CN101193666A - 用于外科植入和引导细胞之组织培养表面的生物相容性材料 - Google Patents

Abstract

一种生物相容性材料，其中该生物相容性材料的至少一部分表面的特征在于包含多种特征的微米或纳米尺度形态结构，其中选择该结构以促进在细胞或组织培养中体内或离体的预定细胞功能。

Description

用于外科植入和引导细胞之组织培养表面的生物相容性材料

技术领域

本发明提供具有影响细胞功能的表面结构和组成的生物相容性材料，所述细胞功能尤其是涉及骨细胞矿化和骨组织形成、胚胎干细胞的分化尤其是神经元分化、和/或胚胎干细胞尤其是未分化胚胎干细胞的生长的细胞功能。

背景技术

促进选定的细胞功能在多种应用中是一项重要任务，比如开发合适植入物，生产未分化干细胞和/或等等。活细胞可以在其上附着、生长和/或分化和/或还执行多种生物学功能的生物相容性材料被期望用于各种治疗目的。

肌肉骨骼器官的退行性疾病、癌症和创伤给公众健康构成日益增加的问题。仅脊椎疾病就影响了30％的成年人口，而年纪大于65岁的人中有40％有骨关节炎的症状。全世界每年进行超过130万例关节异体移植术(alloplasty)来治疗衰弱的末期关节炎。由于没有预防骨关节炎的可接受疗法，因此，由于西方人口的老化，可预料实施关节成形术将在接下来的数十年内显著增加。现在，欧洲和美国超过25％的全部保健费用涉及肌肉骨骼病，并且美国治疗这些疾病的预算(2540亿美元)例如是研究和教学所用资源之和的二倍。

这些疾病的主要外科手术治疗依靠与骨或骨替代物协同使用的金属医用植入物。这些植入物必须能够成功整合入骨组织中以获得良好的临床效果。过去几十年该领域内取得了重要的进展和成果，但是长时间以后植入物松动对于成功的长期关节置换仍然是一个严重的问题。目前的植入物表面不能桥接较大的骨缺损并单独维持长期的稳定性。使用取自患者自身的骨移植物来解决这些问题之后是高达15-30％的供体部位发病率。20％经历过髋关节置换术的患者在首次外科手术之后10～15年内在假体周围发生骨丧失，而且，在脊椎融合术中20-30％的患者融合较差。此外，由于在不久的将来患者群体将包括大量年纪较轻的患者，因此关于长期无菌性植入物松动的问题预计将显著增加。

因此，骨组织内植入物性能的改善将对生活质量和经济方面产生巨大的影响。WHO已经通过指定2000～2010年为“骨和关节的10年”认可了这点(http://www.bonejointdecade.org/)，它也是由丹麦卫生部批准的提案。

植入物在体内的生物相容性/生物整合极为复杂，其涉及传统上属于医学科学、表面科学、材料科学和分子生物技术的过程。当植入物放入组织内时，争夺表面的竞争立刻开始。在植入物插入体内的若干毫秒内，由生理液体中水、蛋白质和其它生物分子构成的生物层就在植入物的表面形成。然后，由于生物层中细胞因子和生长因子的刺激，周围组织的细胞迁移到植入物周围的区域。因此，植入物表面和细胞之间的相互作用通过该生物层调节。植入物表面的性质强烈影响该层的性质，并且这种影响需要被理解和控制以优化生物相容性。同样重要的是细胞的性质，例如它们经由信号分子穿过细胞外基质通信的能力。在骨愈合期间，许多生物活性的信号分子控制骨生成，而一些蛋白质已经显示出刺激骨向植入物愈合的能力。所有这些机制有助于组织对植入物的响应，并影响植入物是否以足够的机械强度固定在患者的骨内或是否出现对植入物的炎症反应，其将最终导致无菌性松动和手术失败。

骨组织细胞可以在其上附着和/或生长并且还执行各种生物学功能的生物相容性材料被需要用于治疗用途，尤其是涉及引入比如假体和骨替代物等植入物的外科治疗中。通过这种治疗获得成功的结果代表一种艰难的挑战，因为植入物需要允许植入部位的组织再生，同时避免成为身体自身强大的排斥机制的标靶。植入物的临床成功取决于植入物和宿主组织之间界面的直接相邻处中的细胞行为。因此，该领域中所述过程中的关键要素在于在制造这些植入物中生物相容性材料的鉴别和使用。

骨组织包含许多细胞类型，其中包括骨祖细胞(osteoprogenitorcells)。骨髓基质细胞(MSC)是产生骨祖细胞和其它细胞类型的多能干细胞。骨祖细胞能够分化并形成成骨细胞，尤其在响应骨再生时。由骨髓基质细胞产生的骨建模蛋白(bone modeling proteins，BMP和其它生长激素)用来募集骨祖细胞，并刺激它们成熟为成骨细胞。成骨细胞分泌例如TGF-beta BMP′s、其它激素和生长因子等，其充当骨祖细胞的趋化引诱剂，刺激成骨细胞的成熟并诱导骨基质的形成。成骨细胞合成并分泌有机骨基质(例如胶原纤维、蛋白聚糖、骨钙素osteocalcin、骨连接蛋白osteonectin和骨桥蛋白osteopontin)，因此，成骨细胞对矿化骨基质的沉积起关键作用。

在骨矿化期间，成骨细胞表达碱性磷酸酶，以及很多种细胞因子和生长激素。

在寻找可用于假体和之后用于骨组织再生支架的新材料中，美国专利US 5,282,861描述了渗有钽的网状开孔泡沫碳。已经表明涂布钽的植入物支持牙齿和矫形应用中的骨内向生长。Price等(J Biomed MatterRes 70：129-138，2004)报道了成骨细胞在直径较小的纳米相碳纤维上的选择性粘附，而没有观察到纤维表面能的影响。US 6,767,928公开了在2D和3D水平图案化(patterning)生物材料的方法，其可用于生产3维或成形(contoured)的生物植入物，以及用于细胞或组织培养。现在具有改善的生物相容性材料的持续开发中，仍然需要鉴别其结构与植入外科手术相容并诱导骨再生的材料。

瑞典专利号SE 511863公开了具有微结构化(microtextured)表面的尤其用于骨组织的植入物。该植入物的表面通过高速旋转植入物并同时光照所涂的光刻胶层而形成。这种方法产生分布在其表面上的多个间隔开的凹陷。

美国专利号6,419,491公开了牙齿植入物，其包括具有形式为交替的脊和槽或凹陷的有序微几何状重复表面图案的颈圈(collar)部分。

然而，上述现有技术没有解决鉴别能促进选定细胞功能的特异性结构的问题，只是证明了在表面中制造不同尺寸的孔的方法。

此外，近年来，胚胎干细胞的治疗应用已经吸引了相当多的注意，而且已经引发日益增长的对有效生长神经元和未分化胚胎干细胞以及引导、控制胚胎干细胞分化的需求。因此，期望得到辅助/促进这些方法的合适的微环境。

发明内容

体内或细胞培养中的单个细胞在微米或纳米结构水平看待其周围组织或组织培养的表面构造，基于这种认识，上述和其它需求可通过提供具有微尺度特征的确定表面形态的生物相容性材料或结构来解决，所述材料或结构可用于构建细胞或组织培养表面和/或用于外科/治疗处理的植入物和装置。

这些细胞的实例为形成骨的细胞。术语形成骨的细胞是指能够形成骨的任何种类的细胞，其包括天然存在的细胞类型和/或修饰的细胞类型，例如通过基因技术修饰的细胞类型。其它的实例包括胚胎干细胞和神经元。

制造具有期望表面形态(可以完全是人工的或可以模拟自然中观察的表面结构)的结构要求能够定义微米级或纳米级尺寸特征的技术。本发明采用目前在微米和纳米技术中开发的工具和技术，其允许设计和建造其表面结构可以具有小到约6nm的侧向特征尺寸的结构。这种特征尺寸可以通过例如铁蛋白的胶体光刻(lithography)和随后除去有机相并留下离子点来实现。特别地，使用电子束光刻(e-beam lithography)和光刻法(photolithography)允许制造精确限定的并能够在相关用途中精确再现的表面形态。

特别地，已经证明，当这种生物相容性材料的至少一部分表面的特点在于包含多种特征的微米级形态结构并且其中所述特征中任一个的至少一个侧向尺寸在约0.1μm和约10μm之间时，各种不同细胞类型中至少一种细胞的多项细胞功能显著提高。

例如，对于骨植入物来说，已经证明不同的结构类型对形成骨的细胞的矿化以及胚胎干细胞的分化具有显著不同的影响。

特别地，已经发现从表面伸出的间隔开的突起的规则图案对促进上述的细胞功能特别有效。

一方面，已经发现突起的尺寸和特征之间间隙的尺寸是相关参数。特别地，每个突起所具有截面的最小截面直径不大于并且优选小于2μm，优选在0.1μm和2μm之间，更优选在0.5μm和2μm之间，例如在0.1μm和1.5μm之间或0.5μm和1.5μm之间。此外，当所述突起位于二维规则网格的网格点上，其中沿至少一维的相邻网格点之间的距离不大于7μm，例如小于4μm，例如在0.1μm和4μm之间，优选在0.5μm和3.5μm之间，例如在1μm和3μm之间时，已经发现对矿化和其它细胞功能的促进尤其有效。已经发现一组结构尤其有效，其中每个突起所具有的最小和最大截面直径在1μm和2μm之间且中心到中心的距离在3μm和8μm之间。

除特征尺寸外，还已经证明很多类型的结构图案特别有利于促进矿化和胚胎干细胞分化的不同方面。

在一个实施方案中，所述结构包括具有不同截面几何形状的突起，例如圆状突起(例如圆形或卵形)和具有包括角的形状的突起，例如多边形、三角形、矩形、正方形、六边形、星形、平行四边形等。特别地，当横截面几何形状不同的突起以交替模式例如交替的行排布在规则的二维网格上时，已经发现对矿化的促进尤其有效。同样地，当结构包含不同横截面区域的突起，尤其是当该突起以规则图案排布时，已经获得良好的结果。已经发现提供良好矿化的这种图案之一类似于鲨鱼皮，其将在此被更为详细地描述。

已经提供良好结果的另一种结构类型是这样的结构，其中突起位于二维规则网格的格点上，使得只有格点的一部分被突起覆盖，即一些格点不被突起覆盖。当规则网格为六边形网格时已经观察到类似的有利效果。特别地，当突起以平行的行排布且其中相邻突起之间的中心到中心的距离在相邻行中不同时，已经获得了良好的效果。当每若干行中相邻突起之间的中心到中心距离是相应的相邻行中相应距离的整数倍时，形成由突起包围的平坦区域。特别地，当中心到中心距离较大的行中的突起与相邻行的突起之间的相应中心排成直线，以便将该突起放置在六边形的角上时，这些区域具有六边形，其进而已经证实是尤其有利的。

对于人或动物胚胎干细胞来说，还已经证实，当这种生物相容性材料的至少一部分表面的特点是包含多种特征的微米级形态结构，其中任一种所述特征的至少一个侧向尺寸在约0.1μm和约10μm之间，尤其是0.5μm和约2μm之间时，若将细胞和该表面接触，则对未分化胚胎干细胞生长的促进显著改善。当该特征以相邻/最邻近特征之间最小间隙尺寸在约2μm和约6μm之间的规则图案排布时，这种改善尤其显著。

已经证明，当所述结构包含按此处所述类似鲨鱼皮的规则图案排布的多个长形脊时，当细胞接触该表面时，改善了对胚胎干细胞分化的促进。

同样地，对于胚胎干细胞的分化来说，还已经证实，当这种生物相容性材料的至少一部分表面的特点是包含多种特征的微米级形态结构，其中任一种所述特征的至少一个侧向尺寸在约0.1μm和约10μm之间，尤其是0.5μm和约2μm之间时，细胞和该表面接触时对胚胎干细胞的神经元分化的促进显著改善，尤其是当细胞经受补充有神经元生长因子和化合物的培养基时如此。当该特征以相邻/最邻近特征之间最小间隙尺寸在约2μm和约6μm之间的规则图案排布时，这种改善尤其显著。此外，当该特征包含规则排布的突起以产生多个突起各自被排布为包围没有突起的相应平面区域(即表面区域相对于突起的顶面是凹陷的区域)时，这种改善尤为显著。当特征/突起规则排布在交替的行中，其中相邻行的特征被排布为具有不同的节距(pitch distance)，例如使得一行中的节距为相邻行中节距的整数倍和/或相对于彼此移位时，可以提供这种图案。优选地，至少一些突起具有基本上是圆状的截面，例如环状截面。

