CN101208352B

CN101208352B - 选择性糖苷酶抑制剂、该抑制剂的制备方法和用途

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Publication number: CN101208352B
Application number: CN2006800149950A
Authority: CN
Inventors: D·沃卡多; G·惠特沃斯; M·莫考雷; K·斯塔布斯
Original assignee: Simon Fraser University
Current assignee: Simon Fraser University
Priority date: 2005-03-01
Filing date: 2006-03-01
Publication date: 2013-08-07
Anticipated expiration: 2026-03-01
Also published as: EP1869060A4; CA2819464A1; US20080287375A1; CA2599843C; JP5154954B2; JP2008531604A; EP2436687A1; CN101208352A; EP1869060A1; AU2006220187B2; AU2006220187A1; EP1869060B1; WO2006092049A1; CA2599843A1

Abstract

本发明包括用于选择性抑制糖苷酶的化合物、所述化合物的药物前体以及含有所述化合物或其药物前体的药物组合物。本发明还包括动物模型和制作动物模型的方法，该动物模型用于研究与O-GIcNAc酶的缺乏或过表达、O-GIcNAc的累积或缺乏相关的疾病及异常，以及这种疾病和异常的疗法。本发明还包括治疗所述疾病和异常的方法。本发明还包括制备所述化合物的方法，以及制备选择性糖苷酶抑制剂的方法。

Description

选择性糖苷酶抑制剂、该抑制剂的制备方法和用途

相关申请

本申请要求在2005年3月1日提交的专利申请号为60/656,878的美国临时专利申请的优先权，该专利通过引证的方式纳入本说明书。

技术领域

本申请涉及选择性抑制糖苷酶的化合物，所述抑制剂的制备方法及其用途。

背景技术

很多细胞蛋白质——既包括核蛋白也包括胞质蛋白——是通过增加单糖2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡糖苷(β-N-乙酰葡糖胺)被翻译后修饰的，所述单糖通过一个O-糖苷键附于蛋白质上^[1]。此修饰通常被称为O连的N-乙酰葡糖胺或O-GlcNAc。

O-GlcNAc修饰的蛋白质具有很多重要细胞功能，例如包括转录 ^[2-5]、蛋白酶体降解^[6]和细胞信号传导^[7]。在许多结构蛋白质中也发现了O-GlcNAc^[8-10]。例如，O-GlcNAc曾被发现于许多细胞骨架蛋白中，包括神经丝蛋白^[11，12]、突触蛋白^[13，14]、针对突触蛋白的网格蛋白装配蛋白AP-3^[15]和锚蛋白G^[16]。曾在大脑中发现大量的O-GlcNAc修饰 ^[17，18]。也曾在明显涉及几种疾病的病原学的蛋白质中发现O-GlcNAc修饰，所述的疾病包括II型糖尿病，阿尔茨海默病(AD)和癌症。

例如，人们很好地证实了AD和包括唐氏症、皮克病、C型尼曼匹克病和肌萎缩性脊髓侧索硬化(ALS)在内的许多相关的tau病变的部分特征在于神经原纤维缠结(NFT)的发展。这些NFT是配对螺旋样纤维(PHF)的聚集体且由重要蛋白“tau”的异常形式组成。正常的tau使一种重要的微管细胞网络稳定，该细胞网络是神经元中分配蛋白质和营养成分必不可少的。然而，AD患者体内的tau被超磷酸化，扰乱了其正常功能，形成PHF并最终累积形成有害的NFT。AD患者脑中的NFT水平与痴呆的程度的明显对应强有力地支持了 tau机能障碍在AD中的重要作用^[19，20]。tau的这种超磷酸化的确切起因还不清楚。因此，人们在以下两方面做出了很大的努力，a)阐明tau超磷酸化的分子生理学基础^[6]；以及b)确定可以限制tau超磷酸化的方法，希望其可能阻止甚至逆转阿尔茨海默病的发展^[7，8]。至今，多种证据表明许多激酶的上调可能参与了tau超磷酸化^{[9，10，21]}，然而最近又有对于超磷酸化的另一种基础发展起来^[21]。具体地说，最近出现的是tau的磷酸盐水平由tau上O-GlcNAc的水平调节。在AD病人脑中超磷酸化的tau的O-GlcNAc的水平显著低于健康人脑中O-GlcNAc的水平^[2，3]。这些结果表明，调控tau中O-GlcNAc水平的机制障碍可能对NFT的形成和相关的神经变性疾病非常重要。

人类有三个从复合糖(glycoconjugate)上切割末端β-N-乙酰葡糖胺残基的基因编码酶。第一个基因编码酶-O-糖蛋白2-乙酰氨基-2-脱氧-3-D-吡喃葡糖苷酶(O-GlcNAcase)。O-GlcNAcase是糖苷水解酶家族84的一员，所述的糖苷水解酶包括来源于从原核致病菌到人类等多种有机体的酶(糖苷水解酶的家族分类参见Continho，P.M.&Henrissat，B.(1999)Carbohydrate-Active Enzymes server at URL：http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/(^[19，20]))。O-GlcNAcase的作用是，使O-GlcNAc从翻译后修饰的蛋白质上的丝氨酸和苏氨酸残基上水解脱去^{[1，22，23]}。与O-GlcNAc在多种细胞内蛋白中的存在一致，O-GlcNAc酶似乎在多种疾病，包括II型糖尿病^[7，21]、AD^{[9，17，24]}和癌症^[18]的病原中有作用。尽管O-GlcNAc酶在早些时候就已被分离^[11，12]，但大约20年后人们才理解其从蛋白质的丝氨酸和苏氨酸残基上切割O-GlcNAc的生物化学功能^[13]。最近O-GlcNAc酶已被克隆^[15]、部分表征^[16]，并被揭示具有另外的作为组蛋白乙酰基转移酶的活性^[14]。然而，对此酶的催化机理人们了解很少。

另外两个基因，HEXA和HEXB，编码催化从复合糖上水解切割末端β-N-乙酰葡糖胺残基的酶。HEXA和HEXB的基因产物分别主要产生两种二聚同工酶，即氨基己糖酶A和氨基己糖酶B。氨基己糖酶A(αβ)是一种异型二聚同工酶，由一个α亚单位和一个β亚单位组成。氨基己糖酶B(ββ)是一种同型二聚同工酶，由两个β亚单位组成。两种亚单位α-和β-具有高度的序列同源性。这两种酶都被归类于糖基水解酶家族20的成员，并通常位于溶酶体中。这些溶酶体β-氨基己糖酶的适当发挥作用对人类生长有关键的作用，不幸的基因病——分别由氨基己糖酶A和氨基己糖酶B的机能障碍引起的贴撒斯症(Tay-Sach′s disease)和山德霍夫病——更强调了这一事实^[25]。这些酶的缺乏引起糖脂和复合糖在溶酶体内的累积，导致神经损伤和变形。在有机体水平上的神经节苷脂的累积的有害作用还未被发现 ^[26]。

由于这些β-N-乙酰基-葡萄糖胺酶的生物学重要性，糖苷酶小分子抑制剂^[27-30]作为阐明这些酶在生物学过程中的作用的工具以及在开发潜在的治疗应用方面受到了很大的重视^[31]。使用小分子控制糖苷酶的功能在多个方面优于基因剔除研究，包括快速改变剂量或全部取消治疗的能力。

然而，在开发用于阻断哺乳动物糖苷酶——包括O-GlcNAc酶——作用的抑制剂的过程中一个重大挑战是存在于高等真核生物的组织中大量的功能相关的酶。因此，在研究一种特定酶的细胞学和有机体生理学功能时，非选择性抑制剂的用途是复杂的，因为这种对功能上相关的酶的伴发抑制产生了复杂的表型。在β-N-乙酰葡萄糖胺酶的例子中，阻断O-GlcNAc酶功能的现有化合物是非特异性的并且有效抑制溶酶体β-氨基己糖酶。至今还没有已知的具有对核质O-GlcNAc酶优于对溶酶体β-氨基己糖酶的选择性的有效的抑制剂。

一些更好被表征的β-N-乙酰基-葡萄糖胺酶的抑制剂有：链脲佐菌素(STZ)、2′-甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷-[2，1-d]-Δ2′-噻唑啉(NAG-噻唑啉)和O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-D-吡喃葡糖基二烯)氨基N-苯基氨基甲酸酯(PUGNAc)^[7，32-35]，这些抑制剂曾被用于研究细胞和组织内O-GlcNAc的翻译后修饰。

由于STZ对β-胰岛细胞具有极有害的作用，其早已被用作致糖尿病的化合物^[36]。STZ通过使细胞DNA的烷基化^[36，37]和产生包括一氧化氮的自由基种类^[38]施加其细胞毒性。所导致的DNA链断裂损伤促进了聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)^[39]的活化，净效果是细胞NAD+水平的耗尽并最终导致细胞死亡^[40，41]。其他研究者提出了另一种观点，认为STZ的毒性是在β-胰岛细胞中高度表达的O-GlcNAc酶不可逆抑制的结果^[32，42]。然而，这种假设曾被两个独立的研究小组质疑 ^[43，44]。由于细胞中蛋白质上O-GlcNAc水平随多种细胞应激形式增加 ^[45]，看起来STZ导致增加的蛋白质O-GlcNAc修饰水平是通过引起细胞应激而不是通过对O-GlcNAc酶的任何特定和直接的作用。事实上，Hanover和他的同事曾表明STZ作为差的并对O-GlcNAc酶有些选择性的抑制剂发挥作用^[46]，并且尽管其他人曾提出STZ的作用是不可逆地抑制O-GlcNAc酶^[47]，但还没有对这种作用模式的明确证明。

人们已发现NAG-噻唑啉是氨基己糖酶家族20^[30，48]和最近发现的O-GlcNAc酶家族84^[49]的有效抑制剂。尽管其是有效的，但在复杂的生物学环境中使用NAG-噻唑啉的不利方面在于它缺乏选择性并因此扰乱多种细胞过程。

PUGNAc是同样缺乏选择性的另一种化合物，但它可用作人O-GlcNAc酶^[13，50]和人β-氨基己糖酶家族20^[51]的抑制剂。PUGNAc分子是Vasella和他的同事开发的，并被发现是对来源于直生刀豆(Canavalia ensiformis)和鲁西(氏)毛霉菌(Mucor rouxii)的β-N-乙酰基-葡萄糖胺酶和来源于小牛肾脏的β-氨基己糖酶^[28]的有效的竞争抑制剂。

因此，需要改进针对糖苷酶的选择性抑制剂。

发明内容

本发明的实施方案涉及选择性抑制糖苷酶的化合物。本发明也涉及制备这种化合物的方法及其用途。

在本发明的一个实施方案中，所述化合物具有化学通式(I)：

其中R₃、R₅、R₆选自支链烷基链、无支链烷基链、环烷基、芳香基、醇、醚、胺、取代或未取代的氨基甲酸酯、取代或未取代的脲、酯、酰胺、醛、羧酸及其含有杂原子的衍生物，其中所述的酯和酰胺可含有一个酰基基团，该酰基基团选自支链烷基链、无支链烷基链、环烷基、芳香基及其杂原子衍生物；R₂和R₄是CH₂、CHR₁、NH、NR₁或任何杂原子，并且，R₁选自H、醚、胺、支链烷基链、无支链烷基链、环烷基、芳香基及其杂原子衍生物。本发明包括上述化合物的可药用的盐。在本发明的一些实施方案中，R₂是S，R₁选自CH₂CH₃、(CH₂)₂CH₃、(CH₂)₃CH₃、(CH₂)₄CH₃、CH(CH₃)₂和CH₂CH(CH₃)₂，且R₄是O。本发明还涉及所述化合物的药物前体，含有所述化合物和一种可药用的载体的药物组合物，以及含有所述化合物的药物前体和一种可药用载体的药物组合物。

在本发明的另一个实施方案中，所述的化合物具有化学通式(II)：

其中X₁-X₆是O、NH、NR₁、CHR₁、CH₂或任何杂原子，R₁至R₅ 选自支链烷基链、无支链烷基链、环烷基、芳香基、醇、醚、胺、取代或未取代的氨基甲酸酯、取代或未取代的脲、酯、酰胺、醛、羧酸及其含有杂原子的衍生物，其中所述的酯和酰胺可含有一个酰基基团，该酰基基团选自支链烷基链、无支链烷基链、环烷基、芳香基及其杂原子衍生物，以及它们的可药用的盐。

在一些实施方案中，与对其他糖苷酶相比，所述化合物选择性地对特定的糖苷酶优先抑制。在本发明的一个实施方案中，所述糖苷酶包括糖苷水解酶。在本发明的另一个实施方案中，所述的糖苷水解酶是糖苷水解酶家族84。在本发明的一个特定实施方案中，所述糖苷酶是O-GlcNAc酶。所述化合物相对于β-氨基己糖酶有选择性地优先抑制O-GlcNAc酶。更具体地，在此特定的实施方案中，所述化合物有选择性地抑制从蛋白质上切割2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡糖苷(O-GlcNAc)。

所述化合物可用在开发动物模型方面，这些动物模型用于研究与O-GlcNAc酶的缺乏、O-GlcNAc酶的过表达、O-GlcNAc的累积、O-GlcNAc的耗尽有关的疾病或异常，以及用于研究与O-GlcNAc酶的缺乏或过表达，或者O-GlcNAc的累积或耗尽有关的疾病和异常的治疗方法。这些疾病和异常包括糖尿病、神经变性疾病(包括阿尔茨海默病)以及癌症。所述化合物同样可用于治疗对糖苷酶抑制疗法响应的疾病和异常。所述化合物还可用于使细胞和组织适应与组织损伤或应激相关的紧张状态、刺激细胞和促进细胞分化。这些化合物也可用于抑制特定糖苷酶——例如是糖苷水解酶家族84成员的微生物毒素，并因此作为抗微生物剂使用。

本发明还涉及制备所述化合物的方法。在一个实施方案中，所述方法可包括以下步骤：

a)用一系列酰化试剂使2-氨基-2-脱氧-1，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖的盐酸盐酰化，生成一系列1，3，4，6-四-O-乙酰基-2-脱氧-2-N-酰基-β-D-吡喃葡萄糖的衍生物；

b)将所述一系列1，3，4，6-四-O-乙酰基-2-脱氧-2-N-酰基-β-D-吡喃葡萄糖衍生物的酰胺转化成相应的硫代酰胺，并将硫代酰胺环化，生成一系列3，4，6-三-O-乙酰基-1，2-二脱氧-2′-烷基-α-D-吡喃葡糖基-[2，1-d]-Δ2′-噻唑啉；以及

c)将所述噻唑啉化合物脱酰化，生成一系列1，2-二脱氧-2′-烷基-α-D-吡喃葡糖基-[2，1-d]-Δ2′-噻唑啉。

本发明也涉及制备选择性糖苷酶抑制剂的方法，包括：

a)选择两种或多种糖苷酶或一类糖苷酶的一种抑制剂；

b)通过扩大或缩小侧链改变抑制剂上的一条或多条侧链；以及

c)测试经改变后的抑制剂对一种或多种糖苷酶的选择性抑制作用。

在本发明的一些实施方案中，制备选择性糖苷酶抑制剂的方法包括以下步骤：

a)选择β-N-乙酰基-葡萄糖胺酶或β-氨基己糖酶的一种具有选自以下通式的抑制剂：

其中X₁-X₆是O、NH、NR₁、CHR₁、CH₂或任何杂原子，R₁至R₅ 选自支链烷基链、无支链烷基链、环烷基、芳香基、醇、醚、胺、取代或未取代的氨基甲酸酯、取代或未取代的脲、酯、酰胺、醛、羧酸及其含有杂原子的衍生物，其中所述的酯和酰胺可含有一个酰基，该酰基选自支链烷基链、无支链烷基链、环烷基、芳香基及其杂原子衍生物，及其可药用的盐；

b)通过扩大或缩小侧链的体积改变所述抑制剂的R₁侧链；以及

c)测试改变后的抑制剂对一种或多种β-N-乙酰基-葡萄糖胺酶或β-氨基己糖酶的抑制作用。

在本发明的一些实施方案中，所述抑制剂的R₁侧链可通过向侧链中插入一个支链烷基链、一个无支链烷基链、一个环烷基、一个芳香基或其杂原子衍生物而被扩大。在一些特定的实施方案中，R₁链通过插入选自CH₂CH₃、(CH₂)₂CH₃、(CH₂)₃CH₃、(CH₂)₄CH₃、CH(CH₃)₂ 和CH₂CH(CH₃)₂的基团而被扩大。

附图说明

在拟用于阐明本发明的实施方案的附图中：

图1图示了O-GlcNAc酶的三种可能的催化机理。途径A：一步法转化机理；途径B：涉及一个共价糖基酶中间体的形成和分解的双置换保留机理(double displacement retaining mechanism)；途径C：涉及一个双环噁唑啉中间体的形成和分解的双置换保留机理。

图2图示了在MU-GlcNAc的N-氟乙酰基衍生物存在下O-GlcNAc酶和β-氨基己糖酶的活性。(A)在人β-氨基己糖酶催化下，MU-GlcNAc的N-氟乙酰基衍生物水解的初始速率；(◆)MU-GlcNAc(5)，(

)MU-GlcNAc-F(5a)，(■)MU-GlcNAc-F2(5b)，(●)MU-GlcNAcF3(5c)。嵌入插图：数轴相交处绘图区域的详情。(B)在人O-GlcNAc酶催化下，MU-GlcNAc的N-氟乙酰基衍生物水解的初始速率；(◆)MU-GlcNAc(5)，(

)MU-GlcNAc-F(5a)，(■)MU-GlcNAc-F2(5b)，(●)MU-GlcNAcF3(5c)。嵌入插图：数轴相交处绘图区域的详情。(C)将MU-GlcNAc底物类似物的N-氟乙酰基取代物的Taft参数(σ*)与图A和B中测得的每个底物的logV_max[E]₀/K_M值作图所得的线性自由能分析图，其中(●)O-GlcNAc酶，(□)β-氨基己糖酶。

