三个月以上所进行的眼睑皮肤扫描电镜观察发现，皮肤胶原纤维有新生细纤维出现，纤维网有空隙存在，纤维束之间交织松软，成纤维细胞数增多，新生性架桥增多，老化性架桥数目相对减少，新生皮肤胶原有增加趋势；弹性纤维表面光滑，轮廓清晰，变性物质颗粒附着较少或没有，真皮的结构清楚，乳头层和网状层结构得以辨认，皮肤组织明显改善，并呈现年轻化趋势，这证明人参皂苷和红景天素不仅具有较好的预防和延缓皮肤老化效果，而且能使皮肤抗衰老和抗皱纹效果更加持久和长远。而将这些功效成分通过纳米乳载体复合应用，其皮肤抗皱效果出现快慢结合，远近效果同现，其表达形式更具创新和特色。

冷冻干燥是利用升华原理进行干燥的一种技术，是将被干燥的物质在低温下快速冻结，然后在适当的真空环境下，使冻结的水分子直接升华成为水蒸气逸出的过程。物质在干燥前始终处于低温(冻结状态)，同时冰晶均匀分布于物质中，升华过程不会因脱水而发生浓缩现象，避免了由水蒸气产生泡沫和氧化等副作用。干燥物呈干海绵多孔状，体积基本不变，极易溶于水而恢复原状。在最大程度上防止干燥物质的理化和生物学方面的变性。而皮肤外用液态复合类肉毒毒素(六胜肽)纳米乳由液态转变为固态，实际上就是冷冻干燥的结果。真空冷冻干燥将含有水分的复合纳米乳在低温状态下预冷后，再在低温真空条件下，对其升温加热，使复合纳米乳中冻结成的细小冰晶颗粒直接升华，由冷凝器捕集，使含有水分的液态复合纳米乳转变成功效完全一致的固态复合纳米乳。而在皮肤外用液态复合类肉毒毒素(六胜肽)纳米乳转变为固态纳米乳过程中，甘露醇和甘氨酸发挥着十分重要的作用，成为使液态复合纳米乳成形的重要添加剂。甘露醇和甘氨酸共同作为冻干赋形保护剂之所以能对液态复合纳米乳起到较好的赋形和保护效果，是因为甘露醇和甘氨酸随纳米乳的冻结和结晶的生长，逐渐浓缩，并分布在纳米乳乳滴周围，阻止乳滴的融合；在纳米乳冷冻干燥过程中，赋形保护剂的加入使液态复合类肉毒毒素(六胜肽)纳米乳的粘性增加，弱化了水的结晶过程，从而减少了冰晶对乳滴的损伤；而且，赋形保护剂加入提高了乳剂的玻璃化转变温度，并在一定的降温速率下使乳剂实现部分玻璃化，避免了晶态固化，减少了冰晶对乳滴的损伤；同时，可改善复合纳米乳外观及再分散性能发挥重要作用。

本发明的主要技术构思和内容：

本发明的技术构思分为三个部分：第一部分：空白纳米乳制备。主要包括：①空白纳米乳工艺流程和操作方法设计；②高质量空白纳米乳的制备。第二部分：皮肤外用液态类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳制备。主要包括：①皮肤外用液态类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳工艺流程和操作方法设计；②皮肤外用液态类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳的制备；第三部分：皮肤外用固态类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳制备。主要包括：①皮肤外用固态类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳工艺流程和操作方法设计；②皮肤外用固态类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳的制备。

第一部分：空白纳米乳制备：①称取10-20克重量的肉豆蔻酸异丙酯(IPM)置于100mL三角烧瓶中，使之为油相(A)；②根据km等于3的设计系数配制乳化剂和助乳化剂混合物，即按辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯(Labrasol)∶聚甘油脂肪酸酯(Plurol Oleique CC497)等于3∶1的比例，再取30-40克辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯(Labrasol)和10-15克聚甘油脂肪酸酯(PlurolOleique CC497)，并将两者置于另一容器之中，充分搅拌，混合均匀，从形成S/C混合物(B)；③按油相(A)∶S/C混合物(B)∶纯蒸馏水(C)等于15∶45∶40的比例，分别取40-50克辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯和聚甘油脂肪酸酯充分混合形成的S/C混合物(B)，30-50克的纯蒸馏水(C)依此加入上述(A)中的100mL三角烧瓶中；④立即选用定时恒温磁力搅拌器在室温25℃条件下，以200rpmmin^-1的转速磁力搅拌30min，即可得到供皮肤外用的空白纳米乳载体。

