CN101205549A - 一种采用化学－酶法制备15n－l－酪氨酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种采用化学－酶法制备¹⁵N－L－酪氨酸的方法，该方法包括以下工艺步骤：(1)菌体细胞的制备；(2)酶反应；(3)提取精制及¹⁵N的回收。与现有技术相比，本发明具有成本低廉，¹⁵N利用率高，通用性广，产品丰度下降少等特点。

Description

一种采用化学-酶法制备15N-L-酪氨酸的方法

技术领域

本发明涉及一种¹⁵N-L-酪氨酸的制备方法，具体地说是涉及一种以廉价出发物有机合成相应的酮酸、采用生物催化方法以¹⁵N-L-天冬氨酸或¹⁵N-L-谷氨酸为氨基供体来制备稳定同位素标记的¹⁵N-L-酪氨酸的方法。属于稳定性同位素标记化合物生产领域，涉及到有机合成、微生物酶和生物下游分离技术。

背景技术

¹⁵N稳定同位素标记的生化物质在临床医学和生物学研究中具有极其重要的用途。它可取代对人体有危害的放射性元素大量用于气相色谱、质谱和核磁共振的分析测试中，以及作为示踪剂帮助确定动物体和人体中氨基酸代谢的各类动态参数。随着人类基因图谱的测定、蛋白质工程的发展及其他相关科学的快速发展，¹⁵N-L-酪氨酸等标记氨基酸将在医学、药物学、生物学、生命科学、农业科学、有机化学等领域得到更为广泛的应用。

L-酪氨酸国内外都采用化学合成法、发酵法、酶法以及化学-酶法来生产。其中有代表性的如采用化学合成法从对羟基苯甲醛出发经缩合、加氢、水解来制得；利用基因工程技术构建携带有莽草酸激酶基因的酪氨酸工程菌株发酵生产(“代谢控制发酵”，中国轻工出版社，P338，1998年)；还有利用细菌中酪氨酸苯酚裂解酶催化苯酚、丙酮酸和氨来合成等(Biochemical and BiophysicalResearch Communications，46(2)，370-374(1972))。但是，这些方法不是涉及繁琐的合成、拆分步骤，或者大量的菌种筛选工作且发酵产量难提高，就是由于底物的限制不能连续化生产。近年来兴起的化学-酶法以廉价出发物有机合成相应的酮酸，再采用生物催化方法在天冬氨酸转氨酶的作用下以L-天冬氨酸或L-谷氨酸为氨基供体转氨制得L-酪氨酸。此法以成本低廉，氮源利用率高，通用性广(以此法可类似合成L-苯丙氨酸和L-色氨酸)的优点特别适合于¹⁵N-L-酪氨酸的生产。虽然国内的南京化工大学(南京化工大学学报，21(3)，66-67(1999))对此路线有一定研究，但报道不深入，仅对酮酸酶法转化L-酪氨酸进行了初步的研究，而采用此法制备¹⁵N-L-酪氨酸国内外均未见报道。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的不足之处而提供一种成本低廉，¹⁵N利用率高，通用性广，产品丰度下降少的，采用化学-酶法制备¹⁵N-L-酪氨酸的方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种采用化学-酶法制备¹⁵N-L-酪氨酸的方法，其特征在于，该方法包括以下工艺步骤：

(1)菌体细胞的制备

a)发酵产酶所采用的微生物包括大肠杆菌(Escherichia coli)、弗氏柠檬酸细菌(Citrobacter frevndii)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)；

b)斜面培养：

培养基为营养肉汁琼脂培养基(g/L)：蛋白胨10.0，牛肉膏3.0，氯化钠5.0，琼脂15.0，蒸馏水1.0L，pH7.0，定容至1.0L，分装，0.1MPa、121℃灭菌20分钟，菌种接入后28℃～32℃培养16～24小时；

