CN101213298A

CN101213298A - 参与岩芹酸生物合成的新基因和用于生产岩芹酸的方法

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Publication number: CN101213298A
Application number: CNA2006800241478A
Authority: CN
Inventors: 冈村幸治; 山中阳子; 村本伸彦; 西田生郎
Original assignee: Toyota Motor Corp
Current assignee: Toyota Motor Corp
Priority date: 2005-06-30
Filing date: 2006-06-29
Publication date: 2008-07-02
Anticipated expiration: 2026-06-29
Also published as: CA2614062A1; CA2700545A1; WO2007004694A1; CA2700545C; JPWO2007004694A1; AU2006266760A1; JP4840360B2; AU2006266760B2; CA2614062C; CN101213298B

Abstract

提供了能够促进岩芹酸累积的新基因和使用所述基因生产岩芹酸的方法。此新基因编码以下蛋白质(a)、(b)或(c)：(a)包含SEQ ID NO：4或6所示氨基酸序列的蛋白质；(b)包含在SEQ ID NO：4或6所示氨基酸序列中删除、替换或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列并具有岩芹酰－ACP硫酯酶活性的蛋白质；或者(c)由在严格条件下与包含互补于SEQ ID NO：3或5所示核苷酸序列的核苷酸序列的DNA杂交的DNA编码并具有岩芹酰－ACP硫酯酶活性的蛋白质。

Description

参与岩芹酸生物合成的新基因和用于生产岩芹酸的方法

技术领域

本发明涉及参与岩芹酸生物合成的新基因。本发明尤其涉及源自胡萝卜的Δ4-棕榈酰-ACP去饱和酶基因和源自植物的岩芹酰-ACP硫酯酶基因。本发明还涉及使用这些新基因产生岩芹酸的方法。

背景技术

近年，在树脂材料领域，从建立再循环社会而不依赖石油资源观点出发，正在进行源自生物量的生产树脂的技术开发。

尼龙是一种人工合成的塑料，其自氨基羧酸作为原材料合成，或通过联氨与二羧酸的聚合合成。大多数原材料单体是通过化学工业技术自化石资源生产的。使用癸二酸(1，10-癸二酸)作为尼龙的源自生物量的原材料。该癸二酸是通过对提取自蓖麻油植物的蓖麻油使用苛性碱裂解制备的，用作尼龙6，10的原材料。但是尼龙6，10的应用是有限的，因此尼龙6，10不能广泛地用作树脂材料。

已知二羧酸可通过氧化分解不饱和脂肪酸而制备。至今为止，研究了制备作为尼龙6，6的原材料单体己二酸的原材料岩芹酸(顺-6-十八碳烯酸)的技术(非专利文献1-8)。

包括芫荽、胡萝卜等在内的伞形科植物(Umbellifers)含有占种子的脂肪和油含量80％或以上的岩芹酸。但是，由于它们的种子产量低，因此不适用于产生岩芹酸。在质体(叶绿体)中新合成了植物脂肪酸。如下合成岩芹酸。将前体-棕榈酰ACP通过Δ4-棕榈酰-ACP去饱和酶(下文中称为4DES)转化为顺-4-十六烯酰ACP，然后通过原核型脂肪酸合成酶复合体延长链以产生岩芹酰-ACP。然后，通过岩芹酰-ACP硫酯酶(下文中称为PTE)合成游离的岩芹酸，并转运至细胞质。认为在合成岩芹酸的植物中存在对岩芹酸的合成特异的一系列生物合成酶和它们的基因。在这些基因中，已克隆了源自芫荽的Δ4-棕榈酰-ACP去饱和酶基因，并导入至本来不产生岩芹酸的拟南芥菜(Arabidopsis thaliana)中，以产生经转化的植物。虽然已证实了岩芹酸的累积，但累积量仅占种子中脂肪和油含量的约1％。

关于PTE，已显示了酶活性的存在(非专利文献8)，但尚未克隆其基因。

不仅在质体中的脂肪酸生物合成体系，而且在细胞质内的脂肪酸衍生物的输送、在内质网膜中甘油三酯合成体系均参与了植物中脂肪和油的生产以及组成性脂肪酸的组成。对于使用基因重组技术生产岩芹酸，还需解决许多问题。

专利文献1美国专利号5,430,134

专利文献2国际公开号94/01565

非专利文献1 Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89，11184-11188，1992

非专利文献2 Plant J.17(6)，679-688，1999

非专利文献3 Prog.Lipid Res.33(1/2)，155-163，1994

非专利文献4 Plant Physiol.124，681-692，2000

非专利文献5 Plant Mol.Biol.47，507-518，2001

非专利文献6 Metab.Eng.4，12-21，2002

非专利文献7 Biochim.Biophys.Acta.1212，134-136，1994

非专利文献8 Plant Physiol.104，839-844，1994

非专利文献9 Planta 215：584-595 2002。

发明公开

根据以上所述，本发明的目的是提供能够促进岩芹酸累积的新基因并提供使用此类基因制备岩芹酸的方法。

为了实现上述目的，本发明人进行了深入研究，并新发现了源自伞形科的胡萝卜(Daucus carota)的Δ4-棕榈酰-ACP去饱和酶在岩芹酸合成能力方面优于源自芫荽的Δ4-棕榈酰-ACP去饱和酶。而且，本发明人首次成功地分离到岩芹酰-ACP硫酯酶基因，并发明了涉及使用该基因和Δ4-棕榈酰-ACP去饱和酶基因使得实现约2倍岩芹酸合成能力的技术。

本发明包含以下方面：

(1)编码以下蛋白质(a)、(b)或(c)的基因：

(a)包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质；

(b)包含在SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中删除、替换或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列并具有Δ4-棕榈酰-ACP去饱和酶活性的蛋白质；或者

(c)由在严格条件下与包含互补于SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的核苷酸序列的DNA杂交的DNA编码并具有Δ4-棕榈酰-ACP去饱和酶活性的蛋白质。

在上述(b)和(c)中，“具有Δ4-棕榈酰-ACP去饱和酶活性的蛋白质”可描述为通过在培养的植物细胞或植物中表达，能够增加顺-4-十六碳烯酸、岩芹酸(顺-6-十八碳烯酸)、或顺-8-二十碳烯酸(cis-8-icosenoic acid)的累积量的蛋白质。

(2)编码以下蛋白质(a)、(b)或(c)的基因：

(a)包含SEQ ID NO：4或6所示氨基酸序列的蛋白质；

(b)包含在SEQ ID NO：4或6所示氨基酸序列中删除、替换或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列并具有岩芹酰-ACP硫酯酶活性的蛋白质；或者

(c)由在严格条件下与包含互补于SEQ ID NO：3或5所示核苷酸序列的核苷酸序列的DNA杂交的DNA编码并具有岩芹酰-ACP硫酯酶活性的蛋白质。

在上述(b)和(c)中，“具有岩芹酰-ACP硫酯酶活性的蛋白质”可描述为通过在培养的植物细胞或植物中与具有Δ4-棕榈酰-ACP去饱和酶活性的蛋白质共表达该蛋白质，能够增加顺-4-十六碳烯酸、岩芹酸(顺-6-十八碳烯酸)、或顺-8-二十碳烯酸的累积量的蛋白质，其中通过共表达获得的累积量大于通过仅表达具有Δ4-棕榈酰-ACP去饱和酶活性的蛋白质而获得的累积量。

本说明书包括在本申请的优先权文件：日本专利申请号2005-191775的说明书和/或附图中公开的部分或全部内容。

附图简述：

图1显示了多种类型的岩芹酰-ACP硫酯酶和油酰基-ACP硫酯酶的氨基酸序列同源性(％)。图1中，DcPTE是指源自胡萝卜(Daucus carota)的岩芹酰-ACP硫酯酶，CsPTE是指源自芫荽(Coriandrum sativum)的岩芹酰-ACP硫酯酶，AgPTE是指源自莳萝(Anethum graveolens)的岩芹酰-ACP硫酯酶，CsOTE是指源自芫荽(Coriandrum sativum)的油酰基-ACP硫酯酶，且DcOTE是指源自胡萝卜(Daucus carota)的油酰基-ACP硫酯酶。

图2-1显示了多种类型的岩芹酰-ACP硫酯酶和油酰基-ACP硫酯酶的氨基酸序列的比对。

图2-2显示了多种类型的岩芹酰-ACP硫酯酶和油酰基-ACP硫酯酶的氨基酸序列比对。

图3显示了源自胡萝卜(Daucus carota)的Δ4-棕榈酰-ACP去饱和酶(称为Dc4DES)的氨基酸序列和源自芫荽(Coriandrum sativum)的Δ4-棕榈酰-ACP去饱和酶(称为Cs4DES)的氨基酸序列的比对。

图4为利用大肠杆菌(Escherichia coli)的纯化的源自胡萝卜(Daucuscarota)的岩芹酰-ACP硫酯酶(称为DcPTE)、源自芫荽(Coriandrumsativum)的油酰基-ACP硫酯酶(称为CsOTE)、和源自胡萝卜(Daucuscarota)的油酰基-ACP硫酯酶(称为DcOTE)的组氨酸标记蛋白质洗脱液中，对每一级分进行SDS-PAGE的结果的照片。

图5显示了在纯化的DcPTE和DcOTE的组氨酸标记蛋白质洗脱液中使用酰基ACP作为底物反应后，进行SDS-PAGE的结果的照片。

图6为显示对图5所示照片中包含的条带使用图像分析软件进行定量的结果的特征图。

图7为显示在实施例中制备的用于持续全身表达的载体的组成图。

图8为显示在实施例中制备的用于种子特异性表达的载体的组成图。

图9显示了对经转化植物的种子进行脂肪酸组成分析的结果图。

本发明的优选实施方案

下文中参照附图详细地描述了本发明的新基因和制备岩芹酸的方法。

1.分离源自胡萝卜(Daucus carota)的Δ4-棕榈酰-ACP去饱和酶基因 (Dc4DES基因)

Dc4DES基因编码包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质(Dc4DES)。Dc4DES为具有对作为C16饱和脂肪酸的棕榈酰-ACP(棕榈酰-酰基载体蛋白)的Δ4位置去饱和活性的蛋白质。作为Dc4DES基因的一个例子，为SEQ ID NO：1所示的编码包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质的基因。

而且，在本发明中，Dc4DES基因可为编码包含在SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中删除、替换或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列并具有Δ4-棕榈酰-ACP去饱和酶活性的蛋白质的基因。此处，术语“多个氨基酸”是指2至150个，优选地2至80个，且更优选地2至40个氨基酸。欲进行删除、替换或添加的区域的例子包括但不限于SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中第1至99位氨基酸之间的区域或第270至386位氨基酸之间的区域，优选地SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中第1至99位氨基酸之间的区域或第301至386位氨基酸之间的区域，更优选地SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中第1至53位氨基酸之间的区域或第381至386位氨基酸之间的区域。

而且，在本发明中，Dc4DES基因可为编码包含与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列具有50％或更高、优选地70％或更高、更优选地90％或更高同源性的氨基酸序列并具有Δ4-棕榈酰-ACP去饱和酶活性的蛋白质的基因。上述多个代表同源性的数值可使用序列分析软件DNASIS(HitachiSoftware Engineering Co.Ltd.)，例如通过执行最大匹配法的指令而求得。其中使用的参数为缺省参数(起始设定的参数)。

