CN109310502A - 用于改变活细胞生理机能的表面形貌 - Google Patents

Abstract

本发明涉及表面形貌，其能用于通过物理刺激调节细胞群的形态、增殖、生化功能、分化、附着、迁移、信号传导和/或细胞死亡。这些形貌可以在体外和体内应用以调节细胞行为。具体实例包括具有调节免疫应答的本发明的形貌的植入物，或增加骨生成的植入物。本发明还涉及用于体外调节细胞行为的物体。

Description

用于改变活细胞生理机能的表面形貌

技术领域

本发明涉及已发现的通过物理刺激调节细胞生理状态(诸如，但不限于，细胞群的形态、增殖、生化功能、分化、附着、迁移、信号传导和/或细胞死亡)的表面形貌。此外，本发明涉及设置有至少一种这样形貌的物体，其可以在体内或体外用于改变细胞行为，还涉及使用这些物体改变细胞行为的方法。

背景技术

众所周知，细胞能与表面接触并相互作用。在自然界中，细胞与其环境之间的直接物理相互作用是其正常生理行为的一部分。当细胞在其自然环境外(例如在细胞培养皿)中培养时，或当细胞暴露于非自然环境时(例如当暴露于诸如髋关机植入物或起搏器的医疗植入物的情况时)，其生理机能通常与其原始环境中的不一样。已付出许多努力来在体外和植入物表面上优化这些细胞的应答。

例如，在细胞培养物中，细胞在合适的培养基中时可以将其放置在表面上，目的是使这些细胞尽可能自然地增殖，和/或呈现出特定的生物学特性(诸如分化，和/或对特定的化学刺激、物理刺激或电刺激的应答)。改变细胞行为的常规策略是添加具有改变细胞应答作用(诸如增殖的变化或诱导分化)的各种各样的激素、化合物、生长因子、酶、盐等。然而，尽管可以在表面上实现这样的改变，但是在这些常规培养物中改变细胞行为通常是通过激素、化合物、生长因子、酶、盐等与细胞表面和/或细胞内部相互作用的化学诱导。在这种常规培养物中以及医学植入物上，通常未考虑存在于表面上的潜在微图案。

最近，发现细胞行为受物理相互作用的影响。例如，已经表明，以由化学蚀刻和/或机械喷砂引起的表面微粗糙度为特征的钛基植入物改善了将植入物桥接到骨/牙齿组织的新形成组织的机械强度[Buser D et al.Int J Oral Maxillofac Implants 1998；13(5):611–619.,Buser D et al.J Biomed Mater Res 1999；45(2):75–83.]。

已经在不同细胞类型中观察到细胞水平上的形貌诱因的影响。例如，与光滑基质相比，在以纳米形貌为特征的表面上培养时，肝细胞附着、形态和功能显著地改善[You Jet al.ACS Appl.Mater.Interfaces 2015；5:12299-12308.]。

附图说明

图1a、图1b：包含(a)一个和(b)两个突起元件的两个相邻突起的示意性俯视图。(虚构的)样本线指出了用于确定两个相邻突起之间的平均距离的方法。

图1c、图1d：包含(c)一个和(d)两个突起元件的2×2突起图案的3D示意性俯视图。指出了突起、凹壁、凹壁截面和凹壁穿孔。

图2：形貌H1-H10影响培养中的恒河猴来源肝细胞。(a)用来分析分析截面内附着细胞的数量和(b)用来分析由细胞覆盖的表面区域。在(c)未图案化(NP)基质和(d)以形貌H3为特征的基质上培养的细胞的可视化。条件：所有基质均无胶原蛋白涂层，培养31天，NP作为对照，其水平用红线表示。

图3：形貌H3、H4、H5、H6和H8影响培养中的恒河猴来源肝细胞。(a、d)用于分析分析截面内附着细胞总数，(b、e)用于分析细胞覆盖的表面积，而(c，f)第8天(a-c)和31天(d-f)后的疟疾寄生虫感染效率。条件：所有基质均无胶原蛋白涂层。

图4：形貌H3、H4、H5、H6和H8影响培养中的原代人源肝细胞(PHH)。分析(a，c)在分析截面内附着的细胞总数和(b，d)在培养(a，b)14和(c，d)30天后细胞覆盖的表面积。条件：所有含有和不含胶原蛋白涂层的基质均包括NP(对照)，以胶原蛋白夹心作为基准。

图5.形貌H3、H4和H8影响培养中的原代人源肝细胞(PHH)。分析了14天后的肝细胞功能的生物标志物的mRNA水平，包括(a)HNF4α、(b)白蛋白和(c)Cyp3A4。条件：所有含有和不含胶原蛋白涂层的基质均包括NP(对照)，以胶原蛋白夹心作为基准。红线表示第3天胶原蛋白夹心中表达的标志物的水平(设定为1)，并用于标准化所有其他样品(倍数诱导)。

图6.形貌H3影响培养中的人源肝细胞(PHH)。分析了长达24天的肝细胞功能的生物标志物，包括(a)HNF4α、(b)白蛋白和(c)Cyp3A4、(d)Cyp2C9、(e)Cyp1A2和(f)E-钙粘蛋白(E-cad)。条件：所有含有和不含胶原蛋白涂层的基质均包括NP(对照)、胶原蛋白夹心作为基准。红线表示第3天胶原蛋白夹心中表达的标志物的水平(设定为1)，并用于标准化所有其他样品(倍数诱导)。

图7a、图b：以2种不同形貌为特征的钛植入物的组织切片的2个典型图像，其中，2种不同型膜是用植入8周后与骨组织接触的成骨特性而选择的。

图8：形貌O1、O6和O7影响体内成骨特性。(a)用于分析从骨中分离植入物所需的拉拔力和(b)用于分析与骨直接接触的植入物表面的百分比。条件：在兔子中植入4周和8周，以表面形貌O1、O6和O7为特征的植入物，对照包括未图案化的植入物。

图9.形貌影响体外巨噬细胞附着和异物巨细胞形成。典型图像显示了第10天表面形貌I1(中间)和I5(右)与未图案化基质(左，对照)的效果。箭头表示异物巨细胞(FBGC)。

图10.形貌I1、I2、I5、I6和I7影响体外免疫调节。(a)分析了每平方毫米的细胞(单核细胞和多核细胞)总数，(b)分析了每平方毫米的异物巨细胞(多核细胞)总数，而(c)分析了每个细胞的平均细胞核数，每个条形图上方显示的数字表示一个细胞中的最大细胞核数。包括未图案化的样品(NP)作为对照。条件：培养10天，从单核细胞分离物开始。

图11.形貌I1、I2、I5、I6和I7影响体内免疫调节。(a、e)分析了免疫细胞的浸润，(b、f)分析了FBGC形成，(c、g)分析了纤维化和(d、h)分析了在第9天(a-d)和第60天(e-h)纤维化囊厚度。条件：小鼠皮下植入，包括NP(对照)、硅弹性体(SE，参考材料)和空伤口(emptywound)(假手术组)。条形图表示第25-第75百分位水平，中间线表示中位数；并且“误差条”是测量的最低和最高水平。

具体实施方式

一般(generic)实施方案：用于调节细胞应答的表面形貌

本发明涉及表面形貌，还涉及包括设置有一个或更多个这种形貌的表面部分的物体。所述表面形貌由表面部分上存在规则间隔的突起形成，并且可以由两个替代定义来限定。在一个定义中，所述表面形貌可以由相邻突起之间的平均距离、突起的顶表面区域和表面部分的覆盖率来限定，且还由突起的长和宽(“突起”-定义)来限定。在另一个定义中，所述形貌可以由位于突起之间(“凹处”-定义)的凹处来限定。这些定义起形貌的两种可替代的数值表示的作用。