第二部分：皮肤外用液态类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳制备。①准确称取5-15克重量的肉豆蔻酸异丙酯(IPM)置于100mL三角烧瓶之中；再用精密分析天平分别准确称取维生素E(VE)2-10克、蛋黄卵磷脂0.5-5.0克、人参皂苷0.1-2.0克、红景天素3-30毫克，加入至上述盛有肉豆蔻酸异丙酯(IPM)的100mL三角烧瓶之中，充分混合，尽可能溶解；实在不能溶解的部分，可滴加少许无水乙醇以促使其完全溶解，并将之作为油相(A)；②再用精密分析天平分别准确称取六胜肽1-10毫克、超氧化物歧化酶(SOD)0.2-2.0毫克、还原型谷胱甘肽(GSH)0.2-2.0克、胎牛血清2-20克、透明质酸20-200毫克、神经酰胺20-200毫克，加入适量蒸馏水使之完全溶解，然后，再用蒸馏水加至30-50毫升，使之作为水相(C)；④根据km等于3的设计系数配制乳化剂和助乳化剂混合物，即按辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯(Labrasol)∶聚甘油脂肪酸酯(Plurol Oleique CC497)等于3∶1的比例，分别准确称取30-40克辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯(Labrasol)和10-15克聚甘油脂肪酸酯(Plurol Oleique CC497)，并将两者置于另一容器之中，充分搅拌，混合均匀，完全溶解，使之形成S/C混合物(B)；⑤最后，再按油相(A)∶S/C混合物(B)∶水相(C)等于15∶45∶40的比例，分别取40-50克辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯和聚甘油脂肪酸酯充分混合形成的S/C混合物(B)、30-50克的水相(C)依此加入上述油相(A)中的100mL三角烧瓶中；⑥此时，立即选用定时恒温磁力搅拌器在室温25℃条件下，以200rpmmin^-1的转速磁力搅拌30min，即可得到供皮肤外用的液态类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳。

第三部分：皮肤外用固态类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳制备：①称取5-15克重量的肉豆蔻酸异丙酯置于100mL三角烧瓶之中；再用精密分析天平分别称取维生素E2-10克，蛋黄卵磷脂0.5-5.0克，人参皂苷0.1-2.0克、红景天素3-30毫克，加入至盛有肉豆蔻酸异丙酯的100mL三角烧瓶之中，充分混合，尽可能溶解；实在不能溶解的部分，可滴加少许无水乙醇以促使其完全溶解，并将之作为油相(A)；②再用分析天平分别称取六胜肽1-10毫克，超氧化物歧化酶0.2-2.0毫克，还原型谷胱甘肽0.2-2.0克，胎牛血清2-20克，透明质酸20-200毫克，神经酰胺20-200毫克，加入适量蒸馏水使之完全溶解，然后再用蒸馏水加至30-50毫升，使之作为水相(C)；④根据km等于3的设计系数配制乳化剂和助乳化剂混合物.即按辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯(Labrasol)∶聚甘油脂肪酸酯(Plurol Oleique CC497)等于3∶1的比例，称取30-40克辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯(Labrasol)和10-15克聚甘油脂肪酸酯(Plurol Oleique CC497)，并将两者置于另一容器之中，充分搅拌，混合均匀，完全溶解，使之形成S/C混合物(B)48克；⑤最后，按油相(A)∶S/C混合物(B)∶水相(C)等于15∶45∶40的比例，分别取40-50克辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯和聚甘油脂肪酸酯充分混合形成的S/C混合物(B)，30-50克的水相(C)依此加入上述油相(A)中的100mL三角烧瓶中；⑥此时，立即选用定时恒温磁力搅拌器在室温25℃条件下，以200rpmmin^-1的转速磁力搅拌30min后，再加入15-30克甘露醇和2-8克甘氨酸，再以200rpmmin^-1转速的磁力搅拌器搅拌30min，并进行冷冻干燥处理，即可得皮肤外用固态类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳

本发明的主要技术创新点：

用本发明设计的组方及工艺技术制备的纳米乳同时作为不同作用途径的多种复杂功效成分的同一载体，即主要抗皱功效成分类肉毒毒素(六胜肽)和辅助功效成分自由基清除剂(SOD和GSH)，促细胞生长剂(胎牛血清)，皮肤营养剂(维生素E和蛋黄卵磷脂)，天然保湿因子(透明质酸和神经酰胺)，天然植物或中药提取物(人参皂苷和红景天素)等的载体系统，目前国际上未见报道，为本发明首创；②用本发明设计的组方及工艺技术制备的纳米乳作为功效成分的有效载体系统，将主要皮肤抗皱功效成分--类肉毒毒素(六胜肽)作为面部运动神经抑制和面部表情肌松弛剂制备的皮肤抗皱纳米乳，用于对抗由面部表情运动产生的皱纹，并发挥快速见效作用，同时将辅助皮肤抗皱功效成分--自由基清除剂(SOD和GSH)，促细胞生长剂(胎牛血清)，皮肤营养剂(维生素E和蛋黄卵磷脂)，天然保湿因子(透明质酸和神经酰胺)，天然植物或中药提取物(人参皂苷和红景天素)制备的延缓皮肤衰老(抗皮肤生理性衰老)，增强类肉毒毒素(六胜肽)皮肤抗皱效果的乳米乳，并发挥缓慢而持久效果，使快慢结合，近期和远期效果结合，内外抗皱效果并用的设计理念，目前国际上未见报道，为本发明首创；③用本发明设计的组方及工艺技术制备的可供皮肤外用的液态和固态类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳，且两者可以相互转化的纳米乳(即由液态转为固态，或者由固态转为液态)，目前国际上未见报道，为本发明首创；④外用皮肤抗皱及延缓皮肤生理性衰老的双效液态和固态类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳，目前国际上未见报道，为本发明首创。

本发明的主要注意事项：

第一，皮肤抗皱的主要功效成分--类肉毒毒素(六胜肽)的用量非常关键。剂量太小，无法达到面部神经抑制和面部表情肌松弛的作用；而剂量太大，可能过多抑制面部神经传导和面部表情肌松弛的作用，引起面部表情不自然和不协调；而且，由于六胜肽价格昂贵，添加过多，还可能造成产品成本过高或不必要浪费。

第二，皮肤抗皱及延缓皮肤生理性衰老的辅助功效成分--自由基清除剂(SOD和GSH)，促细胞生长剂(胎牛血清)，皮肤营养剂(维生素E和蛋黄卵磷脂)，天然保湿因子(透明质酸和神经酰胺)，天然植物或中药提取物(人参皂苷和红景天素)等，具有各自不同的作用途径和功效，其添加比例也是有明确的规定和要求，过多或过少，都难以达到设计效果和实际功效，尤其是生物制剂的添加更应控制好剂量。

第三，皮肤抗皱及延缓皮肤生理性衰老的辅助功效成分中的胎牛血清为血液制品，它必须系来源于健康胎的血清，且必须在检定后剔除含有致病性微生物(包括致病菌、病毒、支原体、衣原体等)和遗传变异的胎牛血清，且大部分血清在使用前必须经过加热灭活处理，即在56℃恒温水浴的条件下灭活30分钟。灭活的目的主要是去除血清中可能含有的补体成分，避免补体对皮肤组织和细胞产生毒性作用。

第四，在对胎牛血清进行热灭活时，温度和时间必须严格按照规定。如灭活温度过高，时间过长，均可能会损失一些对皮肤组织和细胞生长有利的细胞生长因子及其它对热敏感的生物活性成分；因此，对于一些品质高的胎牛血清和新生牛血清可以考虑不经灭活直接使用。

第五，在对胎牛血清灭活前，应尽量避免长时间将血清置于高温环境中，以防止血清出现污染而造成浪费。而且，在操作胎牛血清时务必注意无菌观念和无菌操作；另外，胎牛血清在不马上使用时应储存在-20℃冰箱，同时应避免将其反复冻融。收集或采集胎牛血清及灭活处理后，最好是分装成小包装，以方便使用时融化或使用。除此之外，已融化后的胎牛血清，在4℃冰箱中不宜长时间存放，应尽快使用。