而且，本发明的Dc4DES基因可为编码这样的蛋白质的基因，所述蛋白质为由在严格条件下与包含互补于SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的核苷酸序列的DNA杂交的DNA编码并具有Δ4-棕榈酰-ACP去饱和酶活性的蛋白质。此处，术语“在严格条件下杂交”是指例如即使于溶液(6×SSC，0.5％SDS，和50％甲酰胺)中42℃加热后，于溶液(0.1×SSC和0.5％SDS)中68℃洗的条件下，仍然观察到阳性杂交信号。

术语“Δ4-棕榈酰-ACP去饱和酶活性”是指对棕榈酰-ACP Δ4位置的去饱和活性。此活性的有无可如下测试。将编码欲测试的蛋白质的DNA片段导入不累积顺-4-十六碳烯酸、岩芹酸和顺-8-二十碳烯酸的宿主植物细胞(如烟草或拟南芥菜)，从而基因能发挥作用。测定在导入了DNA片段的植物体的脂质中顺-4-十六碳烯酸、岩芹酸和顺-8-二十碳烯酸的有无。例如，使用通过在持续性表达启动子或特异表达启动子下游定位有Dc4DES基因，即所述基因定位于受相关启动子调节的位置而制备的表达载体转化不累积顺-4-十六碳烯酸、岩芹酸和顺-8-二十碳烯酸的植物细胞(如烟草或拟南芥菜)。提取由此制备的经转化植物细胞或自细胞再生的植物体的种子的脂类。将提取的脂类用甲醇盐酸等处理得到脂肪酸甲酯。通过气相色谱等测定其中含有的岩芹酸甲酯的量、顺-4-十六碳烯酸脂肪酸甲酯的量、顺-8-二十碳烯酸脂肪酸甲酯的量。如果可以检测到这些脂肪酸甲酯，则可以说受试蛋白质具有Δ4-棕榈酰-ACP去饱和酶活性。如果未能检测到这些脂肪酸甲酯，则可以说受试蛋白质缺乏Δ4-棕榈酰-ACP去饱和酶活性。

通过将Dc4DES基因以能发挥功能的形式导入宿主植物细胞，则Dc4DES基因具有在所述细胞中发挥促进岩芹酸合成的功能。例如，使用通过在持续性表达启动子或特异表达启动子下游定位有Dc4DES基因，即所述基因定位于受相关启动子调节的位置构建的表达载体转化植物细胞。将由此获得的经转化植物生长为植物体，可促进植物体中岩芹酸的合成。种子特异的表达启动子优选地用作此种特异的表达启动子。使用种子特异的表达启动子，可在种子中累积岩芹酸。

可如下检测岩芹酸。例如，将经转化的植物生长为植物体，然后粉碎种子等组织。然后将产物与盐酸-甲醇溶液混合，以将组织中含有的岩芹酸甲酯化，然后用己烷提取。可用气相色谱-质谱(GC-MS)设备检测己烷提取物。自GC-MS设备的检测结果可分析促进岩芹酸合成的能力。

2.岩芹酰-ACP硫酯酶的酶基因(PTE基因)

尽管已指出在芫荽(Coriandrum sativium)中存在PTE基因，但该基因既未被分离也未被克隆。本发明首次分离和克隆了此PTE基因。PTE基因为编码对在Δ6位置处具有双键的酰基ACP(酰基载体蛋白)如岩芹酰-ACP有高特异性的硫酯酶(PTE)的基因。PTE参与游离岩芹酸的合成。

PTE基因的一个例子为编码包含SEQ ID NO：4或6所示氨基酸序列的源自胡萝卜的PTE的基因。具体地，编码包含SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的蛋白质的基因示于SEQ ID NO：3。编码包含SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的蛋白质的基因示于SEQ ID NO：5。此外，源自胡萝卜的PTE基因和PTE分别称为DcPTE基因和DcPTE。

本发明的DcPTE基因可为编码包含在SEQ ID NO：4或6所示氨基酸序列中删除、替换或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列并具有活性的蛋白质的基因。此处，术语“多个氨基酸”是指2至188个，优选地2至64个，且更优选地2至44个氨基酸。欲进行删除、替换或添加的区域的例子包括但不限于SEQ ID NO：4所示氨基酸序列中第1至70位氨基酸之间的区域或第311至375位氨基酸之间的区域，优选地SEQ ID NO：4所示氨基酸序列中第1至57位氨基酸之间的区域或第368至375位氨基酸之间的区域，更优选地SEQ ID NO：4所示氨基酸序列中第1至32位氨基酸之间的区域。

而且，编码包含在SEQ ID NO：4或6所示氨基酸序列中导入了替换、删除或插入的氨基酸序列的蛋白质的PTE基因可使用公知的技术如Kunkel法或Gapped duplex法或者根据它们的方法向SEQ ID NO：3或5所示核苷酸序列中导入目的突变而获得。突变的导入可使用例如利用了定点诱变的诱变试剂盒(如Mutan-K(TAKARA)或Mutan-G(TAKARA))，或者使用LA PCR体外诱变系列试剂盒(TAKARA)实施。

而且，在本发明中，DcPTE基因可为编码包含与SEQ ID NO：4或6所示氨基酸序列具有50％或更高、优选地70％或更高、更优选地90％或更高同源性的氨基酸序列并具有岩芹酰-ACP硫酯酶活性的蛋白质的基因。上述多个代表同源性的数值可使用序列分析软件DNASIS(HitachiSoftware Engineering Co.Ltd.)，例如通过执行最大匹配法的指令而求得。其中使用的参数为缺省参数(起始设定的参数)。

而且，本发明的DcPTE基因可为编码这样的蛋白质的基因，所述蛋白质为由在严格条件下与包含互补于SEQ ID NO：3或5所示核苷酸序列的核苷酸序列的DNA杂交的DNA编码并具有岩芹酰-ACP硫酯酶活性的蛋白质。此处，术语“在严格条件下杂交”是指例如即使于溶液(6×SSC，0.5％SDS，和50％甲酰胺)中42℃加热后，于溶液(0.1×SSC和0.5％SDS)中68℃洗的条件下，仍然观察到阳性杂交信号。

术语“岩芹酰-ACP硫酯酶活性”是指将岩芹酰-ACP降解为岩芹酸和ACP的活性。此活性可如下测试。混合25mM Tris-HCl(pH8.0)、1mMDTT、岩芹酰-ACP和水，然后25℃预孵育5分钟。将15μg受试蛋白质添加至100μl反应液中，然后25℃反应30分钟。反应后，通过SDS-PAGE分离未反应的岩芹酰-ACP和作为反应产物的游离ACP。电泳后，将凝胶进行CBB染色，然后使用光密度计定量作为反应产物的游离ACP(通过SDS-PAGE分离)的量。由此测定了所添加的受试蛋白质的硫酯酶活性。备选地，混合25mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM DTT、岩芹酰基用氚标记的岩芹酰-ACP和水，然后25℃预孵育5分钟。将受试蛋白质添加至100μl反应液，然后25℃反应30分钟。反应后，添加50μl异丙醇终止反应。其后通过酶反应产生的岩芹酸通过薄层层析分离。由此产生的岩芹酸的量使用闪烁计数仪定量，从而测定所添加蛋白质的硫酯酶活性。

此外，本发明中的PTE基因的例子不限于编码源自胡萝卜的PTE的基因。PTE基因的实例包括源自生物合成岩芹酸的植物的PTE基因。生物合成岩芹酸的植物的实例除了包括胡萝卜外，还包括伞形科中的如芫荽(Coriandrum sativium)、芹菜(Petroselium crispum)、莳萝(Anethumgraveolens)和五加科(Araliaceae)植物如常青藤(Hedera helix)和楤木(Aralia elata)。

当PTE基因获得自胡萝卜以外的植物时，例如可使用SEQ ID NO：3或5所示的DcPTE基因核苷酸序列中第187至1128之间的核苷酸区域的全部或部分作为探针。当使用长的核酸序列(＞100bp)作为探针时，也可在中等或高度严格条件下进行筛选，以获得具有80％或更高同源性的来自目的样本的信号。此外，也可使用非常短的探针。例如，可使用的寡核苷酸长度为至少约10个，优选地至少约15个，且更优选地20个核苷酸。当使用短区域作为探针时，需要较长探针情况下高的序列同一性。

特别地，使用上述探针和自胡萝卜以外的植物提取的基因组DNA，通过Southern杂交，可分离和鉴定来自该植物基因组的PTE基因。此外，该植物的PTE基因还可不使用基因组DNA，而使用自该植物提取的mRNA作为模板合成的cDNA来分离和鉴定。

基于SEQ ID NO：3或5所示的DcPTE基因的核苷酸序列，自芫荽(Coriandrum sativium)和莳萝(Anethum graveolens)分离的DcPTE同源基因的核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：7和9。此外，由源自芫荽的SEQ IDNO：7所示的PTE基因推定的氨基酸序列(CsPTE)示于SEQ ID NO：8。由源自莳萝的SEQ ID NO：9所示的PTE基因推定的氨基酸序列(AgPTE)示于SEQ ID NO：10。此外，多种植物的硫酯酶蛋白间的氨基酸同源性(％)示于图1中。

如图1所示，PTE组中的成员(包括DcPTE、CsPTE和AgPTE)具有高同源性。另外，DcOTE显示与CsOTE具有高同源性。相反，PTE组与OTE组显示相对低的同源性。因此，可以说与PTE组中的PTE蛋白质具有高于80％的氨基酸同源性的新蛋白质很可能包括在PTE组中。因此，本发明的PTE基因的例子也包括编码包含与SEQ ID NO：4、6、8或10所示氨基酸序列的同源性高于80％的氨基酸序列的蛋白质的DNA。

此外，图2显示了DcPTE、CsPTE、AgPTE、DcOTE和CsOTE的氨基酸序列比对。在OTE和PTE之间存在约30％的氨基酸差异。具体地，OTE组中的一些氨基酸与PTE组中的极性不同。在以下说明中，术语“共有序列中的第X位(氨基酸)(X为自然数)”是指在图2的比对中对于上排所赋予的数值。在PTE组中共有序列的第120、125和373位氨基酸为非极性的，而在OTE组中的这些氨基酸为极性的。而且，在PTE组中共有序列的第140和195位氨基酸为极性的，而在OTE组中的这些氨基酸为非极性的。

此外，OTE组中的一些带电荷氨基酸与PTE组中的极性不同。在PTE组中共有序列的第149和246位氨基酸为不带电荷的，而在OTE组中的这些氨基酸为带正电荷的。此外，在PTE组中共有序列的第244位氨基酸为带负电荷的，而在OTE组中的该氨基酸为不带电荷的。此外，在PTE组中共有序列的第270位氨基酸为带正电荷的，而在OTE组中的该氨基酸为不带电荷的。

认为在这些位置处氨基酸极性的有无和电荷的变化导致了底物选择性的变化。而且，已知在底物结合位点处氨基酸侧链结构的不同导致底物选择性的变化。在PTE组中共有序列的第89、147、161、177、192、196、214、217、223、238、270、287和338位氨基酸的侧链结构不同于OTE组的这些氨基酸的侧链结构。通过替换OTE组和PTE组之间不同的这些氨基酸可能改变对酰基ACP的底物特异性。

当将PTE基因与Δ4-棕榈酰-ACP去饱和酶基因一起以PTE基因能发挥功能的形式导入宿主植物细胞，PTE基因具有显著促进宿主植物细胞中岩芹酸合成的功能。

例如，通过将PTE基因定位于持续性表达启动子或特异表达启动子下游而构建表达载体，即所述PTE基因定位于受相关启动子调节的位置。用Δ4-棕榈酰-ACP去饱和酶基因转化的植物细胞(参见上述1)进一步用由此构建的表达载体转化。备选地，也可使用通过将PTE基因和Δ4-棕榈酰-ACP去饱和酶基因定位于持续性表达启动子或特异表达启动子下游而构建的表达载体转化植物细胞。在这两种情况下，均可将由此获得的经转化植物生长为植物体，并在该植物体中能促进岩芹酸合成。