图3图示了在NAG-噻唑啉(9a)存在下，人O-GlcNAc酶催化的pNP-GlcNAc的水解的一种竞争抑制形式。所使用的9a的浓度(mM)是0.00(◆)，0.033(△)，0.100(●)，0.300(X)，0.900(■)和3.04(○)。嵌入插图：将表观K_M对NAG-噻唑啉的浓度(9a)作图所得的K_I的图解分析。

图4是图示一组噻唑啉抑制剂对O-GlcNAc酶的抑制优于对β-氨基己糖酶的抑制的选择性的图表。柱形图是对抑制O-GlcNAc酶(

)和β-氨基己糖酶(

)催化的MU-GlcNAc的水解测量所得的的噻唑啉抑制剂组的K_I值。

图5是在有或无50μM不同噻唑啉抑制剂的条件下，经40小时培养的COS-7细胞中的蛋白质印迹(Western Blot)图。将COS-7细胞与噻唑啉抑制剂共同培养引起O-GlcNAc修饰的蛋白质的细胞水平的增加。泳道1，噻唑啉9a；泳道2，噻唑啉9c；泳道3，噻唑啉9g；泳道4，无抑制剂。(A)使用抗-O-GlcNAc MAb CTD110.6与接下来的抗鼠IgG-HRP结合物对O-GlcNAc修饰蛋白的细胞水平进行印迹分析。(B)(A)中所加样品经抗β-肌动蛋白mAb clone AC-40与随后的抗鼠IgG-HRP结合物处理后的蛋白质印迹结果，揭示了每个样品中含有相同水平的β-肌动蛋白。

图6是在有或无50μM噻唑啉抑制剂(9c)的条件下，培养超过40小时的COS-7细胞中蛋白质的印迹图。将COS-7细胞与噻唑啉抑制剂(9c)共同培养，产生了随时间增加的O-GlcNAc修饰蛋白的细胞水平。(A)使用抗O-GlcNAc MAb CTD 110.6与接下来的抗鼠IgG-HRP结合物对暴露于抑制剂(9c)后的O-GlcNAc修饰蛋白的细胞水平作为时间的函数进行的印迹分析。(B)(A)中所加样品经抗β-肌动蛋白mAb Clone AC-40与随后的抗鼠IgG-HRP结合物处理的蛋白质印迹结果，揭示了每个样品中含有相同水平的β-肌动蛋白。(C)在无抑制剂存在下对O-GlcNAc修饰蛋白的细胞水平作为时间的函数进行的蛋白质印迹分析，表明O-GlcNAc修饰的蛋白质的水平不随融合(confluence)剧烈变化。在0小时，培养板上约25％融合，而40小时后培养板上约90％融合。(D)(C)中所加样品经(B)组的方法处理后的蛋白质印迹结果，揭示了两个样品中含相同水平的β-肌动蛋白。

图7图示了链脲佐菌素(STZ)在D₂O中的分解。在24小时的时段内监测STZ在D₂O中的溶解。用星号(*)标记的共振峰来自STZ的α端基异构体上的H-1。光谱收集自室温下刚溶解于D₂O中的一份STZ样品(≈10mM)。NMR谱图是在STZ溶解的A)5分钟，B)20分钟，C)40分钟，D)2小时，E)4小时和F)24小时后收集的。

图8是图示了STZ未显示出对O-GlcNAc酶或β-氨基己糖酶的时间依赖性失活作用的图表。A)在50mM NaH₂PO₄，100mM NaCl，1％BSA和5mM β-巯基乙醇存在下，pH6.5时，将O-GlcNAc酶(0.016mg/mL)与10mM STZ共同培养。在多个时间间隔后测定失活混合物和对照组的酶活性。这些值并不是一致的，因为一些STZ随每份酶(3μL)转入含有Mu-GlcNAc(5.7mM)的测定混合物(共25μL)中，在测定混合物中产生终浓度为1.2mM的STZ。事实上，假定STZ是O-GlcNAc酶(K_I＝1.5mM)的一个竞争抑制剂，计算出的测定中对照品与实验品的期望反应速率比(V_对照/V_STZ)是1.17，这个数值与6小时后的测量值完全一致。B)在50mM柠檬酸盐，100mM NaCl，0.1％BSA存在下，pH4.25时，将β-氨基己糖酶(0.036mg/mL)与10mM STZ共同培养。在多个时间间隔后用所述的方法和材料测定失活混合物和对照品的酶活性。这些值不是完全一致的，因为一些STZ随每份酶(3μL)转入含有Mu-GlcNAc(5.7mM)的测定混合物(共25μL)中，在测定混合物中产生终浓度为1.2mM的STZ。事实上，假定STZ是β-氨基己糖酶(K_I＝47mM)的一个竞争抑制剂，计算出的测定中的对照组和实验组的期望反应速率比(V_对照 /V_STZ)是1.01，这个数值与6小时后的测量值一致。

图9显示了来源于被注射不同剂量的抑制剂9c的大鼠的脑、肌肉和肝脏组织中的蛋白质的印迹图。通过尾静脉向四只大鼠注射不同剂量的抑制剂9c或一种对照缓冲剂进行处理。连续注射两次，间隔约18小时，然后在第一次注射的24小时后杀死大鼠。使用α-O-GlcNAc抗体(CTD110.6)的蛋白质印迹分析清楚地表明了所述的抑制剂9c容易进入多种组织中，包括脑(A)、肌肉(B)和肝脏(C)，并且低至50mgkg^-1的剂量几乎足够引起O-GlcNAc水平的最大增加。

图10图示了对大鼠进行静脉葡萄糖耐量试验的结果。(A)对8只大鼠测试其葡萄糖清除(clear)的能力，其中4只通过尾静脉注射50mgkg^-1的抑制剂9c。使用1g/kg的攻击量葡萄糖进行静脉葡萄糖耐量试验(IVGTT)，所述的葡萄糖也是通过尾静脉注入。误差条表明每种情况下四只大鼠之间的差异。(B)使用α-O-GlcNAc抗体(CTD110.6)的印迹分析表明IVGTT中用抑制剂处理的四只大鼠确实有O-GlcNAc修饰蛋白水平的增加。

图11显示了在不同的时间段，被注射抑制剂9c的大鼠的脑和肌肉组织中蛋白质的印迹。多只大鼠通过向尾静脉注射50mgkg^-1抑制剂9c进行处理，并在注射后的特定时间被杀死以观察O-GlcNAc的水平是如何随时间变化的。使用α-O-GlcNAc抗体(CTD110.6)的蛋白质印迹分析被用于监测O-GlcNAc水平。脑(A)和肌肉(B)组织显示，抑制剂可快速到达组织并在组织中很快使O-GNAc水平升高(＜3小时)。约24-32小时内，组织中的抑制剂9c被清除并且O-GlcNAc的水平恢复正常。时间0和32(-)代表在0小时和32小时未被处理的对照动物。

图12显示了来源于大鼠的脑、肌肉、胰腺、脂肪和脾组织的蛋白质的印迹，所述的大鼠被喂食两种不同形式和剂量的抑制剂9c。大鼠被持续三天喂食含有不同量的脱保护的(极性)或被保护的(非极性)的抑制剂9c或根本没有抑制剂的食物。组织中O-GlcNAc的水平通过使用α-O-GlcNAc抗体(CTD110.6)的蛋白质印迹分析检测。根据蛋白质印迹分析判断，100mgkg^-1day^-1的剂量足够抑制O-GlcNAc酶并引起O-GlcNAc修饰蛋白的大量增加，所述的印迹分析使用一种α-O-GlcNAc抗体检测脑(A)、肌肉(B)、胰腺(C)、脂肪(D)和脾(E)组织。1000mgkg^-1day^-1的剂量引起O-GlcNAc修饰蛋白的少量更大增加。使用α-肌动蛋白抗体的对照印迹或SDS-PAGE显示了所加样品是等量的。

具体实施方式

为了提供对本发明更完整的理解，以下说明书中提出了具体细节。但是，本发明的实施也可不包括这些细节。在其他情况下，没有显示出或详细描述公知的元素以避免不必要地使本发明难以理解。因此，说明书和附图的作用是例证性的，而不是限制性的。

本发明包括选择性地抑制糖苷酶的化合物。在本发明的一个实施方案中，所述化合物具有化学通式(I)：

其中R₃、R₅、R₆选自支链烷基链、无支链烷基链、环烷基、芳香基、醇、醚、胺、取代或未取代的氨基甲酸酯、取代或未取代的脲、酯、酰胺、醛、羧酸及其含有杂原子的衍生物，其中所述的酯和酰胺可含有一个酰基基团，该酰基基团选自支链烷基链、无支链烷基链、环烷基、芳香基及其杂原子衍生物；R₂和R₄是CH₂、CHR₁、NH、NR₁或任何杂原子，并且，R₁选自H、醚、胺、支链烷基链、无支链烷基链、环烷基、芳香基，及其杂原子衍生物。本发明包括上述化合物的可药用的盐。在一些实施方案中，R₂是S，R₁选自CH₂CH₃、(CH₂)₂CH₃、(CH₂)₃CH₃、(CH₂)₄CH₃、CH(CH₃)₂和CH₂CH(CH₃)₂，且R₄是O。在本发明的一些特定的实施方案中，所述化合物包括1，2-二脱氧-2′-乙基-α-D-吡喃葡糖基-[2，1-d]-Δ2′-噻唑啉，1，2-二脱氧-2′-丙基-α-D-吡喃葡糖基-[2，1-d]-Δ2′-噻唑啉，1，2-二脱氧-2′-丁基-α-D-吡喃葡糖基-[2，1-d]-A2′-噻唑啉，1，2-二脱氧-2′-戊基-α-D-吡喃葡糖基-[2，1-d]-Δ2′-噻唑啉，1，2-二脱氧-2′-异丙基-α-D-吡喃葡糖基-[2，1-d]-Δ2′-噻唑啉，1，2-二脱氧-2′-异丁基-α-D-吡喃葡糖基-[2，1-d]-Δ2′-噻唑啉。

本领域技术人员可理解，上述式(I)也可由下式代表：

在本发明的另一个实施方案中，所述化合物具有化学通式(II)：

其中X₁-X₆是O、NH、NR₁、CHR₁、CH₂或任何杂原子，R₁至R₅ 选自支链烷基链、无支链烷基链、环烷基、芳香基、醇、醚、胺、取代或未取代的氨基甲酸酯、取代或未取代的脲、酯、酰胺、醛、羧酸，及其含有杂原子的衍生物，其中所述的酯和酰胺可含有一个酰基基团，该酰基基团选自支链烷基链、无支链烷基链、环烷基、芳香基，及其杂原子衍生物，以及它们的可药用的盐。

本发明包括上述化合物的可药用的盐。在一些实施方案中，R₁选自 CH₂CH₃、(CH₂)₂CH₃、(CH₂)₃CH₃、(CH₂)₄CH₃、CH(CH₃)₂和CH₂CH(CH₃)₂，R₂、R₃和R₄是OH，X₁和X₂是O，X₃是NH，X₄和X₅是O，X₆是NH，且R₅是C₆H₆。在本发明一些特定的实施方案中，所述化合物包括O-(2-脱氧-2-丙酰氨基-D-吡喃葡糖亚基)氨基N-苯基氨基甲酸酯，O-(2-脱氧-2-丁酰氨基-D-吡喃葡糖亚基)氨基N-苯基氨基甲酸酯，O-(2-脱氧-2-戊酰氨基-D-吡喃葡糖亚基)氨基N-苯基氨基甲酸酯，O-(2-脱氧-2-己酰氨基-D-吡喃葡糖亚基)氨基N-苯基氨基甲酸酯，O-(2-脱氧-2-异丁酰氨基-D-吡喃葡糖亚基)氨基N-苯基氨基甲酸酯，O-(2-脱氧-2-异戊酰氨基-D-吡喃葡糖亚基)氨基N-苯基氨基甲酸酯。

本申请中，术语“化合物”应被理解为意指如上讨论的化合物并且包括所述化合物的衍生物，包括所述化合物的酰基保护的衍生物，以及所述化合物及其衍生物的可药用的盐。本发明还包括所述化合物的药物前体，含有所述化合物和一种可药用的载体的药物组合物，以及含有所述化合物的药物前体和一种可药用载体的药物组合物。

在本发明的一些实施方案中，所述化合物选择性地对特定糖苷酶活性的抑制优于对其他糖苷酶的抑制。糖苷酶可包括糖苷水解酶。例如，所述的糖苷水解酶可以是糖苷水解酶家族84。在本发明一个特定的实施方案中，所述糖苷酶是O-GlcNAc酶。本发明包括选择性地对O-GlcNAc酶的抑制优于对β-氨基己糖酶的抑制的化合物。具体地说，所述化合物选择性地抑制O-GlcNAc从蛋白质上的断裂。

本发明的化合物是研究细胞水平上和有机体水平上O-GlcNAc的生理学功能的有用的工具。该化合物在开发动物模型方面是有用的，所述动物模型用于研究疾病或异常或者用于研究与O-GcNAc酶的缺乏或过表达、或O-GlcNAc的累积和耗尽相关的疾病或异常的治疗方法。一个例子是，该化合物在开发I型或II型糖尿病的疾病模型上是有用的。

当人们或动物无法适当地调节血糖水平时就会产生II型糖尿病。组织必需能够对葡萄糖可用量和来源于内分泌系统其他部分的信号进行感知和做出快速反应。葡萄糖是调节胰岛素合成和胰腺β-细胞的分泌的重要营养物质。在所有进入细胞的葡萄糖中，2-5％转入己糖胺生物合成途径，从而调节此途径的终产物尿苷二磷酸-N-乙酰基葡糖胺 (UDP-GlcNAc)在细胞内的浓度^[52]。UDP-GlcNAc是核质酶O-GlcNAc转移酶(OGT酶)的底物^[53-56]，其作用是向大量的核质蛋白质上特定的丝氨酸和苏氨酸残基中以翻译后的方式引入GlcNAc。OGT酶通过其三十四肽重复(TPR)域^[61，62]识别它的许多底物^[57，58]和结合伴侣^[59，60]。如上所述，O-GlcNAc酶^[13，15]移除这种翻译后修饰释放蛋白质，使O-GlcNAc-修饰成为一种动态的循环，这种循环在蛋白质的存在期中多次出现^[63]。O-GlcNAc曾在多种蛋白质的已知磷酸化位点上被发现^[3，64-66]，表明了O-GlcNAc在细胞信号传导中的一个作用。此外，OGT酶显示出不同寻常的动力学行为，使其对细胞内UDP-GlcNAc底物浓度并由此对葡萄糖供应尤其敏感^[67]。所有这些数据指出O-GlcNAc水平作为营养物感应机制的一个必然功能。为证明这样一个潜在的营养物感应的功能，有报道显示在周缘组织中，升高的O-GlcNAc水平导致胰岛素抗性的产生^[7，21]。事实上，最近的研究显示，单一核苷酸的多形态与墨西哥人中II型糖尿病的发生有关，据此有人提出显著升高的O-GlcNAc水平可能导致II型糖尿病^[68]。PUGNAc被用于培养细胞和组织中以说明增加的O-GlcNAc水平引起胰岛素抗性^[7，32-35]。类似地，本发明的化合物也可被用于相似研究中，并用于开发动物模型，以说明O-GlcNAc水平在糖尿病的发展中的作用。

本发明的化合物也可用在治疗与O-GlcNAc酶的缺失或过表达或者O-GlcNAc的累积或耗尽相关的疾病或异常，或者任何对糖苷酶抑制疗法有响应的疾病或异常中。这种疾病或异常包括但不限于糖尿病、神经变性异常，如阿尔茨海默病(AD)，及癌症。这种疾病和异常也可能包括与OGT酶的累积或缺失相关的疾病或异常。

例如，由于如上所述的O-GlcNAc水平与tau的磷酸化水平的关系，本发明化合物可被用于研究和治疗AD及其他tau病变。在人脑中发现tau的六种异构体。AD患者体内，所有六种tau的异构体在NFTs中被发现，并且全部都是显著过磷酸化的^[69，70]。健康脑组织中的tau只有2或3个磷酸酯基团，但在AD患者脑中发现的tau平均有8个磷酸酯基团^[71，72]。

tau中存在O-GlcNAc促使人们将O-GlcNAc水平和tau磷酸化水平联系起来研究。该领域最近的兴趣源于人们观察到O-GlcNAc修饰发生在许多已知将被磷酸化的蛋白质的氨基酸残基上。^{[65，66，73]}与此观察一致，人们发现磷酸化水平的增加导致O-GlcNAc水平的降低，且相反地，O-GlcNAc水平增加与磷酸化水平的降低相关。^[74]这种O-GlcNAc和磷酸化之间的相互关系被称为“Ying-Yang假说”^[75]并从最近的发现中获得了强有力的生物化学支持，即OGT酶^[55]与从蛋白质上除去磷酸酯基团的磷酸酶^[60]形成一个功能复合体。与磷酸化类似，O-GlcNAc是一种动态修饰，可在蛋白质的存在期中多次被除去或重新装配。有启发性地，编码O-GlcNAc酶的基因已被定位在与AD相关的染色体位置上。^[15，76]

最近，有证据表明患AD的病人脑中可溶tau蛋白质的O-GlcNAc水平显著低于健康人脑中的tau蛋白质的O-GlcNAc水平^[17]。此外，来源于患病的脑中的PHF表现出完全缺乏任一O-GlcNAc修饰^[17]。虽然这种tau糖基化不完全可能是由于激酶的活性增加和/或参与O-GlcNAc加工的酶之一的功能紊乱，但其分子机理还是未知的。作为对上述后一观点的支持，在小鼠的PC-12神经元细胞和脑组织切片中，使用非选择性的N-乙酰基氨基葡萄糖酶抑制剂以增加tau O-GlcNAc水平，由此检测到磷酸化水平降低。^[17]这些结果总体暗示出通过维持AD患者体内健康的O-GlcNAc水平，例如通过抑制O-GlcNAc酶的作用，人们应能阻止tau的超磷酸化和所有与tau超磷酸化有关的结果，包括NFT的形成及下游效应。然而，由于β-氨基己糖酶的适当起作用非常重要，在通过阻止O-GlcNAc酶的作用进行的AD治疗过程中，任何潜在的治疗干预都应避免对氨基己糖酶A和B的伴随抑制。本发明的化合物可提供这种选择性抑制。