c)发酵培养：

以碳源、氮源、无机物配置成发酵培养基，调节其pH值6～9，灭菌后接入斜面种子，于150～260rpm，32℃～40℃，培养16～24小时；

装液量为50ml/500ml，灭菌条件为0.1MPa，121℃，20分钟；

d)发酵液离心得湿菌体，经生理盐水洗涤离心后加入磷酸吡哆醛溶液活化1～3小时，备用；

(2)酶反应

底物反应液：底物4-羟基苯丙酮酸的浓度为0.2％～5％，加入金属离子及¹⁵N氮源后用氨水或NaOH调节pH值为7.5～8.5；

将上述处理所得游离整体细胞作为酶源加入底物溶液中，菌体加入量0.5％～2.5％，在30℃～45℃下反应20～28小时，转速110～150rpm；

(3)提取精制及¹⁵N的回收

反应结束后，将酶反应液调pH至1～3后进行离心，上清液用乙酸乙酯等体积萃取3次，所得水相于旋转蒸发仪上赶酯浓缩，直至蒸干；然后加水溶解至体积为200～300ml，上732树脂柱，水洗后用0.05M～0.40M的NH₄Cl洗脱，分别收集¹⁵N-L-酪氨酸和¹⁵N-L-天冬氨酸或¹⁵N-L-谷氨酸单斑，浓缩后再上柱除盐，洗脱得到各自的洗脱液；经赶氨浓缩，活性炭脱色后，用乙醇和水进行结晶；结晶液冷至室温后，放冰箱冷藏过夜，第二天抽滤得白色晶体，洗涤、抽干，将晶体刮入容器内，于50℃～60℃真空烘干；对产品进行纯度、丰度检测，纯度＜98.5％可再行重结晶，最终得到¹⁵N-L-酪氨酸产品及回收的¹⁵N-L-天冬氨酸或¹⁵N-L-谷氨酸。

步骤(1)中所述的微生物为能产天冬氨酸转氨酶的菌类。

步骤(1)中所述的菌包括ATCC8739、ATCC11303、ATCC950。

步骤(1)中所述的碳源包括葡萄糖、果糖、蔗糖、含这些糖的糖蜜、淀粉；所述的氮源包括氯化铵、硫酸铵、醋酸铵、磷酸铵、氨水，无机物以及酵母提取物、玉米浆、蛋白胨、牛肉膏的一种或多种；所述的无机物包括磷酸一氢钾、磷酸二氢钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸锰、硫酸铜的一种或多种。

步骤(1)中所述的发酵培养条件：pH值最好是6.5～8.5，转速最好是以180～220rpm，温度优选35℃～39℃。

步骤(1)中所述的磷酸吡哆醛溶液的浓度为1mmol/L～5mmol/L。

步骤(2)中所述的底物为4-羟基苯丙酮酸，底物溶液中所用的¹⁵N氮源为¹⁵N-L-天冬氨酸或¹⁵N-L-谷氨酸，作为氨基供体。

步骤(2)中所述的金属离子包括Mn²⁺、Fe²⁺、Zn²⁺、Co²⁺的一种或多种，浓度为1～5mmol/L。

步骤(2)中所述的底物4-羟基苯丙酮酸的浓度以1％～3％为较佳。

步骤(2)中所述的酶反应温度为35℃～40℃较佳。

与现有技术相比，本发明以合成的4-羟基苯丙酮酸为底物，以¹⁵N-L-天冬氨酸或¹⁵N-L-谷氨酸为氨基供体，在天冬氨酸转氨酶的作用下得到含¹⁵N-L-酪氨酸的反应液，经萃取及上柱分离，提取到¹⁵N-L-酪氨酸产品，本发明的技术方法制备¹⁵N-L-氨基酸，具有成本低廉，¹⁵N利用率高，通用性广，产品丰度下降少的特点，体现出了化学-酶法制备¹⁵N-L-氨基酸的优越性，提高了产品的市场竞争力。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步说明。