表达载体

在本发明中，表达载体包含上述1和2描述的Dc4DES基因和/或PTE基因。对本发明所使用的表达载体没有特别的限制，只要是质粒型载体或染色体导入型载体(其可掺入宿主生物基因组)即可。此类载体的实例包括质粒DNAs、噬菌体DNAs、反转录转座子DNAs和人工染色体DNAs(YAC：酵母人工染色体)。

此类质粒DNAs的实例包括YCp大肠杆菌-酵母穿梭载体(如pRS413，pRS414，pRS415，pRS416，YCp50，pAUR112，和pAUR123)，YEp大肠杆菌-酵母穿梭载体(如pYES2和YEp13)，YIp大肠杆菌-酵母穿梭载体(如pRS403，pRS404，pRS405，pRS406，pAUR101，和pAUR135)，源自大肠杆菌的质粒(如ColE质粒，例如pBR322，pBR325，pUC18，pUC19，pUC118，pUC119，pTV118N，pTV119N，pBluescript，pHSG298，pHSG396，和pTrc99A；p15A质粒，例如pACYC177和pACYC184；以及pSC101质粒，例如pMW118，pMW119，pMW218，和pMW219)，源自农杆菌(Agrobacterium)的质粒(如pBI101)，以及源自枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的质粒(如pUB110和pTP5)。此类噬菌体DNAs的实例包括λ噬菌体(如Charon4A，Charon21A，EMBL3，EMBL4，λgt10，λgt11，和λZAP)，

M13mp18，和M13mp19。反转录转座子的实例包括Ty因子。YAC载体的实例包括pYACC2等。此外，也可使用动物病毒如逆转录病毒和痘苗病毒以及昆虫病毒如杆状病毒(baculovirus)的载体。

需要将Dc4DES基因和/或PTE基因以使所述基因能表达的状态导入此类表达载体。所述“使所述基因能表达的状态”是指通过将Dc4DES基因和/或PTE基因连接至启动子而掺入载体中，从而Dc4DES基因和/或PTE基因可在预定的启动子控制下于所述基因导入的宿主生物中表达。因此，除了Dc4DES基因和/或PTE基因之外，可将启动子和终止子，并且根据需要，将顺式元件如增强子、剪接信号、添加polyA的信号、选择标记、核糖体结合序列(SD序列)等连接入载体。此外，此类选择标记的实例包括抗生素抗性基因如氨苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、潮霉素抗性基因和除草剂抗性基因如双丙氨膦抗性基因。

待用于本发明的表达载体中包含的启动子的实例包括但不特别地限于持续性表达启动子、组织特异的表达启动子和刺激诱导性启动子。在这些实例中，优选使用种子特异的表达启动子，以在种子中累积合成的岩芹酸。作为种子特异的表达启动子，可使用源自油菜籽的油菜籽蛋白A启动子、源自拟南芥菜的FAE1启动子、油质蛋白启动子、源自大豆的谷蛋白B1启动子、亚麻的硬脂酰-ACP去饱和酶(SAD)启动子等。

转化体

可使用上述表达载体制备转化体。特别地，可通过将上述表达载体导入宿主而制备转化体，从而使得在载体中包含的Dc4DES基因和/或PTE基因可表达。宿主植物所属的科包括但不特别地限于伞形科、茄科(Solanaceae)、芸苔科(Brassicaceae)、禾本科(Gramineae)、豆科(Leguminosae)、蔷薇科(Rosaceae)、菊科(Asteraceae)、百合科(Liliaceae)、石竹科(Caryophyllaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、旋花科(Convolvulaceae)、藜科(Chenopodiaceae)。属于伞形科或芸苔科的植物是尤其希望的宿主植物。

当宿主为植物时，经转化的植物可如下获得。本发明的待转化的对象植物是指任一完整的植物体、植物器官(如叶、花瓣、茎、根、和种子)、植物组织(如表皮、韧皮部、薄壁组织、木质部、维管束、栅状组织、海绵状组织)、培养的植物细胞。

可使用常规的转化方法将表达载体导入植物，如真空浸润法(农杆菌法)、粒子枪法、PEG法、电穿孔法等。

例如，可根据已知的技术进行真空浸润法(Shujunsha，ExperimentalProtocols for Model Plants，2001，109-113页)。当使用农杆菌时，将表达载体导入合适的农杆菌(如根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404株)。例如根据叶盘法(Hirofumi Uchimiya编著，GeneticEngineering Manuals for Plants，1990，27-31页，Kodansha Scientific Ltd.东京)，使用该菌株感染宿主(如烟草)的无菌培养叶片，也可获得经转化的植物。

此外，当使用粒子枪法时，可直接使用植物体、植物器官、植物组织本身。备选地，可从其制备切片或原生质体并使用。如此制备的样本可用基因导入设备(如PDS-1000(BIO-RAD公司))处理。处理条件根据植物或样本的不同而不同。处理通常于压力约450psi至2000psi之间，距离约3cm至12cm之间进行。

作为转化的结果而获得的肿瘤组织、枝条、毛状根等可直接用于细胞培养、组织培养或器官培养。而且，此类肿瘤组织、枝条、毛状根等可使用常规的已知植物组织培养法，通过施与合适浓度的植物激素(如生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸、乙烯和油菜素内酯)再生为植物体。

可通过PCR法、Southern杂交法、Northern杂交法等证实基因被掺入了宿主。例如，自转化体制备DNA，设计DNA特异的引物，然后进行PCR。PCR可在用于制备质粒的相似条件下进行。接下来将扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、或毛细管电泳，然后使用溴化乙锭、SYBR Green液等染色。然后，通过扩增产物以单一条带的形式被检测到，从而证实成功的转化。此外，也可以使用事先用荧光染料等标记的引物进行PCR来检测扩增产物。此外，此处可采用的方法还包括将扩增产物结合至固相如微孔板，然后通过荧光反应、酶反应等证实扩增产物。

另外，宿主的实例包括属于埃希氏菌属(Escherichia)(如大肠杆菌)、芽孢杆菌属(Bacillus)(如枯草芽孢杆菌)、假单胞菌属(Pseudomonas)(如恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida))或根瘤菌属(Rhizobium)(如苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti))的细菌；酵母如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；动物细胞如COS细胞和CHO细胞；以及昆虫细胞如Sf9。

当使用细菌如大肠杆菌作为宿主时，重组载体优选地为在细菌中可自主复制的，且同时载体优选地包含有核糖体结合序列、本发明的基因和转录终止序列。大肠杆菌的实例包括大肠杆菌DH5α和大肠杆菌Y1090。枯草菌的实例包括但不限于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。对将重组载体导入细菌的方法没有特别的限制，只要是将DNA导入细菌中的方法即可。此类方法的实例包括使用钙离子的方法[Cohen，S.N.等人：Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.69：2110(1972)]和电穿孔法。

当使用酵母作为宿主时，可使用酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)等。对将重组载体导入酵母的方法没有特别的限制，只要是将DNA导入酵母中的方法即可。此类方法的实例包括使用电穿孔法[Becker，D.M.等人：Methods.Enzymol.194：182(1990)]、原生质球法[Hinnen，A.等人：Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75：1929(1978)]、和醋酸锂法[Itoh，H.J.Bacteriol.153：163(1983)]。

当使用动物细胞作为宿主时，可使用猴细胞(如COS-7和Vero)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、小鼠L细胞、大鼠GH3、人FL细胞等。用于将重组载体导入动物细胞的方法的实例包括电穿孔法、磷酸钙法和脂转染法。

当使用昆虫细胞作为宿主时，可使用Sf9细胞等。用于将重组载体导入昆虫细胞的方法的实例包括磷酸钙法、脂转染法和电穿孔法。

用于产生岩芹酸的方法

在上述经转化的植物中可促进岩芹酸合成，因为导入的Dc4DES基因和/或PTE基因的功能。可使用常规的公知技术提取经转化的植物中合成和累积的岩芹酸。

自植物组织(如产油型植物的种子或果实)压和提取脂肪和油的方法主要分成两种方法：压榨法和提取法。自具有高的脂肪和油含量的组织如油菜籽的种子获得脂肪和油的方法包括用滚动压榨机等粗碎和压组织，在75℃至85℃之间加热，使用压榨机如螺旋式压榨机压榨，然后提取脂肪和油(压榨法)。另外，对于具有低的脂肪和油含量的原材料如大豆，使用溶剂如己烷自组织提取脂肪和油(提取法)。通过这些步骤产生的脂肪和油是脂肪酸(包含岩芹酸)和酯如甘油的混合物。因此，其中含有甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯、磷脂等。接下来，将这些脂肪和油水解，获得脂肪酸。分离和纯化由此获得的脂肪酸混合物，从而可获得非常纯的岩芹酸。此外，将醇如甲醇添加至脂肪和油，然后进行反应，可获得醇酯如岩芹酸甲酯。

下面参照实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明的技术范围不解释为受下列实施例的限制。

[实施例1]Dc4DES基因的克隆

植物样本

在本实施例中，使用胡萝卜(Daucus carota L.Natsu-maki(夏天播种)senko gosun，F1品种)作为实验样本。希望使用具有相同同源基因序列的纯种作为基因克隆源，为了实验的方便(可以准备早期开花的样本)，使用F1品种的植物。胡萝卜种子购自OTA SEED Co.Ltd.种子在温控室(Koito-toron，Koito Manufacturing Co.Ltd.)中于25℃，16小时光照，湿度60％的条件下生长。将由此栽培的胡萝卜植物体用作样本。

胡萝卜RNA的制备

自胡萝卜植物体收集约100mg发育阶段不同的未成熟种子和约100mg叶。将种子和叶在液氮冻结下分别粉碎。使用RNeasy plant mini kit(QIAGEN)，根据该试剂盒所提供的方法自粉碎物制备RNA。

用于扩增DNA片段的PCR引物的设计和RT-PCR

使用NCBI网址中的BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)搜索并收集芫荽(Coriandrum sativum L.)Δ4棕榈酰-ACP去饱和酶(Cs4DES)的同源基因。然后使用Genetyx-Win Ver.4.0/ATGC ver.2.0(SoftwareDevelopment)，将由获得的Cs4DES基因(GenBank登录号M93115)编码的多肽的氨基酸序列与由GenBank中登录的多种植物的Δ9硬脂酰-ACP去饱和酶基因编码的多肽的氨基酸序列进行多重比对分析。作为分析结果，设计了以下PCR引物(简并引物)并用于RT-PCR，以扩增对应于所获得的高保守区域的DNA片段。

PF1：5’CAN GAR GAR GCN CTB CCN CAN TA 3’(SEQ ID NO：11)

PR1：5’TCV RVD AGY TTY TCN ACD ATY TT 3’(SEQ ID NO：12)

PR2：5’GCN GYY KCR TGN CKY TTY TCR TC 3’(SEQ ID NO：13)

NF0：5’GAN MTB CCN GAT GAN TAY TTH RTT G 3’(SEQ ID NO：14)

NR1：5’CCY TCN SCN SWM AGH CCN GT 3’(SEQ ID NO：15)

NR2：5’GGC ATN DVD AYY TTB WTY YTC ATC AT 3’(SEQ ID NO：16)

另外，这些核苷酸序列基于以下国际生物化学联合会(InternationalUnion of Biochemistry；IUB)的符号记载。具体地，R是指A或G；Y是指C或T；M是指A或C；K是指G或T；S是指G或C；W是指A或T；H是指A或T或C；B是指G或T或C；V是指G或A或C；D是指G或A或T；和N是指A或C或G或T.