甚至还有，已经证实，当这种生物相容性材料的至少一部分表面的特点是包含多种特征的微米级形态结构，其中任一种所述特征的至少一个侧向尺寸在约0.1μm和约10μm之间，尤其是1μm和约10μm之间时，细胞和该表面接触时促进神经突从初级神经元细胞沿限定方向长出(outgrowth)。当该特征以相邻/最邻近特征之间最小间隙尺寸在约2μm和约6μm之间的规则图案排布时，这种改善尤其显著。

根据各方面，本发明提供了一种生物材料，或一种医用植入物或生物相容性涂层，其用于制造包含这种生物相容性材料的植入物。该生物材料具有暴露的表面，其中该表面具有包含沿一个或多个侧向的微尺度特征的形态结构。限定本发明生物相容性材料之形态的参数是这样的，其增强附着到其表面的形成骨的细胞的矿化并支持有助于矿化的生物相互作用。

根据另一些方面，本发明提供一种用于培养组织或细胞的装置，例如组织培养皿或瓶或能容纳细胞的其它任何表面，该装置包含用于接纳组织或细胞培养物的暴露表面，其中所述表面具有包含此处所述微米或纳米尺度特征的形态结构，选择所述特征以支持神经元或胚胎干细胞的生长和/或分化，例如处于未分化状态的胚胎干细胞的生长。另一些方面涉及用于生产这些装置的方法和工具，例如包含这些结构的印模(stamp)或这些结构的蓝图，其将用于例如热模压和/或注射成型用于生产包括所述结构的生物相容性材料。

附图说明

下面将结合实施方案并参照附图以更为充分地解释本发明，其中：

图1显示筛选工具的一个实施例的顶视图—所谓的生物表面结构阵列(BioSurface Structure Array，BSSA)晶片(wafer)—用于鉴定促进/增强细胞功能比如骨形成细胞的矿化或者胚胎干细胞或神经元的生长/分化的形态结构(topographical structures)。

图2显示图1中筛选工具沿A-B线的截面视图。

图3显示筛选工具另一个实施例的顶视图。

图4显示包含交替的宽度为X(μm)的槽和宽度为Y(μm)的脊的形态结构的顶视图(图4a)和截面视图(图4b)。

图5显示包含方孔和预定节距的形态结构的顶视图(图5a)和截面视图(图5b)。

图6显示包含由宽为Xμm的脊隔开的尺寸为X(μm)×Y(μm)的矩形孔的形态结构的顶视图(图6a)和截面视图(图6b、c)。

图7显示包含具有预定尺寸和预定节距的柱的形态结构的顶视图(图7a)和截面视图(图7b)。

图8显示包含交替的方孔和柱的形态结构的顶视图。

图9显示在玻璃(a)和在BSSA晶片的参考表面(b)上培养的MC3T3细胞。已经通过罗丹明标记的鬼笔环肽染色显示肌动蛋白纤维。

图10显示在具有“D2/4”表面结构的测试区域上培养的MC3T3细胞。已经通过罗丹明标记的鬼笔环肽染色显示肌动蛋白纤维。

图11显示在具有“D2/10”表面结构的测试区域上培养的MC3T3细胞。已经通过罗丹明标记的鬼笔环肽染色显示肌动蛋白纤维。

图12显示用于胚胎干细胞或神经元的矿化和/或生长/分化的形态结构之实例的示意性顶视图。

图13显示促进矿化的形态结构的实例。

图14举例说明与矿化诱导基因联合应用的基因诱导测试的实例。

图15显示用于绵羊中骨形成测试的样品保持器。

图16显示BSSA晶片局部视图的两个实施例，其显示出四个测试方块的一些部分。

图17显示实验结果，其说明与对照结构相比选定结构如何增加细胞培养中特征性胚胎干细胞集落的数目。

图18显示实验结果，其说明与对照结构相比类似鲨鱼皮的选定结构如何指导分化。

图19显示定量结果，其说明与对照结构相比选定尺寸范围内的结构如何增加细胞培养中特征性胚胎干细胞集落的数目。

图20显示定量结果，其说明与对照结构相比一些选定结构如何增加细胞培养中特征性胚胎干细胞集落的数目。

图21显示定量结果，其说明一些结构在胚胎干细胞集落的表型外观方面如何增强胚胎干细胞集落的质量，而另一些结构如何引导胚胎干细胞沿分化通路继续进行。

图22～26显示被允许在对照结构以及各种形态结构上在B27培养基中分化14天、固定并用抗β-微管蛋白III的抗体(神经元标志物，红色)和DAPI(给细胞核染色，蓝色)染色的细胞的照片。

图27显示定量结果，其说明不同结构上神经元分化的程度。

图28显示定量结果，其说明不同尺寸结构上神经元分化的程度。

图29显示不同结构上用抗-β-微管蛋白III抗体染色的原代神经元培养物的照片。

图30示意性显示具有微尺度结构的暴露表面的组织培养皿的截面图。

具体实施方式

一般期望植入物成功并入骨组织中，以便获得良好的临床结果。过去几十年该领域内已经取得了主要的进展和成果，但是植入物随时间而松弛对于成功的长期关节置换术一直是一个严重的问题。具有能促进骨形成细胞之矿化的表面的植入物或装置可以基于其使用而改善治疗的效果。因此，本发明提供一种生物相容性材料或结构，其支持骨形成细胞(包括成骨细胞)的矿化作用。

整形植入物具有有限的寿命，其中植入物和骨组织之间的粘附性差可能导致植入物的错位。因此，本发明还提供一种植入表面，其支持骨形成细胞的矿化，从而提高该植入物的生物相容性。

此外，在不同的应用例如治疗应用中，期望生产特异性细胞类型，例如用于细胞替代疗法治疗帕金森病的多巴胺能神经元。与之相似，对于例如药物筛选目的，期望控制特定细胞类型均一群体的重复性、质量及其量，以便能实现/促进潜在新药的大规模筛选和测试。

在一些应用中，期望生长大量未分化的胚胎干细胞，然后诱导胚胎干细胞分化成期望的细胞类型。一旦分化成特殊的细胞类型，这些特殊细胞类型可用于很多不同应用，例如药物筛选、细胞替代治疗、糖尿病、软骨损伤等。

本发明基于这种认识，即指导矿化、生长和/或分化的细胞功能受细胞微环境的强烈影响。因此认为，体内骨细胞的矿化、神经元或未分化胚胎干细胞的生长及其随后的分化可依赖于提供细胞可粘附其上的合适结构。特别地，本发明认识到，细胞微环境中表面的2-和3-维结构或形态是上述过程的关键因素。具有极大量的不同可能的微环境。因此本发明在一方面涉及提供一种生物相容性材料，其表面形态形成可以增强矿化并导致植入物更好地整合入其余骨中的特殊微环境。可以受表面形态影响的其它细胞功能包括细胞的生长、扩增、分离、迁移、分化、去分化、细胞内或细胞间组织结构等。由于蛋白质和细胞的尺寸为从纳米到微米的范围，因此对于提供生物形容性材料的问题，这些是相关的长度水平。

I.证明本发明生物相容性材料的生物相容性及其对细胞功能的促进，例如对矿化的促进作用的方法。

通过利用提供不同候选表面结构的筛选工具/测试来筛选具有不同表面形态的材料可以鉴定本发明的生物相容性材料或结构。

特别地，矿化测试，利用例如茜素红染色(实施例2、3)、von Kossa染色(von Kossa，J(1901)：″Ueber die im Organismus kuenstlicherzeugbaren Verkalkungen.″Beitr Pathol Anat AIIg Pathol 29：163-202)，异位骨形成(实施例5)和体内骨形成/骨内生(实施例6)提供了用于证明本发明生物相容性材料的性质和用于选择促进矿化的合适形态结构的工具。

适用于所述筛选形态结构的筛选工具的实例包括所谓的生物表面结构阵列(BSSA)晶片。图1显示了这种生物表面结构阵列晶片的一个实例的顶视图。BSSA晶片1包含60个测试区域。许多测试区域2保持“空白”，即它们未被加工为具有结构化的表面。因此，测试区2的表面基本是平的。因此，对照实验被内在地包括在每个使用BSSA筛选工具的平行筛选测试中。被指定为S1、S2...S54的其余测试区域包含此处所述的各自结构化的表面。这些测试区为尺寸为10mm×10mm的正方形。

可以通过许多生产技术制造用作筛选工具来鉴定诱导/增强细胞功能例如矿化、生长和分化的结构的晶片。

用于其制造的方法的实例包括本领域公知的下列技术中的一种或多种：

·光刻方法：光刻是一种已知的方法，其中几何形状/图案从光掩膜转移至待结构化的表面，如晶片的表面。具有最小侧向特征尺寸在约1微米至100纳米以下范围的光刻设备是已知的。例如下文中描述了光刻工艺：

S.M.Sze：Semiconductor Devices，Physics and Technology，2nd Edition，John Wiley & Sons 2002，Chapter 12：Lithography and Etching；和Plummer，Deal，Griffin：Silicon VLSI Technology，Fundamentals，Practice，and Modeling，Prentice Hall 2000，Chapter 5：Lithography。

·电子束光刻：原则上，电子束光刻可以按光刻中使用光的完全相同的方式进行光刻胶的曝光。电子束光刻具有可达约5纳米的特别高的分辨率。

·热压印：热压印使用原模(master stamp)在聚合物基底上压印微米和纳米尺度的结构。该方法允许使用广泛的聚合物材料，利用原模生产许多完全图案化的基底。热压印技术提供了一种低成本、高多样性的制造方法，可很好地适用于从研发应用到大规模生产中所用BSSA的制造。极高度均匀的高深宽比可以在大尺寸晶片(如8英寸或12英寸晶片)上的微米和纳米尺度结构中实现。尺寸在20纳米以下的特征是可能的。原模可以通过如电子束光刻等技术制造。

·其他涉及所述生物相容性材料或结构生产的生产步骤或工艺的实例包括纳米压印光刻(nano imprint lithography)、激光烧蚀(laser ablation)、化学蚀刻(chemical etching)、等离子喷涂、磨料喷射(abrasive blasting)、雕刻、刻划、或微加工(micro machining)等。

图2显示图1中晶片的截面图。图2a显示该晶片沿A-B线的整个宽度上的截面图。图2b显示其中一个测试区域之表面一部分的放大图。晶片1具有层状结构，其包括图案化的基底层21例如硅层，以及表面层23。晶片表面被图案化，例如通过光刻工艺来图案化，以在各测试区域S1、S2，...，S54的表面上分别提供不同的图案。该结构的深度/高度为H。在光刻过程中，高度H可通过蚀刻过程来控制。图案化的表面覆盖有二氧化硅薄层22，和/或不同生物相容材料的表面层23，所述生物相容材料例如钽或任何其他金属、金属氧化物、金属氮化物、金属碳化物、金刚石、金刚石样碳、半导体、半导体氧化物/氮化物、绝缘体、聚合物、共聚物。测试区域之间有没有结构的“空白”边界区域，即边界区域没有加工为具有结构化的表面。在此情况下，空白边界区域的宽度为0.3mm。空白边界线辅助视觉对准和识别所述结构。所述空白边界还用作与每个测试方块相邻的小对照表面。

应当注意的是，图2是示意图而未按比例绘制。具体来说，为了改善可读性，竖向尺度可能被夸大。

II.本发明生物相容性材料的化学组成

生物相容性材料或结构的实施方案可以采取各种形式，比如

-医用植入物或用于制造医用植入物的生物相容性涂料，

-具有暴露给细胞培养的表面的组织培养皿/瓶，其中所述暴露表面具有支持例如神经元或未分化状态下胚胎干细胞的生长或分化等期望细胞功能的结构，

-组织培养表面或例如组织培养塑料，其已经被修饰为在其表面上显示这些结构或这些结构的蓝图。在这方面，组织培养塑料意思是可用于生产能够用于体外细胞培养中细胞生长的表面的任何聚合物。