实施例1

将斜面培养18小时的菌接入发酵培养基，500ml三角瓶中装50ml培养基，于37℃恒温摇床培养24小时，转速220rpm。培养所得发酵液于4800rpm离心30分钟，倾去上清液，菌体经生理盐水洗涤离心后加入磷酸吡哆醛溶液(浓度为1mmol/L)活化2小时，取得到的菌体悬浮液加入到底物浓度为1％、含丰度为10.12％的¹⁵N-L-天冬氨酸0.50％、硫酸亚铁0.02％的底物溶液200ml中，用NaOH调节pH值为7.8，于35℃恒温反应23小时。得到的反应液经离心，上清液用乙酸乙酯等体积萃取，水相赶酯浓缩后上柱，水洗后用0.05M的NH₄Cl洗脱，分别收集¹⁵N-L-天冬氨酸和¹⁵N-L-酪氨酸单斑，浓缩后再上柱除盐，洗脱得到各自的洗脱液。经赶氨浓缩，活性炭脱色后，用乙醇和水进行结晶。结晶液冷至室温后，放冰箱冷藏过夜，第二天抽滤得白色晶体，洗涤、抽干，将晶体刮入容器内，于50℃真空烘干。得到¹⁵N-L-酪氨酸产品0.87克，丰度为10.03％，仅比原料绝对下降0.09％，相对下降0.9％，纯度大于98.5％。回收得到¹⁵N-L-天冬氨酸0.22克，收率为81.9％。

实施例2

取与实施例1一样培养的湿菌体悬浮液，加入到底物浓度为0.8％，含丰度为99.06％的¹⁵N-L-天冬氨酸0.50％、硫酸锰0.02％的底物溶液400ml中，用NaOH调节pH值为8.5，于37℃恒温反应24小时。得到的反应液经离心，上清液用乙酸乙酯等体积萃取，水相赶酯浓缩后上柱，水洗后用0.25M的NH₄Cl洗脱，分别收集¹⁵N-L-天冬氨酸和¹⁵N-L-酪氨酸单斑，浓缩后再上柱除盐，洗脱得到各自的洗脱液。经赶氨浓缩，活性炭脱色后，用乙醇和水进行结晶。结晶液冷至室温后，放冰箱冷藏过夜，第二天抽滤得白色晶体，洗涤、抽干，将晶体刮入容器内，于60℃真空烘干。得到¹⁵N-L-酪氨酸产品1.42克，丰度为98.43％，比原料绝对下降0.63％，纯度大于98.5％，收率为80.7％，回收得到¹⁵N-L-天冬氨酸0.71克。

实施例3

一种采用化学-酶法制备¹⁵N-L-酪氨酸的方法，该方法步骤如下：

(1)菌体细胞的制备：称取葡萄糖18g，蛋白胨12.0g，牛肉膏3.0g，磷酸二氢钾0.8g，调节pH至7.0，用蒸馏水定容至1.0L，分装，0.1MPa(121℃)灭菌20分钟，菌种接入后于转速150rpm，32℃培养16小时，所得发酵液离心得湿菌体，经生理盐水洗涤离心后加入浓度为1mmol/L的磷酸吡哆醛溶液活化1小时，得菌体悬浮液备用；

(2)酶反应：在浓度为0.2％的4-羟基苯丙酮酸中，加入0.01％的金属离子Mn⁺及0.1％的¹⁵N-L-天冬氨酸后，调节pH值为7.5，配成底物反应液，将步骤(1)中所得菌体悬浮液加入该底物反应液中，使菌体加入量0.5％，在30℃下，反应20小时，转速110rpm；

(3)提取精制及¹⁵N的回收：将步骤(2)中反应结束后的酶反应液调pH至1～3后进行离心，上清液用乙酸乙脂等体积萃取3次，所得水相于旋转蒸发仪上赶酯浓缩，直至蒸干，然后加水溶解至体积为200ml，上732树脂柱，水洗后用0.05M的NH₄Cl洗脱，分别收集¹⁵N-L-天冬氨酸和¹⁵N-L-酪氨酸单斑，浓缩后再上柱除盐，洗脱得到各自的洗脱液，经赶氨浓缩，活性炭脱色后，用乙醇和水进行结晶，结晶液冷至室温后，放冰箱冷藏过夜，第二天抽滤得白色晶体，洗涤、抽干，将晶体刮入容器内，于50℃真空烘干，对产品进行纯度、丰度检测，最终得到纯度大于98.5％的¹⁵N-L-酪氨酸产品及回收到0.25g的¹⁵N-L-天冬氨酸。