使用表1所列PCR引物对进行RT-PCR。使用一步RT-PCR试剂盒(QIAGEN)用于RT-PCR。根据试剂盒所提供的方法制备反应液的组分。使用热循环仪(Master Cycler Gradient，Eppendorf)进行RT-PCR，退火温度为50℃至70℃(5个反应阶段，退火温度为50℃，55℃，60℃，65℃，和70℃)。在RT-PCR条件下进行处理，其中所述RT-PCR条件由50℃ 30分钟和94℃ 15分钟后，94℃ 1分钟，50℃至70℃ 1分钟，和72℃ 1分钟30秒进行40个循环，然后72℃ 15分钟组成。反应后，维持在4℃。

表1

对PCR后的每一反应液使用琼脂糖凝胶和TAE缓冲液进行电泳。电泳后，用溴化乙锭染色琼脂糖凝胶，证实目标片段。对应于目标片段的部分用手术刀片与凝胶一同切下来。使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)自凝胶洗脱和纯化相关部分。由此纯化的PCR产物的核苷酸序列使用DNA测序仪(3100 Genetic Analyzer，ABI)证实。测序反应使用ABIBigDye终止子循环测序FS试剂盒(ver.3.0)进行。根据ABI的操作手册使用实验方法。此外，使用表1中示出的引物测定核苷酸序列。

5’和3’RACE法和PCR

基于通过RT-PCR获得的DNA片段的序列信息设计下列引物，然后用于5’和3’RACE法中。

[用于5’RACE的引物]

D2-R2：5’GCG GTT CTC CTC AGC AGT C 3’(SEQ ID NO：17)

D2-R3：5’GTT GGC ATG GGA GAT GAA TG 3’(SEQ ID NO：18)

[用于3’RACE的引物]

D2-F4：5’CAA ATG CCA GCT CAT GCA ATG 3’(SEQ ID NO：19)

D2-F5：5’CAG CAG ATT GGA GTC TAC TC 3’(SEQ ID NO：20)

使用5’/3’RACE试剂盒(Roche)实施5’RACE法和3’RACE。此外，使用Ex Taq Hot Start Version(TAKARA BIO INC.)进行PCR。根据试剂盒所提供的方法制备反应液的组分。使用热循环仪(Master Cyclergradient，Eppendorf)。其中使用的退火温度为50℃至70℃(5个反应阶段，退火温度为50℃，55℃，60℃，65℃，和70℃)。在PCR条件下进行处理，其中所述PCR条件由94℃ 15分钟，然后94℃ 1分钟，50℃至70℃ 1分钟，72℃ 1分钟30秒进行30个循环，然后72℃ 15分钟组成。反应后，维持在4℃。

与上述方法同样的方式进行PCR产物的纯化和核苷酸序列的测定。

用于扩增多肽编码区的PCR引物的设计

基于通过RACE法确定的序列信息设计下列引物来扩增和克隆全部多肽编码区。作为用于扩增多肽编码区的PCR引物，也通过添加用于导入植物表达载体pBI121的限制性酶位点(BamH I和Sac I)制备了下列引物。

4DS-F-OR1：5’ATG GCT ATG AAA TTG AAC GCC 3’(SEQ ID NO：21)

Bam-4DS-F-OR1：5’TCT AGA GGA TCC ATG GCT ATG AAA TTGAAC GCC 3’(SEQ ID NO：22)

4DS-R-OR：5’TCA TAT CAT GAT CTG ACG GTT G 3’(SEQ ID NO：23)

Sac-4DS-R-OR1：5’TCT AGA CGA GCT CTC ATA TCA TGA TCTGAC GGT TG 3’(SEQ ID NO：24)

使用这些引物通过PCR扩增了全部的多肽编码区。接下来，使用DNA Ligation Kit ver.2(TAKARA BIO INC.)，于16℃(过夜反应)将每一多肽编码区的DNA片段连接入用于TA-克隆的载体(用于克隆PCR产物)(pSTBlue1，Novagen)。根据试剂盒中包括的方法转化感受态细胞(大肠杆菌DH5α，TOYOBO)，然后在补充有IPTG、X-gal和50μg/ml卡那霉素的LB培养基中培养。然后选择转化体。挑取出现的菌落，然后在补充有50μg/ml卡那霉素的LB培养基进行液体培养。使用Plasmid minikit(QIAGEN)自由此获得的微生物体制备质粒DNAs。通过凝胶电泳证实片段插入，获得了质粒DNA(预计含有已被亚克隆于其中的目标片段)。

作为测序用引物，分别使用了以存在于pSTBlue1载体的克隆位点两端的T7序列和M13序列为目标的引物(BcaBEST测序引物T7(TAKARABIO INC.)；5’TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG 3’(SEQ ID NO：25)和M13引物M4(TAKARA BIO INC.)；5’GTT TTC CCA GTC ACG AC 3’(SEQ ID NO：26))。在该实施例中分离的Dc4DES基因的核苷酸序列和Dc4DES的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：1和2。

使用Genetyx-Win Ver.4.0/ATGC ver.2(软件开发公司)分析和编辑由此获得的核苷酸序列。

Dc4DES基因和以前报导的源自芫荽的基因(Cs4DES)在多肽编码区(推定的)序列(Dc4DES基因：1161bp；和Cs4DES基因：1158bp)中的核苷酸序列同源性(同一性)为88.0％。此外，在多肽编码区推定的氨基酸序列(Dc4DES基因：386aa；和Cs4DES基因：385aa)中的氨基酸序列同源性(同一性)为90.2％。图3显示了Dc4DES氨基酸序列和Cs4DES氨基酸序列的比对。在图3中，Dc4DES氨基酸序列示于上排且Cs4DES氨基酸序列示于下排。

[实施例2]PTE基因的鉴定和克隆

植物样本

在实施例2中，使用胡萝卜F1品种(Daucus carota L.Natsu-maki(夏天播种)senko gosun，Yoshun gosun，和Shin Kuroda Gosun(纯育品种))作为实验样本。胡萝卜种子购自OTA SEED Co.Ltd。希望使用具有相同同源基因序列的纯种作为基因克隆源，为了实验的方便(可以准备早期开花的样本)，也使用了F1品种的植物。此外，也栽培和使用了同一伞形科的芫荽(Corianlrum sativium)和莳萝(Anethum graveolens cv.mammoth)。

植物体在温控室(Koito-toron；Koito Manufacturing Co.Ltd.)中于25℃，16小时光照，湿度50％的条件下生长。将由此栽培的植物体用作样本。

RNA制备

各收集约100mg的胡萝卜叶、未成熟种子和成熟种子，然后根据实施例1的方法制备RNA。

RT-PCR扩增

BLAST搜索(blastn和blastx；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)源自与胡萝卜同属伞形科的芫荽的OTE样基因(CsOTE)的部分cDNA序列(登录号L20978)。列出了17种作为同源性高的基因而发现的类似基因。对它们的推定的氨基酸序列进一步进行多重比对分析。选择高度保守的区域。进一步对同一基因的DNA序列类似地进行多重比对分析。基于相关物种的DNA的密码子使用频率，对在氨基酸水平保守性高的区域设计简并引物。由此设计的引物用于RT-PCR法中。引物序列如下所示。此外，括号中的数值表示基于拟南芥菜油酰基-ACP硫酯酶(AtOTE)的对应的核苷酸位置。

TE-PF3(515-536)：5’-RTG GNA CNM GRG KRR ATT GGA T-3’(SEQID NO：27)

TE-PF2(415-438)：5’-CTB ATW TGG GTB ACD DMN MGN ATG-3’(SEQ ID NO：28)

TE-PF1(235-257)：5’-GAR RAY GGN YWN TCB TAY AMR GA-3’(SEQID NO：29)

TE-PR1(886-915)：5’-TGR CAY TCN CKY CKR TAR TC-3’(SEQ IDNO：30)

TE-PR2(787-809)：5’-ACR TTR TTN ACR TGY TKR TTC AT-3’(SEQID NO：31)

TE-PR0(1041-1061)：5’-GTD SKN CMV CKR TTK AKY TC-3’(SEQ IDNO：32)

特别地，使用一步RT-PCR试剂盒(QIAGEN)和上述引物对进行RT-PCR扩增。根据试剂盒所提供的标准方法制备反应液的组分。使用热循环仪(Master Cycler Gradient，Eppendorf)进行RT-PCR。使用所述设备时，可在恒温金属浴仪(Heat Block)设置任一温度梯度(最大为12个反应阶段)，然后进行反应，所以，RT-PCR反应于扩增效率和特异性所需的退火温度50℃至70℃(5个反应阶段，退火温度为50℃，55℃，60℃，65℃，和70℃)进行。反应在PCR条件下进行，PCR条件由50℃ 30分钟，94℃15分钟处理后，94℃ 1分钟，50℃至70℃ 1分钟和72℃ 1分钟30秒进行40个循环，然后72℃ 15分钟组成。反应后，维持在4℃。

作为RT-PCR结果，使用TE-PF2和TE-PR1的组合可获得特异的扩增产物(约500bp)。确定扩增产物的核苷酸序列。使用部分序列分析分子系统树，发现产物属于OTE簇。

5’和3’RACE法和PCR

对于作为RT-PCR结果获得的部分序列，再次搜索数据库。再钓出具有高同源性的基因。将推定的氨基酸序列同样地进行多重比对分析。选择氨基酸水平低保守的区域。接下来，基于所述区域，考虑DNA的密码子使用频率，设计能够特异扩增目标基因的引物用于RACE法。

[用于3’-RACE]

TE-D1F：5’-TAG CAA GTG GGT GAT GAT-3’(SEQ ID NO：33)

TE-D3F：5’-GTT TTC TGC CCC AAA ACA CC-3’(SEQ ID NO：34)

[用于5’-RACE]

TE-D2R：5’-TAT TCA TCT CGA ACA TCA T-3’(SEQ ID NO：35)

TE-D1R：5’-ATC ATC ACC CAC TTG CTA-3’(SEQ ID NO：36)

作为RACE法的结果，通过扩增获得了两种不同类型的基因片段。这两种基因片段均属于包含对不饱和酰基ACP具有特异性的TE组的FatA簇。一种片段在分子系统树与已知的OTE属于同一亚簇，而另一种片段形成了一个新的亚簇。

另外，在实施例2中，对核苷酸序列的确定和所获得的核苷酸序列的分析和编辑与实施例1类似的方式进行。此外，利用国立遗传学研究所日本DNA数据库的基因分析服务(http://www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html)，通过Clustal W程序(用于多重核苷酸序列和氨基酸序列比对和构建系统树的程序)进行分子系统树分析。

作为RACE法的结果，获得了两种不同类型的基因片段。也设计了用于特异扩增这两种基因片段的引物。特别地，基于RACE法确定的序列信息，设计了下列用于OTE基因特异性扩增的引物和用于PTE基因特异性扩增的引物，用于再扩增和克隆全长的cDNA和多肽编码区。

[用于OTE基因特异性扩增的引物]

<用于3’-RACE>

OTE-2F：5’-GCA TTC TAG GCT AGG ATT GT-3’(SEQ ID NO：37)