生物相容性材料或结构的实施方案可以包含基底层和任选地表面层。

适于制备生物相容性材料或结构的基底材料包括任何半导体(掺杂或未掺杂)、单种金属、金属氧化物、金属氮化物、合金、陶瓷、聚合物、共聚物、复合材料、药物递送系统、具有生物活性分子的聚合物、其它生物活性化合物或其任意组合。

在本发明的实施方案中，表面层包含其生物相容性足以增强骨形成细胞矿化的材料。表面层的实例包括表面金属沉积，例如钽、钛、Ti-Al-V合金、金、铬、金属氧化物、半导体氧化物、金属氮化物、半导体氮化物、聚合物、生物聚合物或其它合金。用于植入物的优选表面组成包括钽或钛。

在一些实施方案中，生物相容性材料或结构还包含可以沉积或吸附到所述材料或结构的暴露表面或表面层上的其它组分，例如一种或多种生物活性化合物。例如，所述化合物可以选自抗体、抗原、糖蛋白、脂蛋白、DNA、RNA、多糖、脂质、生长激素、有机化合物和无机化合物。优选地，选自BMP、类EGF、TGF-β的生长激素被吸附或结合到生物相容性材料的表面。

III.本发明生物相容性材料的结构性质

生物相容性材料或结构(其可以采用上述各种形式)的全部或部分表面在所述材料或结构表面所限定的平面内包含一维或多维的微米尺度特征。此处所用的术语微尺度和微米尺度指的是约1μm至约1000μm的长度尺度。此处所用的术语纳米尺度指的是约1nm至约1000nm尤其是约1nm至约100nm的长度尺度。

在本发明的一些实施方案中，所述特征是结构/形态特征，如从生物相容性材料表面伸出的突起。

在本发明的一些实施方案中，微米尺度特征在至少一个方向上具有侧向尺寸，其中所述尺寸选自下列区间之一：约1μm和约20μm之间；约1～10μm之间；约10～20μm之间，约1μm～2μm之间，约2μm～4μm之间，约4μm～6μm之间，约6μm～8μm之间，约8μm～10μm之间；约10～12μm之间；约12～14μm之间；约14～16μm之间；约16～18μm之间；约18～20μm之间。优选至少一个侧向尺寸为1μm～6μm之间。因此，在本发明的一些实施方案中，从特征的截面区内任一给定点到截面区边缘的最短距离为小于20μm，小于10μm，小于8μm，小于6μm，小于4μm，例如小于2μm。

所述侧向尺寸沿基本平行于所述表面或至少基本与所述表面相切的方向测量。

任何微米尺度特征和其最近相邻特征之间的最大距离或间隙在至少一个侧向上具有侧向尺寸，其中所述尺寸选自下列区间之一：约0.5μm～1μm之间，约1μm～2μm之间，约2μm～4μm之间，约4μm～6μm之间，约6μm～8μm之间，约8μm～10μm之间，约10μm～12μm之间，约12μm～14μm之间，约14μm～16μm之间。优选所述侧向尺寸为1μm～12μm之间。微米尺度特征在生物相容性材料表面的布置优选沿一个或多个侧向是周期性的，并可以通过具有选自下列区间之一的侧向节距(pitch)尺寸的周期函数来描述：约1μm～2μm之间，约2μm～4μm之间，约4μm～6μm之间，约6μm～10μm之间，约10μm～16μm之间，约16μm～20μm之间，约20μm～24μm之间。优选节距尺寸为2μm～12μm之间。

所述微米尺度特征的周期函数可以沿一个方向具有较小周期和沿另一个方向具有较大周期，例如大2、3、10倍或更大的周期。生物相容性材料表面的任一种微米尺度特征可以被定义为周期性结构的一个周期。因此，周期性结构特征的侧向尺寸可以被定义为周期性形状/函数的周期，即该结构重复其形状的最短间隔的长度。

微米尺度特征的深度/高度，即它们在从生物相容性材料表面突出的方向上的线性尺寸可以是纳米或微米尺度，即该结构可以具有1nm～10μm的高度/深度，或者其高度/深度选择下列区间的范围：约0.07μm～0.6μm之间，0.6μm～1.6μm之间，约1.6～3.0μm之间，约3μm～10μm之间。在一些实施方案中，该结构具有大于0.6μm、至少1.2μm、1.6μm、2.0μm、3.0μm、5.0μm、10μm的深度/高度，尽管更大的高度也是可能的，例如至少20μm、50μm、100μm或1000μm。在一些实施方案中，所有特征基本具有相同的高度，而在另一些实施方案中所述特征可以具有不同的高度。

任一种微米尺度特征的侧向截面优选为几何形状，如正方形、矩形、六边形、多边形或星形。所述特征的顶和/或侧面优选基本为平面。然而，微米尺度特征的表面也能够包括纳米尺度的特征以实现微米和纳米尺度的形态协同效应。这可以通过例如化学蚀刻(例如用NaOH或柠檬酸)、离子蚀刻、胶体平版印刷术(colloidal lithography)(例如用聚苯乙烯珠、巴基球或蛋白质)、切向入射物理气相沉积涂布、CVD涂布或等离子体喷涂等获得。生物相容性材料表面的特征可以具有相同或不同的形状。优选生物相容性材料表面的特征为几何(例如正方形、矩形、六边形、星形或多边形)形状。

在一些实施方案中，所述特征的截面形状可以来源于简单几何形状如正方形、或圆形等，例如通过修饰正方形的角获得。这些修饰的实例包括切除角或圆角处理。因此，这些形状一般地是正方形、或圆形等，但是它们与完美的正方形或圆形稍有变化，从而引入更多的角和/或修饰相交于每个角的边缘之间的角。

一般地，2维周期性结构可以通过具有预定形状如正方形、矩形、六边形等的表面之平面内的单元格子和定义单元格中详细结构的重复单元(基础)来定义，所述重复单元比如孔或突起，例如方形柱、多棱柱、圆柱、角锥体等。通过单元格所定义的位置来定义重复距离，而重复单元则定义预定的形状和尺寸。这些单元格的位置可以通过各自的2维向量来定义。因此，该网格结构由沿所述表面限定的二维尤其是沿单元格维度的各自倍数从单元格的平移而获得。在一个实施方案中，每个特征的中心位置可以通过向量v限定，v＝n₁v₁+n₂v₂，其中v₁和v₂是表面内线性无关的向量，而n₁和n₂是整数。

在一些实施方案中，每个特征的中心位于具有预定网格常数的2维网格如六边形、矩形或正方形网格的网格点上。

在一些实施方案中，所有特征覆盖这种网格的所有格点，而在另一些实施方案中，下方网格的网格点没有被全部覆盖。例如，在一些实施方案中，每隔一行的格点中，每隔一个格点可以被一个特征覆盖。还有另一些实施方案中，每隔一、二、三或更多行中，每隔一、二、三或更多个格点保持空白。

在一些实施方案中，所述形态结构可以包括多种不同特征，例如排以规则例如周期性图案排布的许多不同特征，例如二、三或更多种不同特征交替排布的行。这些图案的实例包括包含在交替行中排布具有正方形截面特征和具有圆形截面特征的结构。

在一些实施方案中，所述特征排成线和/或行。在一些实施方案中，每行的特征具有相同的节距，而在另一些实施方案中，该节距可以在行内和/或行间变化。与之相似，所有行的行间距可以相同或行与行之间有变化。在一些实施方案中，一行中一些或全部结构可以相对其同一行中各自的相邻结构旋转。在一些实施方案中，一行中一些或全部结构可以相对其相邻行中各自的相邻结构旋转。

在一些实施方案中，所述特征在所有侧向上的侧向尺寸为1μm和约10μm之间。这些特征的实例包括一般具有正方形或圆形截面的突起。在另一些实施方案中，所述特征在一个方向上的侧向尺寸为1μm和约10μm之间，而在另一个方向上的侧向尺寸更大。

这些特征的实例包括长形脊、肋或孔。脊的侧面可以基本光滑或者它们可以包括其它特征，例如突起和/或凹槽的规则序列。因此，在一些实施方案中，这些脊可以具有类似于成行的正方形或圆形等的外观，它们与各自的邻居合并/互相连接而形成不间断的脊。

特别地，在一些实施方案中，所述形态结构包含在所有侧向上侧向尺寸在1μm和约10μm之间的特征以及只在一个方向上侧向尺寸在1μm和约10μm之间的特征。这些结构的实例包括排成行的一般为正方形和/或圆形的特征，其中所述行被长形脊分开。

本发明的一个优选实施方案具有微结构D2/4，其表面特征在于包含以下的形态：尺寸为2μm×2μm的方形柱和节距为6μm的二维周期性结构(图7)。该方向性周期性结构的深度/高度大于0.6μm，优选其竖向尺寸在1.2μm和10.0μm之间，更优选至少竖向尺寸为至少1.2μm、1.6μm、2.0μm、3.0μm、5.0μm、10μm，尽管更大的高度也是可能的，比如至少20μm、50μm、100μm或1000μm。

图12a～k显示具有突起/柱形式的特征的形态结构实例的顶视图，所述柱具有一般为圆形、正方形或矩形的截面。每个特征在至少一个方向具有侧向直径X，而相邻行和列中的特征之间的间隙距离被指定为Y。在图12a、c、e、f和i中，Y等于任意特征和其最接近特征之间的间隙尺寸，其对应于节距X+Y。在图12b、d、g、h和j中，不同特征到最接近特征的间隙距离不同，例如图12b中的特征1201、1202和1203。特征1201与特征1202最接近；相应地间隙尺寸为Y。但是，特征1203与其最接近特征1201和1202之间具有稍微不同的间隙尺寸d。因此，在图12b、d、g、h和j中，行与行之间其节距不同。在包括特征1201的行中，节距为X+Y，而包括特征1203的行中节距为2(X+Y)。

尽管也可以是其它高度，下文实施例中所用结构具有1.6μm的特征高度，除非另外提及。

在图12的实例中，每个特征的中心位于具有网格常数a和b的2维矩形网格的相应格点上，如图12a和b所示。但是，在图12a～e、h～i中，实际上格点没有被全部覆盖，而在图12f和k中全部格点都被特征覆盖。在图12a、c、e、f和i中，所述网格是网格常数a＝b＝(X+Y)的正方形网格。在图12b、d、g、h和j中，所述网格是矩形网格，并且网格常数为a＝X+Y和b＝(X+Y)/2。在图12k中，网格常数为a＝2·X和b＝3.5·X。对于选定的X和Y值，晶片已经根据图12a～h生产，其中以μm计的(X，Y)选自(X，Y)＝(1，1)、(1，2)、(1，4)、(1，6)、(2，1)、(2，2)、(2，4)、(2，6)、(4，1)、(4，2)、(4，4)、(4，6)、(6，1)、(6，2)、(6，4)、(6，6)。对于选定的X和Y值，晶片已经根据图12k生产，其中以μm计的X选自X＝1、2、3、4、5、6、7、8。因此，对于图12a、c、e、f和i中的正方形网格，底层网格的网格常数a和b为a＝b＝2～12μm。对于图12b、d、g、h和j中的矩形网格，沿方向a的网格常数为2～12μm之间，而沿方向b的网格常数为1～6μm之间。对于图12k中的网格，网格常数b位于3.5～28μm之间，而网格常数a位于2～16μm之间。

为了识别X和Y各自不同值的上述结构，图12a中所示的结构在本说明书中称为AX.Y，其中X和Y表示上述尺寸X和Y。因此，结构AX.Y包括具有直径Xμm的圆形截面的突起/柱。突起排布在平行的行中，其中每隔一行中相邻突起之间的间隙尺寸为Yμm，而其余行中突起之间的间隙尺寸为(2Y+X)μm。相邻行的突起之间的间隙尺寸为Yμm。相邻行中的突起之间相互对准。

相似地，图12b中所示的结构被称为BX.Y。因此，结构BX.Y包括具有直径Xμm的圆形截面的突起/柱。突起排布在平行的行中，其中每隔一行中相邻突起之间的间隙尺寸为Yμm，而其余行中突起之间的间隙尺寸为(2Y+X)μm。相邻行中突起之间的间隙尺寸为Yμm。间隙尺寸为(2Y+X)μm的行中突起与其各自相邻行的突起之间间隙的中心对准。