实施例4

一种采用化学-酶法制备¹⁵N-L-酪氨酸的方法，该方法步骤如下：

(1)菌体细胞的制备：称取葡萄糖21g、玉米浆10g、硫酸镁0.6g，磷酸二氢钾1.2g，加蒸馏水配置成发酵培养基，定容至1L，分装，在0.1Mpa下灭菌20分钟，接入菌种后于转速180rpm，35℃，培养20小时，所得发酵液离心得湿菌体，经生理盐水洗涤离心后加入浓度为1mmol/L的磷酸吡哆醛溶液活化2小时，得菌体悬浮液备用；

(2)酶反应：在浓度为1％的4-羟基苯丙酮酸中，加入0.01％的金属离子及0.6％的¹⁵N氮源¹⁵N-L-天冬氨酸后，调节pH值为7.8，配成底物反应液，将步骤(1)中所得菌体悬浮液加入该底物反应液中，使菌体加入量1％。在35℃下，反应28小时，转速150rpm；

(3)提取精制及¹⁵N的回收：将步骤(2)中反应结束后的酶反应液调pH至3后进行离心，上清液用乙酸乙脂等体积萃取3次，所得水相于旋转蒸发仪上赶酯浓缩，直至蒸干，然后加水溶解至体积为300ml，上732树脂柱，水洗后用0.40M的NH₄Cl洗脱，分别收集¹⁵N-L-天冬氨酸和¹⁵N-L-酪氨酸单斑，浓缩后再上柱除盐，洗脱得到各自的洗脱液，经赶氨浓缩，活性炭脱色后，用乙醇和水进行结晶，结晶液冷至室温后，放冰箱冷藏过夜，第二天抽滤得白色晶体，洗涤、抽干，将晶体刮入容器内，于60℃真空烘干，对产品进行纯度、丰度检测，最终得到纯度＞98.5％¹⁵N-L-酪氨酸产品及回收0.20g的¹⁵N-L-天冬氨酸。

实施例5

一种采用化学-酶法制备¹⁵N-L-酪氨酸的方法，该方法步骤如下：

(1)菌体细胞的制备：称取果糖25g、玉米浆3g，醋酸铵15g、硫酸镁0.5g，磷酸一氢钾0.8g，加蒸馏水配置成发酵培养基，定容至1L，分装，在0.1Mpa下灭菌20分钟，接入菌种后于转速260rpm，40℃，培养24小时，所得发酵液离心得湿菌体，经生理盐水洗涤离心后加入浓度为5mmol/L的磷酸吡哆醛溶液活化3小时，得菌体悬浮液备用；

(2)酶反应：在浓度为5％的底物4-羟基苯丙酮酸中，加入0.05％的金属离子Fe²⁺及2％的¹⁵N氮源¹⁵N-L-谷氨酸后，调节pH值为8.2，配成底物反应液，将步骤(1)中所得菌体悬浮液加入该底物反应液中，使菌体加入量2.5％，在50℃下，反应28小时，转速150rpm；

(3)提取精制及¹⁵N的回收：将步骤(2)中反应结束后的酶反应液调pH至3后进行离心，上清液用乙酸乙脂等体积萃取3次，所得水相于旋转蒸发仪上赶酯浓缩，直至蒸干，然后加水溶解至体积为200ml，上732树脂柱，水洗后用0.40M的NH₄Cl洗脱，分别收集¹⁵N-L-谷氨酸和¹⁵N-L-酪氨酸单斑，浓缩后再上柱除盐，洗脱得到各自的洗脱液，经赶氨浓缩，活性炭脱色后，用乙醇和水进行结晶，结晶液冷至室温后，放冰箱冷藏过夜，第二天抽滤得白色晶体，洗涤、抽干，将晶体刮入容器内，于50℃真空烘干，对产品进行纯度、丰度检测，纯度＜98.5％可再行重结晶，最终得到¹⁵N-L-酪氨酸产品及回收的¹⁵N-L-谷氨酸。

Claims (10)