本发明的化合物可用作其他类型糖苷酶的选择性抑制剂。例如，一些微生物毒素是糖苷水解酶家族94的成员，并且因此，本发明的化合物可用作抗微生物剂。

本发明的化合物也可用在促进细胞分化方面，例如促进多能细胞分化成胰岛β细胞。例如，已知O-GlcNAc调节多种转录因子的功能并且已在转录因子PDX-1中发现。通过修饰O-GlcNAc残基对转录因子PDX-1进行的修饰可影响PDX-1的活性，进而影响细胞分化。

本发明的化合物也可用于使细胞适应应激。最近的研究表明PUGNAc可用于动物模型，以在左冠状动脉阻塞后减小心肌梗死面积^[77]。

本发明还涉及多种制备所述化合物的方法。在一个实施方案中，所述方法可包括以下步骤：

a)用一系列酰化试剂酰化2-氨基-2-脱氧-1，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖的盐酸盐，生成一系列1，3，4，6-四-O-乙酰基-2-脱氧-2-N-酰基-β-D-吡喃葡萄糖的衍生物；

b)将所述一系列1，3，4，6-四-O-乙酰基-2-脱氧-2-N-酰基-β-D-吡喃葡萄糖衍生物的酰胺转化成相应的硫代酰胺，并将硫代酰胺环化生成一系列3，4，6-三-O-乙酰基-1，2-二脱氧-2′-烷基-α-D-吡喃葡糖基-[2，1-d]-Δ2′-噻唑啉；以及

本发明还涉及制备选择性糖苷酶抑制剂的方法，例如包括以下步骤：

a)选择两种或多种糖苷酶或一类糖苷酶的一种抑制剂；

在本发明的一些实施方案中，制备选择性糖苷抑制剂的方法包括以下步骤：

a)选择β-N-乙酰基-葡萄糖胺酶或β-氨基己糖酶的一种具有以下通式之一的抑制剂：

其中X₁-X₆是O、NH、NR₁、CHR₁、CH₂或任何杂原子，R₁至R₅ 选自支链烷基链、无支链烷基链、环烷基、芳香基、醇、醚、胺、取代或未取代的氨基甲酸酯、取代或未取代的脲、酯、酰胺、醛、羧酸，及其含有杂原子的衍生物，其中所述的酯和酰胺可包括一个酰基基团，该酰基基团选自支链烷基链、无支链烷基链、环烷基、芳香基，及其杂原子衍生物，及其可药用的盐；

b)通过扩大或缩小侧链的大小改变抑制剂的R₁侧链；以及

c)测试经改变的抑制剂对一种或多种β-N-乙酰基-葡萄糖胺酶或β-氨基己糖酶的抑制作用。

在本发明的一些实施方案中，所述抑制剂的R₁链可通过向侧链中插入一个支链烷基链、一个无支链烷基链、一个环烷基、一个芳香基或其杂原子衍生物而被扩大。在一些特定的实施方案中，R₁链通过插入选自CH₂CH₃、(CH₂)₂CH₃、(CH₂)₃CH₃、(CH₂)₄CH₃、CH(CH₃)₂ 和CH₂CH(CH₃)₂的基团而被扩大。

实施例

以下实施例的作用在于说明本发明的实施方案，而不应以限制性的方式被解读。

实施例1：O-GlcNAc酶和β-氨基己糖酶催化机理的比较分析

1.1 O-GlcNAc酶可能的催化机理

设计O-GlcNAc酶抑制剂的逻辑起点使人们思考O-GlcNAc酶和β-氨基己糖酶的催化机理。虽然人β-氨基己糖酶A和B家族20作用的催化机理已完全确定^[78]，O-GlcNAc酶家族84的机理还是未知的。因此，本发明人首先阐明人O-GlcNAc酶的催化机理，其次将此信息用于设计有效、可透过细胞、且具有对O-GlcNAc酶优于对溶酶体β-氨基己糖酶的高选择性的简单抑制剂。

针对O-GlcNAc酶和糖苷水解酶家族84存在三种实际的备选机理。第一种是诸如已发现的针对来源于糖苷水解酶家族23的鹅溶菌酶的反转机理^[79](图1A)。这种催化机理总体上包括碱催化的在端基异构中心进行的水的亲核攻击，并伴随着离去基团在酸催化下的离去。

第二种可能的机理是权威的两步双置换机理(图1B)，结果是端基异构中心构型的保持。这种机理适用于最多地保留了β-糖苷酶的情况，且此机理包括：第一步，攻击一种酶亲核试剂的端基异构中心，形成一种暂时的共价糖基酶中间体^[80]。糖苷配基离去基团的离去由作为普通的催化酸的酶残基协助。在第二步中，同样的残基作为普通的催化碱协助水分子攻击端基异构中心，切割中间体释放半缩醛产物并保持立体化学结构不变。来源于糖苷水解酶家族3的β-N-乙酰基葡萄糖胺酶以及来源于家族22的C型溶菌酶^[82]显示出适用此机理^[81]。

第三种备选机理包括底物上的2-乙酰氨基团代替一种酶催化亲核试剂进行亲核参与(图1C)。此最后的机理方案适用于来自糖苷水解酶家族20的β-氨基己糖酶^{[30，48，83]}。这三种机理在许多方面是不同的。所述的反转机理是一步反应，结果形成端基异构中心上立体化学结构反转的产物。其他两种方案保留了端基异构中心上的立体化学结构，而彼此的不同点主要在于中间体的性质；第二种机理中这个中间体是共价的酶加成产物，而在第三种机理中则被认为是一种双环的噁唑啉或噁唑啉基离子。

这些备选机理之间最关键的区别在于涉及底物上的2-乙酰氨基团。此部分对于溶酶体β-氨基己糖酶可以作为亲核试剂积极参与催化，或者也可不参与催化。

1.2 底物类似物的合成

为了查明底物中2-乙酰氨基团的作用，合成了含有在N-乙酰基基团上不同水平氟取代的多个底物类似物(路线1)。高度电负性的氟取代基降低了羰基基团的碱性，且这种取代利用邻位促进作用对酶促反应产生期望效果是减小其速率。

i)a)丙酮，4-MU，4-MU-Na⁺，b)K₂CO₃，Et₂Oc)HCl；ii)a)DOWEX-50H⁺，NaOOCCH₂F b)DMF，Et₃N，py，DCC，4℃；iii)DMF，Et₃N，py，DCC，F₂HCCOOH，4℃；iv)DMF，Et₃N，py，DCC，(F₃CCO)₂O，4℃；v)a)NaOMe，MeOH，b)DOWEX-50H⁺

1.2.1底物类似物合成的一般步骤

本研究中使用的所有缓冲盐均获自Sigma-Aldrich。无水甲醇和甲苯购自Acros Organics。二氯甲烷和三乙胺在使用前经CaH₂蒸馏干燥。β-氨基己糖酶购自Sigma(Lot 043K3783)。STZ购自Sigma-Aldrich，在即将测定前将样品溶解。PUGNAc获自Toronto Research Chemicals。其他所有试剂购自Sigma-Aldrich，且使用时不进一步纯化。使用Milli-Q纯水(18.2mΩcm^-1)制备所有的缓冲液。合成反应通过使用MerckKieselgel 60 F₂₅₄铝底薄板的TLC监测。用溶于2M H₂SO₄的10％钼酸铵溶液在加热下进行碳化而检测化合物。正压下的快速色谱法是使用Merck Kieselgel 60(230-400目)和特定的洗脱液实施的。在500MHz处的¹H NMR光谱被记录于Varian AS500 Unity Innova光谱仪上(适当处的化学位移是相对于CDCl₃，CD₃OD或(CD₃)₂SO被记录的)。470 MHz处的¹⁹F NMR光谱被记录于Varian AS500 Unity Innova光谱仪上，并且与CF₃CO₂H质子偶联作为参考。125MHz处的¹³C NMR光谱被记录于Varian AS500 Unity Innova光谱仪上(适当处的化学位移是相对于CDCl₃，CD₃OD或(CD₃)₂SO被记录的)。对所有用于细胞培养和酶活测定的化合物的元素分析都是在Simon Fraser大学的分析实验室进行的。

1.2.2 4-甲基伞形酮2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡糖苷的合成

4-甲基伞形基2-氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡糖苷的盐酸盐(3)大体上按照Roeser和Legler描述的方法^[84]制备，且使用时不进一步纯化。

1.2.3 4-甲基伞形基3，4，6-三-O-乙酰基-2-脱氧-2-氟代乙酰氨基-β-D-吡喃葡糖苷(4a)的合成

向溶于二甲基甲酰胺(DMF，10mL)溶液中的盐酸盐3(0.50g，1.0mmol)的冷却溶液(0℃)中加入三乙胺(0.3mL，0.21g，2.1mmol)和无水吡啶(10mL)。向含有干燥的DOWEX-50H⁺树脂(6g)的无水DMF(45mL)的搅拌混合物中加入氟乙酸钠(0.9g)。一小时后，将二环己基碳二亚胺(DCC，1.6g，7.8mmol)和30mL氟乙酸溶液(6.0mmol)通过导管加入含有盐酸盐3的反应器中。所得的溶液于0℃放置16h后通过TLC分析判断反应是否完全。溶剂在真空中被部分移除，之后加入乙酸乙酯(50mL)和饱和的氯化钠溶液(20mL)。收集有机层并将水层用乙酸乙酯萃取两次。然后将上述合并的有机萃取物依次用水、两次用饱和的碳酸氢钠、及最后用饱和氯化钠溶液冲洗。有机萃取物用MgSO₄干燥，再过滤，再在真空中移除溶剂以生成浅黄色的糊浆。想要的产物使用快速硅胶柱色谱(2∶1；乙酸乙酯-己烷)纯化，产生部分纯化的期望的无定形白色固体化合物(≈356mg，0.68mmol，68％)，此化合物不进一步纯化而用于下一步骤。

1.2.4 4-甲基伞形基3，4，6-三-O-乙酰基-2-脱氧-2-二氟代乙酰氨基-β-D-吡喃葡糖苷(4b)的合成

向溶于二甲基甲酰胺(DMF，6mL)溶液中的盐酸盐3(0.15g，0.3mmol)的冷却溶液(0℃)中加入三乙胺(0.09mL，0.063g，0.62mmol)和无水吡啶(3mL)。通过注射器向反应混合物中加入二环己基碳二亚胺(DCC，0.48g，2.3mmol)和二氟乙酸(0.12mL，0.18g，1.3mmol)。所得的溶液于0℃放置16h，然后加入两滴二氟乙酸。常温下，再过3.5h后在室温下用TLC分析判断反应是否完成。溶剂在真空中被部分移除，之后加入乙酸乙酯(50mL)和饱和的氯化钠溶液(20mL)。收集有机层并将水层用乙酸乙酯萃取两次。然后将上述合并的有机萃取物依次用水、两次用饱和的碳酸氢钠、及最后的饱和氯化钠溶液冲洗。有机萃取物用MgSO₄干燥，再过滤，并在真空中移除溶剂生成浅黄色的糊浆。想要的产物使用梯度溶剂体系(1∶1；己烷-乙酸乙酯)通过快速硅胶柱色谱纯化，以产生部分纯化的白色无定形固体的期望化合物(≈0.10mg，0.19mmol，64％)，此化合物不进一步纯化而用于下一步骤。

1.2.5 4-甲基伞形基3，4，6-三-O-乙酰基-2-脱氧-2-三氟代乙酰氨基-β-D-吡喃葡糖苷(4c)的合成

向溶于二甲基甲酰胺(DMF，6mL)溶液中的盐酸盐3(0.10g，0.2mmol)的冷却溶液(0℃)中加入三乙胺(0.06mL，0.42g，0.41mmol)。然后将反应混合物冷却至0℃，并通过注射器向其中加入三氟乙酸酐(0.08mL，0.12g，5.7mmol)。所得的溶液于0℃下放置16h，之后用TLC分析判断反应是否完成。然后用乙酸乙酯(20mL)稀释反应混合物，再加入饱和的氯化钠溶液(40mL)。收集有机层并将水层用乙酸乙酯萃取两次。然后将上述合并的有机萃取物依次用水、两次用饱和的碳酸氢钠、及最后的饱和的氯化钠溶液冲洗。有机萃取物用MgSO₄干燥，再过滤，再在真空中移除溶剂生成浅黄色的糊浆。通过使用梯度溶剂体系(1∶1；己烷-乙酸乙酯)用快速硅胶柱色谱纯化想要的产物，产生部分纯化的无定形白色固体的期望化合物(≈0.93mg，0.17mmol，82％)，此化合物不进一步纯化而用于下一步骤。

1.2.6 4-甲基伞形基2-脱氧-2-氟代乙酰氨基-β-D-吡喃葡糖苷(5a-c)合成的一般步骤

向无水甲醇中的每种糖苷溶液中加入一刮勺尖的无水甲醇钠。氮气下将所得的碱性溶液搅拌直至通过TLC分析判断反应完全。向经过搅拌的反应混合物中加入Dowex-50 H⁺树脂直至溶液的pH值变为中性。上述悬浮液被过滤并将滤饼用甲醇彻底冲洗，然后真空下从合并的滤出液中除去溶剂。想要的脱保护的糖苷通过快速硅胶柱色谱法使用以下溶剂体系分离：乙酸乙酯-甲醇-水(12∶1∶1)分离N-三氟乙酰基衍生物和N-二氟乙酰基衍生物(5b和5c)，及乙酸乙酯-甲醇(1∶1)分离N-单氟乙酰基衍生物(5a)。产物用乙醇和二乙基醚重结晶以生成想要的产物，且两步法后N-三氟乙酰基衍生物(5c)的总产率是66％，N-二氟乙酰基衍生物(5b)的总产率是37％，N-氟代乙酰基衍生物(5a)的总产率是45％。

4-甲基伞形基2-脱氧-2-氟代乙酰氨基-β-D-吡喃葡糖苷(MuGlcNAc-F)(5a)---¹H-NMR(500MHz，d6-DMSO)δ7.71(1H，d，J_H5AR-H6AR＝8.8，H-5_AR)，7.00(1H，J_H8AR-H6AR＝2.4，H-8_AR)，6.96(1H，dd，H-6_AR)，6.26(1H，d，J_H3AR-cH3＝1.1，H-3_AR)，5.21(1H，d，J_H1-H2＝8.5，H-1)，4.81(2H，d，J_H-F＝47.0，CH₂F)，3.86(1H，dd，J_H2-H3＝9.9，H-2)，3.74(1-H，dd，J_H6-H6′＝11.7，J_H6-H5＝1.7，H-6)，3.53-3.46(2H，m，H-3，H-6)，3.38(1H，ddd，J_H5-H4＝9.6，J_H5-H6′＝6.0，H-5)，3.20(1H，dd，J_H4-H3＝8.9，H-4)，2.39(1H，d，CH₃)ppm；¹⁹F-NMR(500MHz，d6-DMSO)-225.24 ppp(dd，J_F-H＝53)。C₁₈H₂₀FNO₈分析计算结果；C，54.41；H，5.07；N，3.53；实验结果C，54.20；H，4.97；N 3.59。

4-甲基伞形基2-脱氧-2-二氟代乙酰氨基-β-D-吡喃葡糖苷(MuGlcNAc-F₂)(5b)--¹H-NMR(500MHz，d6-DMSO)δ7.69(1H，d，J_H5AR-H6AR＝8.8，H-5_AR)，6.97(1H，J_H8AR-H6AR＝2.4，H-8_AR)，6.92(1H，dd，H-6_AR)，6.24(1H，d，J_H3AR-CH3＝1.2，H-3_AR)，6.21(1H，d，J_H-F＝53.6Hz，CHF₂)，5.16(1H，d，J_H1-H2＝8.5，H-1)，3.79(1H，dd，J_H2-H3＝10.3，H-2)，3.72(1-H，dd，J_H6-H6′＝11.8，J_H6-H5＝1.9，H-6)，3.53-3.42(2H，m，H-3，H-5，H-6′)，3.20(1H，dd，J_H4-H5＝9.6Hz，J_H4-H3＝8.9Hz，H-4)，2.38(1H，d，CH₃)ppm；¹⁹F-NMR(500MHz，d6-DMSO)-127.32(d，J＝54Hz)；C₁₈H₁₉F₂NO₈分析计算结果；C，52.05；H，4.61；N，3.37；实验结果C，51.92；H，4.62；N 3.31。

4-甲基伞形基2-脱氧-2-三氟代乙酰氨基-β-D-吡喃葡糖苷(MuGlcNAc-F₃)(5c)¹H-NMR(500 MHz，d6-DMSO)δ7.70(1H，d，J_H5AR-H6AR＝8.8，H-5_AR)，6.86(1H，J_H8AR-H6AR＝2.3，H-8_AR)，6.91(1H，dd，H-6_AR)，6.25(1H，d，J_H3AR-CH3＝1.2，H-3_AR)，5.16(1H，d，J_H1-H2＝8.5，H-1)，3.80(1H，dd，J_H2-H3＝10.2，H-2)，3.72(1-H，dd，J_H6-H6′＝11.7，J_H6-H5＝1.8，H-6)，3.50-3.42(2H，m，H-6′，H-3，H-5)，3.22(1H，dd，J_H4-H5＝9.5Hz，J_H4-H3＝8.9Hz，H-4)，2.38(1H，d，CH₃)ppm； ¹⁹F-NMR(500MHz，d6-DMSO)-77.29；C₁₈H₁₈F₃NO₈分析计算结果；C，49.89；H，4.19；N，3.23；实验结果C，49.80；H，4.29；N 3.11。