“突起”定义

本发明提供一种物体，包括设置有一个或更多个形貌的表面部分，所述形貌能够通过物理刺激调节细胞群的形态、增殖、生化功能、分化、附着、迁移、信号传导和/或细胞死亡，并且其中所述形貌包括设置有突起的规则图案的表面，所述突起包括一个或更多个突起元件，所述突起元件被定义为高于表面的部分，所述表面具有顶表面区域和圆周侧面，所述圆周侧面将所述表面与顶表面相连，其中每个突起元件在表面上方的最大高度为0.5至50μm，并且其中：

a)相邻突起之间的平均距离为0至50μm；

b)突起的顶表面区域为1至6000μm²；和

c)突起覆盖3％至90％的表面。

优选地，本发明的物体具有如下的突起或突起元件的长度和宽度：

a)如果突起包括一个突起元件：

突起的长为0.01-100μm，定义为平行于表面的顶表面区域的圆周内拟合的最长直线的长度；

突起的宽为0.01-100μm，定义为垂直于所述长，平行于表面的顶表面区域的圆周内拟合的最长直线的长度；

b)如果突起包括多于一个的突起元件：

每个突起元件的长为0.01-100μm，定义为平行于表面的顶表面区域的圆周内拟合的最长直线的长度；

每个突起元件的宽为0.01-100μm，定义为垂直于长，平行于表面的顶表面区域的圆周内拟合的最长直线的长度；

相同突起的相邻突起元件的两个圆周之间的平均距离为0-50μm。

形貌包括具有突起的规则图案的表面。突起由一个或更多个突起元件组成，该元件是在形成突起的表面上方升高的表面部分，即围绕相关突起或突起元件的表面。每个突起元件由升高的表面部分和顶表面区域以及将顶表面区域与表面连接的圆周侧面定义。升高的表面部分是顶表面区域和圆周侧面的总和。一个突起可以被定义为单个突起元件，但是一个突起也可以包括多个突起元件。在一个优选实施方案中，突起包括单个突起元件。在另一个优选实施方案中，突起包括至少两个突起元件。

因此，突起是表面上的小凸起或凸起组。突起定义了在其之间的物体表面中的三维凹处网络。已经发现具有特定尺寸、形状和构造的突起规则图案带来这样的形貌：其能够通过物理刺激调节细胞群的细胞应答、最显著地调节形态、增殖、生化功能、分化、附着、迁移、信号传导和/或细胞死亡。

规则图案可以由交叉网格线的网格定义，其中网格可以覆盖在在表面上，该网格线定义单元格的图案，使得每个单元格包括最多一个突起最大值。因为交叉网格线的网格不需要在物理上存在，但优选地是用于定义规则图案的假想方式，单元格可以具有任何形状。优选地，单元格具有矩形，尤其是正方形、梯形、三角形或六边形形状。

在上下文中的规则图案意味着由m个单元格组成的形貌的任意截面，例如以n×n排列，在与该截面相邻的截面中重复出现。优选地，m和n为1，但m可以是4-16，并且n可以是2-4，特别是在单元格包括不同形状或不同取向的突起的情况下，或者在三角形、六边形或梯形单元格的情况下。

单元格可以例如具有1至10000μm²之间，优选1至2500μm²之间，更优选25至2000μm²之间，更优选100至1000μm²之间的表面积。在正方形或矩形单元格的情况下，单元格可具有(1-100)μm×(1-100)μm，优选地(1-50)μm×(1-50)μm的长度×宽度的尺寸。在高度优选的实施方案中，单元格是正方形并且具有5μm×5μm至45μm×45μm、优选5×5至30μm×30μm，例如5μm×5μm、10μm×10μm、15μm×15μm、20μm×20μm、25μm×25μ或28μm×28μm的长×宽尺寸。

由交叉网格线的图案定义的每个单元格具有单个突起的最大值，该突起可以由如上定义的多个突起元件组成。优选地，每个单元格包括同等尺寸的突起，即每个单元格包括彼此相同的突起。突起的尺寸定义为总特征，包括例如突起的高度、突起元件在单元格内的数量和相对位置、每个突起元件的长和宽、圆周侧面相对于表面的角度，以及每个突起元件的顶表面区域的形状。

突起或至少其一个突起元件的高度在表面上方0.5至50μm之间。也就是说，每个突起元件的高度可以在表面上方0.5和50μm之间，即使在突起包括多个突起元件的情况下，突起中的各种突起元件的高度在所述边界内可以是不同的。然而，每个突起元件的高度优选是相同的。高度被测量为表面上方，尤其是在单元格内的周围表面区域之上的突起或突起元件的顶表面区域的最大高度。

进一步优选地，突起的高度可以为1至45，优选地为2至40μm，更优选为3至35，更优选为4至30μm，甚至更优选为5至28μm，甚至更优选为6至28μm。

只要获得突起的规则图案，一个单元格内的突起元件的数量和相对位置可以与另一个不同。也就是说，可以定义包括相同或不同突起的两个或更多个不同的单元格，这些单元格放置于规则图案中，例如在表面上规则地交替。在具有相同尺寸的突起的三角形或梯形单元格的情况下，这可以引起具有不同取向的相同突起的规则图案，例如在表面上交替相反的取向。在具有单个但不同的突起的两个不同的正方形单元格的情况下，所述单元格的交替图案引起所述突起的行的规则图案，该行取向平行于单元格的边缘，或者平行于单元格的对角线。或者，所有具有相同突起的正方形单元格可以在表面上不同地取向，以便获得其中突起以不同取向规则地分布的表面。

通过应用单元格的概念可以设计出无数种获得突起规则图案的方法，并且可以用于本发明。然而，优选地，正方形、矩形和六边形单元格都沿相同方向取向，而三角形单元格交替地取向。进一步优选地，所有单元格包含相同的突起。

每个突起的长(或者在包括多个突起元件的突起的情况下，每个突起元件的长)被定义为平行于表面的顶表面区域的圆周内拟合的最长直线的长度。

在仅包括单个突起元件的突起的情况下，突起的长为0.01-100μm。优选地，长为0.5-50μm，更优选1-40μm。

在包括多个突起元件的突起的情况下，突起元件的长为0.01-100μm。优选地，长为0.1-45μm，更优选为0.5-40μm，甚至更优选为1-30μm。

每个突起的宽(或者在包括多个突起元件的突起的情况下，每个突起元件的宽)被定义为垂直于长，平行于表面的顶表面区域的圆周内拟合的最长直线的长度。

在仅包括单个突起元件的突起的情况下，突起的宽为0.01-100μm。优选地，宽为0.5-50μm，更优选1-40μm

在包括多个突起元件的突起的情况下，突起元件的宽为0.01-100μm。优选地，宽为0.1-45μm，更优选为0.5-40μm，甚至更优选为1-30μm。

此外，在包括多个突起元件的突起的情况下，在单元格内突起元件的数量和相对位置是突起的尺寸的重要特征。

同一突起的相邻突起元件之间的平均距离是通过以下方式确定的：将彼此面对的突起元件的侧面划分为约0.4μm的相等线段，并确定第一突起元件的每个线段到面对的相邻突起元件的线段的距离(见图)。所有距离的平均值是突起元件之间的平均距离。当然，当突起包括多于两个的突起元件时，一个突起元件到相同突起的第二突起元件的平均距离可以与同一突起元件到同一突起的第三突起元件的平均距离不同。在表面和突起元件的圆周侧面之间的角度不是90°的情况下，相邻突起之间的平均距离决定于突起高度的一半。应用相同类型的计算来确定两个面对的突起之间的平均距离，如图1a和1b中所示。在上下文中“面对”意味着相邻突起之间的距离是基于在这些突起之间延伸的线段确定的，这些线段跨越最短的突起的长。

通常，两个突起之间的平均距离为0-50μm，优选为0.5-40μm，甚至更优选为1-30μm，甚至更优选为2-25μm。同一突起中的两个突起元件之间的平均距离被类似地定义。在一个更优选的实施方案中，如果在一个方向上两个相邻突起之间的平均距离为0，则相邻突起之间在垂直于该距离的方向上的平均距离应大于0。在一个更优选的实施方案中，在任何方向上相邻突起之间的平均距离大于0。

而且，可以通过确定面对的突起之间的最短距离和最长距离来定义表面形貌。最短距离由如上定义的最短直线定义，用于计算在两个相邻突起或突起元件之间绘制的平均距离。最短距离优选为0-50μm，更优选为0-40μm，更优选为0-20μm，并且更优选为0-10μm。在进一步优选的实施方案中，最短距离为1-50μm，优选2-40μm，更优选3-30μm，甚至更优选4-20μm。

最长距离被定义为如上所定义的最长直线，用于计算在两个相邻突起或突起元件之间绘制的平均距离。最长距离可以是0-50μm，优选0.5-40μm，更优选1-35μm。在进一步优选的实施方案中，最长距离为2-50μm，优选3-40μm，更优选4-30μm，甚至更优选5-20μm。