图12c中所示的结构被称为CX.Y。因此，结构CX.Y包括具有线性尺寸Xμm的正方形截面的突起/柱。突起排布在平行的行中，其中正方形的边对准行的方向，并且其中每隔一行中相邻突起之间的间隙尺寸为Yμm，而其余行中突起之间的间隙尺寸为(2Y+X)μm。相邻行的突起之间的间隙尺寸为Yμm。相邻行中突起之间相互对准。

图12d中所示的结构被称为DX.Y。因此，结构DX.Y包括具有线性尺寸Xμm的正方形截面的突起/柱。突起排布在平行的行中，其中正方形的边对准行的方向，并且其中每隔一行中相邻突起之间的间隙尺寸为Yμm，而其余行中突起之间的间隙尺寸为(2Y+X)μm。相邻行的突起之间的间隙尺寸为Yμm。间隙尺寸为(2Y+X)μm的行中突起与其各自相邻行的突起之间间隙的中心对准。

图12e中所示的结构被称为EX.Y。因此，结构EX.Y包括具有直径Xμm的圆形截面的突起/柱以及具有线性尺寸Xμm的正方形截面的突起/柱。突起排布在交替的平行行中，其中每隔一行为圆形突起，而其余行为正方形突起。具有圆形突起的行内相邻突起之间的间隙尺寸为Yμm，而其余行内正方形突起之间的间隙尺寸为(2Y+X)μm。相邻行的突起之间的间隙尺寸为Yμm。相邻行中突起之间相互对准。

图12f中所示的结构被称为FX.Y。因此，结构FX.Y包括具有直径Xμm的圆形截面的突起/柱以及具有线性尺寸Xμm的正方形截面的突起/柱。突起排布在交替的平行行中，其中每隔一行为圆形突起，而其余行为正方形突起。每行内突起之间和相邻行之间的间隙尺寸为Yμm。相邻行中突起之间相互对准。

图12g中所示的结构被称为GX.Y。因此，结构GX.Y包括具有直径Xμm的圆形截面的突起/柱以及具有线性尺寸Xμm的正方形截面的突起/柱。突起排布在交替的平行行中，其中每隔一行为圆形突起，而其余行为正方形突起。具有圆形突起的行内相邻突起之间的间隙尺寸为Yμm，而其余行内正方形突起之间的间隙尺寸为(2Y+X)μm。相邻行的突起之间的间隙尺寸为Yμm。间隙尺寸为(2Y+X)μm的行中正方形突起与其各自相邻行的圆形突起之间间隙的中心对准。

图12h中所示的结构被称为HX.Y。因此，结构HX.Y包括具有直径Xμm的圆形截面的突起/柱以及具有线性尺寸Xμm的正方形截面的突起/柱。突起排布在交替的平行行中，其中每隔一行为圆形突起，而其余行为正方形突起。每行中突起之间和相邻行之间的间隙尺寸为Yμm。相邻行中突起之间相互对准。正方形突起与其各自相邻行的圆形突起之间间隙的中心对准。

图12i中所示的结构被称为IX.Y。因此，结构IX.Y包括具有直径Xμm的圆形截面的突起/柱以及具有线性尺寸Xμm的正方形截面的突起/柱。突起排布在交替的平行行中，其中每隔一行为圆形突起，而其余行为正方形突起。具有正方形突起的行内相邻突起之间的间隙尺寸为Yμm，而其余行内圆形突起之间的间隙尺寸为(2Y+X)μm。相邻行的突起之间的间隙尺寸为Yμm。相邻行中突起之间相互对准。

图12j中所示的结构被称为JX.Y。因此，结构JX.Y包括具有直径Xμm的圆形截面的突起/柱以及具有线性尺寸Xμm的正方形截面的突起/柱。突起排布在交替的平行行中，其中每隔一行为圆形突起，而其余行为正方形突起。具有正方形突起的行内相邻突起之间的间隙尺寸为Yμm，而其余行内圆形突起之间的间隙尺寸为(2Y+X)μm。相邻行的突起之间的间隙尺寸为Yμm。间隙尺寸为(2Y+X)μm的行中圆形突起与其各自相邻行的正方形突起之间间隙的中心对准。

因此，在上述实施例中，最邻近特征之间的最小间隙尺寸为Yμm，而最邻近特征之间的最小中心-中心距离为X+Yμm。

图12k中所示的结构被称为结构KX。结构KX包含成组的矩形截面的长形突起/脊。该脊具有不同的长度，并排布为相互平行。每组的脊排布为形成矩形(？)，使得每组包括最长的脊作为中心脊。中心脊的每侧排布有一系列逐渐变短而到中心脊的距离逐渐增加的脊。因此，矩形KX包括长度为Xμm、2Xμm、3Xμm、4Xμm、3Xμm、2Xμm、Xμm的脊的序列。脊的宽度为Xμm。脊之间的距离为Xμm。脊的组以预定的图案排布，使得脊排成行，其中每行包括两个交替长度的脊：第一种类型的行包括长度Xμm和4Xμm的交替的脊，第二种类型的行包括长度2Xμm和3Xμm的交替的脊。脊的整体图案类似于鲨鱼皮结构。

下面将结合实例说明另一些优选结构。

IV.包含本发明生物相容性材料的植入物

根据一个方面，本发明提供用于骨组织植入等的医用植入物，其中该植入物的至少一部分表面的特征在于本发明的生物相容性材料，其表面的特征在于与骨形成细胞生物相容的确定的周期性微米尺度形态结构，并且其形态结构在上述II节和实施例中描述。本发明的医用植入物包括牙科植入物、整形假体/植入物、脊髓植入物、骨替代物，预期其可用于治疗骨折、退行性疾病、创伤和癌症。

在一个优选的实施方案中，植入物的整个暴露表面区或用于制造植入物的生物相容性涂层在本发明具有增强骨形成细胞矿化的生物相容性材料上构成。在一个替代的实施方案中，所述暴露表面区域的一个或多个部分作为本发明具有增强骨形成细胞矿化的生物相容性材料而被构成。因此，通过选择性提供具有合适表面的装置，其可以被控制，所述表面的哪部分应该以某一方式执行(例如矿化)。植入物的其它部分可以由能够增强例如软骨细胞、上皮细胞的生物相容性的其它类型的结构形成，在这些细胞处植入物将与交替的组织类型相接触。也可以包括排斥细菌生长的表面。例如可以考虑牙科植入物。该植入物将由5种不同的表面构成，以便满足交替环境的要求：1.对矿化/骨形成/向内生长最佳，2.对结缔组织(成纤维细胞)最佳的生物相容性，3.对上皮(上皮细胞)最佳的生物相容性，4.排斥细菌的表面，和最后5.对添加人工牙最佳的表面。

V.在植入物的成型的(contoured)3D表面上合成本发明的生物相容性的形态修饰表面的方法

一种植入物表面对骨形成细胞是生物相容的且增强骨形成细胞的矿化，其可以通过许多生产方法制造，例如下列技术中的一种或多种：

-模压印(die imprinting)：通过使用硬模(例如SiC或SiN模)可以直接在例如植入金属等其它硬质材料上通过压印直接产生图案。该母模(master die)通常通过电子束光刻和活性离子蚀刻联合生产。已经证明，宽度低至40nm的纳米结构的大阵列可以被印在例如Al等软金属上(S.W.Pang，T.Tamamura，M.Nakao，A.Ozawa，H.Masuda，J.Vac.Sci.Technology B16(3)(1998)1145)。更为具体地，期望在压印在其它硬质基底如Al、Ti、钛合金、不锈钢、Ta等时在如SiC或SiN等非常硬的材料中生产模具图案——否则该模具将会受损或甚至毁坏。当然，模压印也可以用于如聚合物等较软的材料。由于如SiC或SiN等材料难于干法蚀刻，因此期望制造由如Cr构成的蚀刻掩膜，而不是仅有光刻胶。该掩膜可以下列方式生产：通过电子束光刻在光刻胶(resist)中产生侧向图案，然后通常在例如醋酸盐等有机溶剂中显影。这在表面留下光刻胶图案。通过PVD覆盖光刻胶图案——沉积约100nm Cr层，最后通过利用光刻胶去除剂溶解光刻胶而完成。硬质模具材料的干法蚀刻可以在活性离子蚀刻系统中实施。结构的深度通过离子蚀刻的时间控制。最后Cr掩膜可以在硝酸铈的水溶液中除去。现在，硬质模已经准备好用于压印入表面合成生物相容的形态修饰表面。通过水压所述模具进入表面的选定区域，该模可以在生物材料的选定区域内压印微米和纳米图案。施加的压力通常为几吨，持续10～30秒。可以通过使模尺寸的一些区域连续图案化而在几个区域形成图案。模具尺寸通常为10×10mm²到40×40mm²。这种微米或纳米压印法非常适于在由例如Ti、钛合金、钽或不锈钢生产的成型3D植入物的选定区域形成图案。但是其当然也可用于例如聚合物材料/涂层等硬度较低的材料。

-通过滚动模具压印。该方法基本与模压印相同，但是此处的模具不是平的，而通常是圆柱。该压模辊通过上述用于模压印的光刻或电子束光刻/活性离子蚀刻形成微米和纳米结构。该装置需要被改进，以便考虑曲面。现在该模压辊可以通过水压该模辊到植入物表面上而压到生物材料的选定区域并滚动，从而压印微米和/或纳米结构。此处的植入物材料也可以是，但不必是例如Ti、Ti合金、钽或不锈钢等硬材料，以便该方法也适用于例如聚合物等。

-通过胶体光刻形成图案：此处，可以通过沉积胶体颗粒(例如聚苯乙烯或蛋白质铁蛋白)形成组装为短程有序图案的纳米图案表面。这些颗粒例如可用作：制备柱的蚀刻掩膜、制备表面突起的形态模板或例如纳米金属簇的沉积(例如通过铁蛋白的金属中心)。

-通过超短激光脉冲激光图案化：该技术可用于高精度图案化。特别地，烧蚀工艺的高度非线性导致对材料去除的明确阈值，而且这已经用于证实形成甚至在衍射极限以下的结构(P.P.Pronko，S.K.Dutta，J.Squier，J.V.Rudd，D.Du，G.Mourou：OpticalCommunication 114，(1995)106)。

-通过超短激光脉冲的激光图案化也可与石英球的预沉积联合使用(K.Vestentoft，J.A.Olesen，B.H.Christensen，P.Balling：Appl.Phys A 80，(2005)493)，以形成纳米级孔的大阵列。更具体地，石英球层沉积在表面上，通常但是不必然形成紧密堆积的阵列。通过超短脉冲的未聚焦激光束扫描具有石英球的表面，可以产生大面积的平行结构，因为所述球充当聚焦激光束的单个透镜。

-激光扫描束干涉光刻：这种低成本方法可用于在大表面区域上制造周期性和准周期性和空间相干的图案。该方法利用两个或多个相干的平面波阵面之间的干涉(S.Kuiper，H.van Wolferen，G.vanRijn，Journal of Micromechanics and Microengineering 11(1)，(2001)33)。

VI.一种用于培养组织或细胞的装置，其包含具有微尺度表面结构的暴露表面。

图30示意性显示具有微尺度结构暴露表面的组织培养皿的截面视图。该皿301包含向上开口的接收器，其具有底部303和侧壁302。在使用中，上表面304被暴露于细胞培养或组织，从而提供用于培养的微环境。在本发明的一些实施方案中，暴露表面304具有微尺度的形态结构，其被选择为促进此处所述的预定细胞功能。通过热压印或注射成型或者通过本领域已知和/或本文所述的任何其它合适方法，可以用例如聚合物来大量制造这种表面，所述聚合物例如聚苯乙烯，不同类型的聚己酸内酯，聚(甲基丙烯酸甲酯，硅酮包括聚二甲基硅氧烷，聚(甲基丙烯酸羟乙酯)，聚(甲基丙烯酸乙酯)，聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)，聚乙烯，聚碳酸酯，聚乙烯醇，基于透明质酸的聚合物，聚(氧化乙烯)，聚(对苯二甲酸丁二醇酯)，甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱，mr-I T85，mr-I 7030，聚(双(三氟乙氧基)膦腈)，天然聚合物包括改性多糖，例如淀粉、纤维素和壳聚糖，和上述物质的混合物和共聚物。表面304可以是底部303的上表面或置于该皿底部303上的独立元件例如圆盘的上表面。例如，这种组织培养皿/瓶或选择用于支持未分化状态下胚胎干细胞生长的任何表面可用于大量生长胚胎干细胞，其在随后发育中可被诱导分化成期望的细胞类型。一旦分化成特定细胞类型，这些特定细胞类型可用于药物筛选和/或细胞替代治疗。