第六，胎牛血清解冻的正确操作很重要，一般规范的操作规程应是：在将胎牛血清从-20℃冷冻箱中取出后，先置于2-8℃冰箱中使之溶解，然后，再在室温下使之全溶。但必须注意的是，溶解过程中必须规则地摇晃均匀，切莫剧烈振荡，这样才不会使产品质量受损。

第七，胎牛血清解冻后发现有絮状沉淀物出现，可能是血清中脂蛋白变性造成；血纤维蛋白在血清解冻后也会存在于血清中，亦是造成血清沉淀物的原因之一。但这些絮状沉淀物，并不影响血清本身的质量，若絮状沉淀物不太多，可直接使用；若絮状沉淀物太多，应先设法去除，即可将其分装在无菌容器中，置于离心机中稍微离心即可。

第八，由于添加功效成分较多，可能是油溶或水溶或醇溶或水油兼溶，因此，实际配制时，应根据各自功效成分溶解特性，先将固体或液体功效成分溶于同相之中。如功效成分属水溶性，则先将它溶于水相之中；如功效成分属油溶性，则先将它溶于油相之中；如功效成分属醇溶性，则先将它溶于醇剂之中，再分别溶于油相或水相或乳化剂/助乳化剂体系之中，之后，再按本发明设计的比例进行复合纳米乳配制。

第九，由于纳米乳是一个自发形成的体系，因此在制备纳米乳时，应以相图为基础，综合考虑乳化剂、助乳化剂、油相、水相以及Km温度的作用。而纳米乳配制时的油相、水相、乳化剂、助乳化剂的比例非常关键，但在实际配制其它功效纳米乳时，可根据配制过程中出现的具体情况适当调整油相、水相、乳化剂、助乳化剂的比例，但上下最好不要超过5％。如此方法仍无法解决，则可根据伪三相图进行估算，再采用滴定的方式，即用水相滴定或乳化剂/助乳化剂混合物进行滴定。滴定用滴管或注射器均可，一滴滴缓慢进行；滴定过程中，搅拌器仍正常工作，直至滴定配制完全透明和澄清为止；此时，应计算准确滴定所消耗量并记录之，以便再次配制时参考。

第十，因配方中有些功效成分添加量极微，故应称量准确，溶解完全，荡洗干净，以免影响其实际浓度或效果；且在按照所添加的功效成分各自的理化特性及溶解特性完成溶解并添加至纳米乳各液相时再次出现浑浊或不溶解时，仍可先根据伪三相图进行估算，在纳米乳配制过程的最后搅拌阶段，采用水相滴定或者醇滴定，或乳化剂/助乳化剂混合物滴定，或乳化剂或助乳化剂单独滴定，直至纳米乳完全澄清和透明为止。伪三元相图法是研制纳米乳相行为最常用和基本的方法，本设计可采用绘制伪三元相图法进行纳米乳的制备，选择将水相和油相按比例混合制备成二元液，同时用S/C混合液作为滴定液对二元液进行滴定，这样在滴定过程中只需观察一次相变过程，降低了用水相或油相作为滴定液进行滴定时出现两次相变而产生的误差。

第十一，按照本发明专利的技术工艺和制备方法，也可选择其他乳化剂/助乳化剂体系，但最好是选择能与各功效成分相互匹配，以及无色、无味、无臭、透明、且高度安全、对皮肤无刺激性的乳化剂/助乳化剂体系。这样，不仅可以替代进口试剂，来源方便，且可大大降低成本；不过，选择新的乳化剂/助乳化剂体系及油相和水相时，应先摸索并计算好比例。

第十二，本发明制备固态复合纳米乳所采用的赋形保护剂为甘露醇与甘氨酸的混合物。其中，甘露醇的结晶为羽毛状，乳滴分散在结晶的片层之间，因此能得到外观较好的冻干制品。通常甘露醇的量越大，产生的结晶空隙越多，其纳米乳滴分散越均匀，且重分散性越好。而甘露醇与甘氨酸合用，其共晶点温度相对较高，这能有效保持样品冻干过程中固态的形状，减少样品的皱缩，提高冻干速率，缩短冻干时间。但甘露醇和甘氨酸最好在形成纳米乳前加入，如配制好的纳米乳再加入，一方面不好溶解，浪费时间，而且，也影响赋形和保护的效果。