突起元件的圆周侧面可以在侧面与表面相交的位置处，与表面具有0°和180°之间的任何角度。90°的角度定义为垂直于表面，且0°和90°之间的角度定义为顶表面区域大于表面的升高部分的情况，以至于顶表面区域至少部分覆盖表面。90°和180°之间的角度定义为顶表面区域小于表面的升高部分的情况。表面的升高部分被定义为突起在其与表面相交的点处的圆周。由此，0°和90°之间的角度引起具有悬挂(hangs over)在表面上的顶表面区域的突起元件，而90°和180°之间的角度引起朝向顶表面区域逐渐上升(rise gradually)的突起元件。

优选地，突起或突起元件(优选整个突起或突起元件)的至少一部分的圆周侧面，与表面成45°和135°之间的角度，更优选地在60°和120°之间，甚至更优选在75°和115°之间，以及甚至更优选在80°和100°之间。最优选地，突起或突起元件的至少一部分，优选整个突起或突起元件的周向侧面，在侧面与表面相交的位置处基本上垂直地延伸至表面，诸如以88-92°的角度。在进一步优选实施方案中，在侧面与表面相交的位置处，所有突起元件与表面具有大约相同的角度。

每个突起元件的顶表面区域的形状也是突起尺寸的重要特征，并且还可以称为突起(或突起元件)的形状。这是因为这种形状定义了凹壁的形状，相邻组织的细胞可以在凹壁上生长以提供固定。顶表面区域的圆周形状被确定平行于表面。由此，其是突起元件的俯视图，其可以具有任何几何形状。在一些实施方案中，该形状可包括圆形、椭圆形、三角形、正方形、矩形、梯形、五边形、六边形、七边形或八边形。这种通常已知的形状在本文中将被称为基本形状。在进一步的实施方案中，该形状可包括基本形状的组合。

在一些实施方案中，每个突起/突起元件的顶表面区域的形状可以不是单个几何形状，例如正方形、三角形、圆形、八角形、五角星形、六角形、三角星形(3-pointed star)、半月形、或角被取出的圆形(“吃豆人”(“pacman”))。在一些实施方案中，形状可以不是圆形、椭圆形或诸如多边形、三角形、矩形、正方形、六边形、星形、平行四边形的形状。

在一些实施方案中，突起可具有如表1中所示的形状。在其他实施方案中，形貌不包括如表1中所示的形状的突起。在一个实施方案中，形貌不具有来自表1的形状1。在另一个实施方案中，形貌不具有来自表1的形状2。在另一个实施方案中，形貌不具有来自表1的形状3。还在其他实施方案中，形貌独立地不具有来自表1的形状3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32。在一些实施方案中，形貌不包括表1中形貌的选择，并且在进一步的实施方案中，形貌不包括表1中的所有形状。

表1

在优选实施方案中，顶表面区域是定位于基本上平行表面的表面，尽管顶表面区域可以是略微凹入或凸出的，诸如例如略微圆顶形的。

特别优选的突起(或突起元件)包括基本形状的重叠或相邻组合，优选地通过一个或更多个桥接或重叠部分互连，以便获得复杂的形状。已经发现，通过具有特定定义的复杂形状的突起通过物理刺激调节细胞群的细胞应答、最显著地调节形态、增殖、生化功能、分化、附着、迁移、信号传导和/或细胞死亡的效果，不仅受突起的尺寸影响，而且单独受突起(或突起元件)的形状的影响。对于具有相似高度、重量、长和宽但具有不同形状的突起，对物理刺激表面部分的细胞应答具有明显的影响。在实施例中将进一步阐述突起形状通过物理刺激调节细胞群的形态、增殖、生化功能、分化、附着、迁移、信号传导和/或细胞死亡的个体影响。

在突起(或突起元件)包括基本形状的组合的情况下，可以获得复杂的形状。复杂形状可包括重叠或相邻的圆形、椭圆形、三角形、正方形、矩形、梯形、五边形、六边形、七边形或八边形。在相邻的基本形状的情况下，相邻的基本形状优选地通过重叠(桥接)部分连接，使得基本形状的俯视图具有比单独的基本形状的表面区域更大的表面积。相对于单独形状的增加的表面区域优选地位于基本形状之间，有效地增加了基本形状之间的任何接触点的宽度。

进一步优选地，突起(或突起元件)的圆周侧面是通过角度连接的连续侧面，连续侧面可以是连接的一系列直线部分。或者，直线段和/或角度可以平滑地弯曲，以便获得平滑弯曲的圆周侧面。

在这种情况下，平滑弯曲的圆周侧面意味着圆周侧面仅具有圆角。拐角可以源于它们存在的形状，诸如正方形、三角形和六边形中的拐角，但是这些拐角也可以源于突起元件中两个相邻形状之间的接触点，或者来自突起元件中两个基本形状之间存在的重叠(或桥接)的部分。也就是说，在这种意义上的拐角指的是当以俯视图观察突起时的拐角。当突起元件的圆周侧面中的所有拐角都是圆形时，获得平滑弯曲的圆周侧面。

在优选实施方案中，突起具有复杂的形状。复杂形状是基本形状的组合，其中基本形状作为单个突起元件存在，或者作为重叠或相邻的基本形状存在。通过圆周侧面中的拐角数量进一步定义复杂形状。在这方面，拐角可以是直的或圆的拐角，并且可以定义为圆周侧面(俯视图)中的方向的任何变化。采用长度为圆周侧面长度的5％的线的形状的角将被称为“弯曲”。圆周侧面中的直线将被称为“直线”。

拐角可以是窄的或宽的。窄拐角是角度小于90°的角。也就是说，窄拐角引起形状的“”(spike)”，该刺突相对于突起向内或向外。宽拐角是突起的圆周侧面展示大于90°的角度的角。直角是角度为90°的角。

复杂形状被定义为具有至少一个宽拐角的形状，其中优选地，窄拐角的数量与宽拐角的数量不同。或者，复杂形状包括至少一个弯曲(优选至少两个或至少三个)，和至少一个拐角(优选至少两个，更优选至少三个拐角)。在进一步可替代的优选实施方案中，复杂形状包括至少一个弯曲和至少一个直线。在进一步优选的实施方案中，复杂形状是包含多于两个直线的形状，优选多于三个，更优选多于四个，其中至少75％(优选至少85％，更优选至少95％)的直线的长度不同。在其他优选实施方案中，复杂形状包括至少3个弯曲。

到特定单元格中与突起相邻(或面对)的突起是存在于与该特定单元格共用侧面的单元格中的突起。相邻的单元格被类似地定义。仅与特定单元格共享一个拐角的单元格不相邻。给定突起的规则图案，例如，一个突起在三角形单元格的情况下与三个突起相邻，在梯形、方形或矩形单元格的情况下与四个突起相邻，在六边形单元格的情况下与六个突起相邻。

突起的顶表面区域被定义为突起在其最高圆周处的表面区域。由上可知，如果突起包括多个突起元件，则突起的顶表面区域是突起的所有突起元件的所有表面区域的总和，每个都在突起元件的最高圆周处确定。突起的顶表面区域可以通过例如计算构成突起(或突起元件)的顶表面区域的像素的数量(作为0.4μm×0.4μm元(elements))来确定。

突起的顶表面区域为1至6000μm²之间，优选10至3000μm²，更优选20至1500μm²之间，更优选25至1000μm²之间，甚至更优选30至750μm²之间。

突起的覆盖率定义为顶表面区域相对于被突起覆盖的整个区域的百分比。因此，覆盖率是所有顶表面积的总和除以表面形貌的总面积，乘以100％。这与计算包括突起的顶表面区域的单元格的百分比相同。

突起覆盖表面部分的3％至90％之间，优选地在表面部分的5％至80％之间，更优选地在10％至75％之间，更优选地在20％至70％之间，更优选地在30％至65％之间。因此，突起覆盖单元格的3至90％之间，优选单元格的5至80％之间，更优选单元格的10至75％之间，更优选单元格的20至70％之间，更优选单元格的30至65％之间。