表面304也可以分离的组织培养塑料的形式来提供，其已经被修饰成在其表面上显示选定结构或这些结构的蓝图。例如，分离的组织培养塑料可以可取出方式插入培养皿301中。在这方面，术语组织培养塑料意思包括可用于产生能够用于体外细胞培养中细胞生长的表面的任何聚合物/金属涂层/材料。

实施例

实施例1

包含60个测试区域的4英寸BSSA晶片的制造

厚度为525±25微米的单面抛光的硅晶片(4英寸)为生物相容材料的制造提供了基层。该晶片是一种电阻率为1-20欧姆厘米的n-型晶片。根据以下方案，通过标准的光刻技术和在SF₆/O₂中放电的活性离子蚀刻，将微米尺寸的图案印在硅晶片的抛光面上。

1、所述晶片用缓冲的氢氟酸(BHF：BHF是一种溶液，其中浓HF(49％)、水、和缓冲盐NH₄F的比例约为1∶6∶4)预蚀刻30秒，然后在N₂气流下干燥，以及

2、然后在该晶片上旋涂一层1.5微米厚的光刻胶AZ5214，HoechstCelanese Corporation，NJ，US(其化学组成可参见由Hoechst CelaneseCorporation提供的材料安全数据表(MSDS))，并在约90℃下预烘焙120秒，以及

3、涂覆有光刻胶的晶片在AL6-2型EVC光刻机中通过合适的掩膜用紫外光(UV)曝光5秒，显影50-60秒，然后在120℃下后烘焙1分钟，以及

4、然后涂覆有光刻胶的晶片用BHF短暂地蚀刻约30秒而被图案化，接着在约0.30微米/分钟的速率下接受活性离子蚀刻处理(RIE)，用丙酮剥离光刻胶，随后RCA清洗。该RCA清洗过程有三个依次应用的主要步骤：用5∶1∶1的H₂O∶H₂O₂∶NH₄OH溶液(SC1)去除不溶性有机污染物；用稀释的50∶1的H₂O∶HF溶液去除二氧化硅薄层，在该薄层中可能积累了作为(I)之结果的金属污染物；以及用6∶1∶1的H₂O∶H₂O₂∶HCl溶液(SC2)去除离子或重金属原子污染物。

5、图案化的晶片然后通过干法氧化具有20纳米SiO₂层而钝化，其在1000℃下热生长15分钟。

6、通过溅射沉积在图案化晶片上沉积250纳米的钽层。

图3显示如上制备的一个晶片的顶视图。该晶片包括60个尺寸为10mm×10mm的测试区域，其中每个区域具有根据实施例1制备的特定侧向形态。每个晶片包括4个具有平坦表面的对照测试区域2，以及14种不同侧向形态中每一种的4个复本。根据这些定义的参数制备了一系列晶片，其中侧向形态的深度分别限定为0.07微米、0.25微米、0.60微米、1.20微米、1.60微米。

每种特定的侧向结构重复4次。图3中，每个测试区域都被标记以指示其形态表面结构，其中所述标记指示如下结构：

·“BL”：无结构，即基本上平坦的表面。

·“AX/Y”：图4所示的线结构。该结构包括宽度为X(微米)的槽41和宽度为Y(微米)的脊42。因此，图4的线结构具有仅一维的微米尺度特征。在实施例1中，区域A2/2包括具有宽度2微米的槽和宽度2微米的脊的线结构，区域A4/4包括具有宽度4微米的槽和宽度4微米的脊的线结构，区域A10/10包括具有宽度10微米的槽和宽度10微米的脊的线结构，区域A4/2包括具有宽度4微米的槽和宽度2微米的脊的线结构，以及区域A10/2包括具有宽度10微米的槽和宽度2微米的脊的线结构。

·“BX/Y”：图5所示的方形孔结构。该结构包括尺寸为X(微米)×X(微米)的方形孔/凹陷51，且节距为X+Y，即脊52的网的宽度为Y。因此，图5的结构在测试区域的表面平面中的两个维度上都具有微米尺度特征。在实施例1中，区域B4/4包括尺寸为4微米×4微米和8微米节距的方形孔，区域B10/4包括尺寸为10微米×10微米和14微米节距的方形孔，以及区域B15/4包括尺寸为15微米×15微米和19微米节距的方形孔。

·“KX/Y”：图6所示的包含被脊分隔开的矩形孔/凹陷的结构。该结构包括被宽度为X(微米)的脊62分隔开的尺寸为X(微米)×Y(微米)的矩形孔61。因此，区域K10/110包括被宽度为10微米的脊分隔开的尺寸为10微米×110微米的矩形孔。

·“DX/Y”：图7所示的包含突起/柱的结构。该结构包括具有尺寸为X(微米)×X(微米)的方形横截面和节距X+Y的突起/柱71。因此，区域D2/4包括具有柱尺寸为2微米×2微米的方形柱结构且节距为6微米，以及区域D2/10包括具有柱尺寸为2微米×2微米的方形柱结构且节距为12微米。

·“CX”：图8所示的方形孔/柱结构。该结构外观像棋盘，具有孔81和突起/柱82，并且二者均是尺寸为X(微米)×X(微米)的方形形状。

因此，区域C10包括方形的孔/柱结构，且孔和柱的尺寸均为10微米×10微米；区域C40包括方形的孔/柱结构，且孔和柱的尺寸均为40微米×40微米；以及区域C90包括方形的孔/柱结构，且孔和柱的尺寸均为90微米×90微米。

应当理解，上述制备方法也可以用于具有其他形式和尺寸的测试区域以及其他结构类型的晶片上。同样的生产方法可用于各种不同的晶片，其中测试区域的布局和具体表面结构可通过晶片曝光时所用的掩膜来确定。

实施例2

筛选BSSA晶片，鉴定用于小鼠成骨细胞矿化的生物相容性材料：

许多晶片结合实施例1中所述的方法来生产。每个晶片都置于P15皿中(NUNC，Biotech line)并先后用70％乙醇和PBS(6.8g NaCl，0.43g KH₂PO₄，0.978g Na₂HPO₄*2H₂O溶于1升双蒸水中，～pH7.4)清洗。MC3T3-E1鼠成骨细胞系(Sudo，H et al.1983，J Cell Biol96(1)：191-98)的细胞以浓度20000细胞/cm²接种于所述晶片。细胞在常规培养基(α-最小基本培养基[α-MEM]，10％胎牛血清[FCS]，100U/ml青霉素，和100微克/毫升链霉素(Gibco，Invitrogen提供))中培养4天。细胞在增湿的培养箱中维持(5％CO₂/95％空气气氛，37℃)，随后在生长培养基中加入284μM抗坏血酸(Wako Chemicals，DE)和10mMβ-甘油磷酸(Sigma-Aldrich，DK)。每周两次更换培养基，培养细胞3周。

(a)体外矿化：培养3周后，通过用PBS清洗晶片和用70％乙醇在-20℃固定晶片上的细胞1小时来测试每个培养皿中晶片上的矿化程度。然后细胞用双蒸水漂洗，接着用pH调节至4.2的40mM茜素红S(Sigma-Aldrich，DK)室温(约20-25℃)染色10分钟。晶片用H₂O进行后漂洗并在PBS中孵育15分钟以减少非特异性染色。

(b)可与钙结合的茜素红微弱地染色了所有的测试区域，但强烈地染色了具有微结构D2/4的测试区域，这已被几个独立实验中晶片上的细胞生长所确认。D2/4具有二维的周期性结构，具有尺寸为2微米×2微米和6微米节距的方形柱(如图7所示)。

(c)通过比较具有不同侧向形态深度的晶片上的矿化，揭示出细胞培养中矿化过程具有显著的竖向尺寸依赖性。与其他测试区域相比，在测试区域D2/4上增强了的矿化仅当D2/4的侧向形态的竖向尺寸大于0.6微米时被检测到。在具有竖向尺寸为1.2微米和1.6微米的测试区域显示了矿化。

图9～11显示在BSSA晶片测试区域上骨发生MC3T3细胞的筛选结果：图9a显示玻璃上的MC3T3细胞，而图9b显示BSSA晶片的参考表面上的MC3T3细胞。图10显示具有“D2/4”表面结构(H＝1600nm)的测试区域上的MC3T3细胞。图11显示具有“D2/10”表面结构(1600nm)的测试区域上的MC3T3细胞。接种细胞后48小时，图9～11中显示的MC3T3细胞被固定并用罗丹明标记的鬼笔环肽染色。鬼笔环肽标记细胞内的肌动蛋白纤维。可以看出，细胞的细胞骨架受表面形态的不同影响。对于钽和金属上的参考结构，可以看出长的肌动蛋白纤维跨越整个细胞直径。对非矿化结构D2/10观察到类似的结果，尽管该结构的单个点偶尔被肌动蛋白纤维增强。对于矿化结构D2/4，其图案明显不同。细胞的形状受细胞表面上图案的影响，似乎细胞将点与点连接起来，而且由于实际上肌动蛋白骨架看起来包裹在单个点周围，所述结构观察得非常清楚。

细胞和植入物表面之间的接触点是粘着斑的点，在此细胞蛋白如整联蛋白与沉积于表面上的细胞外基质蛋白中的肽序列如RGD相接触。整联蛋白的细胞内结构域与细胞骨架的肌动蛋白组分以及蛋白质如粘着斑蛋白(vinculin)、桩蛋白(paxillin)和粘着斑激酶(FAK)相结合。这些蛋白质通过不同的信号通路调节不同的细胞应答，其被预期影响细胞介导的矿化过程。预期肌动蛋白骨架的细胞内分布影响矿化的另一种途径是通过细胞外基质的沉积。已知肌动蛋白骨架确定例如纤连蛋白等细胞外基质蛋白。据观察，纤连蛋白沿肌动蛋白纤维沉积(例如见Molecular Biology ofthe Cell，Fourth Edition，by Bruce Alberts，Alexander Johnson，JulianLewis，Martin Raff，Keith Roberts，and Peter Walter，fig.19-54)。因此，其它细胞外基质蛋白例如I型胶原蛋白有可能受到肌动蛋白骨架的影响。I型胶原蛋白已经与骨和成骨细胞的矿化高度相关。胶原纤维内的沟槽被认为充当羟基磷灰石结晶初始种子的成核位点。我们预期植入物表面形态之内的变化将导致细胞骨架内的变化，从而影响上述过程。

实施例3

鉴定用于骨发生MC3T3细胞矿化的生物相容性材料：

制备包含测试方块的BSSA晶片，所述测试方块具有选自图12中所鉴定结构或从图12所鉴定结构中修饰而来结构中的形态结构。

晶片包含具有图12a～k所示形态结构或其修饰结构的测试区域，在其上接种MC3T3细胞、培养，然后利用茜素红测试进行矿化染色，如实施例2中所述，然后基于目视检查评价矿化的水平。所发现尤其有利于矿化并因此显示对骨形成细胞生物相容的表面结构的图像示于图13。图13a～g中每个显示一张表，其中每行对应于一种所述已鉴定结构。第一列(最左边)包括各自结构的识别码，第二列显示具有通过茜素红矿化染色的细胞的晶片上测试区域的各自一部分，而第三行(最右边)显示不含细胞的相应测试区域。在显示包含细胞区域的图像中显示出各测试方块的边缘，以允许和非结构化表面进行比较。所述已鉴定的表面结构为(下列结构通过根据图13的代码来识别)：

B4.1：只包含图12b和13b中第二行所示圆的结构。B4.1包括每隔一行中直径X＝4μm和节距X+Y＝5μm的圆柱结构(即Y＝1μm)。其余行包括直径X＝4μm和节距2(X+Y)＝10μm的圆柱结构。行之间节距为5μm。节距10μm的行中的柱与节距为5μm的行中的柱之间间隙的中心对准。