1.3 O-GlcNAc酶和β-氨基己糖酶的动力学分析

1.3.1 动力学分析的实验步骤

所有测试在37℃下进行30分钟，并重复三次，该测试使用终止法，通过加入6倍过量的(150μL)骤停缓冲剂(200mM氨基乙酸，pH 10.75)使酶促反应(25μL)骤停。测试是通过用注射器加入酶(3μL)引发的，并且在所有情况下，所得的骤停溶液的最终pH值大于10。β-氨基己糖酶和O-GlcNAc酶的时间依赖性测试揭示了此时间段内两种酶在各自的缓冲剂下都是稳定的；50mM柠檬酸，100mM NaCl，0.1％BSA，pH 4.25以及50mM NaH₂PO₄，100mM NaCl，0.1％BSA，pH 6.5。上述反应的进度在30分钟结束时用荧光检测法通过测量被释放的4-甲基伞形酮的程度来确定，所述荧光检测法使用Varian CARY Eclipse荧光光谱仪96孔板系统进行测定，并在相同缓冲剂条件下与4-甲基伞形酮的标准曲线进行比较。使用368nm的激发波长和450nm的发射波长，狭缝开口为5mm。人胎盘β-氨基己糖酶购自Sigma-Aldrich(Lot 043K3783)。O-GlcNAc酶的克隆及表达如文献中描述^[85]。两种酶均使用PBS缓冲液进行透析，且用Bradford法测定其浓度。使用荧光底物的测试中β-氨基己糖酶和O-GlcNAc酶的浓度(μg/μL)如下：对于4-甲基伞形基2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡糖苷(MuGlcNAc)(5)：0.00077，0.0126；MuGlcNAc-F(5a)：0.0031，0.0189；MuGlcNAc-F₂(5b)：0.0154，0.0756，且对于MuGlcNAc-F₃(5c)：0.0154，0.01523。此外，在使用浓度为0.64mM的底物5对抑制剂进行测定时，β-氨基己糖酶和O-GlcNAc酶的浓度(μg/μL)分别为0.0154和0.0378。所有抑制剂均是在从5倍至1/5倍K_I范围中的八个浓度下测试的，除了β-氨基己糖酶在抑制剂8e下的测试，由于8e的K_I值高，如此高的抑制剂浓度是无法达到的。K_I值通过迪克逊图数据的线性回归得到。必要时将测试重复三次并将误差条包括在数据作图中。

1.3.2 使用底物类似物时动力学分析的结果

这些化合物首先用溶酶体人β-氨基己糖酶测试，因为已知该酶通过涉及邻位促进作用的机理(附图2A)工作。虽然Michaelian饱和动力学并未在所有底物中检测到(表1)，但与控制酶催化反应的二级速率常数成正比的V_max[E]₀/K_M可以从米-门二氏作图(Michaelis-Menten)(附图2A嵌入图)的起始斜率得出。logV_max[E]₀/K_M对N-酰基取代物的Taft电学参数(σ^*)的图中显示出与氟取代的增加负线性相关(附图2C)。如预期的那样，降低羰基氧的碱性对催化作用是有害的。类Taft线性自由能分析的较大的负斜率(由反应常数得出，ρ＝-1.0±0.1)说明羰基氧是作为亲核试剂攻击端基异构中心的。

底物	σ^*a	酶	K_M (mM)	V_max[E]₀ (μmol min^-1 mg^-1)	V_max[E]₀/K_M (μmol mM^-1 min^-1mg^-1)
						MuGlcNAc(5)	0.0	氨基己糖酶	0.88±0.05	8.3±0.2	9.5±0.8
O-GlcNAc酶	0.43±0.04	0.74±0.02	1.7±0.2
						MuGlcNAc-F₁(5a)	0.8	氨基己糖酶	3.8±0.4^b	3.3±0.2^b	0.40±0.07^d
O-GlcNAc酶	0.49±0.06	0.60±0.03	1.2±0.2
						MuGlcNAc-F₂(5b)	2.0	氨基己糖酶	ND^c	ND^c	0.069±0.001^d
O-GlcNAc酶	0.45±0.05	0.16±0.01	0.36±0.06
						MuGlcNAc-F₃(5c)	2.8	氨基己糖酶	ND^c	ND^c	0.0077±0.0010^d
O-GlcNAc酶	0.38±0.03	0.033±0.001	0.0077±0.0008

表1：β-氨基己糖酶和O-GlcNAc酶催化一系列4-甲基伞形酮2-N-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡糖苷的水解的米-门二氏参数。

^a对于每种N-酰基取代物使用的Taft电学参数(σ^*)获自Hansch和Leo^[86]。

^b通过对米-门二氏数据进行非线性回归所估的值。应注意测得的底物浓度相当但不超过K_M，因为底物溶解度有限。

^c这些值不能确定，因为底物溶解度有限，不能检测到饱和动力学。

^d由米-门二氏图的二级速率常数区的线性回归测定的值。

该数据与涉及端基异构中心亲电转移以及后续的鎓离子类似物的过渡态的机理一致，所述的过渡态已被普遍地用于酶催化的糖苷水解 ^[80，82]。对于O-GlcNAc酶，检测到所有四种底物的Michaelian饱和动力学，因此，两种动力学参数都被确定(表1，图2B)。对于O-GlcNAc 酶，V_max[E]₀/K_M值也依赖于氟取代的程度，但斜率更缓(ρ＝-0.42±0.08，图2C)。在这些结果的基础上可以看出，O-GlcNAc酶与溶酶体β-氨基己糖酶一样，适用于涉及邻位促进的催化机理。

反应常数(ρ)—在类Taft分析中的相关性的斜率—是反应对不同取代基的灵敏度的指示。根据下式，该常数可被认为是电学分量(ρ^*，由反应对取代基电学参数σ^*的灵敏度决定)和空间分量(δ，由反应对取代基空间Taft参数E_s的灵敏度决定)的函数。

ρ＝ρ^*+δ (等式1)

测量所得的溶酶体β-氨基己糖酶和O-GlcNAc酶的斜率差异可能表明过渡态在反应坐标中的位置或可能说明溶酶体β-氨基己糖酶比O-GlcNAc酶具有空间更有限的活性位点结构。事实上，一个常见的错误概念在于人们常常认为与氢的大小(范德华半径120pm，C-H键长109pm)相比，氟的大小(范德华半径147pm，C-F键长138pm)可以忽略不计。因此，底物与人β-氨基己糖酶活性位点之间不利的空间相互作用可能在区别不同水平氟取代方面除电子学以外也起作用。事实上，最近的人氨基己糖酶B的晶体学结构揭示了在三个色氨酸残基之间紧密地容纳乙酰氨基的一个精细的袋状结构^[78，87]。O-GlcNAc酶的三维结构还未知。然而，测得的所有底物类似物的相对常数K_M值说明了空间作用并不是主要原因，而N-酰基-氟取代基的电学作用才是占主导地位的。早期的一个对分离出的属于未知家族的酶的研究得出一个ρ^*值为-1.41±0.1，该研究使用了两种在乙酰氨基上具有二个或三个氟取代基的对-硝基苯基2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡糖苷(pNP-GlcNAc)^[88]。该值比在此研究中已发现的溶酶体β-氨基己糖酶的值(ρ^*＝-1.0±0.1)更大，表明了Kosman和Jones研究的来源于黑曲霉的酶与糖苷水解酶家族84成员相比更有可能是家族20的成员。

1.3.3 使用NAG-噻唑啉作为抑制剂的动力学分析结果

作为对O-GlcNAc酶是否适用涉及邻位促进机理的进一步测试，使用该酶测试抑制剂NAG-噻唑啉(9a)。被设计作为双环噁唑啉中间体的模拟物的NAG-噻唑啉之前曾被表明作为氨基己糖酶家族20的抑制剂起作用^[30，48]。使用pNP-GlcNAc作为底物，NAG-噻唑啉被发现是人O-GlcNAc酶家族84的一种有效抑制剂，且观察到一种明确的竞争抑制形式(附图3)。非线性回归揭示了pH 7.4时K_I值为180nM，并且使用MU-GlcNAc的分析(5)揭示了pH 6.5时K_I值为70nM(表2)。因此，NAG-噻唑啉是O-GlcNAc酶的一种有效抑制剂，结合紧密程度比其本体糖GlcNAc在pH 6.5时的值(K_I＝1.5mM)大约高出21000倍。这种有效的抑制可归因于NAG-噻唑啉与假定的噁唑啉中间体或结构上相关的过渡态的相似性。事实上，检测到的抑制数据与本发明人测得的人溶酶体β-氨基己糖酶家族20的数据(K_I＝70nM，比GlcNAc结合更紧密17000倍，GlcNAc的K_I值是1.2mM)相似，并且有力地支持了类Taft分析中表明的O-GlcNAc酶——与β-氨基己糖酶家族20一致——采用涉及邻位促进的催化机理。来源于家族18^[89]和56^[90]的糖苷水解酶是切割寡糖链的内糖苷酶，其也被指明采用涉及邻位促进的机理^[91]。因此，家族18、20、56及84都由采用涉及邻位促进的机理的保留糖苷酶组成，所述邻位促进来自底物的乙酰氨基。这与来源于家族3和22的保留β-糖苷酶以及反转内糖苷酶的反转家族23显著不同，所述来源于家族3和22的保留β-糖苷酶仍作用于各自在2位含有乙酰氨基的底物上^[81，82]。

化合物	O-GlcNAc酶K_I (μM)	β-氨基己糖酶K_I (μM)	选择性之比 (β-氨基己糖酶K1/0-GlcNAc酶K1)
				GlcNAc	1500	1200	0.8
STZ	1500²	47000²	31
				PUGNAc	0.046	0.036	0.8
9a	0.070	0.070	1
				9b	0.12	32	270
9c	0.23	340	1500
				9d	1.5	4600	3100
9e	57	11000	100
				9f	1.6	720	700
9g	5.7	4000	190

表2：O-GlcNAc酶和β-氨基己糖酶的抑制常数和抑制剂的选择性。所有的K_I由迪克逊图的线性回归确定。

实施例2：选择性O-GlcNAc酶的第一个实施方案的设计与合成

2.1 选择性O-GlcNAc酶抑制剂的第一个实施方案的设计

随着人O-GlcNAc酶以及由其延伸开的其他糖苷水解酶家族84成员的机理的确立，人们开始将注意力转移到将此信息使用在抑制剂的设计中，该抑制剂具有对此酶优于对人溶酶体β-氨基己糖酶的选择性。由于β-氨基己糖酶和O-GlcNAc酶采用的都是涉及邻位促进的机理，因此选择NAG-噻唑啉作为骨架，该骨架可被修饰为产生需要的选择性。三个观察结果为所述抑制剂的设计提供了起始点。第一个是对溶酶体酶的类Taft分析的斜率要比测得的O-GlcNAc酶的斜率大得多，因此说明N-酰基基团的体积可能是底物识别中的一个决定因素(见上)。第二个，也是相关的考虑因素是，人溶酶体β-氨基己糖酶B的结构揭示了可以稳定容纳乙酰氨基取代基上的甲基基因的一个紧密袋状结构^[78]。第三点是含有大体积N-酰基取代基的STZ显示出对O-GlcNAc酶优于对β-氨基己糖酶的选择性^[46]。

2.2 选择性O-GlcNAc酶抑制剂的第一个实施方案的合成

制备一系列七种抑制剂，其中的噻唑啉环用长度增加的脂肪链修饰，以使这些化合物具有对O-GlcNAc酶比对溶酶体氨基己糖酶更显著的抑制。这一组抑制剂的合成被概括在路线2中。这个简单的合成路线使制备大量抑制剂成为可能，所述抑制剂从市售的原料经三步制备，或使用价廉的原料2-氨基-2-脱氧-吡喃葡萄糖经六步制备。

路线2：

2.2.1 化合物合成的一般步骤

该一般步骤与上述底物类似物合成的步骤相同。

2.2.2 1，3，4，6-四-O-乙酰基-2-脱氧-2-N-酰基-β-D-吡喃葡萄糖(7a-g)合成的一般步骤

向溶于1体积无水二氯甲烷中的2-氨基-2-脱氧-1，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖(6)盐酸盐^[92]的溶液中加入2当量的无水三乙胺，加入的时间是在起始原料溶解后。将上述反应混合物冷却到0℃，并用注射器加入1.2当量的适当的酰氯。将所得的混合物在室温下搅拌约2小时。当反应混合物通过TLC分析认为是完全反应时，加入5体积的乙酸乙酯。所得的有机相依次用水，1M NaOH和饱和氯化钠冲洗。所述的有机相经MgSO₄干燥，过滤和浓缩后得到白色结晶固体。上述原料用乙酸乙酯和己烷的混合物重结晶，以生成想要的N-酰化的原料，且产率的范围是46％至74％。

1，3，4，6-四-O-乙酰基-2-脱氧-2-N-丙基-β-D-吡喃葡萄糖(7b)-¹H NMR(500M Hz，CDCl₃)δ：5.68(1H，d，J_H1，H2＝8.8Hz，H-1)，5.42(1H，d，J_NH，H2＝6.7Hz，NH)，5.14(1H，dd，J_H3，H4＝8.7Hz，H-3)，5.12(1H，dd，J_H4，H5＝8.7Hz，H-4)，4.34(1H，ddd，J_H2，H3＝8.7Hz，H-2)，4.27(1H，dd，J_H6，H6′＝12.5Hz，J_H5，H6＝4.6Hz，H-6)，4.12(1H，dd，J_H5，H6′＝2.1Hz，H-6′)，3.79-3.75(1H，m，H-5)，2.12(3H，s，OAc)，2.10(3H，s，OAc)，2.04(3H，s，OAc)，2.02(3H，s，OAc)，2.15-2.10(2H，m，H-7)，0.90(3H，t，J_H8，H7＝7.4Hz，H-8)ppm.¹³C NMR(125MHz，MeOD)δ：174.1，171.5，170.9，169.8，169.5，92.9，73.2，72.8，67.9，61.8，53.1，30.0，21.1，21.0，20.9，20.8，10.1ppm.

1，3，4，6-四-O-乙酰基-2-脱氧-2-N-丁基-β-D-吡喃葡萄糖(7c)-¹H NMR(500MHz，CDCl₃)δ：5.73(1H，d，J_H1，H2＝8.8Hz，H-1)，5.58(1H，d，J_NH，H2＝9.5Hz，NH)，5.21-5.14(2H，m，H-3/H-4)，4.38(1H，ddd，H-2)，4.31(1H，dd，J_H6，H6′＝12.5Hz，H-6)，4.16(1H，dd，J_H5，H6′＝2.2Hz，H-6′)，3.84(1H，ddd，J_H5，H6＝4.7Hz，H-5)，2.16(3H，s，OAc)，2.13(3H，s，OAc)，2.18-2.10(2H，m，H-7)，2.08(3H，s，OAc)，2.05(3H，s，OAc)，1.64(2H，ddd，H-8)，0.94(3H，t，J_H8，H9＝7.4Hz，H-9)ppm.¹³C NMR(125MHz，MeOD)δ：173.1，171.4，170.9，169.8，169.5，92.9，73.2，72.8，67.9，61.9，53.0，38.8，21.1，21.0，20.9，20.8，19.2，13.7ppm.

1，3，4，6-四-O-乙酰基-2-脱氧-2-N-戊基-β-D-吡喃葡萄糖(7d)-¹H NMR (500MHz，CDCCl₃)δ：5.68(1H，d，J_H1，H2＝8.8Hz，H-1)，5.50(1H，d，J_NH，H2＝9.5Hz，NH)，5.18-5.12(2H，m，H-3/H-4)，4.36-4.30(1H，m，H-2)，4.26(1H，dd，J_H6，H6′ ＝12.5Hz，H-6)，4.13(1H，dd，J_H5，H6＝2.2Hz，H-6′)，3.82-3.77(1H，m，J_H5，H6＝4.5Hz，H-5)，2.11(3H，s，OAc)，2.11(2H，m，H-7)，2.09(3H，s，OAc)，2.04(3H，s，OAc)，2.02(3H，s，OAc)，1.56(2H，dd，J_H7，H8＝7.5Hz，H-8)，1.52(2H，dd，J_H7′，H8＝7.5Hz，H-8)，1.26(2H，ddq，J_H8，H9＝7.5Hz，H-9)，0.94(3H，dd，J_H9，H10＝7.5Hz，H-10)ppm.¹³C NMR(125MHz，MeOD)δ：173.4，171.4，170.9，169.8，169.5，92.9，73.2，72.7，67.9，61.9，53.0，36.7，27.9，22.4，21.1，21.0，20.9，20.8，13.9ppm.1，3，4，6-四-O-乙酰基-2-脱氧-2-N-己基-β-D-吡喃葡萄糖(7e)-¹H NMR(500MHz，CDCl₃)δ：5.69(1H，d，J_H1，H2＝8.8Hz，H-1)，5.52(1H，d，J_NH，H2＝9.5Hz，NH)，5.14(2H，m，H-3/H-4)，4.37-4.30(1H，m，H-2)，4.26(1H，dd，J_H6，H6′＝12.5Hz，H-6)，4.15-4.08(1H，m，H-6′)，3.82-3.77(1H，m，J_H5，H6＝4.7Hz，H-5)，2.11(3H，s，OAc)，2.09(3H，s，OAc)，2.04(3H，s，OAc)，2.02(3H，s，OAc)，1.58-1.52(2H，m，H-7)，1.33-1.08(6H，m，H-8，H-9，H-10)，0.87(3H，t，J_H11，H10＝7.1Hz，H-11)ppm.¹³C NMR(125MHz，MeOD)δ：173.4，171.4，170.9，169.8，169.5，92.9，73.2，72.8，67.9，61.9，60.6，53.0，36.9，31.4，25.5，22.5，21.1，21.0，20.9，20.8，14.1ppm.1，3，4，6-四-O-乙酰基-2-脱氧-2-N-异丁基-β-D-吡喃葡萄糖(7f)-¹HNMR(500 MHz，CDCl₃)δ：5.70(1H，d，J_H1，H2＝8.8Hz，H-1)，5.58(1H，d，J_NH，H2＝9.6Hz，NH)，5.18-5.12(2H，m，H-3/H-4)，4.36-4.30(1H，m，H-2)，4.27(1H，dd，J_H6，H6′＝12.5Hz，H-6)，4.12(1H，dd，J_H5，H6＝2.2Hz，H-6′)，3.84-3.87(1H，m，J_H5，H6 ＝4.8Hz，H-5)，2.10(3H，s，OAc)，2.08(3H，s，OAc)，2.28(1H，m，H-7)，2.04(3H，s，OAc)，2.03(3H，s，OAc)，1.08(6H，t，J_H8，H7＝2.8Hz，H-8)ppm.¹³C NMR(125MHz，MeOD)δ：177.2，171.5，170.9，169.8，169.5，93.0，73.3，72.7，67.9，61.9，52.9，36.0，21.0，21.0，20.8，20.8，19.6ppm.