“凹处”的定义

如上所述，突起的规则图案同时定义了凹处的图案。因此，本发明的表面形貌可替代地由通过物理刺激调节细胞群的形态、增殖、生化功能、分化、附着、迁移、信号传导和/或细胞死亡的表面部分定义，其包括设置有由突起的规则图案定义的凹处的规则图案的顶表面，该凹处形貌包括凹底、第一凹壁和第二凹壁，该第一凹壁包括第一凹壁截面和可选的第一凹壁穿孔，而该第二凹壁包括第二凹壁截面和可选的第二凹壁穿孔，其中所述第一和第二凹壁截面由与凹处邻近的突起的侧面定义，并且其中所述第一和第二凹壁穿孔被定义为这样的凹壁部分：在该凹壁部分处，垂直于凹处且平行于凹底的线不接触与凹处相邻的突起，且其中

a)凹壁的高度为0.5-50μm，定义为垂直于凹底，从凹底到顶表面区域的距离；

b)第一和第二凹壁的凹壁外廓独立地为0-40μm。

c)第一和第二凹壁截面的长独立地为0.01-100μm。

d)如果有第一和第二凹壁穿孔，其长独立地为0-50μm。

e)凹处的平均宽为0-50μm。

顶表面区域已如上进行了定义，并且是由突起的所有顶表面区域定义的区域。在突起之间，定义了一系列凹处。凹处由两个凹壁定义，凹壁包括与凹处相邻的突起的圆周侧面的那些截面。凹壁是，在凹处的方向上，与凹处相邻的突起的圆周侧面的那些部分的假想直线平均值。见图1c和1d。

因此，凹壁包括凹壁截面，其中凹壁截面由与凹处邻近的突起的侧面(即，突起的圆周侧面的一侧)定义。因此，凹壁截面是凹壁上的假想直线，其长度由突起的存在定义。在沿一个方向接触突起的情况下(即，在规则图案的一个方向上相邻突起之间的平均距离为0的情况下)，该方向上的凹壁仅包括凹壁截面，而不包括凹壁穿孔。

然而，在优选实施方案中，突起是单独间隔开的突起，即与所有相邻突起间隔开使得所有方向上的平均距离大于0，凹壁进一步包括凹壁穿孔。

凹壁穿孔被定义为这样的凹壁部分：在该凹壁部分处垂直于凹处且平行于凹底不接触与凹处相邻的突起。因此，其是没有凹壁截面的凹壁的一部分，即没有突起与凹处相邻的的凹壁中的点。见图1c和1d。

根据突起的形状，所述第一和第二凹壁定义了可以相同或不同，并且具有相同或不同的凹壁外廓(profile)的凹处。

凹底被定义为位于突起之间的表面，在距离顶表面区域尽可能最远处。凹底可能由于加工而具有一些微小的曲率，在这种情况下，凹底从第一凹壁上升的点延伸到第二凹壁上升的点。因此，其也可以由形成凹处的突起之间的平均距离定义。

与突起的高度一致，凹壁的高度为0.5-50μm，定义为垂直于凹底从凹底到顶表面区域的距离。优选地，凹壁的高度为1至45μm，更优选为2至40μm，更优选为3至35μm，更优选为4至30μm，甚至更优选为5至28μm，甚至更优选为6到28μm。

凹壁由与凹处相邻的突起的形状定义。由于这些形状可能是不规则的，凹壁也由凹壁外廓定义。在这方面，凹壁外廓被定义为垂直于凹壁的方向上的偏差，并且仅基于凹壁截面计算。凹壁中的任何谷壁穿孔都不包括在计算中。

凹壁外廓表示为凹壁截面的每个点距凹壁的距离的算术平均值。其通常表示为

其中R_a是凹壁外廓，并且其中n是数据点的数量，并且其中|y_i|是一个正数，表示到垂直于凹壁的凹壁段的距离，即垂直于凹壁截面的平均表面。n的大小通常取决于用于测量R_a的装置的分辨率，其可以例如是0.4μm，在这种情况下，n是以μm为单位的凹壁截面的长度。R_a可以适当地通过对表面形貌的俯视图的进行数学分析来确定。

凹壁外廓在0和40μm之间，优选地在0.1和30μm之间，更优选地在0.5和15μm之间，甚至更优选地在0.8和10之间。凹壁外廓为0表示定义凹壁的所有突起都具有平行于凹处的直线，诸如可以在正方形或矩形突起的情况下发生。当然，根据突起的形状，第一和第二凹壁的凹壁外廓可以不同。如本文使用的，“外廓”，或凹壁外廓等词，可以等同于术语“粗糙度”，尽管术语“粗糙度”通常应用于表面的表面粗糙度，其由垂直于表面的垂直方向上的平均表面(对于水平表面)的偏差决定。在当前情况下，凹壁外廓是凹壁的粗糙度，即包含在水平定向的形貌上的垂直表面的粗糙度，其由平均凹壁在平行于表面形貌并垂直于凹壁的方向上的偏差确定。

在平行于表面的顶表面区域的圆周内拟合的最长直线平行于凹壁的情况下，凹壁截面的长能与突起的长度相同。在其他情况下，凹壁截面比突起(或突起元件)的长要短。因此，凹壁截面的长为0.01-100μm，优选地，凹壁截面的长度为0.05-50μm，更优选为0.1-40μm。根据定义凹处的突起的形状，在定义凹处的两个凹壁中的凹壁截面的长度可以相同或不同。

凹壁穿孔的长通常为0至50μm，优选为0.5-40μm，更优选为1-30μm，甚至更优选为2至25μm之间。凹壁穿孔本身定义了凹处，该凹处相对于目标凹处垂直取向。根据定义凹处的突起的形状，第一和第二凹壁中的凹壁穿孔的长可以相同或不同。

凹处的平均宽在0到50μm之间。凹处的平均宽与突起、或突起元件之间的平均距离一致，并且通过将凹处的相对侧上的凹壁段划分为约0.4μm的线段，并且确定在凹处的一侧上的凹壁截面的每条线段和在(相同)凹处的另一侧上的相邻突起的凹壁线段的齿面与轴面交线线段之间的距离，然后平均这些距离来计算。平均凹处宽是两个相邻突起之间的平均距离。

凹处的平均宽优选为0.5至40μm之间，更优选为1至30μm之间，更优选为2至25μm之间。

或者，凹处的宽可以由同一凹处的相对侧上的相对突起之间的最短和最长距离定义，与上面定义的相对突起之间的最短和最长距离一致。

在一个更优选的实施方案中，表面形貌包括单独间隔开的突起，其不接触相邻的突起。因此，突起之间的距离(即凹处的宽)大于0，并且每个凹壁包括凹壁穿孔。在该实施方案中，获得了横向凹处的规则图案。在该实施方案中，每个凹壁包括凹壁截面和凹壁穿孔。

因为，至少多个突起或突起元件的侧面优选在在侧面与表面相交的位置处基本垂直地向表面延伸，其凹壁还优选相对于凹底基本上垂直。凹壁相对于凹底可以具有的角度被定义为与圆周侧面与表面具有的角度一致。

因此，在形貌仅包括含有单个突起元件的单一类型的突起的情况下，所有凹壁截面具有相同的外廓(其由与凹处相邻的突起的圆周侧面定义)。在这种情况下，凹壁截面与凹壁穿孔交替，所述穿孔都具有相同的长度。

在形貌包括含有多个突起元件的突起的情况下，或者在形貌包括不同形状或不同定向的突起的情况下，单个突起定义多个凹壁截面，其可具有不同的外廓，以及多个凹壁穿孔，其可以为不同的长度。在这种情况下，凹壁截面以规则的顺序与凹壁穿孔交替。

物体

如上定义的形貌优选存在于具有包括金属、聚合物、复合材料或陶瓷材料的表面部分的物体上。表面部分可以是物体的外表面或内表面部分。外表面部分是当细胞与物体接触时，可以与位于物体外部的细胞自由接触的表面部分。外表面或内表面部分可包括洞、穴或孔。

合适的材料是本领域已知的，并且包括在手边适用于应用的任何材料。也就是说，为了将本发明的形貌应用于例如反应器，应该使用适于构建反应器的材料。类似地，为了将本发明的形貌应用于植入物上，应该使用适于构建植入物的材料。技术人员知道什么类型的材料适合于何种类型的应用，并且能够相应地选择适当的材料。合适材料的实例是钛(例如用于硬(整形外科或牙科)医用植入物)、聚氨酯(例如用于腹部网状物和美容用植入物)，和聚苯乙烯(例如用于体外培养器皿)。