OTE-3F：5’-AAG GAA GTC CTT TAT ACG-3’(SEQ ID NO：38)

<用于5’-RACE>

OTE-m1R：5’-GGC GAA TCG AGA TCG AAT CT-3’(SEQ ID NO：39)

OTE-m2R：5’-CAC CTG AGC ATT CAC CCC ATT-3’(SEQ ID NO：40)

OTE-m3R：5’-CTC AAT TTC TCC GCC AAG CT-3’(SEQ ID NO：41)

[用于PTE基因特异性扩增的引物]

<用于3’-RACE>

PTE-2F：5’-CTT TTC CAG TCT CGG GCT TG-3’(SEQ ID NO：42)

<用于5’-RACE>

PTE-4R：5’-GGA AGC AAC TCA TCG TCG TCT GT-3’(SEQ ID NO：43)

PTE-2R：5’-CAA GCC CGA GAC TGG AAA AG-3’(SEQ ID NO：44)

此外，作为用于扩增多肽编码区的引物，还制备了下列引物，通过添加限制性酶位点(BamH I和Sac I)用于导入植物表达载体pBI121。

[对推定的多肽编码区]

XbaBam-DcPTE-0F：5’-TCT AGA GGA TCC ATG TTA TTG ACA ACAGGG AC-3’(SEQ ID NO：45)

DcPTE-0F：5’-ATG TTA TTG ACA ACA GGG AC-3’(SEQ ID NO：46)

Sac-DcPTE-6R：5’-TCT AGA CGA GCT CCT AGT TTA AAC AGT ACACTG-3’(SEQ ID NO：47)

DcPTE-6R：5’-CTA GTT TAA ACA GTA CAC TG-3’(SEQ ID NO：48)

使用这些引物和胡萝卜RNA作为模板进行RT-PCR，以扩增全部的多肽编码区。接下来，使用DNA Ligation Kit ver.2(TAKARA BIO INC.)，于16℃(过夜反应)将PCR扩增片段连接入用于TA-克隆的载体(用于克隆PCR产物)(pSTBlue1，Novagen)。根据包括在试剂盒中的方法转化感受态细胞(大肠杆菌DH5α，TOYOBO)，然后在补充有IPTG、X-gal和50μg/ml卡那霉素的LB培养基中培养。然后选择转化体。挑取出现的菌落，然后在补充有50μg/ml卡那霉素的LB培养基进行液体培养。使用Plasmidmini kit(QIAGEN)自由此获得的微生物体制备质粒DNAs。通过凝胶电泳证实片段插入，获得了预计目标片段已被亚克隆于其中的质粒DNA。在该实施例中，分离了两种类型的Dc4PTE基因。由此分离的这两种类型的Dc4PTE基因称为Dc4PTEa和Dc4PTEb。它们的核苷酸序列分别示于SEQID NO：3和5。这两种类型的Dc4PTE的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：4和6。

如上所述克隆DcPTE基因。与DcPTE基因的克隆同样地尝试了芫荽和莳萝的PTE基因的克隆。分离了源自芫荽的岩芹酰-ACP硫酯酶基因(CsPTE基因)和源自莳萝的岩芹酰-ACP硫酯酶基因(AgPTE基因)。它们的核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：7和9。这两种类型的Dc4PTE的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：8和10。接下来，测试了由所述DcPTE基因编码的酶的岩芹酰-ACP硫酯酶活性。特别地，如下所述使用大肠杆菌制备组氨酸标记的重组蛋白。然后分析酶活性。

组氨酸标记的蛋白质的表达构建体的制备

基于已知的源自红花的油酰基-ACP硫酯酶的发现(Plant Physiol.100，1751-1758，1994)，预测每一基因的成熟肽切割位点，然后设定为成熟肽表达用的DNA构建体中的编码区的N末端。另外，C末端侧在终止密码子处终止。关于DcPTEa基因，推测成熟肽切割位点位于编码第32个氨基酸的核苷酸序列和编码第33个氨基酸的核苷酸序列之间。关于DcOTE基因和CsOTE基因，推测成熟肽切割位点位于编码第51个氨基酸的核苷酸序列和编码第52个氨基酸的核苷酸序列之间。

使用克隆入pST Blue1(克隆载体，Novagen)的DcPTEa、DcOTE、或CsOTE cDNA作为模板通过PCR法扩增该区域。每一产物与用于组氨酸标记的蛋白质的表达载体pQE-30 UA(QIAGEN)混合，加入等量的TaKaRa Ligation Kit ver.2，然后16℃ 30分钟进行连接反应以亚克隆。亚克隆入载体使得可利用大肠杆菌制备其中6xHis已添加至N末端的重组蛋白质。将全量的反应液添加至50μl大肠杆菌感受态细胞(具有lacI^q突变的JM109株，TAKARA BIO INC.)。然后按照制造商说明的方法实施转化。自得到的转化体(在补充有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基中生长)制备质粒。

在大肠杆菌中表达组氨酸标记的蛋白质并纯化该蛋白质

用由此制备的DNA构建体转化大肠杆菌(JM109株)(或利用质粒制备前保存的甘油原种)，用于表达组氨酸标记的蛋白质。将大肠杆菌在补充有Overnight Express Autoinduetion System 1(Merck)和50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中过夜培养，诱导表达。

接下来，收集用每一表达构建体转化的大肠杆菌20mL。加入4mL裂解缓冲液(50mM磷酸氢钠，300mM NaCl，和10mM咪唑)和10mg/ml溶菌酶并与该溶液混合。置于冰中30分钟。通过超声破碎装置(UD-201，TOMY)超声处理(10秒×6次)产物。

4℃ 15000转/分钟离心10分钟后，将上清用注射器注入事先已平衡的HisTrap HP柱(Amersham)。使用Perister泵(P-1，Amersham)，利用试剂盒中包括的缓冲液洗和洗脱。对每1mL溶液进行洗脱，分级总共4mL溶液。

对纯化的DcPTEa、DcOTE和CsOTE的组氨酸标记的蛋白质洗脱液的每一级分进行SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)。从而证实了纯化的目标蛋白质。图4显示了结果。

基于图4中的电泳结果，选择其中以高浓度洗脱的蛋白质的级分。通过Lowry法(RCDC蛋白质检测试剂盒，BIO-RAD)测定蛋白质浓度。由此，可制备重组蛋白质(每种约200μg)。

制备酰基ACP

如下制备作为底物使用的酰基ACP。首先，制备脂肪酸(油酸、岩芹酸)的己烷溶液(100mM)。将6.2μl该溶液加至10ml玻璃试管，然后用氮气干燥和固化。接下来，添加下表2的反应液，在恒温金属浴仪上37℃反应60分钟。

表2

■1M Tris-HCl(pH 8.0) 400μl

■1M MgCl 40μl

■1M ATP 200μl

■1M DTT 10μl

■20％Triton X-100 400μl

■4M LiCl 400μl

■Holo-ACP(PanVera) 1000μl

■His-标记的酰基-ACP合成酶(0.26mg/mL) 48μl

■H₂O 1502μl

反应后，加入12ml水，然后用乙酸调节溶液至pH6.0。通过以下步骤(A)至(M)纯化反应液中含有的酰基ACP。

(A)用1.8ml DEAE-Toyopearl 650C(TOSOH)填充(1ml柱床体积)未填充的聚丙烯柱(BIO-RAD LABORATORIES)。

(B)以大于(A)的10倍量添加Bis Tris-HCl pH6.0(称为缓冲液B)并平衡化。

(C)添加酰基ACP溶液(pH 6.0)至柱。

(D)用3mL缓冲液B洗。

(E)用3mL在缓冲液B中的80％(w/w)异丙醇洗掉未反应的脂肪酸。

※此处所用的异丙醇和缓冲液B分别通过超声洗净机脱气制备并混合它们。

(F)用3mL缓冲液B洗。

(G)用5ml在缓冲液B中的0.6M LiCl洗脱。

(H)将4.5ml辛基-琼脂糖(Octyl-Sepharose)(Amersham)添加至另一未填充的柱(至柱床体积为约3ml)。

(I)用大于(H)的10倍量缓冲液B平衡化。

(事先进行步骤H和I)

(J)将(G)的洗脱液直接洗脱并应用于(I)。

(K)用5ml 10mM MES-NaOH pH6.0(称为缓冲液C)洗。

(L)用6mL在缓冲液C中的35％(w/w)异丙醇洗脱。

※异丙醇和缓冲液C分别通过超声洗净机脱气制备并混合它们。

(M)使用真空离心机，使异丙醇挥发。

检测纯化酶的硫酯酶活性

通过上述步骤纯化的组氨酸标记的蛋白质使用酰基ACP(油酰基ACP或岩芹酰-ACP)作为底物确定硫酯酶活性。在反应前，通过Lowry法(RCDC蛋白质检测试剂盒，BIO-RAD)测定两溶液中的蛋白质浓度。

混合25mM Tris-HCl(pH 8.0)、1mM DTT、酰基ACP、和水，然后25℃预孵育5分钟(此处所用缓冲液已允许放置至达到反应温度)。添加12μg组氨酸标记的蛋白质(DcPTE或DcOTE)或γ-球蛋白(作为对照组)至反应液总量为100μl，然后25℃反应30分钟。使用十分之一的反应液量(10μl)通过SDS-PAGE检测未反应的酰基ACP和游离ACP(反应产物)，测定硫酯酶活性。图5将结果以电泳图的形式显示。

电泳后的凝胶经CBB染色后，使用高性能扫描仪(Pictrostat digital400，FUJIFILM)产生数字图像数据。使用图像分析软件Image Analysis ver.3.0(Hitachi)定量酰基ACP和游离ACP的条带浓度。图6显示了结果。如图6所示，当用岩芹酰-ACP作为底物(图6(B))时，DcPTE明显较DcOTE具有更高的反应性。相反，当用油酰基-ACP作为底物(图6(A))时，DcOTE具有更高的反应性。因此，可以得到DcPTE为对岩芹酸具有特异性的硫酯酶的结论。

[实施例3]

接下来，制备了导入实施例1中克隆的Dc4DES基因和实施例2中克隆的DcPTE基因的经转化植物。检测了经转化的植物中的岩芹酸合成能力。特别地，制备了其中仅导入了Dc4DES基因的经转化植物、其中仅导入了DcPTE基因的经转化植物、和其中Dc4DES基因和DcPTE基因一同导入的经转化植物。

制备用于持续全身表达的DNA构建体

在用于转化的载体中，图7显示了用于持续全身表达的载体。在图7中，“Pnos”是指源自农杆菌的胭脂碱合成酶启动子，“Tnos”是指源自农杆菌的胭脂碱合成酶终止子，“P35S”是指CaMV35S启动子，且“NPT II”是指新霉素磷酸转移酶II基因。

特别地，将植物表达载体pBI121(Cloetech)中含有的GUS基因替换为Dc4DES基因的cDNA序列。

使用所设计的在5’末端侧添加了Bam HI序列和在3’末端侧添加了Sac I序列的引物通过PCR法扩增编码Dc4DES基因ORF区的DNA片段。将PCR产物与pSTBlue1(克隆载体，Novagen)混合，然后向该混合物加入等量TaKaRa Ligation Kit ver.2，于16℃ 30分钟进行连接反应。将反应液的总量添加至50μl感受态细胞(大肠杆菌DH5α，TOYOBO)，然后按照制造商说明的方法进行转化。自由此获得的转化体(生长于补充有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基)制备质粒。由此获得的质粒用限制性酶(Bam HI和Sac I)处理。接下来，为了切下pBI121中连接在CaMV35S启动子下游的GUS基因，同样地用限制性酶(Bam HI和Sac I)处理。将这些限制性酶消化的产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳。使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)和Geneclean II(BIO 101)，分别分离和纯化含有Dc4DES基因的DNA片段和pBI121骨架(对应于其中GUS基因已移除的部分)。

将pBI121骨架片段和欲插入的DNA片段(Dc4DES基因)以1∶10的比率混合。使用等量的TaKaRa Ligation Kit ver.2于16℃进行连接反应30分钟。将反应液的总量添加至100μl感受态细胞(大肠杆菌菌株DH5α，TOYOBO)，然后按照制造商说明的方法进行转化。将所得产物涂布至含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基，然后过夜培养.