C4.1：只包含图12c和13a中第一行所示正方形的结构。C4.1包括每隔一行中柱尺寸4μm×4μm(即X＝4μm)和节距X+Y＝5μm的方柱结构(即Y＝1μm)。其余行包括柱尺寸4μm×4μm和节距10μm的方柱结构。行间节距为5μm。所有行的正方形也按列对准，即相邻行的正方形位于彼此上方。

C4.2：只包含图12c和13c中第三行所示正方形的结构。C4.2包括每隔一行中柱尺寸4μm×4μm(即X＝4μm)和节距X+Y＝6μm的方柱结构(即Y＝2μm)。其余行包括柱尺寸4μm×4μm和节距12μm的方柱结构。行间节距为6μm。所有行的正方形按列对准，即相邻行的正方形位于彼此上方。

E6.1：包含图12e和13a中第四行所示相对量为1∶2的正方形和圆的结构。E6.1包括每隔一行中柱尺寸6μm×6μm和节距14μm的方柱结构。另外每隔一行包括直径6μm和节距7μm的圆柱结构。行间节距为7μm(即X＝6μm，Y＝1μm)。行内的柱位于彼此上方。

E6.2：包含图12e和13b中第一行所示相对量为1∶2的正方形和圆的结构。E6.2包括每隔一行中柱尺寸6μm×6μm和节距16μm的方柱结构。另外每隔一行包括直径6μm和节距8μm的圆柱结构。行间节距为8μm(即X＝6μm，Y＝2μm)。行内的柱位于彼此上方。

E6.4：包含图12e和13e中第四行所示相对量为1∶2的正方形和圆的结构。E6.4包括每隔一行中柱尺寸6μm×6μm和节距20μm的方柱结构。另外每隔一行包括直径6μm和节距10μm的圆柱结构。行间节距为10μm(即X＝6μm，Y＝4μm)。行内的柱位于彼此上方。

E6.6：包含图12e和13f中第一行所示相对量为1∶2的正方形和圆的结构。E6.6包括每隔一行中柱尺寸6μm×6μm和节距24μm的方柱结构。另外每隔一行包括直径6μm和节距12μm的圆柱结构。行间节距为12μm(即X＝6μm，Y＝6μm)。行内的柱位于彼此上方。

F4.2：包含图12f和13d中第一行所示相对量为1∶1的正方形和圆的结构。F4.2包括每隔一行中柱尺寸4μm×4μm和节距6μm的方柱结构。另外每隔一行包括直径4μm和节距6μm的圆柱结构。行间节距为6μm(即X＝4μm，Y＝2μm)。行内的柱位于彼此上方。

F4.4：包含图12f和13d中第二行所示相对量为1∶1的正方形和圆的结构。F4.4包括每隔一行中柱尺寸4μm×4μm和节距8μm的方柱结构。另外每隔一行包括直径4μm和节距8μm的圆柱结构。行间节距为8μm(即X＝4μm，Y＝4μm)。行内的柱位于彼此上方。

G4.1：包含图12g和13d中第三行所示相对量为1∶2的正方形和圆的结构。G4.1包括每隔一行中柱尺寸4μm×4μm和节距10μm的具有修饰/粗化边缘的方柱结构。另外每隔一行包括直径4μm和节距5μm的具有修饰/粗化边缘的圆柱结构。行间节距为5μm(即X＝4μm，Y＝1μm)。行内的正方形位于相互之间，即对准相邻行的圆柱之间的间隙。

H4.4：源自图12h的结构且包含具有相对量为1∶1的修饰/粗化边缘正方形和圆的结构，如图13f第四行中所示。H4.4包括每隔一行中柱尺寸4μm×4μm和节距8μm的正方柱结构。另外每隔一行包括直径4μm和节距8μm(即X＝4μm，Y＝4μm)的圆柱结构。行间节距为8μm。行内的柱位于相互之间。在该实例中，具有粗化边缘的正方形具有基本正方形的截面，其中正方形的边缘由曲线而非直线形成，从而产生具有褶边的正方形。

I4.4：源自图12i的结构且包含具有相对量为2∶1的修饰/粗化边缘正方形和圆的结构，如图13g第二行中所示。I4.4包括每隔一行中柱尺寸4μm×4μm和节距8μm的正方柱结构。另外每隔一行包括柱直径4μm和节距16μm的圆柱结构。行间节距为8μm。行内的柱位于彼此上方。

J6.2：包含图12j和13e中第一行所示相对量为2∶1的正方形和圆的结构。J6.2包括每隔一行中柱尺寸6μm×6μm和节距8μm的方柱结构。另外每隔一行包括柱直径6μm和节距16μm的圆柱结构。行间节距为8μm(即X＝6μm，Y＝2μm)。行内的柱位于彼此之间。

D2.1′(修改)：图13b第三行中显示的结构，其源自图12d中的结构，只包含正方形但是相比图12d中所示结构具有45°旋转。D2.1′每隔一行包括方柱结构，其中正方形具有弯曲/圆化的边缘，并具有柱尺寸2μm×2μm和节距3μm。另外每隔一行包括柱尺寸2μm×2μm和节距6μm(即X＝2μm，Y＝1μm)的方柱结构。行间节距为3μm。行被移位以使正方形位于彼此之间。

D2.2′(修改)：图13a第三行中显示的结构，其源自图12d的结构，只包含正方形但是相比图12d中所示结构具有45°旋转。D2.2′每隔一行包括柱尺寸2μm×2μm和节距4μm的具有粗化边沿的方柱结构。另外每隔一行包括柱尺寸2μm×2μm和节距8μm的方柱结构。行间节距为4μm(即X＝2μm，Y＝2μm)。行被移位以使正方形位于彼此之间。

E2.1′(修改)：图13c第四行中显示的结构，其源自图12e的结构，包含相对量为1∶2的正方形和圆但是相比图12e中所示结构其正方形具有45°旋转。E2.1′包括每隔一行中柱尺寸2μm×2μm和节距6μm的方柱结构。另外每隔一行包括柱直径2μm和节距3μm的圆柱结构。行间节距为3μm(即X＝2μm，Y＝1μm)。行被移位以使柱位于彼此之间。

F2.2′(修改)：图13c第二行中显示的结构，其源自图12f的结构，包含相对量为1∶1的正方形和圆但是相比图12f中所示结构其正方形具有45°旋转。F2.2′包括每隔一行中柱尺寸2μm×2μm和节距4μm的方柱结构。另外每隔一行包括柱直径2μm和节距4μm的圆柱结构。行间节距为4μm(即X＝2μm，Y＝2μm)。行被移位以使柱位于彼此上方。

H4.2′(修改)：图13f第三行中显示的结构，其源自图12h的结构，包含相对量为1∶1的正方形和圆但是相比图12h中所示结构具有修改为具有像花形状的正方形。H4.2′包括每隔一行中柱尺寸4μm×4μm和节距6μm的花柱结构。另外每隔一行包括柱直径4μm和节距6μm的圆柱结构。行间节距为6μm(即X＝4μm，Y＝2μm)。行被移位以使柱位于彼此之间。

I4.2′(修改)：图13g第一行中显示的结构，其源自图12i的结构，包含相对量为2∶1的正方形和圆但是相比图12i中所示结构具有修改为具有像花形状的正方形。I4.2′包括每隔一行中柱尺寸4μm×4μm和节距6μm的花形柱结构。另外每隔一行包括柱直径4μm和节距12μm的圆柱结构。行间节距为6μm(即X＝4μm，Y＝2μm)。行被移位以使柱位于彼此之上。

源自C6.1：图13e第三行中显示的结构，其源自图12c的结构，包含初始源自图12c中所示结构的水平和竖直脊的结构。该结构包括直径在3～6μm之间和最大节距为14μm(即X＝6μm，Y＝1μm)的交叉线。所述脊具有包括由多个边/角形成的侧向突起的侧面。

源自D4.1：图13a第二行中显示的结构，其包含初始源自图12d中所示结构的正方形和线。该结构包括每隔一行中柱尺寸4μm×4μm和节距10μm的方柱结构。如图13a第二行中所示该正方形看来具有的切角。另外每隔一行包括具有多个角和1～4μm宽度的线/脊结构。行间节距为5μm(即X＝4μm，Y＝1μm)。

源自H4.1：图13f第二行中显示的结构，其包含初始源自图12h中所示结构的圆和线/脊。该结构包括每隔一行中柱直径4μm和节距5μm的圆柱结构。如图13f第二行中所示该圆看来具有修饰/粗化的边。另外每隔一行包括具有多个角和1～4μm直径的线结构。行间节距为5μm(即X＝4μm，Y＝1μm)。

源自H6.1：图13b第四行中显示的结构，其包含初始源自图12h中所示H结构的圆和线。该结构包括每隔一行中柱直径6μm和节距7μm的圆柱结构。如图13b第四行中所示该圆看来具有粗化边沿。另外每隔一行包括具有多个角和直径3～6μm的线结构。行间节距为7μm(即X＝6μm，Y＝1μm)。

源自I6.1：图13d第四行中显示的结构，其包含初始源自图12i中所示结构的圆和线。该结构包括每隔一行中柱直径6μm和节距14μm的圆柱结构。如图13d第四行中所示该圆看来具有粗糙边沿。另外每隔一行包括具有多个角和4～6μm直径的线结构。行间节距为7μm(即X＝6μm，Y＝1μm)。

源自J6.1：图13g第三行中显示的结构，其包含初始源自图12j中所示结构的圆和线。该结构包括每隔一行中柱直径6μm和节距14μm的圆柱结构。如图13g第三行中所示该圆看来具有粗糙边沿。另外每隔一行包括具有多个角和4～6μm直径的线结构。行间节距为7μm(即X＝6μm，Y＝1μm)。

源自K：图13c第一行中显示的结构，其包含每组6个线/矩形的组，其中每组线被排布为形成矩形。该结构源自图12k中所示的结构。该矩形包括尺寸x、2x、3x、3x、2x、x的线，其中线性尺寸为x～1.8μm，宽度为～1μm。线之间的距离为～1μm。行被移位以使矩形位于彼此之间。

源自K′：图13e第二行中显示的结构，其包含每组7个线/矩形的组，其中每组线被排布为形成矩形。该结构源自图12k中所示的结构。该矩形包括尺寸x、3x、5x、7x、5x、3x、x的线，其中线性尺寸为x～2.8μm，宽度为～1μm。线之间的距离为～1μm。行被移位以使矩形位于彼此之间。

总之，从所有这些数据可以看出，与参照结构(平面结构)相比，所述给定结构使染色强度高度增加。特别地，矿化看起来位于角内和结构周围附近。

图16显示BSSA晶片一部分视图的两个实例，其显示出四个测试方块的一部分。构建具有4×4mm测试方块的四英寸晶片。图16a～b分别显示四个这种测试方块的一部分。MC3T3细胞被接种到晶片上，并如实施例1和2中所述被诱导矿化。然后，如对10mm晶片所述，晶片利用茜素红对Ca染色。测试方块的表面结构如下：测试方块1601：E6.1(即图12e中所示的结构，X＝6，Y＝1)；测试方块1602：E6.2(即图12e中所示的结构，X＝6，Y＝2)；测试方块1603：F2.4(即图12f中所示的结构，X＝2，Y＝4)；测试方块1604：空白(没有结构)；测试方块1605：G4.1(即图12g中所示的结构，X＝4，Y＝1)；测试方块1606：G4.2(即图12g中所示的结构，X＝4，Y＝2)；测试方块1607：H4.6(即图12h中所示的结构，X＝4，Y＝6)；测试方块1608：H6.1(即图12h中所示的结构，X＝6，Y＝1)。

这两个实施例清楚表明不同结构的矿化能力的差异。首先，可以看出矿化染色受结构边界限制，证明了所述结构的重要性。其次，观察到染色强度的差异，例如1604和1607的矿化能力不及例如1601和1608浓。