包括根据本发明的一个(或更多个)形貌的物体可以通过已知的用于在特定材料上形成特定形状的微结构的任何技术来制造。技术人员知道什么类型的技术适合于什么类型的材料。合适技术的实例是3D打印、激光打印、写入(writing)、逐层涂覆、静电纺丝、沉积技术、喷涂和溅镀、冲压、(热)压制、(热)压花、(纳米)压印、(注射)制模、铸造、蚀刻、激光加工、激光切割和烧蚀、(精密)电化学加工、(精密)电化学网格化和(精密)电火花加工等。

本发明的物体优选地通过将形貌激光加工、精密技术、雕刻、打印、涂覆、冲压或蚀刻到物体上来制造。或者，可以在单个工艺(诸如通过注射制模)中形成具有形貌的物体。获得具有所述形貌的物体的合适技术在本领域中是公知的。

如本领域中已知的，可以通过在金属、聚合物、陶瓷、复合材料或其他基质的表面部分上采用3D打印、激光打印和写入表面突起来实现打印。

可以通过在基质上产生突起然后使用喷涂、溅镀、逐层涂覆、静电纺丝，或从溶液沉积来涂覆表面部分来实现涂覆。

可以通过首先制造包含负定型的突起的模具然后通过使用诸如压制、热压制、压花、热压花、压印和纳米压印的技术将该模具冲压到表面部件上来实现冲压。其他技术包括注射制模、熔体加工或铸造，也是可能的。

蚀刻可以通过使用液体和/或蒸气形式的不同溶剂，诸如酸和/或有机溶剂，以及合适的保护层(mall)，诸如去除未被保护层保护的表面部分的部分以获得表面形貌来实现。激光加工、雕刻和烧蚀技术也可用于将形貌雕刻到合适材料的表面中。精密技术可包括(精密)电化学加工，(精密)电化学网格化，(精密)电火花加工。

在一个更优选的实施方案中，包括突起的规则图案的形貌是物体的不可分离部分。这可以通过将形貌冲压、打印、蚀刻、涂覆到物体上或通过使用上述提及的其他方法来实现，例如通过在单个工艺中诸如通过注射制模来形成物体而实现。

突起(凹底)、圆周侧面(凹壁截面)和/或突起的顶表面区域之间的表面可以是光滑的或基本上光滑的，即具有约0(即0±0.01μm)的粗糙度。

然而，在一个可选实施方案中，突起和/或顶表面区域和/或圆周侧面之间的表面可具有粗糙度，通常缩写为R_a，为0.01μm-10μm，优选0.05-8μm，甚至更优选地0.1-5μm。此外，粗糙度可以是0.2-20或0.15-3μm。在这方面，粗糙度是通过在形成形貌之前或之后蚀刻、喷砂或刷涂表面部分等技术获得的表面粗糙度。因此，通过相同的公式缩写和计算的凹壁外廓，能看作垂直于该表面的凹壁的粗糙度。

粗糙度可以使用原子力显微镜分析来确定。可以通过常规蚀刻、涂刷、喷砂等获得表面形貌的随机粗糙化的表面部分，该表面形貌包括突起的规则图案。或者，可以在形成本发明的表面形貌之后，首先使的平坦表面部分，诸如植入物的表面部分，粗糙化。

重要的是，任何随机粗糙的表面部分仍然包括本发明的突起，使得随机粗糙的表面部分可能不具有大于突起的高度和/或宽度的粗糙度，以至于用这些尺寸表明的突起在其他地方仍然存在。

本发明的形貌是由许多规则间隔的突起组成的表面形貌。因此，包括突起的单元格分布在表面部分上，以便提供如上所述的单一形貌。单个形貌中的单元格数量优选为至少50，更优选至少100，甚至更优选至少200，甚至更优选至少500，甚至更优选至少1000。在相当大的表面部分上延伸的形貌可能对大细胞集合(诸如特定组织)的功能具有高度潜在影响。这被认为适合于体外使用，诸如细胞培养物或组织的生长，或体内使用，诸如植入物的产生。

本发明的形貌能够通过物理刺激调节细胞群的细胞应答，最显著地调节细胞群的形态、增殖、生化功能、分化、附着、迁移、信号传导和/或细胞死亡。也就是说，本发明的形貌能够通过诱导形态、增殖、生化功能、分化、附着、迁移、信号传导和/或细胞死亡的变化来改变一种或多种活细胞的行为。所述行为由物理刺激改变。

在上下文中的物理刺激意味着引起行为改变的信号通过细胞所处的周围环境的形状、硬度和大小，即形貌来转移。细胞的“周围环境”直接调节细胞。物理刺激意味着表面形貌本身在各个方面改变细胞的应答，其中细胞形态、增殖、生化功能、分化、附着、迁移、信号传导和/或细胞死亡，并且这种应答对于不同的形貌是不同的。在所有其他参数保持相同的情况下，通过改变与细胞或细胞群接触的表面形貌，可以影响细胞的形态、增殖、生化功能、分化、附着、迁移、信号传导和/或细胞死亡。

例如，在具有特定参数的单一形貌上的细胞培养能展现出轻微的增殖，而将形貌改变为不同的参数组可以在其他条件相同的情况下引起细胞培养展现出高增殖。

细胞群的细胞位于突起之间(即在形貌的凹处内)和/或突起的顶部之间(即形貌的顶表面区域之间)。这通过形貌最大化细胞群的物理刺激。

负责改变行为的物理刺激与化学刺激改变行为的效果不同。在化学刺激中，细胞接收的改变行为的信号的起始是通过添加的化合物或通过表面化学(例如，基体材料、涂层，或表面功能化的选择)而化学诱导的，并且随后通过与细胞表面上的受体相互作用或进入细胞与细胞内的受体分子相互作用的信号分子转移。目前观察到的改变行为的物理刺激背后的机制仍未完全了解，但实例表明，表面形貌的形状，而不是化学刺激，引起观察到的细胞群的细胞形态、增殖、生化功能、分化、附着、迁移、信号传导和/或细胞死亡的调节起始。因此，细胞的物理刺激与表面和/或环境的化学性质无关。由表面形貌的物理刺激引发的改变的细胞生理行为可能影响细胞对信号分子和受体分子的响应和相互作用。

在实施例1-7中，展现的数据已经显示了各种形貌特征材料，包括钛、聚氨酯和聚苯乙烯，对通过物理刺激不同细胞类型引起细胞群的形态、增殖、生化功能、分化、附着、迁移、信号传导和/或细胞死亡的影响。而没有形貌的相同材料没有类似地调节细胞行为。

形态的调节包括细胞形状的变化，例如展开或伸长、扁平或圆形、细胞核形状的变化、细胞或细胞核大小的变化、细胞表面积、细胞长度、细胞周长、细胞长宽比和离心率、粘着斑和伪足的存在和细胞骨架(即肌动蛋白纤维)的组织。在一些实施方案中，本发明的表面形貌不调节细胞，特别是人间充质干细胞(hMSC)的形态，。

细胞骨架由连接的纤维和小管的网络组成，其形成细胞质的背景。肌动蛋白微纤维是细胞骨架中的主要细丝。细胞骨架内肌动蛋白纤维的重组织影响细胞形状和细胞行为。

伪足是细胞质的延伸，并且由细胞通过肌动蛋白纤维的重组形成。伪足涉及诸如细胞运动和营养摄取的细胞功能。粘着斑是用于细胞粘附到基质或细胞外基质(ECM)的细胞结构。机械力和化学信号通过粘着斑从基质或ECM或其他细胞传递到细胞。因此，细胞形状似乎通过伪足和/或粘着斑的其它重定位来影响细胞功能。

细胞的形态学变化通常通过明视场或免疫荧光显微镜观察，其利用例如免疫荧光(抗体)标记或组织学染色以使细胞内的细胞质、细胞核或特定蛋白质可视化。可以使用不同的图像分析软件来量化这些形态学观察，诸如Cell Profiler。

增殖的调节包括增加或减少的增殖或有丝分裂，其可通过以下参数呈现：细胞数量、增殖速度(在特定时间点的现有细胞数量与附着或接种在基质上的细胞的初始数量的比率或者替代地，细胞群倍增所需的时间)、细胞集落的数量和这些集落内的细胞数、细胞层在基质上的汇合、细胞之间的连接。