1，3，4，6-四-O-乙酰基-2-脱氧-2-N-异戊基-β-D-吡喃葡萄糖(7g)-¹HNMR(500MHz，CDCl₃)δ：5.67(1H，d，J_H1，H2＝8.8Hz，H-1)，5.58(1H，d，J_NH，H2＝9.5Hz，NH)，5.18-5.10(2H，m，H-3/H4)，4.38-4.32(1H，m，H-2)，4.27(1H，dd，J_H6，H6′＝12.5Hz，H-6)，4.12(1H，1，J_H5，H6′＝2.2Hz，H-6′)，3.82-3.78(1H，m，J_H5，H6＝4.6Hz，H-5)，2.10(3H，s，OAc)，2.08(3H，s，OAc)，2.06-2.01(2H，m，H-7)，2.04(3H，s，OAc)，2.03(3H，s，OAc)，1.98(1H，ddd，H-8)，0.94(6H，d，J_H8，H9＝6.5Hz，H-9)ppm.¹³C NMR(125MHz，MeOD)δ：172.6，171.4，170.9，169.8，169.5，92.9，73.2，72.7，67.9，61.8，52.8，46.2，26.3，22.4，22.3，21.1，21.0，20.9，20.8ppm.

2.2.3 3，4，6-三-O-乙酰基-1，2-二脱氧-2′-烷基-α-D-吡喃葡糖基-[2，1-d]-Δ2′-噻唑啉(3，4，6-三-O-乙酰基-NAG-噻唑啉类似物)(8a-g)合成的一般步骤

向溶于无水甲苯中的适量1，3，4，6-四-O-乙酰基2-N-酰基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖(7a-g)的溶液中加入Lawesson’s试剂(0.6当量)，并将反应混合物回流2h，之后用TLC分析判断反应是否完成。将上述溶液冷却至室温并在真空中除去溶剂。将剩余物溶解在甲苯中并将想要的物质通过快速硅胶柱色谱分离，使用的溶剂体系是己烷和乙酸乙酯，二者的比例范围在4∶1至1∶2之间是适当的。分离产物的产率范围是62至83％。

3，4，6-三-O-乙酰基-1，2-二脱氧-2′-甲基-α-D-吡喃葡糖基-[2，1-d]-Δ2′-噻唑啉(8a)已使用前述相似的反应条件制备^[30]。全部光谱特征与文献值一致。

3，4，6-三-O-乙酰基-1，2-二脱氧-2′-乙基-α-D-吡喃葡糖基-[2，1-d]-Δ2′-噻唑啉(8b)-¹H NMR(500MHz，CDCl₃)δ：6.28(1H，d，J_H1，H2＝7.4Hz，H-1)，5.60(1H，dd，J_H3，H4＝3.3Hz，H-3)，4.97(1H，d，J_H4，H5＝9.3Hz，H-4)，4.56-4.52(1H，m，H-2)，4.18-4.10(2H，m，H-6/H-6′)，3.58(1H，ddd，J_H5，H6＝3.2Hz，H-5)，2.74-2.67(1H，m，H-7)，2.14(3H，s，OAc)，2.11(3H，s，OAc)，2.09(3H，s，OAc)，1.29(3H，t，J_H8，H7＝7.60Hz，H-8)ppm.

3，4，6-三-O-乙酰基-1，2-二脱氧-2′-丙基-α-D-吡喃葡糖基-[2，1-d]-Δ2′-噻唑啉(8c)-¹H NMR(500MHz，CDCl₃)δ：6.26(1H，d，J_H1，H2＝7.2Hz，H-1)，5.58(1H，dd，J_H3，H4＝33Hz，H-3)，4.96(1H，d，J_H4，H5＝9.2Hz，H-4)，4.54-4.50(1H，m，H-2)，4.16-4.08(2H，m，H-6/H-6′)，3.58(1H，ddd，J_H5，H6＝3.3Hz，H-5)，2.70-2.58(2H，m，H-7)，2.14(3H，s，OAc)，2.08(3H，s，OAc)，2.07(3H，s，OAc)，1.76-1.69(2H，m，H-8)，1.00(3H，t，J_H9，H8＝7.4Hz，H-9)ppm.

3，4，6-三-O-乙酰基-1，2-二脱氧-2′-丁基-α-D-吡喃葡糖基-[2，1-d]-Δ2′-噻唑啉(8d)-¹H NMR(500MHz，CDCl₃)δ：6.21(1H，d，J_H1，H2＝7.2Hz，H-1)，5.57(1H，dd，J_H3，H4＝3.3Hz，H-3)，4.94(1H，d，J_H4，H5＝9.4Hz，H-4)，4.48-4.44(1H，m，H-2)，4.12-4.07(2H，m，H-6/H-6′)，3.53(1H，ddd，J_H5，H6＝3.0Hz，H-5)，2.60-2.57(2H，m，H-7)，2.12(3H，s，OAc)，2.07(6H，s，OAc)，1.67-1.63(2H，m，H-8)，1.40(2H，ddd，J_H5，H8＝7.3Hz，H-9)，0.92(3H，t，J_H10，H9＝7.4Hz，H-10)ppm.

3，4，6-三-O-乙酰基-1，2-二脱氧-2′-戊基-α-D-吡喃葡糖基-[2，1-d]-Δ2′- 噻唑啉(8e)-¹H NMR(500MHz，CDCl₃)δ：6.24(1H，d，J_H1，H2＝7.2Hz，H-1)，5.60(1H，s，H-3)，4.96(1H，d，J_H4，H5＝9.4Hz，H-4)，4.52-4.49(1H，m，H-2)，4.14-4.10(2H，m，J_H6，H6′＝12.2Hz H-6/H-6′)，3.56(1H，ddd，J_H5，H6＝3.1Hz，J_H5，H6′＝5.6Hz，H-5)，2.65-2.60(2H，m，H-7)，2.14(3H，s，OAc)，2.09(3H，s，OAc)，2.08(3H，s，OAc)，1.71-1.68(2H，m，H-8)，1.38-1.33(4H，m，H-9/H-10)，0.91(3H，t，J_H11，H10＝6.9Hz，H-11)ppm.

3，4，6-三-O-乙酰基-1，2-二脱氧-2′-异丙基-α-D-吡喃葡糖基-[2，1-d]-Δ2′-噻唑啉(8f)-¹H NMR(500MHz，CDCl₃)δ：6.27(1H，d，J_H1，H2＝7.2Hz，H-1)，5.60(1H，m，H-3)，4.97(1H，d，J_H4，H5＝9.3Hz，H-4)，4.55-4.49(1H，m，H-2)，4.18-4.11(2H，m，H-6/H-6′)，3.60(1H，ddd，J_H5，H6＝3.1Hz，H-5)，2.55(2H，s，H-7)，2.15(3H，s，OAc)，2.09(3H，s，OAc)，2.08(3H，s，OAc)，1.07(6H，t，J_H8，H7＝6.6Hz，H-8)ppm.

3，4，6-三-O-乙酰基-1，2-二脱氧-2′-异丁基-α-D-吡喃葡糖基-[2，1-d]-Δ2′-噻唑啉(8g)-¹H NMR(500MHz，CDCl₃)δ：6.26(1H，d，J_H1，H2＝7.2Hz，H-1)，5.60(1H，dd，J_H3，H4＝3.3Hz，H-3)，4.97(1H，d，J_H4，H5＝9.3Hz，H-4)，4.564.50(1H，m，H-2)，4.16-4.10(2H，m，H-6/H-6′)3.62-3.58(1H，m，J_H5，H6＝3.1Hz，H-5)，2.57-2.52(2H，m，H-7)，2.15(3H，s，OAc)，2.09(3H，s，OAc)，2.08(3H，s，OAc)，1.28-1.23(2H，m，H-8)，1.02(6H，t，J_H9，H8＝6.6Hz，H-9)ppm.

2.2.4 1，2-二脱氧-2′-烷基-α-D-吡喃葡糖基-[2，1-d]-Δ2′-噻唑啉(NAG噻唑啉类似物)(9a-g)合成的一般步骤

向溶于无水甲醇中的适量被保护的噻唑啉(8a-g)溶液中加入一刮勺尖的无水甲醇钠。将此碱性溶液搅拌直至通过TLC分析判断反应完全(一般2小时)。将冰醋酸的甲醇溶液(1∶20)逐滴加入反应混合物中直至溶液的pH为中性。然后在真空下除去溶剂，用快速硅胶柱色谱法分离想要的物质(9a-g)，使用的溶剂体系是乙酸乙酯与甲醇，二者的比例范围在2∶1至6∶1之间是适当的。分离产物的产率范围是86至99％。1，2-二脱氧-2′-甲基-α-D-吡喃葡糖基-[2，1-d]-Δ2′-噻唑啉(9a)已使用前述的相似的反应条件制备^[30]。全部光谱特征与文献值一致，检测时使用的样品的元素分析结果也与文献一致。C₈H₁₃O₄NS的分析计算值；C，43.82；H，5.98；N，6.39；实验值C，43.45；H，6.23；N，6.18。

1，2-二脱氧-2 ′-乙基-α-D-吡喃葡糖基-[2，1-d]-Δ2′-噻唑啉(9b)-¹H NMR(500MHz，MeOD)δ：6.31(1H，d，J_H1，H2＝7.0Hz，H-1)，4.29-4.26(1H，m，J_H2，H3＝4.32Hz，H-2)，4.09(1H，dd，J_H3，H4＝4.32Hz，H-3)，3.70(1H，dd，J_H6，-H6′＝12.07Hz，H-6)，3.57(1H，dd，H-6′)3.52(1H，dd，J_H4，H5＝9.10Hz，H-4)，3.32-3.29(1H，m，J_H5，H6＝6.29Hz，J_H5，H6′＝2.21Hz，H-5)，2.52(2H，dd，J_H7，H8＝7.59Hz，H-7)，1.18(3H，t，H-8)ppm.¹³CNMR(125MHz，MeOD)δ：175.1，89.4，80.2，75.7，74.5，71.4，62.5，28.9，11.1ppm；C₉H₁₅O₄NS的分析计算值；C，46.34；H，6.48；N，6.00；实验值C，45.95；H，6.33；N，5.93.

1，2-二脱氧-2′-丙基-α-D-吡喃葡糖基-[2，1-d]-Δ2′-噻唑啉(9c)-¹HNMR(500MHz，MeOD)δ：6.32(1H，d，J_H1.H2＝7.0Hz，H-1)，4.28(1H，m，J_H2，H3＝4.4Hz，H-2)，4.09(1H，dd，J_H3，H4＝4.4Hz，H-3)，3.72(1H，dd，J_H6，H6′＝12.0Hz，H-6)，3.59(1H，dd，H-6′)，3.53(1H，dd，J_H4，H5＝9.1Hz，H-4)，3.33(1H，m，J_H5，H6＝6.3Hz，J_H5，H6＝.5Hz，H-5)，2.51-2.48(1H，m，J_H7，H8＝7.3Hz，J_H7，H7′＝14.9Hz，H-7)，2.49-2.47(1H，m，H-7′)，1.68-1.65(2H，m，J_H8，H9＝7.4Hz，H-8)0.98(3H，dd，H-9)；

C₁₀H₁₇O₄NS的分析计算值；C，48.57；H，6.93；N，5.66；实验值C，48.32；H，6.77；N，5.45.

1，2-二脱氧-2′-丁基-α-D-吡喃葡糖基-[2，1-d]-Δ2′-噻唑啉(9d)-¹HNMR(500 MHz，MeOD)δ：6.31(1H，d，J_H1，H2＝7.0Hz，H-1)，4.30-4.28(1H，m，J_H2，H3＝4.4Hz，H-2)，4.09(1H，dd，J_H3，H4＝4.4Hz，H-3)，3.71(1H，dd，J_H6，H6′＝12.0Hz，H-6)，3.59(1H，dd，H-6′)，3.53(1H，dd，J_H4，H5＝9.1Hz，H-4)，3.35-3.30(1H，m，J_H5，H6＝6.3Hz，J_H5，H6′＝2.5Hz，H-5)，2.58-2.53(1H，m，J_H7，H8＝7.8Hz，J_H7，H7′＝14.8Hz，H-7)2.53-2.50(1H，m，J_H7′，H8＝7.6Hz，H-7′)1.60(2H，ddd，J_H8，H9＝14.9Hz，H-8)1.37(2H，ddd，J_H9，H10＝7.4，H-9)0.92(3H，t， H-10)ppm.¹³CNMR(125MHz，MeOD)δ：175.5，89.4，79.1，75.2，74.2，71.5，62.7，36.9，20.4，15.2ppm；

C₁₁H₁₉O₄NS的分析计算值；C，50.55；H，7.33；N，5.36；实验值C，50.68；H，7.12；N，5.13.

1，2-二脱氧-2′-戊基-α-D-吡喃葡糖基-[2，1-d]-Δ2′-噻唑啉(9e)-¹HNMR(500 MHz，MeOD)δ：6.20(1H，d，J_H1，H2＝6.9Hz，H-1)，4.29-4.27(1H，m，J_H2，H3＝6.0Hz，H-2)，4.09(1H，dd，J_H3，H4＝4.4Hz，H-3)，3.72(1H，dd，J_H6，H6′＝12.0 Hz，H-6)，3.59(1H，dd，H-6′)，3.53(1H，dd，J_H4，H5＝9.1Hz，H-4)，3.35-3.31(1H，m，J_H5，H6＝6.3，J_H5，H6′＝2.4Hz，H-5)，2.52 (2H，ddd，J_H7，H8＝6.2Hz，H-7)，1.37-1.32(2H，m，H-8)，1.35-1.30(2H，m，H-9)，1.66-1.63(2H，m，J_H10，H11＝7.1Hz，H-10)，0.90(3H，t，H-11)ppm.¹³C NMR(125 MHz，MeOD)δ：174.8，89.3，79.2，75.5，73.4，71.5，62.2，35.4，30.3，28.8，22.1，13.1ppm；C₁₂H₂₁O₄NS：的分析计算值；C，52.34；H，7.69；N，5.09；实验值C，52.48；H，7.67；N，4.40.

1，2-二脱氧-2′-异丙基-α-D-吡喃葡糖基-[2，1-d]-Δ2′-噻唑啉(9f)-¹HNMR(500MHz，MeOD)δ：6.31(1H，d，J_H1，H2＝7.0Hz，H-1)，4.29(1H，m，J_H2，H3＝4.4Hz，H-2)，4.11(1H，dd，J_H3，H4＝4.4Hz，H-3)，3.60(1H，dd，J_H6，H6′＝12.0Hz，H-6)，3.72(1H，dd，H-6′)，3.55(1H，dd，J_H4，H5＝9.1Hz，H-4)，3.35-3.32(1H，m，J_H5，H6 ＝6.4Hz，J_H5，H6′＝2.4Hz，H-5)，2.87-2.83(2H，m，J_H7，H8＝6.9Hz，H-7)，1.24(3H，d，H-8)，1.21(3H，d，H-8′)ppm.¹³C NMR(125MHz，MeOD)δ：175.2，89.5，79.7，75.6，72.3，70.8，62.3，35.1，30.3，22.5，13.8ppm；C₁₀H₁₇O₄NS的分析计算值；C 48.57；H 6.93；N 5.66；实验值C 48.40；H 6.70；N 5.33.

1，2-二脱氧-2′-异丁基-α-D-吡喃葡糖基-[2，1-d]-Δ2′-噻唑啉D(9g)-¹HNMR(500MHz，MeOD)δ：6.38(1H，J_H1，H2＝7.1Hz，H-1)，4.28-4.24(1H，m，J_H2，H3＝6.0Hz，H-2)，4.06(1H，dd，J_H3，H4＝6.0Hz，H-3)，3.71(1H，dd，J_H6，H6′＝12.0Hz，H-6)，3.58(1H，dd，H-6′)3.58(1H，dd，J_H4，H5＝9.2Hz，H-4)，3.35-3.30(1H，m，J_H5，H6＝6.3Hz，J_H5，H6′＝2.4Hz，H-5)，2.46-2.40(1H，m，J_H7，H8＝7.3Hz，J_H7，H7′＝14.1Hz，H-7)2.37-2.33(1H，m，J_H7′，H8＝7.3Hz，H-7′)2.00(2H，ddd，J_H8，H9＝6.7Hz，H-8)0.97(3H，d，H-9)ppm；C₁₁H₁₉O₄NS的分析计算值；C，50.55；H，7.33；N，5.36；实验值C，50.68；H，7.12；N，5.13.