实施例4：结合矿化诱导基因的基因诱导测试

下面参照图14所述的基因诱导测试可与矿化诱导基因结合使用。基因诱导测试的这个实例使用源自敲入小鼠的原代细胞。对于活细胞，使用EGFP的报告基因系统或其它表达荧光蛋白的报告基因系统可用于构建报告基因构建体，以代替天然存在的基因。在ES细胞中同源重组以后，产生敲入小鼠，例如在K.Wertz和EM.Fuchtbauer，Dev Dyn.1998 Jun；212(2)：229-41中“Dmd(mdx-beta geo)：a new allele for themouse dystrophin gene”中所述。从这些小鼠中分离相应的原代细胞。当目标基因被诱导时，源自这些小鼠的细胞表达EGFP构建体。图14显示作为骨诱导表面筛选实例的BSSA晶片的4个测试区域。测试区域1501包含骨诱导表面，而测试区域1502包含非骨诱导表面。可以理解，其它多种报告基因系统可用于此处。一个实例是表达β半乳糖苷酶的敲入小鼠。利用这种表达系统存在超过6000种不同敲入小鼠的集合，例如下述：Hansen J，Floss T，Van Sloun P，Fuchtbauer EM，Vauti F，Arnold HH，Schnutgen F，Wurst W，von Melchner H，Ruiz P，“Alarge-scale，gene-driven mutagenesis approach for the functionalanalysis of the mouse genome”，Proc Natl Acad Sci U S A，2003 Aug19；100(17)：9918-22.Epub 2003 Aug 6。

实施例5：异位骨形成

异位(ectopic)骨形成可按如下分析：在6mm×6mm的生物相容性材料结构D2/4上在包括加入50微克/ml抗坏血酸和10mM β-甘油磷酸酯的普通培养基中培养500,000个MC3T3-E1细胞/cm²。培养1周后，将所述生物相容性材料结构转移到用于异位骨形成的皮下小鼠模型中。在小鼠背侧面皮下制作两个囊。在手术期间，用异氟烷麻醉动物，在每个囊中放入一个结构并用外科缝合封闭。小鼠保留8周后断颈处死。取出所述结构，塑料包埋入聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)中，切片，并染色，用于骨检测(例如碱性品红/亮绿或茜素红S)。

实施例6：绵羊中骨形成测试

下文所述的体内绵羊模型可用于测试生物相容性材料诱导骨形成/向内生长的能力：

在6mm×6mm硅晶片方块基底上产生相关生物相容性材料和对照如平面钽的样品。样品分别命名为“活性”和“对照”，并成对应用以降低由动物差异引起的结果偏差。样品用生物相容性胶水(例如Loctite 431)胶合在样品保持器上得到植入物。

用于绵羊体内骨形成测试的样品保持器在图15中示出。特别地，图15a显示样品保持器的底部视图，图15b显示样品保持器的侧视图，图15c显示样品保持器的顶视图，图15d显示样品保持器的透视图，而图15e显示样品保持器的截面视图。所述样品保持器包含方形凹槽1501，适于接收其生物相容性表面被暴露的样品。该方形凹槽位于圆柱件1502的底面中。样品保持器的顶面中包含螺纹孔1503，其有助于将样品保持器放入骨内或从骨中取出。

手术前，给绵羊2.5ml Rompun vet.和2ml阿托品。20分钟后，用15ml异丙酚麻醉动物。在每个内侧股骨髁中钻一个深6mm和直径11mm的孔。这在生物相容性表面和骨之间留下0.5mm的间隙，用于检测骨的向内生长。将植入物压入孔内，并用外科缝合封闭切口。绵羊在四周后处死。取出植入物并包埋入聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)中。骨向内生长的程度通过μCT-扫描进行初步检查，然后切开，通过标准组织学检查骨容积和骨朝向植入物的向内生长。

实施例7

小鼠胚胎干(ES)细胞

ES细胞(KH2 cells)被接种到BSSA晶片上并扩增一代。细胞以1.3～5x10⁶细胞/p10培养皿的密度接种。培养条件为5％CO₂、90％空气湿度和37℃。细胞在补充有15％FCS、2mM谷氨酰胺、50U/ml青霉素、50μg/ml链霉素、非必需氨基酸、100μM β-巯基乙醇和核苷的DMEM中生长。此外，ES细胞生长培养基中添加1000U/ml的白血病抑制性生长因子(LIF)，以维持ES细胞的未分化表型。细胞染色其碱性磷酸酶(AP)活性(蓝)。未分化小鼠ES细胞中AP的水平高。传统上ES细胞生长在饲养层细胞上，并且每两天传代一次。这种情况下细胞传代三天然后固定，但是不用饲养层。

图17显示实验结果，其表明与对照结构相比，选定结构如何增加细胞培养中特征性胚胎干细胞集落的数目。图17a显示结构D1.2(如图12d中所述)上染色ES的照片，图17b显示对照表面(没有结构)上染色ES的照片，而图17c显示结构H1.2(如图12h中所述)上染色ES的照片。

与对照表面相比，选定结构D1.2和H1.2增加了特征性ES细胞集落的数量(它们看起来被高AP活性引起的强染色包围)。

图18显示实验结果，其表明与对照结构相比，类似鲨鱼皮的选定结构如何指导分化。图18a和c显示结构K2(如图12k中所述)上的ES，而图18b和d显示对照表面(没有结构)上的ES。在图18a和b中，没有加入LIF，而在图18c和d中加入LIF。获得LIF的细胞具有一天的LIF，接着两天使用不含LIF的培养基。因此，与对照结构相比，结构K2指导分化。还可看出，结构化表面上的细胞密度高于未结构化表面上的细胞密度。

图19显示定量结果，其表明与对照结构相比，选定尺寸范围内的结构如何增加细胞培养中特征性胚胎干细胞集落的数目。特别地，图19显示X和Y值不同的一系列结构GX.Y(如图12g所述)的定量结果。从图19可以看出，直径1微米和间隙尺寸1～6微米之间、更具体地2～6微米之间的结构(用附图标记1901表示)增加所形成ES集落的数目。标记为0，0(附图标记1902)的结构对应未结构化的参照。

图20显示定量结果，其表明与对照结构相比，一些选定结构如何增加细胞培养中特征性胚胎干细胞集落的数目。特别地，图20显示结构D1.2(2001)、E1.2(2002)上、未结构化表面(2003)上、结构F4.1(2004)上和结构K5(2005)上ES细胞计数的结果。因此，许多独立实验表明，相比未结构化表面(2003)以及相比其它结构(2004、2005)，一些结构(D1.2、E1.2)增加ES集落的形成。集落数已经根据未结构化参考表面进行标准化。

图21显示定量结果，其表明一些结构如何在胚胎干细胞集落的表型外观方面(更圆更小)提高胚胎干细胞集落的质量，而另一些结构则引导胚胎干细胞走向分化途径。数据已经根据对照结构标准化。ES细胞在晶片上用LIF生长三天，但不进行传代。

总之，上述结果表明，一些结构在不包含饲养细胞层条件下(饲养层非依赖的)支持未分化小鼠ES细胞的生长。特别地，已经发现D1.2、E1.2、H1.2有这种作用。然而，已经发现，具有约1微米特征直径并且相邻/最近邻特征之间最小间隙在2～6微米之间的结构一般具有这种作用。另一方面，与复杂K结构相似，其它类型的结构驱使ES细胞走向分化途径(例如K2)。

实施例8

胚胎干细胞的神经元分化

小鼠胚胎干(ES)细胞KH2利用朝向谷氨酸能神经元诱导分化的方案分化为神经元，所述方案修改自(Bibel 2004，Nat.Neurosci.7(9)，p 1003)：ES细胞在白血病抑制性因子(LIF)存在下扩增后，将细胞转移到不含LIF的非粘附皿中以诱导胚体(EB)的形成。四天后加入视黄酸，EB再继续生长四天。然后解离EB，将单细胞转移到在N2培养基(DMEM∶F12(1∶1)，添加N2补充剂)中用多聚-D-赖氨酸包被的BSSA晶片上。两天后，培养基被换成含B27补充剂的神经基础培养基，细胞再生长3到14天。图22～26显示细胞照片，其中使细胞在B27培养基中分化14天，固定并分别用抗β-微管蛋白III的抗体(神经元标志物，红色)(图22a、23a、24a、25a、26a)和DAPI(染色细胞核，蓝色)(图22b、23b、24b、25b、26b)。

图22显示对照表面(没有结构)上的细胞。图23显示结构A1.4上(如图12a中所述)的细胞。图24显示结构A2.1上(如图12a中所述)的细胞。图25显示结构B1.4上(如图12b中所述)的细胞。图26显示结构B2.1上(如图12b中所述)的细胞。

大部分细胞对β-微管蛋白亚型III呈阳性，这表明它们是神经元(例如见图22)。在多数结构和对照上具有不被抗β-微管蛋白III染色或染色很弱的高密度细胞的区域，这表明它们不是神经元(图22、图24和图26)。特别地，图22显示，在未结构化的表面上，细胞密度高，但是有很多细胞“空斑”，这些细胞不被抗β-微管蛋白III染色(图22b中黑箭头所指)或染色很弱(图22b中黑箭头所指)。

与此相反，在一些结构上(例如A1.4和B1.4，分别见图23和图25)，没有看见这种非神经元细胞的空斑，而更高比例的细胞已经变成神经元。

为定量神经元分化的比例，测定染红色和染蓝色的面积，并且用染红色的面积除以染蓝色的面积，从而获得神经元分化的量度。不同结构种类和不同结构尺寸的这些测量结果示于图27中。对于从A到J系列的所有结构(如图12a～j所示)，具有尺寸1，4(附图标记2701)和1，6(附图标记2702)和某种程度上1，2(附图标记2703)的结构上发现较高的神经元分化比例，其表明特征/柱的尺寸和节距都重要。在这些测试结构中，已经发现约1微米的特征截面尺寸和4～6微米之间的相邻/最邻近特征之间最小特征间节距尤其有利。当这些结果根据结构尺寸汇集时，如图28所示，可以看出，神经元分化显著受尺寸为1，4(附图标记2801)和1，6(附图标记2802)的结构刺激。与之相比，K结构(鲨鱼皮)比包括对照表面在内的所有其它结构(汇集所有K结构)具有明显更低比例的神经元细胞(β-微管蛋白III阳性细胞)。

实施例9

神经突的指导生长

在BSSA晶片上建立了源自18日龄大鼠胚胎皮层的原代神经元培养物，并且体外7天后，细胞被固定并用神经元特异性抗β-微管蛋白III的抗体染色。

图29显示如图12所示不同结构上用抗-β-微管蛋白III抗体染色的原代神经元培养物的照片。特别地，图29a显示结构C1.2，图29b显示结构C6.4，图29c显示对照表面(无结构)，图29d显示结构C4.2，而图29e显示结构F1.2。

从图29可以看出，一些结构清楚地引导神经突在确定方向上向外生长。也发现，结构的尺寸倾向于比实际的结构图案更重要。一般来说，结构引导神经突的程度可用以下表示：1，1<1，2>1，4；2，1<2，2～2，4；4，2～4，4；6，2<6，4>6，6。与之相比，具有大柱和小间距或者具有小柱和大间距的结构没有引导向外生长的作用。

实施例10

人间充质干细胞在BSSA晶片FH001上的矿化

从后上髂棘中抽取骨髓样品。用Lymphoprep的梯度离心分离低密度的单个核细胞。混合源自3个供体的纯化细胞，并在培养瓶中生长2代，随后第3代以18,000细胞/cm²的浓度接种到BSSA晶片上。第二天加入新鲜培养基(不含酚红的(MEM)[Earles]，含有10％胎牛血清[FCS]、100U/ml青霉素和100微克/ml链霉素)。一周后加入含有284μM抗坏血酸、10mM β-甘油磷酸酯和10nM地塞米松的培养基以刺激细胞。培养基每周更换一次。41/2周后晶片用茜素红染色。

下列结构显示矿化增加(按范围分为1～4，强度递减)

范围1：F4.2；E6.2；

范围2：H1.1；D1.1；B2.1。

范围3：I1.1；G1.1；K1；K2；K4；K5；K6。

范围4：K3、K7、K8、J2.1。

因此，一般来说，具有不同截面几何形状之特征的结构(如EX.Y；FX.Y；HX.Y；IX.Y；JX.Y)和/或其中格点没有全部填有突起而形成突起包围的六边形区域的结构(如BX.Y；DX.Y；GX.Y；JX.Y)和/或“鲨鱼皮”结构(K结构)和/或特征截面尺寸约为1μm(X＝1)且相邻特征之间中心间距约2～3μm(X+Y在2和3之间)的结构。