增殖参数可以通过对染色或未染色细胞核的细胞和/或细胞质和/或细胞膜组分等进行实时或末期成像来测量，并使用合适的图像分析软件，诸如Cell Profiler，定量细胞的数量。其他技术诸如裂解细胞并测量裂解物中DNA的量、测量细胞的代谢活性、从基质上分离细胞并使用手动或自动细胞计数器对其计数也可用于定量细胞增殖。

在一些实施方案中，本发明的表面形貌不诱导增殖的调节，特别是人诱导多能干细胞(iPSC)的增殖的调节。

生化功能的调节包括发生在细胞内或与细胞相关的所有化学过程和应答。这些过程包括生物合成和细胞代谢、蛋白质合成、蛋白质转录和蛋白质分泌、酶促反应和酶表达、通过膜通道和受体的生化转运、细胞信号传导和细胞免疫应答。

分化的调节包括向某种细胞类型的分化、维持分化的或未分化的表型、维持特定的功能、从已分化的细胞类型去分化，以及向另一种细胞类型的再分化。

干细胞或祖细胞变为更分化的细胞类型称为分化。已分化的细胞表达特定的蛋白质标志物和功能。已分化的细胞可以保持相同的表型，失去其分化的表型并变成未分化的细胞(去分化)或变成另一种分化的细胞类型(再分化)。

各种已知分子生物学技术被用于分析细胞生化功能和分化状态。例如，细胞的分化可以通过使用分化特异性蛋白质(组合)的免疫荧光标记(抗体标记)与荧光显微镜或荧光激活细胞分选(FACS)组合来表征细胞的分化。其他技术可用于定量某些细胞类型的特定标志物的蛋白质或基因水平的表达，包括定量聚合酶链应答(qPCR)，或酶联免疫吸附测定(ELISA)。

细胞附着的调节包括附着于基质的细胞数量的增加或减少、细胞之间紧密连接的形成、粘着斑的形成、细胞附着中涉及的蛋白质的分泌、细胞从表面的分离、细胞彼此的分离、细胞与表面的附着强度等。

细胞附着的调节可以通过细胞质或粘着斑蛋白的免疫荧光标记，(明场，荧光或扫描电子)显微镜技术和细胞成像、裂解细胞并测量裂解物中DNA的量，测量细胞的代谢活性、将细胞从基质上分离并使用手动或自动细胞计数器对其计数等来测量。细胞附着的调节在任何涉及粘附细胞的应用中都是重要的。细胞附着是细胞与生物材料相互作用的主要步骤之一，并且基本上影响细胞和生物材料之间的所有未来相互作用。例如，促进巨噬细胞附着的生物材料可能影响纤维组织的封装水平。具有较低血小板附着的生物材料可以抑制血液凝固。

细胞迁移的调节包括某个区域中细胞的(微)运动或其朝向或重新定位到不同区域的运动。

细胞迁移的调节可以通过实时成像、延时显微镜、荧光标记等来测量。细胞迁移的调节可以影响组织发育的所有阶段，例如胚胎和成体组织形成、组织再生和更新、治疗策略发展、伤口和缺陷愈合和免疫应答。

细胞信号传导的调节包括调节细胞(细胞-细胞相互作用)之间的任何物理或化学相互作用、基因表达、蛋白质产生和分泌。

细胞信号传导的调节可以通过使用诸如免疫荧光染色、qPCR、ELISA、Western印迹等技术定量从活细胞表达或分泌的生物标志物来测量。

细胞信号传导的调节可以影响控制细胞命运和对外来生物材料的应答的所有过程，包括形态、增殖、生化功能、分化、附着、迁移和细胞死亡。

细胞死亡的调节包括增加或减少细胞凋亡(程序性细胞死亡)、坏死、有丝分裂障碍或细胞组分死亡(自噬)。

可以通过活死法(live-dead assay)、计数细胞数、凋亡标志物的免疫荧光染色等来测量细胞死亡(诸如细胞凋亡)的调节。

细胞死亡的调节(诸如细胞凋亡或坏死)可以影响用于支持活细胞的培养和生长的开发或用于疾病和癌症治疗的治愈方法而开发的系统。

在优选的实施方案中，通过物理刺激调节细胞群的细胞形态、增殖、生化功能、分化、附着、迁移、信号传导和/或细胞死亡包括细胞形态、增殖、生化功能、分化和附着的调节。在优选的实施方案中，细胞应答的调节包括细胞形态的调节。在其他优选的实施方案中，细胞应答的调节包括细胞增殖的调节。在其他优选的实施方案中，细胞应答的调节包括细胞生化功能的调节。在其他优选的实施方案中，细胞应答的调节包括细胞分化的调节。在其他优选的实施方案中，细胞应答的调节包括细胞附着的调节。

在一些实施方案中，通过物理刺激调节细胞群的细胞形态、增殖、生化功能、分化、附着、迁移、信号传导和/或细胞死亡不包括物理刺激人间充质干细胞(hMSC)以调节分化，最显著的是抑制脂肪形成分化。在其他实施方案中，此类调节不包括通过调节细胞附着、增殖和形态，或通过调节细胞形态，粘附和功能来物理地刺激肾上皮细胞。在其他实施方案中，此类刺激不包括物理地刺激诱导多能干细胞(iPSC)以在体外维持多能性增殖。

可以与本发明的形貌一起使用的细胞群不受特别限制。当需要时，在合适的培养基中，细胞群包含一种或多种活细胞。细胞群可包含单细胞类型，但也可包含多种细胞类型(诸如细胞共培养中或活组织中的)。

细胞群是真核细胞群，例如源自人、植物、动物、原生生物、酵母和真菌的。细胞可以来自任何植物、微生物或动物，并且可以来自任何类型。

在一些实施方案中，细胞不是人iPSC。在其他实施方案中，细胞不是hMSC。

哺乳动物细胞是优选的，特别是来自人、猴、牛、猪、大鼠或小鼠的细胞。进一步优选地，哺乳动物细胞包括间充质干细胞、脂肪来源的干细胞、成骨细胞、免疫应答相关细胞，其中优选巨噬细胞和肝细胞。

细胞可以以任何已知的方式获得，诸如通过从活体或死亡供体的组织中分离、通过细胞培养、通过具有更高潜力的细胞类型的分化、通过具有更具进展的分化状态的细胞类型的去分化或通过来自具有不同分化状态的细胞类型再分化来获得。从组织或活组织检查中分离细胞包括通过一种或多种酶，例如胶原蛋白酶，消化细胞的细胞外基质。由于大多数时间，组织由不同的细胞类型或细胞群组成，通常细胞分离的下一步包括细胞的纯化。可以根据细胞类型来使用其他技术获得细胞。例如，可以通过离心全血并收集含有不同类型细胞的分离层来获得血细胞。

如本领域已知的，本发明的物体可以与合适的培养基结合使用。这种培养基包含水，并且可以另外包含蛋白质(诸如胎牛血清(FBS)和生长因子)、氨基酸、维生素、葡萄糖、无机盐和抗生素等。对于本发明物体的体外应用，优选使用合适的培养基。在其他条件下，细胞可以在其他液体中培养，例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)、水、或在凝胶(诸如基质胶或琼脂糖凝胶)上培养，在涂层(如胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、纤维蛋白原或多胺)上培养或嵌入生物材料(诸如水凝胶或聚合物载体)中培养。可以使用固定溶液固定细胞并在湿或干条件下分析。

本发明还涉及通过物理刺激调节细胞群的形态、增殖、生化功能、分化、附着、迁移、信号传导和/或细胞死亡的方法，包括

1)使合适的介质中的一种或更多种细胞与设置有有规则的突起图案的表面部分接触，该突起的规则图案由交叉网格线的网格定义，该网格可以覆盖在表面部分上，该网格线定义了单元格的图案，使得每个单元格包括最多一个突起，该突起包括一个或更多个突起元件，该突起元件被定义为在高于具有顶表面区域和圆周侧面的表面的表面部分，圆周侧面连接表面与顶表面，其中每个突起元件在表面上方具有0.5至50μm之间的最大高度，并且其中

a)相邻突起之间的平均距离为0到50μm；

b)突起的顶表面区域为1和6000μm²；和

c)突起覆盖3％至90％的表面；

2)允许细胞对表面作出应答。

所述方法可以适用于下面描述的每个特定应用目的。该方法可以是体内方法，但优选是体外方法。

本发明的物体可以在体内或体外使用。

在一个实施方案中，本发明的物体通过体外物理刺激调节细胞群的形态，增殖、生化功能、分化、附着、迁移、信号传导和/或细胞死亡。体外使用包括例如在包含如上定义的形貌的表面部分上培养细胞。在该实施方案中，在本发明的物体上或中培养的细胞被直接或间接地物理刺激以改变其行为。