2.3使用抑制剂9a-g的动力学分析

2.3.1 动力学分析的实验步骤

所有测试在37℃下进行30分钟，并重复三次，该测试使用终止法，通过加入6倍过量的(150μL)骤停缓冲剂(200mM氨基乙酸，pH 10.75)使酶促反应(25μL)骤停。测试是由注射器加入的酶(3μL)引发的，并且在所有情况下，所得的骤停溶液的pH值大于10。β-氨基己糖酶和O-GlcNAc酶的时间依赖性测试揭示了此时间段内两种酶在各自的缓冲剂下都是稳定的；各自的缓冲剂为50mM柠檬酸，100mM NaCl，0.1％BSA，pH 4.25以及50mM NaH₂PO₄，100mM NaCl，0.1％BSA，pH 6.5。

上述反应的进度在30分钟结束时用荧光法通过测量释放4-甲基伞形酮的程度来确定，所述荧光法使用Varian CARY Eclipse荧光光谱仪96孔板系统进行测定，并与相同缓冲条件下4-甲基伞形酮的标准曲线进行比较。使用368nm的激发波长和450nm的发射波长，狭缝开口为5mm。O-GlcNAc酶的可能的时间依赖性失活可通过以下方法测试：将10mMSTZ与0.016mg/mL的O-GlcNAc酶在50mM NaH₂PO₄，100mM NaCl，1％BSA，5mM β-巯基乙醇的存在下，pH6.5时共同培养，或者将10mMSTZ与0.036mg/mL β-氨基己糖酶在50mM柠檬酸盐，100mM NaCl，0.1％BSA的存在下，pH4.25时共同培养。经过一些时间间隔后测量被包含在失活混合物中的残余酶的活性。每种酶的测定以上述方法进行，除了反应是通过向测定混合物中加入一份反应混合物引发的，所述的测定混合物中含有5.7mM的MU-GlcNAc和对应于每种酶适当的缓冲液。首先STZ的稳定性是用NMR跟踪其在氘水中的分解测定的。室温下，STZ在水溶液中的半衰期远大于6小时，该时间是在室温下用NMR跟踪其分解测定的。人胎盘β-氨基己糖酶购自Sigma-Aldrich(Lot043K3783)。O-GlcNAc酶的克隆及表达如文献中描述^[85]。两种酶均使用PBS缓冲液透析，且用Bradford法测定其浓度。使用荧光底物的测试中β-氨基己糖酶和O-GlcNAc酶的浓度(μg/μL)如下：对于4-甲基伞形基2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡糖苷(MuGlcNAc)(5)：0.00077，0.0126；MuGlcNAc-F(5a)：0.0031，0.0189；MuGlcNAc-F₂(5b)：0.0154，0.0756，且对于MuGlcNAc-F₃(5c)：0.0154，0.01523。此外，在使用浓度为0.64mM的底物5对抑制剂进行测定时，β-氨基己糖酶和O-GlcNAc酶的浓度(μg/μL)分别为0.0154和0.0378。所有抑制剂均是在从5倍至1/5倍K_I范围中的八个浓度下测试的，除了β-氨基己糖酶在抑制剂8e下的测试，由于8e的K_I值高，如此高的抑制剂浓度是无法达到的。K_I值通过迪克逊图数据的线性回归得到。有必要时，将测试重复三次并将误差条包括在数据作图中。

2.3.2 使用抑制剂9a-g的动力学分析结果

对人β-氨基己糖酶抑制的分析揭示了增加的链长导致这些抑制剂有效性的显著下降(附图4和表2)。甚至包含一个亚甲基单元(化合物9b)也会导致与母体化合物NAG-噻唑啉(9a)相比，β-氨基己糖酶的 K_I值增加460倍。链长的进一步增加还会导致K_I值的更大增加。但是，对于O-GlcNAc酶情况却显著不同(附图4和表2)。其对链长的增加的耐受性更强，且包含两个亚甲基单元的化合物(9c)的K_I值(K_I＝230nM)仅比测得的母体化合物NAG-噻唑啉(9a)(K_I＝70nM)的值高出3倍。由于化合物9f和9g是O-GlcNAc酶的良好抑制剂，脂肪链的支化也不消除结合。由数据的分析中可以看出，化合物9b、9c和9f都是O-GlcNAc酶的有效抑制剂，并且显现出对O-GlcNAc酶优于对溶酶体氨基己糖酶的显著选择性。事实上，化合物9d对O-GlcNAc酶优于对β-氨基己糖酶的选择性的比例是3100倍，化合物9c的值是1500倍，化合物9f的值是700倍(图2和表2)。

2.3.3 使用现有抑制剂的动力学分析结果

同样测试了O-GlcNAc酶的现有抑制剂的抑制性质和选择性。确定针对O-GlcNAc酶(K_I＝1.5mM)和β-氨基己糖酶(K_I＝47mM)的STZ的K_I值(表2)，并且针对O-GlcNAc酶的测量值与前面所得的范围在1至2.5mM之间的IC₅₀值是一致的^[42，46]。由于STZ的N-酰基基团的体积，其对O-GlcNAc酶的抑制优于对β-氨基己糖酶的抑制作用的选择性出人意料地有限(31倍)。可能由于噻唑啉化合物形成一个过渡态或紧密结合的中间体，其表现出比STZ具有更大的选择性。我们也研究了可能的由STZ诱导的O-GlcNAc酶和β-氨基己糖酶的不可逆失活。不可逆抑制剂导致了由于失活剂修饰蛋白而使得酶活性的时间依赖性损失。为了首先检查STZ在水溶液中的稳定性和市售物质的纯度，用NMR监测新溶解在氘代水中的STZ的时间依赖性的分解。STZ随时间分解的半衰期明显大于6小时(见附图7)。据发明人所知，新溶解的STZ在6小时内既没有作为O-GlcNAc酶的时间依赖性的失活剂，也没有作为β-氨基己糖酶的时间依赖性的失活剂(见附图8)。我们还研究了PUGNAc的选择性。使用O-GlcNAc酶测量了PUGNAc的K_I值(K_I＝46nM)，并发现与前面确定的值(K_I＝50nM)较一致^[13]。但是，该化合物没有显示出对O-GlcNAc酶与β-氨基己糖酶(K_I＝36nM)相比的选择性。

这些数据也支持了上述的观点，即氟取代的底物上N-酰基基团的体积并没有极大地影响使用O-GlcNAc酶测量的类Taft分析的斜率(ρ＝-0.42)。而根据式1，用溶酶体β-氨基己糖酶测得的斜率(ρ＝-1.0)则看起来很可能是电子和空间效应两者的结合。因此，所述反应对氟取代基的电子效应的灵敏度(ρ^*)可能对两种酶是相同的，但是溶酶体β-氨基己糖酶催化的反应对底物空间效应的高灵敏度(δ)导致了β-氨基己糖酶的斜率比测得的O-GlcNAc酶的斜率明显更陡。总之，类Taft线性自由能分析和选择性抑制数据表明，O-GlcNAc酶的活性位点比溶酶体β-氨基己糖酶在底物上围绕2-乙酰氨基基团的区域具有更大的空间。

实施例3：选择性O-GlcNAc酶抑制剂的第二个实施方案的设计与合成

3.1 第二类选择性O-GlcNAc酶抑制剂的设计

基于上述观察，在PUGNAc的N-酰基侧链上做出修饰以产生有效且有选择性的基于另一种抑制剂骨架的O-GlcNAc酶抑制剂的第二个实施方案。这种抑制剂可具有不同的药代动力学特性，且是在细胞和有机体水平上分析O-GlcNAc翻译后修饰的作用的重要工具。

3.2 选择性O-GlcNAc酶抑制剂的第二种实施方案的合成

一系列六种使用PUGNAc作为骨架的抑制剂的合成被概括于路线3中。

从易得的盐酸盐10开始^[93]，将Boc基团引入用于保护胺部分，以生成四乙酸盐11^[94](路线3)。用所得的四乙酸盐11，使用(NH₄)₂CO₃进行选择性脱-O-乙酰化以高产率得到半缩醛12。用NH₂OH·HCl处理该半缩醛12以良好产率产生粗制E和Z肟13。

下一步反应是氧化性闭环反应，Mohan和Vasella曾报道该反应非常不稳定(路线4)。

路线3：

路线4：

当使用1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一-7-烯(DBU)和N-氯代琥珀酰亚胺(NCS)使肟14氧化时，在加入NCS时仔细地控制反应混合物的温度对避免形成不想要的1，4-内酯肟15是关键的^[95]。与这些考虑一致，多个使用14的试验反应显示，温度确实是成功制备1，5-内酯肟16、而不是不想要的1，4-内酯肟15的关键。事实上，在稍高的温度(-20℃)下，只获得1，4-内酯肟15。

根据上述路线3，在文献报道的条件下使用DBU/NCS处理肟13^[95]，产生了一种想要的1，5-内酯17和不想要的1，4-内酯肟18的混合物，二者比例为4∶1。但是，发现先将NCS加入含有13的溶液中，再向该混合物中加入DBU则只生成17，虽然产量稍低些。在此遇到的一个问题是从17中分离这些反应的一种副产物琥珀酰亚胺较困难。此外，由于从1Hn.m.r.光谱中获得的信号变宽，17的光谱分析被复杂化。

尽管如此，在快速色谱法纯化后使用异氰酸苯酯处理不纯的氢化肟内酯(hydroximolactone)17产生了高产量的纯的氨基甲酸酯19。事实上，Boc保护基团被溶于二氯甲烷的无水三氟乙酸溶液温和地除去。使用适当的酰氯处理上述所得的粗制胺盐20生成酰胺21a-g的总产率良好。对21a和21b的详细分析支持了该全部N-乙酰化的系列化合物的同一性。后续的使用饱和的氨在甲醇中对21a的脱-O-乙酰化生成了高产率的PUGNAc。22a也是由相似的方法从21b获得的。为了突出这些转化的简易性，常规的中间体20可使用一系列酰氯处理，以生成粗制产物21c-g。将这些粗制的中间体立即脱-O-乙酰化很容易生成产率良好的三元醇22b-f。

3.2.1 化合物合成的一般步骤

所有溶剂在使用前除水。合成反应由TLC监测，使用MerckKieselgel 60 F₂₅₄铝底薄板。通过使用溶于乙醇的10％的浓硫酸溶液在加热下使化合物碳化而检测化合物。正压下的快速色谱是使用MerckKieselgel 60(230-400目)和特定的洗脱液实施的。¹H和¹³C的NMR光谱由Bruker AMX400在400MHz下记录(对于¹³C是100 MHz)，或者由Varian AS500 Unity Innova光谱仪在500MHz下记录(对于¹³C是125MHz)(适当时，记录的化学位移是相对于CDCl₃或CD₃OD的)。所有在酶活测定中使用的合成化合物的元素分析是在Simon Fraser大学或British Cohumbia大学的分析实验室进行的。

3.2.2 (E)-和(Z)-3，4，6-三-O-乙酰基-2-叔-丁氧基甲酰胺-2-脱氧-D-葡萄糖肟(13)的合成

将盐酸羟胺(3.2g，46mmol)加入半缩醛12^[93](12g，31mmol)和吡啶(6.3mL，77mmol)的甲醇溶液(200mL)中，将所得的溶液搅拌并回流(2h)。将该溶液浓缩并与甲苯(2×20mL)共蒸发。用EtOAc溶解剩余物，并用水(2×50mL)、盐水(50mL)洗涤，干燥(MgSO₄)洗，再过滤并浓缩生成所设想的肟13(9.5g)。使用剩余物而不进一步纯化。

3.2.3 3，4，6-三-O-乙酰基-2-叔-丁氧基甲酰胺-2-脱氧-D-葡糖酸氢化肟(gluconohydroximo)-1，5-内酯(17)的合成

(a)-45℃下，将1，8-一氮杂双环[5.4.0]十一-7-烯(0.98mL，6.6mmol)加入粗制的肟13(2.5g，5.9mmol)的CH₂Cl₂(60mL)溶液中，并搅拌混合物(5min)。然后将N-氯代琥珀酰亚胺(0.87g，6.5mmol)以如下的方式加入溶液中：溶液的温度不超过-40℃，且所得的混合物在此温度下搅拌30分钟，然后在2小时的时间内升温至室温。将混合物用水使反应骤停并用EtOAc(100mL)稀释。有机层被分离并用水(2×50mL)、盐水(1×50mL)冲洗，干燥(MgSO₄)，过滤并浓缩。将所得的剩余物进行快速色谱(EtOAc/己烷2∶3)，得到无色油状的标题化合物17(1.7g，68％)。¹H和¹³C NMR色谱显示出该目的化合物，但已被1，4-内酯肟18和琥珀酰亚胺污染。

(b)-45℃下，将1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一-7-烯(3.0mL，20mmol)以如下的方式加入肟13(7.7g，18mmol)和N-氯代琥珀酰亚胺(2.7g，20mmol)的CH₂Cl₂(110mL)溶液中：温度不超过-40℃，且所得的混合物在此温度下搅拌30分钟，然后在2小时的时间内升温至室温。然后，用(a)中的方式处理所述混合物得到标题化合物17(4g，52％

)。R_f 0.16(EtOAc/己烷1∶1)；δ_H(500MHz，CD₃OD)：9.12(br s，1H，NOH)，5.33-5.18(m，3H，H3，H4，NH)，4.60-4.52(m，1H，H2)，4.33(dd，J＝3.5，12.5，1H，H6)，4.33(dd，J＝2.0，1H，H6)，4.19(ddd，J＝9.5，1H，H5)，2.08(s，3H，CH₃)，2.03(s，3H，CH₃)，2.02(s，3H，CH₃)，1.40(s，9H，C(CH₃)₃).δc(125MHz，CD₃OD)：171.5，170.5，170.3，169.0(4C，C＝O)，150.7(C1)，76.5，72.4，67.3(3C，C3，C4，C5)，61.5(C6)，50.8(C2)，29.6(C(CH₃)₃)，28.2(C(CH₃)₃)，20.7，20.6，20.5(3C，CH₃).

3.2.4 O-(3，4，6-三-O-乙酰基-2-叔-丁氧基甲酰胺-2-脱氧-D-吡喃葡糖亚基)氨基N-苯基氨基甲酸酯(19)的合成

将异氰酸苯酯(0.5mL，3.7mmol)加入内酯17(1.3g，3.1mmol)和Et3N(1.3mL，9.3mmol)的THF(50mL)溶液中，并搅拌该溶液(室温，3h)。将所得的剩余物浓缩后进行快速色谱(EtOAc/己烷1∶4)，生成无色油状的氨基甲酸酯19(1.2g，71％)。R_f 0.65(EtOAc/己烷1∶1)；δ_H(500MHz，CDCl₃)：7.83(br s，1H，PhNH)，7.42(m，2H，Ar)，7.32(m，2H，Ar)，7.11(m，1H，Ar)，5.38-5.30(m，2H，H3，H4)，5.18(br s，1H，NH)，4.62(m，1H，H2)，4.45-4.40(m，2H，H5，H6)，4.31(dd，J＝3.5，13.5，1H，H6)，2.12(s，3H，CH₃)，2.09(s，3H，CH₃)，2.07(s，3H，CH₃)，1.44(s，9H，C(CH₃)₃).δ_c (125 MHz，CDCl₃)：171.1，170.3，170.0，169.1(4C，C＝O)，155.0(CONHPh)，151.4(C1)，136.8，129.1，124.2，119.4(4C，Ar)，77.2，71.0，67.2(3C，C3，C4，C5)，61.2(C6)，51.1(C2)，30.6(C(CH₃)₃)，28.2(C(CH₃)₃)，(20.7，20.6，20.5(3C，CH₃)；C₂₄H₃₁N₃O₁₁ 分析计算值：C，53.63；H，5.81；N，7.82.实测值C，53.72；H，5.78；N，7.78％.

3.2.5 O-(3，4，6-三-O-乙酰基-2-酰氨基-2-脱氧-D-吡喃葡糖亚基)氨基N-苯基氨基甲酸酯(21a-g)合成的一般步骤

0℃下，将三氟乙酸(13mmol)加入溶于CH₂Cl₂(10mL)的氨基甲酸酯19(1mmol)中，并搅拌溶液(2h)。然后将吡啶(200mmol)缓慢加入上述溶液中，并将所得混合物静置(0℃，10min)。然后在0℃下将适当的酰氯(3mmol)加入并使该溶液在4℃静置过夜。浓缩混合物产生微黄色的剩余物，将该剩余物溶解在EtOAc(30mL)溶液中，并用(2×20mL)、盐水(1×20mL)冲洗，干燥(MgSO₄)过滤并浓缩。对于想要的三-O-乙酸酯21c-g，进行这些步骤无需进一步纯化。对假定为21a和21b的剩余物进行的快速色谱(EtOAc/己烷1∶1)产生了需要的酰基衍生物21a和21b，产率分别为48％和42％。

O-(2-乙酰氨基-3，4，6-三-O-乙酰基-2-脱氧-D-吡喃葡糖亚基)氨基N-苯基氨基甲酸酯(21a)-产生的¹H和¹³C NMR光谱与文献中的一致 ^[96]。(48％)R_f 0.2(EtOAc/己烷7∶3)。

O-(3，4，6-三-O-乙酰基-2-脱氧2-丙酰氨基--D-吡喃葡糖亚基)氨基N-苯基氨基甲酸酯(21b)-(42％)R_f 0.11(EtOAc/己烷1∶1)δ_H(500MHz，CDCl₃)：7.71(br s，1H，PhNH)，7.41(m，2H，Ar)，7.32(m，2H，Ar)，7.11(m，1H，Ar)，6.59(d，J＝7.5，1H，NH)，5.40(dd，J＝9.0，1H，H3)，5.35(dd，J＝9.0，1H，H4)，4.89(dd，1H，H2)，4.53(ddd，J＝3.0，4.0，1H，H5)，4.43(dd，J＝13.0，1H，H6)，4.32(dd，1H，H6)，2.22(q，J＝7.5，CH₂)，2.13(s，3H，COCH₃)，2.07(s，3H，COCH₃)，2.05(s，3H，COCH₃)，1.14(t，3H，CH₃).δ_C(125MHz，CDCl₃)：174.2，170.4，170.2，169.1(4C，C＝O)，155.1(CONHPh)，151.7(C1)，136.8，129.2，124.3，119.2(4C，Ar)，77.2，71.2，67.1(3C，C3，C4，C5)，61.2(C6)，49.6(C2)，29.4(CH₂)，20.7，20.6，20.5(3C，COCH₃)，9.7(CH₃).