Claims (64)

1.一种生物相容性材料，其中所述生物相容性材料的至少一部分表面的特点在于包含排布成规则图案之多个特征的纳米或微米尺度形态结构，其中选择所述结构以促进预定的细胞功能。

2.根据权利要求1的生物相容性材料，其中每个特征具有约0.1μm至约20μm之间、约1～10μm之间、约10～20μm之间的至少一个侧向尺寸(X)。

3.根据权利要求2的生物相容性材料，其中所述侧向尺寸(X)选自下列区间之一：约1μm～2μm之间；约2μm～4μm之间；约4μm～6μm之间；约6μm～8μm之间；约8μm～10μm之间；约10～12μm之间；约12～14μm之间；约14～16μm之间；约16～18μm之间；约18～20μm之间。

4.根据权利要求1～3中任一项的生物相容性材料，其中每个特征具有截面区，使得从所述截面区内任一点到所述截面区边缘的最短距离不超过10μm。

5.根据权利要求1～4中任一项的生物相容性材料，其中一个或多个特征的所述侧向截面具有由周界和/或几何图形所限定的形状，所述形状选自以下之一：圆环、圆形、星形、正方形、矩形、六边形和多边形或其组合。

6.根据权利要求1～5中任一项的生物相容性材料，其中一个或多个特征具有一般正方形的截面。

7.根据权利要求6的生物相容性材料，其中一个或多个特征具有一般圆形的截面，而一个或多个特征具有一般正方形的截面。

8.根据权利要求1～7中任一项的生物相容性材料，其中任何特征和其最邻近特征之间最大间隙的侧向尺寸(d；Y)在以下至少一个区间内：约0.5μm～1.0μm之间，约1μm～2μm之间，约2μm～4μm之间，约4μm～6μm之间，约8μm～10μm之间，约10μm～12μm之间，约12μm～14μm之间，约14μm～16μm之间。

9.根据权利要求1～8中任一项的生物相容性材料，其中所述材料表面的特点在于周期性微米尺度形态结构，其沿任何侧向尺寸的侧向节距选自以下至少一个区间：约1μm～2μm之间；约2μm～4μm之间，约4μm～6μm之间，约6μm～10μm之间，约10μm～16μm之间，约16μm～20μm之间，约20μm～24μm之间。

10.根据权利要求1～9中任一项的生物相容性材料，其中所述形态结构的每个所述特征具有选自以下至少一个区间的竖向高度/深度尺寸：约1nm～0.1μm之间，约0.1μm～0.5μm之间，约0.07μm～1.6μm之间，约1.6μm～3.0μm之间，约3μm～10μm之间。

11.根据权利要求1～10中任一项的生物相容性材料，其中所述周期性形态结构的特征的中心位于网格常数为a和b的2维矩形网格的格点上，并且其中：

a.所述网格为正方形网格，其中每个方向的所述网格常数(a＝b)在2～12μm之间，或

b.所述网格为矩形，其沿第一方向的网格常数(a)在2～12μm之间，而沿第二方向的网格常数(b)在1～6μm之间，约6μm～10μm之间，约10μm～16μm之间，约16μm～20μm之间，约20μm～24μm之间。

12.根据权利要求1～11中任一项的生物相容性材料，其中所述表面的至少一部分包被有钽和/或钛。

13.根据权利要求1～12中任一项的生物相容性材料，还包含选自以下的吸附化合物：多肽、碳水化合物、脂质、生长激素、抗体、抗原、糖蛋白、脂蛋白、DNA、RNA、多糖、脂质、有机化合物和无机化合物。

14.根据权利要求13的生物相容性材料，其中所述生长激素选自BMP、EGF样、TGF-β。

15.根据权利要求1～14中任一项的生物相容性材料，其中至少一些所述特征具有带有纳米尺度形态结构的顶表面。

16.根据权利要求1～15中任一项的生物相容性材料，其中所述结构包含排布成规则图案的多个突起，其中所述突起具有最小截面直径不大于2μm、优选不大于1.5μm的截面，并且其中所述截面的直径大于10nm，比如大于50nm，比如大于100nm，比如在0.1μm和2μm之间，比如在0.5μm和2μm之间，比如在0.1μm和1.5μm之间，比如在0.5μm和1.5μm之间。

17.根据权利要求16或17的生物相容性材料，其中所述截面的最大截面直径不大于2μm，优选在0.01μm和2μm之间，优选在0.1μm和2μm之间，优选在0.5μm和2μm之间，比如0.1μm和1.5μm之间，比如0.5μm和1.5μm之间。

18.根据权利要求16～18中任一项的生物相容性材料，其中所述突起位于规则二维网格的格点上，其中沿至少一个维度在相邻格点之间的距离不大于7μm。

19.根据权利要求19的生物相容性材料，其中沿至少一个维度在相邻格点之间的距离小于4μm，比如在0.01μm和4μm之间，优选0.1μm和4μm之间，更优选0.5μm和3.5μm之间，例如1μm和3μm之间。

20.根据权利要求19或20的生物相容性材料，其中沿所述两个维度在相邻格点之间的距离不大于4μm，优选在0.01μm和4μm之间，优选0.1μm和4μm之间，更优选0.5μm和3.5μm之间，比如1μm和3μm之间。

21.根据权利要求16～21中任一项的生物相容性材料，其中所述结构包括具有至少两种不同截面几何形状的突起。

22.根据权利要求22的生物相容性材料，其中所述截面几何形状不同的突起以交替模式排布成二维规则网格。

23.根据权利要求16～23中任一项的生物相容性材料，其中所述结构包括具有不同截面区域的突起。

24.根据权利要求24的生物相容性材料，其中所述突起为具有不同长度的长形脊。

25.根据权利要求25的生物相容性材料，其中每个所述长形脊具有0.1μm和2μm之间、优选0.5μm和1.5μm之间的宽度。

26.根据权利要求25或26的生物相容性材料，其中相邻长形脊之间的距离小于2μm，优选在0.1μm和2μm之间，优选在0.5μm和1.5μm之间。

27.根据权利要求25～27中任一项的生物相容性材料，其中所述长形脊各自的长度小于20μm，优选小于10μm，比如在0.5μm和10μm之间。

28.根据权利要求16～28中任一项的生物相容性材料，其中所述突起位于二维规则网格的格点上，使得只有一部分格点被突起覆盖。

29.根据权利要求16～29中任一项的生物相容性材料，其中所述突起排布成平行的行中，其中相邻突起之间的中心-中心距离在相邻行中不同。

30.根据权利要求1～30中任一项的生物相容性材料，其中选择所述结构以促进骨形成细胞的矿化。

31.根据权利要求31的生物相容性材料，其中所述周期性形态结构的特征具有结构(D2/4)，其包含：

a.方柱的二维周期性结构，每个方柱具有约2μm的侧向尺寸(X)，所述方柱具有约6μm的节距(X+Y)，和

b.每个柱具有大于0.6μm的竖向尺寸(H)。

32.根据权利要求1～30中任一项的生物相容性材料，其中选择所述结构以促进未分化胚胎干细胞的生长。

33.根据权利要求1～30中任一项的生物相容性材料，其中选择所述结构以促进胚胎干细胞的神经元分化。

34.根据权利要求33或34的生物相容性材料，其中任一个所述特征的至少一个侧向尺寸在约0.5μm和约2μm之间，优选约0.8μm和约1.2μm之间，更优选约0.9μm和约1.1μm之间，例如约1μm。

35.根据权利要求33～35中任一项的生物相容性材料，其中所述特征排布成规则图案，其相邻特征之间的最小间隙尺寸在约1μm和约7μm之间，优选约2μm和约6μm之间。

36.根据权利要求34～36中任一项的生物相容性材料，其中所述特征包括规则排布的突起，以产生各自的多个突起排布为包围无突起的相应区域的图案，所述无突起的区域具有大于所述特征间最小间隙尺寸、优选大于所述特征间最小间隙尺寸2倍的线性尺寸。

37.根据权利要求1～30中任一项的生物相容性材料，其中选择所述结构以促进胚胎干细胞的分化。

38.根据权利要求38的生物相容性材料，其中所述结构包括排布成规则图案的多个长形脊。

39.根据权利要求39的生物相容性材料，其中所述长形脊具有不同的长度，并排布成规则图案。

40.根据权利要求1～30中任一项的生物相容性材料，其中选择所述结构以促进源自原代神经元细胞的神经突沿限定方向向外生长。

41.根据权利要求41的生物相容性材料，其中所述特征排布成规则图案，其相邻特征之间的最小间隙尺寸在约1μm和约5μm之间，优选约2μm和约4μm之间。

42.根据权利要求42的生物相容性材料，其中任一个所述特征的至少一个侧向尺寸在约0.5μm和约1.5μm之间，而相邻特征之间的最小间隙尺寸在约1μm和约6μm之间。

43.根据权利要求43的生物相容性材料，其中任一个所述特征的至少一个侧向尺寸在约1.5μm和约2.5μm之间，而相邻特征之间的最小间隙尺寸在约1μm和约4μm之间。

44.根据权利要求43的生物相容性材料，其中任一个所述特征的至少一个侧向尺寸在约3.5μm和约4.5μm之间，而相邻特征之间的最小间隙尺寸在约1.5μm和约4.5μm之间。

45.根据权利要求43的生物相容性材料，其中任一个所述特征的至少一个侧向尺寸在约5.5μm和约6.5μm之间，而相邻特征之间的最小间隙尺寸在约2μm和约6μm之间。

46.一种用于培养细胞或组织培养物的装置，所述装置包括在使用中与细胞或组织培养物接触的暴露表面，其中所述暴露表面由根据权利要求1～46中任一项的生物相容性材料制成。

47.一种用于制造医用装置的印模或掩模，所述医用装置至少部分由生物相容性材料制造，所述印模适于将权利要求1～46中任一项所定义的形态表面结构压印或赋予入所述生物相容性材料的表面。

48.一种模具，用于生产具有如权利要求1～46中任一项所定义之表面结构的生物相容性材料。

49.一种培养细胞或组织的方法，所述方法包括使细胞或组织接触根据权利要求1～46中任一项的生物相容性材料。

50.一种用于骨组织植入的医用植入物，其包含表面，其中至少一部分所述表面由如权利要求1～32中任一项所限定的生物相容性材料来限定。

51.根据权利要求51的医用植入物，还包含选自以下的吸附化合物：多肽、碳水化合物、脂质、生长激素、抗体、抗原、糖蛋白、脂蛋白、DNA、RNA、多糖、脂质、有机化合物和无机化合物。

52.根据权利要求52的医用植入物，其中所述生长激素选自BMP、EGF样、TGF-β。

53.根据权利要求51～53中任一项的医用植入物，其中所述植入物为牙科植入物。

54.根据权利要求51～53中任一项的医用植入物，其中所述植入物为整形植入物。

55.根据权利要求51～55中任一项的医用植入物，其用于人或动物的外科治疗。

56.根据权利要求54的医用植入物，其用于人或动物牙病的治疗。

57.根据权利要求55之医用植入物的用途，其用于人或动物的整形疾病的治疗。

58.一种用于制造与骨形成细胞生物相容的医用植入物的生物相容性涂料，其中所述生物相容性涂料包含根据权利要求1～32中任一项的生物相容性材料。

59.根据权利要求1～32中任一项的生物相容性材料在制备医用植入物中的用途。

60.一种促进骨形成细胞矿化的方法，所述方法包括使所述细胞接触根据权利要求1～32中任一项的生物相容性材料。

61.一种促进未分化胚胎干细胞生长的方法，所述方法包括使所述细胞接触根据权利要求33～37中任一项的生物相容性材料。

62.一种促进胚胎干细胞的神经元分化的方法，所述方法包括使所述细胞接触根据权利要求34～37中任一项的生物相容性材料。

63.一种促进胚胎干细胞分化的方法，所述方法包括使所述细胞接触根据权利要求38～40中任一项的生物相容性材料。

64.一种促进源自原代神经元细胞的神经突沿限定方向向外生长的方法，所述方法包括使所述细胞接触根据权利要求41～46中任一项的生物相容性材料。

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