例如，该物体可以是例如用于培养细胞的物体，诸如培养烧瓶(culture flask)、碟、皿、载玻片、瓶子、腔室或袋子，该物体包括用于细胞培养的包含如上定义的形貌的表面。

用于体外使用的物体的形貌可以具有各种尺寸。例如，培养瓶可具有形貌特征表面，其表面积为5-10000cm²，优选10-5000cm²，更优选15-1000cm²，并且培养板的孔内存在的形貌特征表面通常每孔具有的表面积为0.01-10cm²。

本发明进一步涉及本发明物体的用途，用于通过物理刺激体外调节细胞群的形态、增殖、生化功能、分化、附着、迁移、信号传导和/或细胞死亡。该物体可以适用于下面描述的每个特定应用目的的使用。

在另一个实施方案中，本发明的物体适用于体内使用。如上所述，这样的实施方案优选是植入物，其优选地设置有通过物理刺激调节细胞生化功能、细胞附着或分化的形貌。

在体内使用的一个实施方案中，本发明涉及通过应用如上定义的物体(根据任一定义)治疗患者的方法，用于通过物理刺激调节细胞群的形态、增殖、生化功能、分化、附着、迁移、信号传导和/或细胞死亡。这些方法可以基于具有用于下面描述的每个特定应用目的形貌的物体。

在体内使用的另一个实施方案中，本发明涉及如上定义的物体(根据任一定义)用于通过物理刺激调节细胞群的形态、增殖、生化功能、分化、附着、迁移、信号传导和/或细胞死亡。该物体可以用于下面描述的任何特定应用目的。

在体内使用的又一个实施方案中，本发明涉及如上定义的物体(根据任一定义)在通过物理刺激调节细胞群的形态、增殖、生化功能、分化、附着、迁移、信号传导和/或细胞死亡的用途。该物体可以用于下面描述的任何特定应用目的。

在体内使用的另一个优选实施方案中，本发明涉及如上定义的物体(根据任一定义)在制备用于通过物理刺激调节细胞群的形态、增殖、生化功能、分化、附着、迁移、信号传导和/或信号/或细胞死亡的药物中的用途。药物可以针对下面描述的任何特定应用目的。

所有上述一般定义的本发明的方面和参数可以与上面定义的其他方面和参数组合。另外，上面定义的每个一般定义的方面和参数也适用于下面定义的每个特定应用目的，除非使用与上面使用的不同的措辞或参数专门为应用目的特定地描述该方面或参数。在这种情况下，为下面的特定应用目的定义的方面和参数否决了上面定义的相同方面或参数的一般定义。

用于细胞应答的特定应用的实施方案

在一个实施方案中，本发明的物体在其表面部分上优选地包括一个但不多于10个不同的形貌。即，在该实施方案中，本发明的物体包括至多10个，优选至多9个，更优选至多8个，更优选至多7个，更优选至多6个，更优选至多5个，更优选至多4个，更优选至多3个，更优选至多2个，最优选1个形貌。在该实施方案中，形貌可以具有1μm至10m的长、宽或直径。根据应用，这种形貌的表面积可以是1μm²至100m²。

在该实施方案中，对于特定应用，使用一种(或至多几种)经选择的形貌，以通过物理刺激促进细胞的应答。形貌可以有任何形状。应用可包括但不限于细胞培养的物体，包括培养器皿或培养平台(例如芯片或微流体装置)、生物反应器、膜或植入物。技术人员可以提出无数种方式来应用本发明的形貌。

本发明的优点包括但不限于细胞应答的精确调节、不需要使用生长因子或(蛋白质)涂层的物理刺激、应用于不同材料和产品的方法的灵活性、无浸出或层缺陷以及不存在批次差异。

在用于细胞应答的特定应用的另一个实施方案中，本发明的物体适用于体内应用。这种用途可包括具有形貌的物体，其被植入或临时被插入至活体中。在这种情况下，物体优选是植入物。因此，本发明进一步涉及如上定义的用作植入物的物体。

植入物可以是临时植入物或持久植入物。如本领域中已知的，临时植入物是在体内保持有限的持续时间，并且可以在实现其目的后从体内取出，或者可以在体内缓慢降解的植入物。持久植入物原则上应无限期地保持在适当位置的植入物，尽管这可能受到所考虑植入物的寿命因素(例如磨损)的影响。

本发明还涉及用包含如上定义的形貌的植入物治疗需要植入物的受试者的方法。本发明的植入物可以是例如整形外科或牙科植入物、肝脏植入物或控制免疫应答的植入物。根据本发明的其他植入物可以是肌肉植入物、神经系统植入物、电刺激植入物包括脊髓刺激器植入物、电声植入物、深部脑刺激器，起搏器植入物、美容植入物、乳房重建植入物、(腹部)网状植入物。这种植入物需要适当调节免疫应答。

对于本发明的实施方案是植入物，具有本发明的表面形貌的植入物调节细胞以提供期望应答是明显的优点。这允许例如调节周围组织的向内生长、调节周围细胞的分化，或调节的细胞附着。在整形外科或牙科植入物的情况下，优点可以是增加新骨的形成/向内生长，从而更好地将植入物固定在骨或牙组织中或上。

或者，这允许例如降低针对植入物的免疫应答，具备减少具有纤维组织的植入物的有问题的封装或植入物的排斥的优点。进一步地，或者，这允许例如增加内皮细胞的附着和增殖，具备在植入物表面上(相比其他)具有功能性单层内皮细胞，以避免血液凝固和血栓形成的优点。进一步地，或者，这允许增加增殖并维持肝细胞的表型，具备增加细胞长时间存活力和功能的优点。

根据本发明的植入物可以通过本领域已知的任何上述技术制造。为物体提供形貌的合适技术的实例如上所述。

对于下面定义的每个特定应用目的，包括具有特定形状的突起的形貌将被描述为“命中(hit)”形貌。这些形貌显示在实施例部分的表中。除非另有说明，否则在上面的一般描述中和/或在下面描述的特定应用目的下列举的每个方面和参数可以应用于每个命中形貌。

命中形貌反映了突起形状，其在该应用目的中具有最佳效果。然而，可以合理地假设，对于每个应用目的，形貌的效果对于具有与命中形貌相似的形状的形貌来说是相同的。形状是否相似基本上通过眼睛比较来判断。如本领域已知的，可以通过数学地定义突起的中心点而数字地表达。然后，从该中心点到圆周侧面上的任何特定点的距离称为朝向该特定点的半径。如果在通过对齐比较形状的中心点并使形状定向以便尽可能接近地匹配命中形貌的形状来覆盖相似形状时，类似形状的半径偏离圆周侧面的任何点上的命中形貌的半径不大于10％，优选不大于5％，更优选不大于2.5％，甚至更优选不大于1％。

肝细胞

在一个实施方案中，本发明的物体可以是用于调节肝细胞的物体。在本文中，肝细胞被定义为在肝脏组织中发现的主要细胞，并且其参与肝脏的大多数生化功能并且如上所述的可以源自任何人或动物，包括恒河猴、小鼠等。在这种情况下，肝细胞也指肝细胞祖细胞，和肝细胞样细胞(如永生化细胞系如Hep G2)。

在该实施方案中，形貌通过以下项定义：

a)相邻突起之间的平均距离为0-50μm，优选0.5-40μm，更优选1-30μm，甚至更优选3-25μm；

b)突起的顶表面区域为1-6000μm²，优选10-3000μm²，优选15-1500μm²，更优选17-1000μm²，甚至更优选20-250μm²；和

c)突起覆盖表面部分的3-90％，优选5-50％，更优选7-40％，甚至更优选8-35％。

另外，形貌可以由长为0.01-100μm，优选0.5-50μm，更优选1-40μm，甚至更优选2-35μm的突起/突起元件，以及宽为0.01-100μm，优选0.5-50μm，更优选1-35μm，甚至更优选4-23μm的突起/突起元件定义。