1.一种采用化学一酶法制备¹⁵N-L-酪氨酸的方法，其特征在于，该方法包括以下工艺步骤：

(1)菌体细胞的制备

a)发酵产酶所采用的微生物包括大肠杆菌(Escherichia coli)、弗氏柠檬酸细菌(Citrobacter frevndii)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)；

b)斜面培养：

培养基为营养肉汁琼脂培养基(g/L)：蛋白胨10.0，牛肉膏3.0，氯化钠5.0，琼脂15.0，蒸馏水1.0L，pH7.0，定容至1.0L，分装，0.1MPa、121℃灭菌20分钟，菌种接入后28℃～32℃培养16～24小时；

c)发酵培养：

以碳源、氮源、无机物配置成发酵培养基，调节其pH值6～9，灭菌后接入斜面种子，于150～260rpm，32℃～40℃，培养16～24小时；

装液量为50ml/500ml，灭菌条件为0.1MPa，121℃，20分钟；

d)发酵液离心得湿菌体，经生理盐水洗涤离心后加入磷酸吡哆醛溶液活化1～3小时，备用；

(2)酶反应

底物反应液：底物4-羟基苯丙酮酸的浓度为0.2％～5％，加入金属离子及¹⁵N氮源后用氨水或NaOH调节pH值为7.5～8.5；

将上述处理所得游离整体细胞作为酶源加入底物溶液中，菌体加入量0.5％～2.5％，在30℃～45℃下反应20～28小时，转速110～150rpm；

(3)提取精制及¹⁵N的回收

反应结束后，将酶反应液调pH至1～3后进行离心，上清液用乙酸乙酯等体积萃取3次，所得水相于旋转蒸发仪上赶酯浓缩，直至蒸干；然后加水溶解至体积为200～300ml，上732树脂柱，水洗后用0.05M～0.40M的NH₄Cl洗脱，分别收集¹⁵N-L-酪氨酸和¹⁵N-L-天冬氨酸或¹⁵N-L-谷氨酸单斑，浓缩后再上柱除盐，洗脱得到各自的洗脱液；经赶氨浓缩，活性炭脱色后，用乙醇和水进行结晶；结晶液冷至室温后，放冰箱冷藏过夜，第二天抽滤得白色晶体，洗涤、抽干，将晶体刮入容器内，于50℃～60℃真空烘干；对产品进行纯度、丰度检测，纯度＜98.5％可再行重结晶，最终得到¹⁵N-L-酪氨酸产品及回收的¹⁵N-L-天冬氨酸或¹⁵N-L-谷氨酸。

2.根据权利要求1所述的一种采用化学-酶法制备¹⁵N-L-酪氨酸的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的微生物为能产天冬氨酸转氨酶的菌类。

3.根据权利要求1所述的一种采用化学-酶法制备¹⁵N-L-酪氨酸的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的菌包括ATCC8739、ATCC11303、ATCC950。

4.根据权利要求1所述的一种采用化学-酶法制备¹⁵N-L-酪氨酸的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的碳源包括葡萄糖、果糖、蔗糖、含这些糖的糖蜜、淀粉；所述的氮源包括氯化铵、硫酸铵、醋酸铵、磷酸铵、氨水，无机物以及酵母提取物、玉米浆、蛋白胨、牛肉膏的一种或多种；所述的无机物包括磷酸一氢钾、磷酸二氢钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸锰、硫酸铜的一种或多种。

5.根据权利要求1所述的一种采用化学-酶法制备¹⁵N-L-酪氨酸的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的发酵培养条件：pH值最好是6.5～8.5，转速最好是以180～220rpm，温度优选35℃～39℃。

6.根据权利要求1所述的一种采用化学-酶法制备¹⁵N-L-酪氨酸的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的磷酸吡哆醛溶液的浓度为1mmol/L～5mmol/L。

7.根据权利要求1所述的一种采用化学-酶法制备¹⁵N-L-酪氨酸的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的底物为4-羟基苯丙酮酸，底物溶液中所用的¹⁵N氮源为¹⁵N-L-天冬氨酸或¹⁵N-L-谷氨酸，作为氨基供体。

8.根据权利要求1所述的一种采用化学-酶法制备¹⁵N-L-酪氨酸的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的金属离子包括Mn²⁺、Fe²⁺、Zn²⁺、Co²⁺的一种或多种，浓度为1～5mmol/L。

9.根据权利要求1所述的一种采用化学-酶法制备¹⁵N-L-酪氨酸的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的底物4-羟基苯丙酮酸的浓度以1％～3％为较佳。

10.根据权利要求1所述的一种采用化学-酶法制备¹⁵N-L-酪氨酸的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的酶反应温度为35℃～40℃较佳。