第十三，功效成分在纳米乳液体系中的释放和分散程度，取决于这些功效成分在纳米乳体系中的浓度。一般说，功效成分在纳米乳载体中的浓度越高，则功效成分释放和分散就越快，因此，功效成分在纳米乳中的浓度不可太低，否则功效成分会强烈吸附于乳化剂或表面活性剂组成的液膜上，从而造成扩散受阻；另一方面，功效成分浓度低，体系浓度差小，扩散就慢，导致功效成分生物利用率降低，效果下降。

第十四，纳米乳较其它体系最突出的一个特点就是可以增溶功效成分，不管是水溶性的功效成分，还是脂溶性的功效成分，在纳米乳液中都可以达到很大的增溶量。而功效成分在纳米乳内的增溶，对功效成分的缓释和控释具有重要的意义。因为小液滴内功效成分释放，必须先通过由乳化剂或表面活性剂分子组成的界面膜，此过程通常是较慢，而功效成分在纳米乳液的小液滴内的总浓度却可达很高。而且，功效成分增溶在纳米乳中，可减少用药次数，缓慢释放药物的目的。

第十五，纳米乳虽然属于热力学稳定系统，但温度过高和过低则直接影响到它的稳定性。低温时，乳化剂或表面活性剂主要分布在水相，而高温时则主要分布在油相。温度的升高，乳化剂或表面活性剂的亲油性增大，亲水性减弱，形成反胶团，因此，非离子乳化剂或表面活性剂的亲水基与水形成的氢键强度减弱，甚至断裂，将导致乳化剂或表面活性剂从水溶液中析出，即产生浊点现象。温度降低，由于非离子乳化剂或表面活性剂的亲水性大于亲油性，它与水形成正胶团，因此，也将产生类似的浊点现象；只有当体系处在某个中间温度，非离子乳化剂或表面活性剂则能形成层状胶团，从而真正达到平衡，体系也维持平衡和稳定。因此，纳米乳需要在常温下保存。

第十六，乳化剂或表面活性剂的选择上首先需要考虑的就是它的亲水亲油平衡(HLB)值，如选择HLB介于8～18之间乳化剂或表面活性剂，则它将形成O/W型纳米乳，而选择3～6之间的乳化剂或表面活性剂则易形成W/O型纳米乳。本发明设计选择的乳化剂或表面活性剂Labrasol主要来源于植物，它的HLB值为14，它适用于功效成分制剂的高HLB值的非离子型两性辅料。而作为助乳化剂或助表面活性剂的Plurol Oleique CC 497主要作为非离子型乳化剂及纳米乳的助表剂，将两种表面活性剂按一定比例混合能形成混合膜，可以制得更为稳定的复合纳米乳制剂。

具体实施方式

1、主要原料：

①空白纳米乳主要制备原料：肉豆蔻酸异丙酯(IPM)，辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯(Labrasol)，聚甘油脂肪酸酯(Plurol Oleique CC497)，纯蒸馏水，无水乙醇等；②主要功效成分：类肉毒素(六胜肽)；③辅助功效成分：维生素E，蛋黄卵磷脂，人参皂苷，红景天素，超氧化物歧化酶(SOD)，还原型谷胱甘肽(GSH)，胎牛血清，透明质酸，神经酰胺第三部分：皮肤外用固态类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳制备；④冷冻干燥赋形保护剂：甘露醇，甘氨酸。

2、主要配制器材

十万分之一电子天平、万分之一电子天平、千分之一药物天平、液体快速混合器、定时恒温磁力搅拌器、石英管玻璃双重蒸馏水器、大容量低温离心机、冷冻干燥机、无菌过滤器、各种规格容器、烧瓶、烧杯、吸管、采血器等。

一、空白纳米乳制备(以配制100g为例)：

①用千分之一药物天平准确称取15g重量的肉豆蔻酸异丙酯，并立即置于经过洗消过的100mL洁净三角烧瓶之中，加盖后，用彩色记号笔清楚地标记为油相(A)15g。

②按照事先已设计好的辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯∶聚甘油脂肪酸酯等于3∶1的比例，分别准确称取36g辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯和12g聚甘油脂肪酸酯，并将两者置于经过洗消过的100mL洁净三角烧瓶之中；加盖，并将此三角烧瓶迅速置于液体快速混合器上，打开液体快速混合器，并将其调至II档，充分混合均匀，使之形成乳化剂/助乳化剂(S/C)混合物，3-5min后，关闭液体快速混合器，取下三角烧瓶，并用彩色记号笔清楚标记为S/C混合物(B)48g。