3.2.6 O-(2-酰氨基-2-脱氧-D-吡喃葡糖亚基)氨基N-苯基氨基甲酸酯(PUGNAc，22a-f)合成的一般步骤

将溶于MeOH(2mL)的氨的饱和溶液加入溶于MeOH(10mL)的氨基甲酸酯(0.3mmol)溶液中，并将溶液静置(室温，2h)。将剩余物浓缩后进行快速色谱(MeOH/EtOAc 3∶97)，生成需要的三元醇PUGNAc，22a-f，产率范围从21％至32％。

O-(2-乙酰氨基-2-脱氧-D-吡喃葡糖亚基)氨基N-苯基氨基甲酸酯(PUGNAc)-(32％)产生的¹H和¹³C NMR光谱与文献中的一致^[96]。R_f 0.15(MeOH/EtOAc 1∶19)

O-(2-脱氧-2-丙酰氨基-D-吡喃葡糖亚基)氨基N-苯基氨基甲酸酯 (22a)-(32％)R_f0.11(MeOH/tOAc1∶19)；δ_H(500MHz，CD₃OD)：7.41(m，2H，Ar)，7.26(m，2H，Ar)，7.03(m，1H，Ar)，4.54(m，1H，H2)，3.96-3.93(m，2H，H5，H6)，3.83(dd，J＝4.0，12.5，1H，H6)，3.75-3.71(m，2H，H3，H4)，2.31(q，J＝7.5，CH₂)，1.16(t，3H，CH₃)；δ_C(125 MHz，CD₃OD)：177.5(C＝0)，159.5(CONHPh)，154.7(C1)，139.3，129.9，124.8，120.3(4C，Ar)，84.1，74.4，69.9(3C，C3，C4，C5)，61.8(C6)，52.9(C2)，30.2(CH₂)，10.2(CH₃)；C₁₆H₂₁N₃O₇.H₂O的分析计算值：C，50.00；H，5.77；N，10.93.实际值C，50.02；H，5.78；N，10.76％.

O-(2-脱氧-2-丁酰氨基-D-吡喃葡糖亚基)氨基N-苯基氨基甲酸酯(22b)-(26％)R_f0.26(MeOH/EtOAc1∶19)；δ_H(500MHz，CD₃OD)：7.41(m，2H，Ar)，7.27(m，2H，Ar)，7.03(m，1H，Ar)，4.54(m，1H，H2)，3.94-3.92(m，2H，H5，H6)，3.83(dd，J＝4.5，13.0，1H，H6)，3.74-3.70(m，2H，H3，H4)，2.26(t，J＝6.0，COCH₂)，1.66(m，2H，CH₂CH₃)，0.96(t，J＝7.0，3H，CH₃)；δ_C (100MHz，CD₃OD)：176.7(C＝O)，159.5(CONHPh)，154.7(C1)，139.3，130.0，124.8，120.3(4C，Ar)，84.1，74.5，69.9(3C，C3，C4，C5)，61.8(C6)，52.9(C2)，39.1(CH₂)，20.3(CH₂)，14.1(CH₃)；C₁₇H₂₃N₃O₇的分析计算值C，53.54；H，6.08；N，11.02实际值C，53.52；H，6.09；N，10.90％.

O-(2-脱氧-2-戊酰氨基-D-吡喃葡糖亚基)氨基N-苯基氨基甲酸酯(22c)-(23％) R_f0.43(MeOH/EtOAc1∶19)；δ_H(400MHz，CD₃OD)：7.45(m，2H，Ar)，7.30(m，2H，Ar)，7.03(m，1H，Ar)，4.58(m，1H，H2)，3.99-3.94(m，2H，H5，H6)，3.87(dd，J＝4.0，12.4，1H，H6)，3.79-3.75(m，2H，H3，H4)，2.33(t，J＝7.2，COCH₂)，1.64(m，2H， CH₂CH₂)，1.40(m，2H，CH₂CH₂)，0.92(t，J＝7.2，3H，CH₃)；δ_C(100MHz，CD₃OD)：176.8(C＝0)，159.5(CONHPh)，154.7(C1)，139.3，130.0，124.8，120.4(4C，Ar)，84.1，74.3，69.9(3C，C3，C4，C5)，61.8(C6)，52.9(C2)，37.0(CH₂)，29.0(CH₂)，23.5(CH₂)，14.2(CH₃)；C₁₈H₂₅N₃O₇.2H₂O的分析计算值：C，50.11；H，6.34；N，9.79.实际值C，50.25；H，6.04；N，9.94％.

O-(2-脱氧-2-己酰氨基-D-吡喃葡糖亚基)氨基N-苯基氨基甲酸酯(22d)-(26％)R_f0.48(MeOH/EtOAc1∶19)；δ_H(500MHz，CD₃OD)：

7.43(m，2H，Ar)，7.28(m，2H，Ar)，7.05(m，1H，Ar)，4.55(m，1H，H2)，3.97-3.92(m，2H，H5，H6)，3.85(dd，J＝4.0，12.5，1H，H6)，3.77-3.72(m，2H，H3，H4)，2.30(t，J＝7.5，COCH₂)，1.66(m，2H，COCH₂CH₂)，1.36-1.27(m，4H，CH₂CH₂)，0.87(t，J＝6.5，3H，CH₃)；δC(125MHz，CD₃OD)：176.8(C＝O)，159.5(CONHPb)，154.7(C1)，139.3，130.0，124.8，120.4(4C，Ar)，84.1，74.3，69.9(3C，C3，C4，C5)，61.8(C6)，52.9(C2)，37.2(CH₂)，32.6(CH₂)，26.6(CH₂)，23.5(CH₂)，14.3(CH₃)；C₁₉H₂₇N₃O₇ 的分析计算值C，55.74；H，6.65；N，10.26.实际值C，55.55；H，6.86；N，9.99％.

O-(2-脱氧-2-异丁酰氨基-D-吡喃葡糖亚基)氨基N-苯基氨基甲酸酯(22e)-(29％)R_f0.22(MeOH/EtOAc1∶19)；δ_H(500MHz，CD₃OD)：7.42(m，2H，Ar)，7.27(m，2H，Ar)，7.03(m，1H，Ar)，4.52 (m，1H，H2)，3.96-3.92(m，2H，H5，H6)，3.83(dd，J＝4.5，12.5，1H，H6)，3.77-3.71(m，2H，H3，H4)，2.54(m，J＝7.0，CH)，1.16(d，3H，CH₃)，1.14(d，3H，CH₃)；δ_C(125MHz，CD₃OD)：180.6(C＝O)，159.4(CONHPh)，154.7(C1)，139.3，130.1，124.8，120.4(4C，Ar)，84.1，74.3，69.9(3C，C3，C4，C5)，61.8(C6)，52.8(C2)，36.4(CH)，19.9，19.8(2C，CH₃)；C₁₇H₂₃N₃O₇的分析计算值：C，53.54；H，6.08；N，11.02.实际值C，53.17；H，6.18；N，10.87％.

O-(2-脱氧-2-异戊酰氨基-D-吡喃葡糖亚基)氨基N-苯基氨基甲酸酯(22f)-(23％)R_f0.47(MeOH/EtOAc1∶19)；δ_H(400MHz，CD₃OD)：7.44(m，2H，Ar)，7.30(m，2H，Ar)，7.06(m，1H，Ar)，4.59(m，1H，H2)，3.98-3.95(m，2H，H5，H6)，3.86(dd，J＝4.4，12.8，1H，H6)，3.77-3.74(m，2H，H3，H4)，2.17(d，J＝7.5，COCH₂)，2.12，(m，1H，CH(CH₃)₂)，0.98(m，6H，CH₃)；δ_C(100MHz，CD₃OD)：176.0(C＝0)，159.5(CONHPh)，154.7(C1)，139.3，130.0，124.8，120.4(4C，Ar)，84.1，74.5，69.9(3C，C3，C4，C5)，61.8(C6)，52.9(C2)，46.5(CH₂)，27.5(CH(CH₃)₂)，23.0，22.9(2C，CH₃)；C₁₈H₂₅N₃O₇的分析计算值：C，54.68；H6.37；N，10.63.实际值：C，54.33；H，6.48；N，10.56％.

3.3 使用抑制剂22a-f的动力学分析

3.3.1 动力学分析的实验步骤

所有测试使用终止法在37℃下进行30分钟，并重复三次，通过加入4倍过量的(200μL)骤停缓冲剂(200mM氨基乙酸，pH 10.75)使酶促反应(50μL)骤停。测试是通过用吸量管小心加入酶(5μL)引发的，并且在所有情况下，所得的骤停溶液的最终pH值大于10。O-GlcNAc酶和β-氨基己糖酶的时间依赖性测试揭示了测试时间内两种酶在各自的缓冲剂下都是稳定的：50mM NaH₂PO₄，100mM NaCl，0.1％BSA，pH6.5以及50mM柠檬酸盐，100mM NaCl，0.1％BSA，pH 4.25。上述反应的进度在30分钟结束时通过用UV测量法在400nM下检测释放4-硝基酚的程度来确定，本测试中使用96孔板(Sarstedt)和96孔板酶标仪(分子生物学装置)。人胎盘β-氨基己糖酶购自Sigma(Lot 043K3783)，在即将使用前过量表达并纯化O-GlcNAc酶。^[85]在使用浓度为0.5mM的底物pNG-GlcNAc测定抑制剂时，O-GlcNAc酶和β-氨基己糖酶的浓度(μg/μL)分别为0.0406和0.012。所有抑制剂均是在从3倍至1/3倍KI范围中的七个浓度下测试的，除了β-氨基己糖酶在抑制剂22d下的测试，由于K_I值高，如此高的抑制剂浓度是无法达到的。K_I值通过迪克逊作图数据的线性回归得到。

3.3.2 使用抑制剂22a-f的动力学分析结果

如上所述，PUGNAc是O-GlcNAc酶^[13，50]和β-氨基己糖酶^[28，51]的有效的竞争性抑制剂。对于来源于人的酶的K_I值分别为46nM和36nM。 ^[13，49]将抑制剂22a-f的选择性进行评价并与PUGNAc的选择性进行比较。使用pNG-GlcNAc作为底物，发现这些化合物22a-f是人O-GlcNAc酶和人β-氨基己糖酶两者的抑制剂(表3)。

化合物	O-GlcNAc酶 K_I (μM)	β-氨基己糖酶K_I (μM)	选择性之比(β-氨基己糖酶K_I/O-GlcN
				PUGNAc 22a 22b 22c 22d 22e 22f	0.046 1.2 2.4 40 210 9 190	0.036 1.2 26 220 ＞900 20 ＞1200	1 1 11 6 ≥5 2 ≥6

表3：O-GlcNAc酶和β-氨基己糖酶的抑制剂的抑制常数和选择性。

对人β-氨基己糖酶的抑制的分析揭示了增加N-酰基基团的链长导致这些抑制剂有效性的显著下降(表3)。仅仅包含一个亚甲基(化合物22a)也会导致其与母体化合物PUGNAc相比，针对β-氨基己糖酶的K_I 值增加33倍。链长再增加还会导致K_I值的更大增加。此外，O-GlcNAc酶比β-氨基己糖酶对链长增加的耐受性更好(表3)。

针对这两种来源于人的酶，即O-GlcNAc酶和β-氨基己糖酶，前述制备的NAG-噻唑啉衍生物9b-g^[49]的K_I值的直接比较揭示了修饰后的噻唑啉比相应的基于PUGNAc的化合物22a-f更具选择性，且是更有效的抑制剂。这些观察结果指出了抑制剂上酰基基团位置的重要性，以及潜在的异头碳的重要性。与具有sp²杂化异头碳的相应的PUGNAc衍生物PUGNAc和22a-f上的酰基链相比，具有sp³杂化的异头碳的噻唑啉——NAG-噻唑啉和9b-g——包括限制酰基链的运动的一个双环骨架。同样，这两组化合物活性位点上侧链的精确定位一定是不同的。总之，这两个因素导致了由PUGNAc衍生的化合物与噻唑啉衍生物相比，总体上抑制作用较差，选择性也更低。与这些结果相一致的是：O-GlcNAc酶的一种不好的抑制剂(K1＝1.5mM)^{[46，47，49]}链脲佐菌素(STZ)也具有一个体积大、自由旋转的酰基链，并显示出优于对β-氨基己糖酶的对O-GlcNAc酶的中等选择性。^{[46，47，49]}

基于噻唑啉的化合物NAG-噻唑啉和9b-g与PUGNAc衍生物PUGNAc和22a-f间的不同点源于前者模拟O-GlcNAc酶^[49]和β-氨基己糖酶^{[30，48，83，97]}的催化机理中涉及的假定的类双环过渡态。与此不同的是，PUGNAc类似物和STZ上的N-酰基基团的位置与天然底物N-乙酰基-D-吡喃葡糖苷的N-酰基基团位置类似。PUGNAc和噻唑啉的衍生物上的异头碳的不同杂化也可能是这些N-酰基基团精确定位的原因。

上述制备的全部化合物都是人O-GlcNAc酶和人β-氨基己糖酶两者的抑制剂。然而，这些化合物利用这两种酶活性位点结构的不同，从而使其对O-GlcNAc酶具有选择性。尽管PUGNAc类似物与噻唑啉衍生物相比具有较低的选择性，这些化合物可能因为其不同的骨架而具有不同的药代动力学特性。因此，噻唑啉和PUGNAc衍生物都可被证明是解析细胞水平和有机体水平上O-GlcNAc翻译后修饰作用的有用工具。事实上，其他糖苷酶抑制剂的修饰已经产生了针对完全不同的酶的临床上有用的化合物。^[98]同样，使用此处的概括的方案，对其他β-N-乙酰基-氨基葡糖苷酶抑制剂骨架^[99，100]的系统修饰也会生成人O-GlcNAc酶的选择性抑制剂。

实施例4：细胞培养中选择性抑制剂的评估

证明了这些化合物在体外的选择性后，评估了所述化合物在活细胞中的用途。

4.1 实验步骤

4.1.1 细胞培养与抑制

在补充了5-10％FBS(Invitrogen)的DMEM培养基(Invitrogen)中培养COS-7细胞。将等份的抑制剂(每份50μL抑制剂溶于95％乙醇中)分配至组织培养板中，蒸发乙醇。将细胞在37℃下培养40小时，达到约80％的融合率。依如下方法研究了对使用50μM的化合物9a、9c或9g处理细胞响应O-GlcNAc修饰蛋白的时间依赖性累积。于5％FBS中培养COS-7细胞至25％融合，并向每个培养板加入一份(100μL)溶于培养基中、过滤并除菌的抑制剂，以使抑制剂的终浓度为50μM。在适当时间刮落收集COS-7细胞，并通过离心(200×g，10min)集中。用pH 7.0(10mL)的PBS冲洗细胞一次并沉淀(200×g，10min)。此时将细胞于-80℃冷冻。无抑制剂的对照组培养物用相同的方法处理。

4.1.2 蛋白质印迹分析

在抑制剂9a，9c，或9g的存在下，依上述方法培养COS-7细胞至约90％融合。对照细胞的培养物用与如下相同的方法处理，但培养物中没有抑制剂。将细胞以上述方法收集。冷冻的细胞在4℃解冻，并加入低温的裂解缓冲液(含有150mM NaCl，1mM EDTA，1mM PMSF，1％NP-40，0.5％脱氧胆酸钠和1mM抑制剂9f的1mL 50mM Tris溶液，pH8.0)。4℃下10分钟后，将溶液于Eppendorf 5154C微量离心机中，14000rpm下离心，收集上清。向每个样品的一份(15μL)中加入SDS/PAGE加样缓冲液，96℃加热后上样至10％或12％的Tris·HCl聚丙烯酰胺凝胶。电泳后，将样品电印迹至硝酸纤维素膜上(0.45μm，Bio-Rad)。通过目测观察预染的标记物(双色Precision Plus蛋白质标准-Biorad)的转移来确认转移。使用5％BSA(第五组分，Sigma)的PBS溶液(用于被小鼠抗-O-GlcNAc单克隆IgM抗体(MAb CTD110.6-Covance)探测的样品的封闭缓冲液A)，或者使用pH 7.4、含有0.1％吐温20的5％低脂奶粉(用于被抗-β-肌动蛋白探测的样品的封闭缓冲液B)，室温下1h或4℃过夜封闭上述的膜。倾去封闭溶液，并按需要加入含有MAb CTD 110.6(原料液的1∶2500)的封闭缓冲液A或含有小鼠单克隆抗-β-肌动蛋白IgG(Clone AC-40-Sigma)的封闭缓冲液B(1∶1000稀释)。膜在室温下温育1h或4℃过夜，然后倾去封闭缓冲液，用含有0.1％吐温20的pH7.4的PBS(清洗缓冲液)清洗膜。然后将膜用清洗缓冲液冲洗2×5min和3×15min。对于O-GlcNAc的免疫检测，将膜在封闭缓冲液A中室温下温育1小时，并在冲洗后，将膜在含有第二山羊抗小鼠-IgM-HRP结合物(1∶2500，Santa Cruz Biotech)的封闭溶液中室温下温育1小时或4℃过夜。对于β-肌动蛋白水平的检测，将膜在含有第二山羊抗小鼠IgG-HRP结合物(1∶100000，Sigma)的封闭溶液B中室温下温育1小时或4℃过夜。冲洗膜，并用化学发光检测法完成与膜结合的山羊抗小鼠IgG-HRp结合物的检测，化学发光检测中使用SuperSignal West Pico化学发光检测试剂盒(Pierce)和胶片(Kodak Biomax MR)。