用于共表达Dc4DES基因和DcPTE基因的载体(图6(D))如下构建：将DcPTE基因的表达单元(包含启动子和终止子的DNA片段)插入图6(A)所示的Dc4DES表达用表达载体中的T-DNA的LB附近的唯一的Eco RI位点和Dra III位点之间。DcPTE基因的表达单元通过PCR法使用所设计的两端添加有Eco RI位点和Dra III位点的引物扩增。

制备用于种子特异性表达的DNA构建体

在用于转化的载体中，用于种子特异性表达的载体示于图8(A)至(D)。在图8(A)至(D)中，“Pnap”是指源自油菜籽(B.campestris cvKizakinonatane)的油菜籽蛋白A启动子。已知Monsanto公司使用该启动子调控油菜籽的脂肪和油含量。

具体地，通过将图7所示的载体中的CaMV35S启动子替换为源自油菜籽的油菜籽蛋白A启动子而构建种子特异性表达的载体。此外，将GUS基因替换为Dc4DES基因、DcPTE基因、或Cs4DES的cDNA序列。

同时，用于共表达Dc4DES基因和DcPTE基因的载体(图8(D))如下构建：将DcPTE基因的表达单元(包含启动子和终止子的DNA片段)插入图8(A)所示的Dc4DES表达用表达载体中的T-DNA的LB附近的唯一的Eco RI位点和Dra III位点之间。DcPTE基因的表达单元通过PCR法使用所设计的两端添加有Eco RI位点和Dra III位点的引物扩增。

通过电穿孔法将基因导入农杆菌

使用所制备的质粒通过电穿孔法转化农杆菌。将40μl通过常规方法制备的根癌农杆菌(LBA4404株)的感受态细胞溶解，然后添加5μl(25μg)DNA溶液。将溶液置于冰上1至2分钟。接下来，将溶液置于冰冷的小杯(0.2cm，BIO-RAD)中。使用基因导入设备(Shimadzu)施加脉冲电流(1.25kV和10μF)。加入立即冷却的SOC培养基460μl，然后28℃培养1小时。将该溶液涂布至含有50μg/ml卡那霉素和50μg/ml利福平的LB琼脂培养基，然后过夜培养。选择转化体。对于出现的转化体菌落进行单菌落分离。挑取多个菌落，通过PCR法证实目标质粒DNAs。

通过真空浸润法制备拟南芥菜转化体

通过真空浸润法转化拟南芥菜(Arabidopsis thaliana et.Columbia)。根据Experimental Protocols for Model Plants，Shujunsha，2001，109-113页实施真空浸润法。

接下来，培养经真空浸润的拟南芥菜。然后，收集种子并确定为第1世代转化种子(T1种子)。但是，为了方便，将它们作为世代转化种子使用。然而，该种子群体的所有种子不是均已被转化。

接下来，将第1世代转化种子播种于补充有卡那霉素的培养基(向Murashige & Skoog基本培养基中添加有0.5g/L MES、10g/L蔗糖、8g/L琼脂、100mg/L羧苄青霉素、和50mg/L卡那霉素)。使种子在亮条件下发芽。生长植物约1至2周，然后选择转化的个体植物(由于它们的卡那霉素抗性而正常生长)。将其叶已正常展开的植物个体再次移植至相同的培养基，然后生长约1至2周用于再选择。将由此获得的植物体确定为第1世代转化植物体(T1植物)。将卡那霉素抗性的植物品系移植至未灭菌的蛭石，从而使得它们经培育后变得适应未灭菌的环境。

接下来，自第1世代转化植物体收集约100mg莲座丛叶，在液氮冻存下粉碎。使用DNA制备试剂盒(DNeasy plant mini kit，QIAGEN)，按照在试剂盒中包括的标准方法制备DNA。使用以T-DNA中的药物抗性基因(NPTII)和所导入的脂肪酸合成体系的基因为靶的PCR引物以及使用Ex Taq DNA聚合酶(TAKARA BIO INC.)进行PCR扩增。

将由此获得的片段(PCR扩增产物)使用0.8％琼脂糖凝胶和TAE缓冲液进行电泳。然后进行溴化乙锭染色，证实目标片段的扩增。基于扩增的有无确定所导入基因的有无。

接下来，继续栽培上述确认了T-DNA导入的植物品系，收集的种子确定为第二世代转化种子(T2种子)。对每一构建体收获15个或更多品系的T2种子，并用于以下的脂肪酸组成分析。

用于分析拟南芥菜种子的脂肪酸组成的方法

为了进行种子中脂肪酸组成的分析，将种子中的脂肪酸用盐酸-甲醇进行甲酯化，然后对其正己烷提取物通过GC-MS分析。此外，添加BHT(丁基化羟基甲苯)作为样本的抗氧化剂。另外，作为内部标准，将植物油中不含有的十五烷酸(C15:0)的甲酯(SIGMA)的甲醇溶液直接添加至称重后的种子，用于校正在制备分析用样本时出现的实验误差。

适于邻苯二甲酸酯分析用的正己烷(Tokyo Chemical Industry Co.Ltd.)用于提取。这可消除邻苯二甲酸酯的影响，其中所述邻苯二甲酸酯在GC分析中显示出与脂肪酸类似的特性。

表3显示了用于定性分析的方法，且表4显示了用于定量分析的方法。

表3

用于定性分析的方法

＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊

(1)称重5mg样本(鲜重)

(2)将样本添加至1.5-mL eppendorf管(PP)，然后添加1粒Tangsten珠(Qiagen)

(3)添加0.1％BHT和5mM C15:0-OMe/MeOH(各500μl)

(4)在Freq：1/20s，1分钟条件下粉碎(混合研磨机MM300，Qiagen)所得物

(5)添加500μl 10％HCl/MeOH(Tokyo ChemicalIndustry，保存在4℃)

(6)于80℃维持1小时(恒温金属浴仪(Heat block)，Iwaki)

(7)加入1ml正己烷(用于邻苯二甲酸酯分析，Tokyo Chemical Industry)

(8)涡旋(混合)5秒

(9)转移上层(己烷相，800μl)至1.5-ml eppendolf管

(10)在减压条件下干燥和固化(Concentrator 5301，Eppendolf)

(11)添加100μl正己烷(用于邻苯二甲酸酯分析，Tokyo ChemicalIndustry)

(12)转移所得物至GC用玻璃管瓶并密封瓶

(13)GC/MS分析

表4

用于定量分析的方法

(1)称重10粒样本种子(鲜重)

(2)将种子加至1.5-mL eppendorf管(PP)，然后添加1粒Tangsten珠(Qiagen)

(3)添加0.002％BHT和0.1mM C15:0-OMe/MeOH(各500μl)

(4)在Freq：1/20s，1分钟条件下粉碎(混合研磨机MM300，Qiagen)

(5)添加500μl 10％HCl/MeOH(Tokyo Chemical Industry，保存在4℃)

(6)于80℃维持1小时(恒温金属浴仪，Iwaki)

(7)加入1ml正己烷(用于邻苯二甲酸酯分析，Tokyo Chemical Industry)

(8)涡旋(混合)5秒

(9)转移上层(己烷相，800μl)至1.5-ml eppendolf管

(10)在减压条件下干燥和固化(Concentrator 5301，Eppendolf)

(12)转移所得物至GC用玻璃管瓶并密封瓶

(13)GC/MS分析(HP)

通过根据上述方法进行处理所得的谱在表5的条件下分析。所述条件为能够将由于双键位置不同的位置异构体：油酸(C18:1，Δ9)和岩芹酸(C18:1，Δ6)通过GC分离并分析的条件。

表5

----------------------------------------------------------------------------------

分析仪器：HEWLETT PACKARD GC/MS HP6890系列GC系统，5973

Mass Selective Detector

柱：SUPELCO SP-2380(内径：0.25mm，100m)

分离程序：80℃(开始时)，以3℃/分钟升温→180℃(维持该温度35分钟)，以30℃/分钟升温→240℃(维持该温度10分钟)，总计：约80分钟

分析模式：分裂(分裂比率20∶1)

载气：氦，流速1mL/分钟，压力29.9psi，平均速率20cm/秒

在GC-MS系统质量检测仪的总离子色谱图(Total IonChromatogram)中，用每一峰的积分值除以内部标准和相关分子量。由此计算的值的和确定为脂肪酸总量。在脂肪酸总量中的每一脂肪酸的百分率以摩尔百分率(mol-％)表示。此外，使用质量检测仪检测的碎片强度随物质的不同而不同，已知不能简单地反映分子量。但是，当在相同条件下分析时，再现性和定量可靠性非常高，因此进行相对比较是充分可能的。

分析结果1

为了测试根据本发明获得的Dc4DES基因对岩芹酸生产的效果，使用在CaMV35S启动子控制下的表达Dc4DES基因的pB-4DES构建体制备持续全身表达型的经转化的植物。自经转化的植物收集叶，提取脂肪和油成分，根据上述方法分析脂肪酸组成。此外，文中分析的脂肪酸组分为岩芹酸和岩芹酸前体顺-4-十六碳烯酸(16:1Δ4)。表6显示了这些单烯不饱和脂肪酸的分析结果。

表6

结果，在其中导入了pB-Dc4DES的转化体的叶中，相对于总脂肪酸量，累积了7.67wt％岩芹酸(在野生型拟南芥菜中未分析到)。特别地，显示了通过使用源自胡萝卜的Dc4DES基因，可在植物细胞中有效地生产岩芹酸(表6)。如之前所报导的(专利文献1)，向培养的烟草细胞中导入源自芫荽的Cs4DES基因，岩芹酸含量为2.7wt％。因此，揭示了对于岩芹酸的合成和累积而言，源自胡萝卜Dc4DES基因的功能优于源自芫荽的Cs4DES基因的功能。

分析结果2

制备了使用种子特异性表达的油菜籽的油菜籽蛋白启动子以种子特异性方式表达Dc4DES基因、Cs4DES基因、或DcPTE基因的经转化植物。从这些种子提取脂肪和油成分，然后通过上述方法分析脂肪酸组分。表7显示了单烯不饱和脂肪酸的分析结果。此外表7中的“NT”是“未测试”的缩写。

表7

结果，导入pN-Cs4DES的转化体的种子中累积了0.81mol％岩芹酸。相反，导入pN-Dc4DES的转化体的种子中累积了0.89mol％岩芹酸。关于在种子中合成和累积岩芹酸，源自胡萝卜的Dc4DES基因的功能也优于源自芫荽的Cs4DES基因的功能。