③再按油相(A)∶S/C混合物(B)∶纯蒸馏水(C)＝15∶45∶40的比例，分别取45g辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯和聚甘油脂肪酸酯充分混合形成的S/C混合物(B)，40g的纯蒸馏水(C)依此加入上述(A)中的100mL三角烧瓶之中，加盖，固定于定时恒温磁力搅拌器上。

④检查固定放置牢固后，立即启动定时恒温磁力搅拌器开关，在室温25℃条件下，以200rpmmin^-1的转速磁力搅拌30min。

⑤关闭定时恒温磁力搅拌器，取下100mL三角烧瓶，观察其外观为淡淡蓝色，清亮，透明，流体性和分散性好，有明显可见的乳光，即为100g的皮肤外用空白纳米乳。

二、皮肤外用液态类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳制备(以配制100g为例)：

①用千分之一药物天平准确称取10g重量的肉豆蔻酸异丙酯，立即置于经过洗消过的100mL洁净三角烧瓶之中。

②再用万分之一的精密分析天平分别称取维生素E(VE)2g，蛋黄卵磷脂0.8g，人参皂苷0.2g，红景天素10mg，加入至已盛有10g肉豆蔻酸异丙酯(IPM)的100mL三角烧瓶之中，充分混合，尽之可能溶解；实在不能溶解的部分，可用10mL吸管缓慢滴加分析醇(AR级)的无水乙醇，以促使其完全溶解，并用记号笔清楚标记为油相(A)。

③再用十万分之一的精密分析天平分别称取六胜肽5mg、超氧化物歧化酶(SOD)1mg(丁氏SOD微量快速测定法定量的6000U)，还原型谷胱甘肽(GSH)0.5g，胎牛血清5g，透明质酸50mg，神经酰胺50mg，置于同一个经过洗消灭菌的50mL洁净的三角烧瓶之中。

④直接加入40mL的蒸馏水至上述盛有各种功效成分的50mL三角烧瓶之中，加盖，并将此三角烧瓶迅速置于液体快速混合器上；打开液体快速混合器，并将其调至II档，充分混合均匀使之完全溶解，3-5min后，关闭液体快速混合器，取下三角烧瓶，并用彩色记号笔清楚标记为水相(C)。

⑤按照事先已设计好的辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯∶聚甘油脂肪酸酯等于3∶1的比例，分别准确称取36克辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯和12克聚甘油脂肪酸酯，并将两者置于经过洗消过的100mL洁净三角烧瓶之中；加盖，并将此三角烧瓶迅速置于液体快速混合器上，打开液体快速混合器，并将其调至II档，充分混合均匀，使之形成乳化剂/助乳化剂(S/C)混合物，3-5分钟后，关闭液体快速混合器，取下三角烧瓶，并用记号笔清楚标记为S/C混合物(B)。

⑥最后，再按油相(A)∶S/C混合物(B)∶水相(C)等于15∶45∶40的比例，取40g的水相(C)直接加入至上述油相(A)中的100mL三角烧瓶中；然后，再取45g辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯和聚甘油脂肪酸酯充分混合形成的S/C混合物(B)直接加入至上述油相(A)和水相(C)混合的100mL三角烧瓶中。

⑦立即选用定时恒温磁力搅拌器在室温25℃条件下，以200rpmmin^-1的转速磁力搅拌30min。

⑧关闭定时恒温磁力搅拌器，取下100mL三角烧瓶，观察其外观为清亮，透明，流体性和分散性好，有明显可见的乳光，即为100g可供皮肤外用的液态类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳。

三、皮肤外用固态类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳制备(以配制100g为例)：

①用千分之一药物天平准确称取10g重量的肉豆蔻酸异丙酯，立即置于经过洗消过的100mL洁净三角烧瓶之中。

②再用万分之一的精密分析天平分别称取维生素E(VE)2g，蛋黄卵磷脂0.8g，人参皂苷0.2g，红景天素10mg，加入至已盛有10g肉豆蔻酸异丙酯(IPM)的100mL三角烧瓶之中，充分混合，尽之可能溶解；实在不能溶解的部分，可用10mL吸管缓慢滴加分析醇(AR级)的无水乙醇，以促使其完全溶解，并用记号笔清楚标记为油相(A)。