4.2 细胞研究的结果

与对照细胞(数据未显示)相比，在含有50μM的抑制剂9a，9c或9g的平板中培养的COS-7细胞没有显示出繁殖率或形态上的异常。在有或无抑制剂9a，9c或9g存在下在培养40小时的细胞内的细胞水平的O-GLcNAc修饰蛋白使用O-GlcNAc引导的单克隆抗体(64)mAbCTD110.6。与对照组相比，细胞内O-GlcNAc修饰的蛋白质的细胞水平的显著增加(附图5A)表明了这些化合物较易进入细胞内部，在此它们阻止了O-GlcNAc酶起作用。还探测了在COS-7细胞内噻唑啉抑制剂(9c)阻止O-GlcNAc酶作用的速度。通过用蛋白质印迹分析监测COS-7O-GlcNAc修饰蛋白的水平，我们发现了O-GlcNAc修饰蛋白水平的清晰的时间依赖性增加。甚至在暴露于抑制剂(9c)1小时后，也观察到O-GlcNAc修饰蛋白的水平的增加。看起来抑制剂快速地进入细胞，在其中立即阻止O-GlcNAc酶的活性导致了O-GlcNAc修饰蛋白的时间依赖性增加(附图6)。在最初的快速升高之后，被抑制剂(9c)处理后的细胞中的O-GlcNAc修饰蛋白的水平在细胞内似乎渐渐接近一个稳定的状态(附图6)。这种行为与之前观察到的与PUGNAc^[50]共同培养的HT29细胞中的相似的时间依赖性一致。对于使用α-β-肌动蛋白探测的蛋白质印迹分析(附图5B)，以及随后的适当的第二HRP-结合揭示了在所有情况下，加样的样品是等量的。还值得注意的是，母体化合物NAG-噻唑啉(9a)之前曾被证明能够进入细胞，并在其中对溶酶体β-氨基己糖酶施加作用^[101]。

实施例5：选择性O-GlcNAc酶抑制剂在开发用于研究II型糖尿病的动物模型中的用途

5.1 显示But-NAG-噻唑啉(9c)在不同组织类型和葡萄糖清除中的作用的动物研究

5.1.1 实验步骤

将八只五周龄的健康斯普拉-道来氏大鼠(Charles River)成对关入笼内。使该动物在Simon Fraser大学的动物饲养实验室(SFU ACF)中适应环境一周。3:00pm，对四只大鼠通过尾静脉注射400μL溶于PBS缓冲剂(pH 7.4)的抑制剂9c，剂量为50mg kg^-1。剩余的四只大鼠通过尾静脉注射400μL的PBS作为对照。所有溶液通过0.2μm过滤器(Millipore)预除菌，并通过包括28号×0.5的针头(Terumo)的0.5mL注射器在10秒内推注。约11:00pm时取消食物。第二天早晨8:30am时，对大鼠进行第二次注射。三小时后用异氟烷麻醉大鼠，并从颈静脉抽取100μL血样用于测量禁食时的血糖水平。然后实施静脉葡萄糖耐量试验(IVGTT)。通过尾静脉在30秒内注射0.5mL溶于PBS(预除菌)中的50％w/v葡萄糖溶液。葡萄糖注射后的10、20、30、40、60和90分钟时，从颈动脉抽取100μL血样。获得血样后，立即使用一小份血液通过血糖测量仪(Accu-Check Advantage，Roche)测量血糖浓度，并将剩余血液在冰上保存20分钟，再离心分离血清。IVGTT完成后，用1∶1的CO₂/O₂混合物杀死大鼠。立即收集其组织样品(脑、肌肉、肝脏、脾、胰腺、脂肪)，用液氮速冻并储存于-80℃。为使组织匀浆从而获得细胞提取物，用研钵和杵将组织研磨成粉末状时保持组织的冷冻状态。然后将100mg粉末于1mL低温裂解缓冲液(50mM Tris，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，1％NP-40，1mM EDTA，1mM PMSF和1mM丁基-NAG-噻唑啉)中匀浆，使用Jenke and Kunkel Ultra-Turrax组织匀浆仪使用两个10秒脉冲进行上述匀浆。然后将组织于13000rpm下，在微量离心机(eppendrof)中离心以除去细胞碎片。将可溶的细胞提取物使用上述用于细胞研究的蛋白质印迹分析法分析其O-GLcNAc修饰蛋白的水平。

5.1.2 不同组织类型中丁基-NAG-噻唑啉(9c)的作用

被由尾动脉注射了不同剂量的抑制剂9c的大鼠显示了静脉给药抑制剂9c影响了不同组织类型中O-GLcNAc修饰蛋白的细胞水平(附图9)。脑组织的样品(附图9A)显示了当大鼠被注射50、120和300mg/kg的抑制剂9c时，与对照实验相比，O-GlcNAc修饰蛋白的细胞水平显著增加。这表明抑制剂9c很容易进入脑细胞内，在其中起作用阻止O-GlcNAc酶的功能。在肌肉和肝脏组织的样品中也发现了相似的结果(附图9B和9C)。

从结果中看出，似乎抑制剂仅以半剂量依赖的方式抑制O-GlcNAc酶。这说明50mg/kg抑制剂9c足够引起O-GlcNAc修饰蛋白的最大程度的增加。同样，这些结果说明了抑制剂能够在低于24小时的时间内进入多种组织并至少维持6小时的作用。同样应注意的是，与对照的大鼠相比，这些研究中使用的经抑制剂处理的大鼠并未显出任何不适。

5.1.3 葡萄糖清除中丁基-NAG-噻唑啉的作用

已经阐明抑制剂9c能够抑制大鼠的O-GlcNAc酶，注意力被转移到研究增加的O-GlcNAc修饰蛋白水平是否会改变大鼠维持葡萄糖体内稳态的能力。使用葡萄糖静脉耐量试验(IVGTT)作为测量动物对1g kg^-1 葡萄糖攻击的反应能力的方法。结果清晰地表明短时间地暴露于抑制剂(＜24小时)不会影响大鼠的葡萄糖清除速率(附图10A)。应注意这些结果是具有统计显著性的，因为它们是由被抑制剂处理的四只大鼠和用对照的PBS缓冲液注射处理的四只大鼠得出的。蛋白质印迹分析表明IVGTT中用抑制剂处理的四只大鼠确实具有增加的O-GlcNAc修饰蛋白水平(附图10B)。

该结果是令人惊奇的，因为之前显示在培养的脂肪细胞中O-GlcNAc修饰蛋白的水平的升高导致胰岛素抵抗。发明人假设这些结果之间的差异源于一到两种可能性。首先，由于从整个有机体获得的结果比使用培养的细胞的实验更与生理上相关，因此，胰岛素抵抗不会在周缘组织中产生。第二种可能性是抑制剂9c实际上通过引起胰腺β细胞分泌更多胰岛素的方式作用于胰腺β细胞。此作用会克服周缘组织中的胰岛素不敏感性，可能如观察结果一样导致正常葡萄糖清除。对此第二种假设的支持来自一个事实，即β细胞内产生和传递胰岛素所涉及的大量蛋白质本身被 O-GlcNAc修饰，例如刺激胰岛素产生的两种转录因子(pdx-1和sp1)。

5.2 显示丁基-NAG-噻唑啉(9c)清除率的动物研究

5.2.1 实验步骤

为获得抑制剂从组织中被清除的速度的信息，向五只10周大的斯普拉-道来氏大鼠尾静脉注射所述抑制剂(50mg kg^-1)。依次在注射后3、7、24、27和32小时杀死大鼠。用另外两只大鼠作为对照。一只大鼠在其他大鼠即将接受注射之前被杀死，以获得O-GlcNAc修饰蛋白的正常水平的信息。此外，一只大鼠在其他大鼠注射的同时被注射灭菌的PBS(pH7.4)，并在实验结束时杀死(32小时)。组织收集、匀浆和蛋白质印迹分析的方法以与上文描述相同的方式进行。

5.2.2 清除速率结果

被注射抑制剂9c的大鼠显示了抑制剂9c的静脉给药在早至注射后三小时时即影响了多种组织类型中O-GlcNAc修饰蛋白的细胞水平(附图11)。脑组织的样品(附图11A)显示了与对照实验相比，注射后三小时O-GlcNAc修饰蛋白的细胞水平有显著增加。这表明抑制剂9c很容易地进入脑细胞的内部并在其中起到阻止O-GlcNAc酶功能的作用。七小时后，O-GlcNAc修饰蛋白的细胞水平仍然很高。24小时后，该水平下降并似乎在32小时后回到正常水平。在肌肉组织样品中也观察到了相似结果(图11B)。

5.3 显示丁基-NAG-噻唑啉(9c)的口服有效性的动物研究

5.3.1 实验步骤

为确定抑制剂9c是否口服有效，将其加入食物中(实验室食谱5001啮齿目食谱，PMI Nutrition International，LLC)。为制备大鼠食物，将600g碾碎的食物与355mL水和溶解于乙醇中的5mL抑制剂混合。使用面条机(Pasta Express，Creative)制作小块，并于37℃下脱水过夜(SnackmasterDehydrator，American Harvest)。制作了含有以下量的抑制剂的五份食物：0mg kg^-1天^-1，100或1000mg kg^-1天^-1的脱保护(极性)抑制剂，和100或1000mg kg^-1天^-1的保护(非极性)抑制剂。这些数据基于从之前的研究中获得的数据，即六周大的大鼠每天食用约25g食物。然后向十只五周大的健康斯普拉-道来氏大鼠(每组食物两只)喂食三天上述的鼠粮。然后将这些动物杀死并收集其组织，匀浆并使用上述方法分析。

5.3.2 口服有效性结果

向大鼠喂食三天两种不同剂量的保护(非极性)的和脱保护(极性)形式的抑制剂9c。蛋白质印迹分析显示，口服两种形式的抑制剂9c影响了多种组织中O-GlcNAc修饰蛋白的细胞水平(附图12)。脑组织样品(附图12A)显示，当大鼠被喂食100mg/kg/天剂量的保护或脱保护形式的抑制剂9c时，O-GlcNAc修饰蛋白的细胞水平显著增加。当大鼠被喂食1000mg/kg/天的更大剂量的保护或脱保护形式的抑制剂9c时，脑组织中的O-GlcNAc修饰蛋白的细胞水平更高。这表明了即使抑制剂9c是以剂量依赖的方式被口服的，抑制剂9c也容易进入脑细胞的内部，并在其中阻断O-GlcNAc酶的功能，。在其他类型的组织样品中也观察到相似的结果，包括肌肉、胰腺、脂肪和脾(附图12B-12E)。

本领域技术人员应清楚，根据前述公开，在不偏离本发明的主旨和范围的情况下，可在本发明的实施中作出许多改变和修改。

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Claims

1.一种化学通式(I)的化合物或其可药用的盐：

其中R¹选自H和COCH₃，其中每个R¹均相同；R²选自CH₂CH₃、(CH₂)₂CH₃、(CH₂)₃CH₃、(CH₂)₄CH₃、CH(CH₃)₂和CH₂CH(CH₃)₂。

2.如权利要求1所述的化合物，其中所述化合物选自：

1,2-二脱氧-2'-乙基-α-D-吡喃葡糖基-[2,1-d]-△2'-噻唑啉（IUPAC名称：(3aR,5R,6S,7R,7aR)-2-乙基-5-(羟甲基)-5,6,7,7a-四氢-3aH-吡喃[3,2-d]噻唑-6,7-二醇），

1,2-二脱氧-2'-丙基-α-D-吡喃葡糖基-[2,1-d]-△2'-噻唑啉（IUPAC名称：(3aR,5R,6S,7R,7aR)-5-(羟甲基)-2-丙基-5,6,7,7a-四氢-3aH-吡喃[3,2-d]噻唑-6,7-二醇），

1,2-二脱氧-2'-丁基-α-D-吡喃葡糖基-[2,1-d]-△2'-噻唑啉（IUPAC名称：(3aR,5R,6S,7R,7aR)-2-丁基-5-(羟甲基)-5,6,7,7a-四氢-3aH-吡喃[3,2-d]噻唑-6,7-二醇），

1,2-二脱氧-2'-戊基-α-D-吡喃葡糖基-[2,1-d]-△2'-噻唑啉（IUPAC名称：(3aR,5R,6S,7R,7aR)-5-(羟甲基)-2-戊基-5,6,7,7a-四氢-3aH-吡喃[3,2-d]噻唑-6,7-二醇），

1,2-二脱氧-2'-异丙基-α-D-吡喃葡糖基-[2,1-d]-△2'-噻唑啉（IUPAC名称：(3aR,5R,6S,7R,7aR)-5-(羟甲基)-2-异丙基-5,6,7,7a-四氢-3aH-吡喃[3,2-d]噻唑-6,7-二醇），

1,2-二脱氧-2'-异丁基-α-D-吡喃葡糖基-[2,1-d]-△2'-噻唑啉（IUPAC名称：(3aR,5R,6S,7R,7aR)-5-(羟甲基)-2-异丁基-5,6,7,7a-四氢-3aH-吡喃[3,2-d]噻唑-6,7-二醇），

3,4,6-三-O-乙酰基-1,2-二脱氧-2'-乙基-α-D-吡喃葡糖基-[2,1-d]-△2'-噻唑啉（IUPAC名称：(3aR,5R,6S,7R,7aR)-5-(乙酰氧基甲基)-2-乙基-5,6,7,7a-四氢-3aH-吡喃[3,2-d]噻唑-6,7-二基二乙酸酯），

3,4,6-三-O-乙酰基-1,2-二脱氧-2'-丙基-α-D-吡喃葡糖基-[2,1-d]-△2'-噻唑啉（IUPAC名称：(3aR,5R,6S,7R,7aR)-5-(乙酰氧基甲基)-2-丙基-5,6,7,7a-四氢-3aH-吡喃[3,2-d]噻唑-6,7-二基二乙酸酯），

3,4,6-三-O-乙酰基-1,2-二脱氧-2'-丁基-α-D-吡喃葡糖基-[2,1-d]-△2'-噻唑啉（IUPAC名称：(3aR,5R,6S,7R,7aR)-5-(乙酰氧基甲基)-2-丁基-5,6,7,7a-四氢-3aH-吡喃[3,2-d]噻唑-6,7-二基二乙酸酯），

3,4,6-三-O-乙酰基-1,2-二脱氧-2'-戊基-α-D-吡喃葡糖基-[2,1-d]-△2'-噻唑啉（IUPAC名称：(3aR,5R,6S,7R,7aR)-5-(乙酰氧基甲基)-2-戊基-5,6,7,7a-四氢-3aH-吡喃[3,2-d]噻唑-6,7-二基二乙酸酯），

3,4,6-三-O-乙酰基-1,2-二脱氧-2'-异丙基-α-D-吡喃葡糖基-[2,1-d]-△2'-噻唑啉（IUPAC名称：(3aR,5R,6S,7R,7aR)-5-(乙酰氧基甲基)-2-异丙基-5,6,7,7a-四氢-3aH-吡喃[3,2-d]噻唑-6,7-二基二乙酸酯），和

3,4,6-三-O-乙酰基-1,2-二脱氧-2'-异丁基-α-D-吡喃葡糖基-[2,1-d]-△2'-噻唑啉（IUPAC名称：(3aR,5R,6S,7R,7aR)-5-(乙酰氧基甲基)-2-异丁基-5,6,7,7a-四氢-3aH-吡喃[3,2-d]噻唑-6,7-二基二乙酸酯），或者

这些化合物的一种可药用的盐。

3.如权利要求1或2所述的化合物，其中所述化合物包括一种药物前体。

4.如权利要求3所述的化合物，其中所述药物前体选自：

34,6-三-O-乙酰基-1,2-二脱氧-2'-丁基-α-D-吡喃葡糖基-[2,1-d]-△2'-噻唑啉（IUPAC名称：(3aR,5R,6S,7R,7aR)-5-(乙酰氧基甲基)-2-丁基-5,6,7,7a-四氢-3aH-吡喃[3,2-d]噻唑-6,7-二基二乙酸酯），

34,6-三-O-乙酰基-1,2-二脱氧-2'-异丙基-α-D-吡喃葡糖基-[2,1-d]-△2'-噻唑啉（IUPAC名称：(3aR,5R,6S,7R,7aR)-5-(乙酰氧基甲基)-2-异丙基-5,6,7,7a-四氢-3aH-吡喃[3,2-d]噻唑-6,7-二基二乙酸酯），和

3,4,6-三-O-乙酰基-1,2-二脱氧-2'-异丁基-α-D-吡喃葡糖基-[2,1-d]-△2'-噻唑啉（IUPAC名称：(3aR,5R,6S,7R,7aR)-5-(乙酰氧基甲基)-2-异丁基-5,6,7,7a-四氢-3aH-吡喃[3,2-d]噻唑-6,7-二基二乙酸酯），或

这些化合物的一种可药用的盐。

5.一种药物组合物，包括一种或多种如权利要求1或2所述的化合物和一种可药用的载体。

6.一种药物组合物，包括一种或多种如权利要求3或4所述的药物前体和一种可药用的载体。

7.一种化学通式(I)的化合物或其可药用的盐在制备一种药剂中的用途，所述药剂用于治疗有需要的患者体内一种对O-GlcNAc酶抑制治疗有响应的异常：

其中R¹选自H和COCH₃，其中每个R¹均相同；R²选自CH₂C_H3、(CH₂)₂CH₃、(CH₂)₃CH₃、(CH₂)₄CH₃、CH(CH₃)₂和CH₂CH(CH₃)₂。

8.如权利要求7所述的用途，其中所述异常选自糖尿病，神经变性疾病、tau病变、癌症和应激中的一种或多种。

9.如权利要求7所述的用途，其中所述tau病变是阿尔茨海默病。

10.一种化学通式(I)的化合物或其可药用的盐在制备一种药剂中的用途，所述药剂用于选择性抑制有需要的患者体内的O-GlcNAc酶：

11.如权利要求7、8或10所述的用途，其中所述化合物选自：

这些化合物的一种可药用的盐。

12.如权利要求7、8或10所述的用途，其中所述化合物包括一种药物前体。

13.如权利要求12所述的用途，其中所述药物前体选自：

这些化合物的一种可药用的盐。

14.如权利要求7、8或10所述的用途，其中所述化合物和一种可药用的载体作为一种药物组合物提供。