在已导入了pN-Dc4DES-DcPTE的转化体中，累积了1.83mol％岩芹酸。特别地，与仅导入Cs4DES基因相比，累积的岩芹酸量增加至226％。通过导入对岩芹酰-ACP具有高底物特异性的DcPTE，促进了岩芹酸产生。更特别地，揭示了与仅表达Dc4DES基因相比，共表达Dc4DES基因和DcPTE基因可获得显著高的岩芹酸累积的效果。而且，通过此共表达获得的值是根据涉及仅使用源自芫荽的Cs4DES基因的常规技术获得的值的近2倍或2倍以上。通过与4DES基因共表达而使得岩芹酸累积量增加的岩芹酸生物合成系统基因是至今为止未知的。该岩芹酸生物合成系统基因是世界上首次发现的。

此外，如表6所示，发现通过仅表达Dc4DES基因或通过共表达Dc4DES基因和DcPTE基因，不仅产生岩芹酸，也可产生顺-8-二十碳烯酸。而且，能够证实与仅表达Dc4DES基因相比，通过共表达Dc4DES基因和DcPTE基因能更加增加顺-8-二十碳烯酸的生产量。此外，至今尚无在植物中成功生产顺-8-二十碳烯酸的情形。

分析结果3

此外，在仅表达Dc4DES基因或DcPTE基因的经转化的植物中，或在共表达Dc4DES基因和DcPTE基因的经转化的植物中，分析了每一脂肪酸组成(包括饱和脂肪酸)。

结果，揭示了与野生型株、与导入了Cs4DES基因的经转化植物、以及与导入了Dc4DES基因的经转化植物相比较，在仅表达DcPTE基因的转化体或在共表达DcPTE基因和Dc4DES基因的转化体的种子中饱和脂肪酸含量显著增加(图9)。在已导入了DcPTE基因的植物的种子中硬脂酸(C18:0)含量、二十烷酸(C20:0)含量、或二十二烷酸(C22:0)含量达到没有导入DcPTE基因的植物的种子中相关含量的水平近2倍。基于推定的氨基酸序列进行分子系统树分析的结果，将DcPTE基因归入称为Fat A的组(其成员对不饱和脂肪酸-ACP具有特异性)的硫酯酶基因。而且，根据实施例2所示，DcPTE基因显示对岩芹酰ACP的底物特异性的结果，可以预测增加不饱和脂肪酸含量的效果。但是，难于预测增加饱和脂肪酸生产的效果。因此，揭示了DcPTE基因具有本领域技术人员无法预测的特别显著的效果。

在通过氧化分解源自植物的脂肪酸而制备尼龙原材料(二羧酸)时，DcPTE基因具有特别有利的特性。特别地，所述特性为除了促进岩芹酸累积之外，还增加C18(或更大碳数)的饱和脂肪酸的含量的效果。更特别地，DcPTE基因能增加饱和脂肪酸含量，从而降低除岩芹酸外的不饱和脂肪酸含量(为由于氧化分解而引起世代不纯的原因)。此外，此效果不仅可通过使用与另一基因(如Dc4DES基因)组合而获得，而且可通过仅使用DcPTE基因获得，因此，DcPTE基也可用于除岩芹酸累积外的用途(如饱和脂肪酸生产)，以制备树脂原材料。

工业利用性

根据本发明，可提供用于在岩芹酸生产中增加岩芹酸合成量的新基因。此外，提供了使用该基因生产岩芹酸的新方法。使用本发明的参与岩芹酸生产的基因，可以例如在植物种子中大量累积岩芹酸。

本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请均在本说明书中全文引用作为参考。

序列表

<110>丰田自动车株式会社

<120>参与岩芹酸生物合成的新基因和用于生产岩芹酸的方法

<130>PH-2761-PCT

<150>JP 2005-191775

<151>2005-06-30

<160>48

<170>PatentIn版本2.0

<210>1

<211>1161

<212>DNA

<213>胡萝卜(Daucus carota)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1161)

<400>1

atg gct atg aaa ttg aac gcc ctc agt ctg cag tgc cca aaa gga aac 48

Met Ala Met Lys Leu Asn Ala Leu Ser Leu Gln Cys Pro Lys Gly Asn

1 5 10 15

agc ttc aca agg gtg gct cct cct caa gta ggg agg gtg gtg aga tca 96

Ser Phe Thr Arg Val Ala Pro Pro Gln Val Gly Arg Val Val Arg Ser

20 25 30

aac gtg ccc atg gct tca act ctt cat gct agc ccc ctg gtg ctt gat 144

Asn Val Pro Met Ala Ser Thr Leu His Ala Ser Pro Leu Val Leu Asp

35 40 45

acg ctg aag gct cca agg cct cac gtg gat gag ata ttc acc tct ctg 192

Thr Leu Lys Ala Pro Arg Pro His Val Asp Glu Ile Phe Thr Ser Leu

50 55 60

gaa ggt tgg gcc agg gac aac atc ctg gtg cat ctg aaa tcc gtt gag 240

Glu Gly Trp Ala Arg Asp Asn Ile Leu Val His Leu Lys Ser Val Glu

65 70 75 80

aac tca tgg cag cca cag gac tat ctg cct gat ccg acg tct gat gga 288

Asn Ser Trp Gln Pro Gln Asp Tyr Leu Pro Asp Pro Thr Ser Asp Gly

85 90 95

ttt gaa gag caa gtg aag gag atc agg gaa cgg gcc aag gag atc ccc 336

Phe Glu Glu Gln Val Lys Glu Ile Arg Glu Arg Ala Lys Glu Ile Pro

100 105 110

gac gac tac ttc gtt gtt ctg gtg gga gac atg atc act gaa gag gca 384

Asp Asp Tyr Phe Val Val Leu Val Gly Asp Met Ile Thr Glu Glu Ala

115 120 125

ctc cca act tac atg tcc atg ctt aac aga tgt gat ggc atc aag gat 432

Leu Pro Thr Tyr Met Ser Met Leu Asn Arg Cys Asp Gly Ile Lys Asp

130 135 140

gag act ggc gct gca cct gat gct tgg gca aca tgg acc agg gcc tgg 480

Glu Thr Gly Ala Ala Pro Asp Ala Trp Ala Thr Trp Thr Arg Ala Trp

145 150 155 160

act gct gag gag aac cgc cat ggc gat ctc ctc aac aag tat ctt tat 528

Thr Ala Glu Glu Asn Arg His Gly Asp Leu Leu Asn Lys Tyr Leu Tyr

165 170 175

ctc tct ggc cga gtt gat atg agg atg att gag aag act att cag tat 576

Leu Ser Gly Arg Val Asp Met Arg Met Ile Glu Lys Thr Ile Gln Tyr

180 185 190

ctt att ggc tcc gga atg gat aca aag aca gag aac tgt ccc tac atg 624

Leu Ile Gly Ser Gly Met Asp Thr Lys Thr Glu Asn Cys Pro Tyr Met

195 200 205

ggc ttc atc tac aca tct ttt caa gag agg gca aca ttc atc tcc cat 672

Gly Phe Ile Tyr Thr Ser Phe Gln Glu Arg Ala Thr Phe Ile Ser His

210 215 220

gcc aac aca gcc aaa ctc gct cgg cac tac ggt gac aag agc cta gct 720

Ala Asn Thr Ala Lys Leu Ala Arg His Tyr Gly Asp Lys Ser Leu Ala

225 230 235 240

cag gtc tgt ggc aac att gcc tcc gat gag aaa cgc cac gcc act gcc 768

Gln Val Cys Gly Asn Ile Ala Ser Asp Glu Lys Arg His Ala Thr Ala

245 250 255

tac acc aaa atc gtg gag aag ctg gct gag att gat cct gac acc aca 816

Tyr Thr Lys Ile Val Glu Lys Leu Ala Glu Ile Asp Pro Asp Thr Thr

260 265 270

gtg atc gcg ttt gct gat atg atg agg aag aaa atc caa atg cca gct 864

Val Ile Ala Phe Ala Asp Met Met Arg Lys Lys Ile Gln Met Pro Ala

275 280 285

cat gca atg tat gat ggc tcg gac act ctg ctc ttc aag cac ttc aca 912

His Ala Met Tyr Asp Gly Ser Asp Thr Leu Leu Phe Lys His Phe Thr

290 295 300

gcc gtg gca cag cag att gga gtc tac tcg gca tgg gat tac tgc gaa 960

Ala Val Ala Gln Gln Ile Gly Val Tyr Ser Ala Trp Asp Tyr Cys Glu

305 310 315 320

ata att gat ttt ctc gtg gag aag tgg aat gtg cag aag atg acg ggg 1008

Ile Ile Asp Phe Leu Val Glu Lys Trp Asn Val Gln Lys Met Thr Gly

325 330 335

ctt tcg gat cag ggg aga aag gct cag gaa tat gtt tgt ggc ttg gct 1056

Leu Ser Asp Gln Gly Arg Lys Ala Gln Glu Tyr Val Cys Gly Leu Ala

340 345 350

gct aaa ata agg aga gtt gag gag aag gtt cag ggg aag gag aag aaa 1104

Ala Lys Ile Arg Arg Val Glu Glu Lys Val Gln Gly Lys Glu Lys Lys

355 360 365

gct gtg cag ctg cct gtc tct ttc agc tgg att ttc aac cgt cag atc 1152

Ala Val Gln Leu Pro Val Ser Phe Ser Trp Ile Phe Asn Arg Gln Ile

370 375 380

atg ata tga 1161

Met Ile

385

<210>2

<211>386

<212>PRT

<213>胡萝卜

<400>2

Met Ala Met Lys Leu Asn Ala Leu Ser Leu Gln Cys Pro Lys Gly Asn

1 5 10 15

Ser Phe Thr Arg Val Ala Pro Pro Gln Val Gly Arg Val Val Arg Ser

20 25 30

Asn Val Pro Met Ala Ser Thr Leu His Ala Ser Pro Leu Val Leu Asp

35 40 45

Thr Leu Lys Ala Pro Arg Pro His Val Asp Glu Ile Phe Thr Ser Leu

50 55 60

Glu Gly Trp Ala Arg Asp Asn Ile Leu Val His Leu Lys Ser Val Glu

65 70 75 80

Asn Ser Trp Gln Pro Gln Asp Tyr Leu Pro Asp Pro Thr Ser Asp Gly

85 90 95

Phe Glu Glu Gln Val Lys Glu Ile Arg Glu Arg Ala Lys Glu Ile Pro

100 105 110

Asp Asp Tyr Phe Val Val Leu Val Gly Asp Met Ile Thr Glu Glu Ala

115 120 125

Leu Pro Thr Tyr Met Ser Met Leu Asn Arg Cys Asp Gly Ile Lys Asp

130 135 140

Glu Thr Gly Ala Ala Pro Asp Ala Trp Ala Thr Trp Thr Arg Ala Trp

145 150 155 160

Thr Ala Glu Glu Asn Arg His Gly Asp Leu Leu Asn Lys Tyr Leu Tyr

165 170 175

Leu Ser Gly Arg Val Asp Met Arg Met Ile Glu Lys Thr Ile Gln Tyr

180 185 190

Leu Ile Gly Ser Gly Met Asp Thr Lys Thr Glu Asn Cys Pro Tyr Met

195 200 205

Gly Phe Ile Tyr Thr Ser Phe Gln Glu Arg Ala Thr Phe Ile Ser His

210 215 220

Ala Asn Thr Ala Lys Leu Ala Arg His Tyr Gly Asp Lys Ser Leu Ala

225 230 235 240

Gln Val Cys Gly Asn Ile Ala Ser Asp Glu Lys Arg His Ala Thr Ala

245 250 255

Tyr Thr Lys Ile Val Glu Lys Leu Ala Glu Ile Asp Pro Asp Thr Thr

260 265 270

Val Ile Ala Phe Ala Asp Met Met Arg Lys Lys Ile Gln Met Pro Ala

275 280 285

His Ala Met Tyr Asp Gly Ser Asp Thr Leu Leu Phe Lys His Phe Thr

290 295 300

Ala Val Ala Gln Gln Ile Gly Val Tyr Ser Ala Trp Asp Tyr Cys Glu

305 310 315 320

Ile Ile Asp Phe Leu Val Glu Lys Trp Asn Val Gln Lys Met Thr Gly

325 330 335

Leu Ser Asp Gln Gly Arg Lys Ala Gln Glu Tyr Val Cys Gly Leu Ala

340 345 350

Ala Lys Ile Arg Arg Val Glu Glu Lys Val Gln Gly Lys Glu Lys Lys

355 360 365

Ala Val Gln Leu Pro Val Ser Phe Ser Trp Ile Phe Asn Arg Gln Ile

370 375 380

Met Ile

385

<210>3

<211>1128

<212>DNA

<213>胡萝卜

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1128)