③再用十万分之一的精密分析天平分别称取六胜肽5mg、超氧化物歧化酶(SOD)1mg(丁氏SOD微量快速测定法定量的6000U)，还原型谷胱甘肽(GSH)0.5g，胎牛血清5g，透明质酸50mg，神经酰胺50mg，置于同一个经过洗消灭菌的50mL洁净的三角烧瓶之中。

④直接加入40mL的蒸馏水至上述盛有各种功效成分的50mL三角烧瓶之中，加盖，并将此三角烧瓶迅速置于液体快速混合器上；打开液体快速混合器，并将其调至II档，充分混合均匀使之完全溶解，3-5min后，关闭液体快速混合器，取下三角烧瓶，并用彩色记号笔清楚标记为水相(C)。

⑤按照事先已设计好的辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯∶聚甘油脂肪酸酯等于3∶1的比例，分别准确称取36克辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯和12克聚甘油脂肪酸酯，并将两者置于经过洗消过的100mL洁净三角烧瓶之中；加盖，并将此三角烧瓶迅速置于液体快速混合器上，打开液体快速混合器，并将其调至II档，充分混合均匀，使之形成乳化剂/助乳化剂(S/C)混合物，3-5分钟后，关闭液体快速混合器，取下三角烧瓶，并用记号笔清楚标记为S/C混合物(B)。

⑥最后，再按油相(A)∶S/C混合物(B)∶水相(C)等于15∶45∶40的比例，取40g的水相(C)直接加入至上述油相(A)中的100mL三角烧瓶中；然后，再取45g辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯和聚甘油脂肪酸酯充分混合形成的S/C混合物(B)直接加入至上述油相(A)和水相(C)混合的100mL三角烧瓶中。

⑦立即选用并启动定时恒温磁力搅拌器，在室温25℃条件下，以200rpmmin^-1的转速磁力搅拌30min。

⑧关闭定时恒温磁力搅拌器，取下100mL三角烧瓶，观察其外观为清亮，透明，流体性和分散性好，有明显可见的乳光，即为100g可供皮肤外用的液态类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳。

⑨用千分之一药物天平准确称取22g甘露醇和3g甘氨酸，分别加入上述皮肤外用的液态类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳中，加盖，立即用定时恒温磁力搅拌器在室温25℃条件下，以200rpmmin^-1的转速磁力搅拌30min后，关闭定时恒温磁力搅拌器，取下100mL三角烧瓶。

⑩100mL三角烧瓶打开瓶盖，先置于-20℃冰箱预冻，12h后取出，然后置于-50℃的环境中保持3.5h，待达到预冻效果之后，立即置于冷冻干燥机中；开动真空系统，将冻干箱内压力抽至7Pa，并保持此真空度；让此复合纳米乳样品自然升温至-20℃，保温8h，使其中大部分水分升华；最后，缓慢将温度升至0℃，再通过加热板将此复合纳米乳样品温度缓慢加热至30℃，去除残余水分，在真空状态下压盖，即可得到冷冻干燥后的皮肤外用固态类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳。

另外，如需要将此固态类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳再次转化为液态类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳，只要在此固态类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳中加入40mL蒸馏水，置于液体快速混合仪器上振摇3-5min，此时，固态类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳可迅速分散于蒸馏水之中，再次形成均匀一致、流体性和分散性较好的液态类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳。

本发明所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行的描述，并非对本发明构思和范围进行限定，在不脱离本发明设计思想的前题下，本领域中的学者或工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的保护范围，本发明请求保护的技术内容，已经全部记在权利要求书中。

Claims (4)

1.一种皮肤外用液态和固态类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳，其特征在于：

液态类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳是由下述重量份配比的原料制成：

肉豆蔻酸异丙酯5-15克、维生素E 2-10克、蛋黄卵磷脂0.5-5.0克、人参皂苷0.1-2.0克、红景天素0.003-0.03克、六胜肽0.001-0.01克、超氧化物歧化酶0.0002-0.002克、还原型谷胱甘肽0.2-2.0克、胎牛血清2-20克、透明质酸0.02-0.2克、神经酰胺0.02-0.2克、蒸馏水35-45克、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯30-40克、聚甘油脂肪酸酯10-15克；

固态类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳是由下述重量份配比的原料制成：

肉豆蔻酸异丙酯5-15克、维生素E2-10克、蛋黄卵磷脂0.5-5.0克、人参皂苷0.1-2.0克、红景天素0.003-0.03克、六胜肽0.001-0.01克、超氧化物歧化酶0.0002-0.002克、还原型谷胱甘肽0.2-2.0克、胎牛血清2-20克、透明质酸0.02-0.2克、神经酰胺0.02-0.2克、蒸馏水35-45克、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯30-40克、聚甘油脂肪酸酯10-15克、甘露醇15-30克、甘氨酸2-8克。

2.根据权利要求1所述的皮肤外用液态和固态类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳，其中：

液态类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳各原料最佳的重量配比是：

肉豆蔻酸异丙酯10克、维生素E 2克、蛋黄卵磷脂0.8克、人参皂苷0.2克、红景天素0.01克、六胜肽0.005克、超氧化物歧化酶0.001克、还原型谷胱甘肽0.5克、胎牛血清5克、透明质酸0.05克、神经酰胺0.05克、蒸馏水40克、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯36克、聚甘油脂肪酸酯12克；

固态类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳各原料最佳的重量配比是：

肉豆蔻酸异丙酯10克、维生素E2克、蛋黄卵磷脂0.8克、人参皂苷0.2克、红景天素0.01克、六胜肽0.005克、超氧化物歧化酶0.001克、还原型谷胱甘肽0.5克、胎牛血清5克、透明质酸0.05克、神经酰胺0.05克、蒸馏水40克、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯36克、聚甘油脂肪酸酯12克、甘露醇22克、甘氨酸3克。

3.根据权利要求1所述的液态类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)按液态类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳原料的配比，将肉豆蔻酸异丙酯、维生素E、蛋黄卵磷脂、人参皂苷、红景天素共同置于容器中；将容器内原料充分混合、溶解，不能溶解的部分加少许无水醇促进完全溶解，并将作为油相(A)备用；

2)按六胜肽、超氧化物歧化酶、还原型谷胱甘肽、胎牛血清、透明质酸、神经酰胺及适量蒸馏水混合使之完全溶解，再加蒸馏水使之作为水相(C)备用；

3)按辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯、聚甘油脂肪酸酯等于3∶1的比例，置于另一容器之中，充分搅拌均匀，使之形成S/C混合物(B)备用；

4)再按油相(A)∶S/C混合物(B)∶水相(C)等于15∶45∶40的比例，分别取S/C混合物(B)、水相(C)依此加入油相(A)容器中；

5)在室温条件下，选用定时恒温磁力搅拌器，并以200rpmmin-1的转速磁力搅拌30min，即可得到可供皮肤外用的液态类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳。

4.根据权利要求1所述的固态类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳的制备方法，其特征在于包括以下步骤：：

1)按固态类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳原料的配比，将肉豆蔻酸异丙酯、维生素E、蛋黄卵磷脂、人参皂苷、红景天素共同置于容器中；将容器内原料充分混合、溶解，不能溶解的部分加少许无水醇促进完全溶解，并将作为油相(A)备用；

2)按六胜肽、超氧化物歧化酶、还原型谷胱甘肽、胎牛血清、透明质酸、神经酰胺及适量蒸馏水混合使之完全溶解，再加蒸馏水使之作为水相(C)备用；

3)按辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯、聚甘油脂肪酸酯等于3∶1的比例，置于另一容器之中，充分搅拌均匀，使之形成S/C混合物(B)备用；

4)再按油相(A)∶S/C混合物(B)∶水相(C)等于15∶45∶40的比例，分别取S/C混合物(B)、水相(C)依此加入油相(A)容器中；

5)在室温条件下，选用定时恒温磁力搅拌器以200rpmmin-1的转速磁力搅拌30min，再加入甘露醇和克甘氨酸，再以200rpmmin-1的转速磁力搅拌30min，并进行冷冻干燥处理，即可得到可供皮肤外用的固态类肉毒素(六胜肽)复合纳米乳。