<400>3

atg tta ttg aca aca ggg aca tgg aca act aca tgc aat gct gct ttc 48

Met Leu Leu Thr Thr Gly Thr Trp Thr Thr Thr Cys Asn Ala Ala Phe

1 5 10 15

tct tac aaa aat cta gct ata aat ctg gcc ggt tcg gtt ctc cgg atg 96

Ser Tyr Lys Asn Leu Ala Ile Asn Leu Ala Gly Ser Val Leu Arg Met

20 25 30

aac tct act gca tgt gtt ccg gtt tct gtt act tgt aga agt agt aat 144

Asn Ser Thr Ala Cys Val Pro Val Ser Val Thr Cys Arg Ser Ser Asn

35 40 45

gct ccg gtt cag gca gcc aat gcc ggt gaa ccg gag aaa aag agc tta 192

Ala Pro Val Gln Ala Ala Asn Ala Gly Glu Pro Glu Lys Lys Ser Leu

50 55 60

gct gag gag ctg cgg ttt gga agc ttg gag gaa gac ggg tta tct tat 240

Ala Glu Glu Leu Arg Phe Gly Ser Leu Glu Glu Asp Gly Leu Ser Tyr

65 70 75 80

aaa gag aga ttt att gtg agg tct tac gaa gtt gga gtt aac aag act 288

Lys Glu Arg Phe Ile Val Arg Ser Tyr Glu Val Gly Val Asn Lys Thr

85 90 95

gct act att gaa acc atg gct aat tat cta cag gag gtg gcc tgc aac 336

Ala Thr Ile Glu Thr Met Ala Asn Tyr Leu Gln Glu Val Ala Cys Asn

100 105 110

cat gct cag att gtt ggc ttc tca act gat gga ttt tcg act aca act 384

His Ala Gln Ile Val Gly Phe Ser Thr Asp Gly Phe Ser Thr Thr Thr

115 120 125

acc atg aga aga ttg aat ctg ata tgg gtg aca gcc cga atg cac att 432

Thr Met Arg Arg Leu Asn Leu Ile Trp Val Thr Ala Arg Met His Ile

130 135 140

gaa gtc tac aag tac cct gct tgg agt gat gtg gtt gag att gag aca 480

Glu Val Tyr Lys Tyr Pro Ala Trp Ser Asp Val Val Glu Ile Glu Thr

145 150 155 160

tgg ggc caa agt gaa gga aga att ggg acc aga cgc gac tgg att atc 528

Trp Gly Gln Ser Glu Gly Arg Ile Gly Thr Arg Arg Asp Trp Ile Ile

165 170 175

agg gat tac tcc aat ggc gaa gtc att ggc aga gca aca agc aag tgg 576

Arg Asp Tyr Ser Asn Gly Glu Val Ile Gly Arg Ala Thr Ser Lys Trp

180 185 190

gtg atg atg cat caa gat agt aga cga ttt cag aaa gtc agt gat gaa 624

Val Met Met His Gln Asp Ser Arg Arg Phe Gln Lys Val Ser Asp Glu

195 200 205

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Asn Ala Ala Gly Thr Lys Leu Lys Val Ser Asn Gly Tyr Ala Ser Ala

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130 135 140

Val Thr Ala Arg Met His Ile Glu Val Tyr Lys Tyr Pro Ala Trp Ser

145 150 155 160

Asp Val Val Glu Ile Glu Thr Trp Gly Gln Ser Glu Gly Arg Ile Gly

165 170 175

Thr Arg Arg Asp Trp Ile Ile Arg Asp Tyr Ser Asn Gly Glu Val Ile

180 185 190

Gly Arg Ala Thr Ser Lys Trp Val Met Met His His Asp Ser Arg Arg

195 200 205

Phe Gln Lys Val Ser Asp Glu Val Arg Asp Glu Tyr Leu Val Phe Cys

210 215 220

Pro Lys Thr Pro Arg Phe Ala Phe Pro Glu Glu Asp Asn Tyr Ser Leu

225 230 235 240

Arg Lys Ile Ser Lys Leu Glu Asp Pro Ala Leu Phe Ser Ser Leu Gly

245 250 255

Leu Ala Pro Arg Arg Val Asp Leu Asp Met Asn Gln His Val Asn Asn

260 265 270

Val Ala Tyr Ile Gly Trp Ile Leu Glu Ser Ile Pro Gln Glu Val Ile

275 280 285

Asn Thr His Glu Leu Gln Thr Ile Thr Leu Asp Tyr Arg Arg Glu Cys

290 295 300

Gln His Asp Asp Ile Val Asp Ser Leu Thr Ser Pro Glu Ser Glu Glu

305 310 315 320

Asn Ala Ala Gly Thr Lys Leu Lys Val Ser Asn Gly Tyr Ala Ser Ala

325 330 335

Ala Ala Ala Ala Thr Asp Gly Asp Asp Leu Leu Pro Phe Leu His Met

340 345 350

Leu Arg Leu Ser Asn Asn Lys Leu Glu Ile Asn Arg Ala Arg Thr Arg

355 360 365

Trp Arg Lys Lys Thr Lys Pro Thr Asn Asn Ile Val

370 375 380

<210>11

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的DNA

<400>11

cangargarg cnctbccnca nta 23

<210>12

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的DNA

<400>12

tcvrvdagyt tytcnacdat ytt 23

<210>13

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的DNA

<400>13

gcngyykcrt gnckyttytc rtc 23

<210>14

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的DNA

<400>14

ganmtbccng atgantaytt hrttg 25

<210>15

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的DNA

<400>15

ccytcnscns wmaghccngt 20

<210>16

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的DNA

<400>16

ggcatndvda yyttbwtyyt catcat 26

<210>17

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的DNA

<400>17

gcggttctcc tcagcagtc 19

<210>18

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的DNA

<400>18

gttggcatgg gagatgaatg 20

<210>19

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的DNA

<400>19

caaatgccag ctcatgcaat g 21

<210>20

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的DNA

<400>20

cagcagattg gagtctactc 20

<210>21

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的DNA

<400>21

atggctatga aattgaacgc c 21

<210>22

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的DNA

<400>22

tctagaggat ccatggctat gaaattgaac gcc 33

<210>23

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的DNA

<400>23

tcatatcatg atctgacggt tg 22

<210>24

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的DNA

<400>24

tctagacgag ctctcatatc atgatctgac ggttg 35

<210>25

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的DNA

<400>25

taatacgact cactataggg 20

<210>26

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的DNA

<400>26

gttttcccag tcacgac 17

<210>27

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的DNA

<400>27

rtggnacnmg rgkrrattgg at 22

<210>28

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的DNA

<400>28

ctbatwtggg tbacddmnmg natg 24

<210>29

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的DNA

<400>29

garrayggny wntcbtayam rga 23

<210>30

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的DNA

<400>30

tgrcaytcnc kyckrtartc 20

<210>31

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的DNA

<400>31

acrttrttna crtgytkrtt cat 23

<210>32

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的DNA

<400>32

gtdskncmvc krttkakytc 20

<210>33

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的DNA

<400>33

tagcaagtgg gtgatgat 18

<210>34

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的DNA

<400>34

gttttctgcc ccaaaacacc 20

<210>35

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的DNA

<400>35

tattcatctc gaacatcat 19

<210>36

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的DNA

<400>36

atcatcaccc acttgcta 18

<210>37

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的DNA

<400>37

gcattctagg ctaggattgt 20

<210>38

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的DNA

<400>38

aaggaagtcc tttatacg 18

<210>39

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的DNA

<400>39

ggcgaatcga gatcgaatct 20

<210>40

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的DNA

<400>40

cacctgagca ttcaccccat t 21

<210>41

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的DNA

<400>41

ctcaatttct ccgccaagct 20

<210>42

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的DNA

<400>42

cttttccagt ctcgggcttg 20

<210>43

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的DNA

<400>43

ggaagcaact catcgtcgtc tgt 23

<210>44

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的DNA

<400>44

caagcccgag actggaaaag 20

<210>45

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的DNA

<400>45

tctagaggat ccatgttatt gacaacaggg ac 32

<210>46

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的DNA

<400>46

atgttattga caacagggac 20

<210>47

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的DNA

<400>47

tctagacgag ctcctagttt aaacagtaca ctg 33

<210>48

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的DNA

<400>48

ctagtttaaa cagtacactg 20

Claims

1.编码以下蛋白质(a)、(b)或(c)的基因：

(a)包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质；

2.编码以下蛋白质(a)、(b)或(c)的基因：

(a)包含SEQ ID NO：4或6所示氨基酸序列的蛋白质；

3.具有根据权利要求1的基因和/或根据权利要求2的基因的表达载体。

4.导入了根据权利要求1的基因和/或根据权利要求2的基因的转化体。

5.用于产生岩芹酸的方法，所述方法包括：将根据权利要求1的基因和/或根据权利要求2的基因导入植物细胞，产生经转化的植物的步骤；以及从由经转化的植物收集来的组织提取岩芹酸的步骤。

6.能够产生岩芹酸的经转化的植物细胞或经转化的植物，其中导入了根据权利要求1的基因和根据权利要求2的基因。

7.能够产生顺-4-十六碳烯酸的经转化的植物细胞或经转化的植物，其中导入了根据权利要求1的基因和根据权利要求2的基因。

8.能够产生顺-8-二十碳烯酸的经转化的植物细胞或经转化的植物，其中导入了根据权利要求1的基因和根据权利要求2的基因。

9.能够增加饱和脂肪酸生产的经转化的植物细胞或经转化的植物个体，其中导入了根据权利要求2的基因。

10.根据权利要求5的用于产生岩芹酸的方法，其包括使用具有种子特异的启动子和位于该启动子下游的上述基因的表达载体转化植物细胞，然后自种子提取岩芹酸。

11.根据权利要求5的用于产生顺-4-十六碳烯酸的方法，其包括使用具有种子特异的启动子和位于该启动子下游的上述基因的表达载体转化植物细胞，然后自种子提取顺-4-十六碳烯酸。

12.根据权利要求5的用于产生顺-8-二十碳烯酸的方法，其包括使用具有种子特异的启动子和位于该启动子下游的上述基因的表达载体转化植物细胞，然后自种子提取顺-8-二十碳烯酸。

13.根据权利要求5的用于产生饱和脂肪酸的方法，其包括使用具有种子特异的启动子和位于该启动子下游的上述基因的表达载体转化植物细胞，然后自种子提取饱和脂肪酸。