或者，根据本发明的用于肝细胞调节的物体可由以下项定义：

a)凹壁高度为0.5-50μm，优选1-40μm，更优选2-35μm，更优选4-30μm，甚至更优选5-28μm，定义为垂直于凹底从凹底到顶表面区域的距离，；

b)第一和第二凹壁的凹壁外廓独立地为0-40μm，优选为0.1-35μm，更优选为0.5-30μm，甚至更优选为1-20μm。

c)第一和第二凹壁截面的长独立地为0.01-100μm，优选为0.1-50μm，更优选为1-40μm，甚至更优选为2-32μm。

d)如果存在第一和第二凹壁穿孔，其长独立地为0-50，优选为0.2-40，更优选为0.5-35μm。

e)凹处的平均宽为0-50μm，优选为0.5-40μm，更优选为1-30μm，甚至更优选为3-25μm；

因此，本发明还涉及通过如上定义的物理刺激调节细胞群的形态、增殖、生化功能、分化、附着、迁移、信号传导和/或细胞死亡的方法，其中活细胞是肝细胞，且其中形貌如上所定义。

可以使用任何材料来制造所述物体，但是优选地，所述物体，或至少其具有形貌的表面部分由玻璃、金属或聚合物材料制成，甚至更优选地由聚合物材料制成。最优选地，该物体包括表面部分，该表面部分包括聚苯乙烯、聚丙烯、胶原蛋白、层粘连蛋白、多胺和水凝胶(如基质胶和琼脂糖凝胶)。

用于该实施方案的合适培养基包括，但不限于，一种或多种组分：水、葡萄糖、蛋白质、氨基酸、维生素、青霉素、抗生素和无机盐。

调节肝细胞包括刺激肝细胞样形态、在更短的时间内和/或更多周期肝细胞的增殖、在培养中更长的时间维持肝细胞同时保留表型和肝细胞特征功能、在早期和晚期时间点刺激肝细胞附着，以及防止早期细胞死亡。该功能可以通过评估肝细胞的功能性生物标志物来确定，包括解毒标志物包括细胞色素蛋白(CYP)、白蛋白、E-钙粘蛋白、CD81等。可以使用各种技术，诸如qPCR、ELISA、免疫荧光染色、蛋白质印迹和荧光激活细胞分选(FACS)在基因和蛋白质水平评估这些标志物的表达。

已经鉴定了一组能够支持长时间功能性肝细胞的体外培养同时保持其表型的表面形貌。将形貌嵌入聚苯乙烯(PS)基质中，并在添加和不添加胶原蛋白涂层的情况下使用，并使用常规细胞培养技术检查其与肝细胞的相互作用。

与没有表面形貌的样品相比，这种所选择的形貌特征的样品允许更高的细胞附着。当在嵌入形貌的基质上培养时，来自恒河猴以及人类来源的肝细胞可以在体外培养中维持至少1个月，在表面上具有和不具有胶原蛋白涂层的PS都是如此。这是目前的黄金标准，即胶原蛋白夹心培养(肝细胞在其间培养的双层胶原蛋白)可以支持肝细胞的体外培养最多8-10天。在嵌入形貌的基质上培养的肝细胞用功能性表征并且发现其是完全功能性的，即肝细胞特异性标志物的适当表达，包括超过10种解毒和代谢活性标志物。与有胶原蛋白涂层的嵌入形貌的基质相比，不具有胶原蛋白涂层的嵌入形貌的基质上培养的肝细胞表达相似或甚至更高水平的分析的肝细胞特异性标志物，证明所选择的形貌使得昂贵、费力且易于失败的胶原蛋白涂层多余。同样，研究表明接种到嵌入形貌的基质上的肝细胞，无论是否有胶原蛋白涂层，均可成功感染疟疾寄生虫，并维持培养1个月，表明表面形貌在支持病理条件下肝细胞的体外培养中的有效性。

在另一个实施方案中，于体内调节肝细胞。在该实施方案中，本发明的物体可以是肝脏植入物。在该实施方案中，“突起”定义中的参数平均距离、顶表面区域、覆盖范围、长和宽，以及参数凹壁高度、凹壁外廓、凹壁截面和穿孔的长以及凹处的平均宽，如上对于体外培养肝细胞中所定义。

根据本发明的肝脏植入物可以是具有至少一个表面部分的物体，该表面部分设置有如上定义的表面形貌并且可以提供有肝细胞。优选地，植入物还设置有将肝细胞保留在设置形貌的表面部分上的构件。

将肝细胞保留在设置有形貌的表面部分上的合适构件包括例如水凝胶层、聚合物层、蛋白质涂层等。优选地，这些层允许用于体内细胞功能的营养物和其他必需组分的扩散，以到达物体上的肝细胞，和/或提供更好的细胞附着至表面。

肝脏植入物可以在表面部分上包括多个表面形貌，例如多达10个，以调节肝细胞和参与肝脏功能的其他类型细胞的生物应答。

肝脏植入物也可以是3D支架，优选地由如上定义的材料制成，并且是多孔的，在表面部分上包括一个或更多个表面形貌，为肝细胞生长和组织形成提供合适的环境。

具有如上定义的形貌的肝脏植入物的优点在于其将恢复或增强肝脏的功能，包括代谢和解毒由身体产生或引入身体的生化化合物，例如药物。

进一步使用本发明的形貌来调节肝细胞包括例如人工肝脏、用于肝再生的3D支架、药物筛选平台和生物传感器。这些装置可以使用如上所述的不同技术生产，并且可以在表面部分上包括1-10个调节性表面形貌。对于体内使用，可以将具有或不具有细胞的物体引入体内，诸如来自供体的细胞、在实验室环境中培养的自体细胞或不同来源的细胞。

骨生成

在该实施方案中，本发明的物体是整形外科或牙科植入物，其中通过物理刺激调节细胞群的细胞应答、最显著地调节形态、增殖、生化功能、分化、附着、迁移、信号传导和/或细胞死亡是成骨生化功能、分化和附着的调节。在该实施方案中，细胞应答被调节的细胞优选是成骨细胞。

该实施方案涉及用于刺激骨生成的物体，诸如医疗装置，优选植入物，用于植入人或动物骨或牙齿中或上，其是模仿天然组织的人工制造的天然组织替代物。植入物(生物医学植入物)优选地植入人体或动物骨骼或牙齿中或上。在一个优选实施方案中，将植入物植入至人体骨骼或牙齿中。在另一个优选的实施方案中，将植入物植入至动物骨或牙齿中。

骨是由成骨细胞合成的天然矿化结构，其具有为脊椎动物的身体体提供强度和支撑的功能。而且，骨为肌肉的附着提供了固体支撑，从而允许身体的运动。

据称骨通常以两种类型存在：皮质骨组织是骨的坚硬外层，并且具有光滑、白色、闪亮的外观。其由密集的微观列组成，其中存在成骨细胞和矿化组织。

松质骨，也称为海绵状骨，存在于骨内部，并且由或多或少的多孔的骨组织网络组成。在骨组织之间的空间中，存在骨髓和干细胞以及血管，以向骨内的活细胞提供营养。

牙齿是由在人类和其他脊椎动物的颌骨中发现的高度钙化的组织制成的小结构，在咀嚼和说话中起重要作用。牙齿有两个部分，一个在牙龈内，一个在牙龈外分别称为牙根和牙冠。牙齿组织中有不同的层包括：最硬且主要由磷酸钙构成的牙齿外层的牙釉质、牙釉质下的层由硬质矿物基质中的活细胞组成的牙本质、包含活细胞、血管和神经的更柔软牙齿内部结构的牙髓、牙骨质，牢固连接牙齿根部与牙龈和下颌的层，以及最后是牙周韧带，也参与将牙齿固定在颌骨中。

与大多数其他组织类型一样，骨和牙齿组织不断形成和降解。由于矿化环境，与大多数其他组织类型相比，骨和牙齿组织的形成和降解速率相对较慢。因此，当发生缺陷时，骨或牙齿组织的再生比其他组织类型的再生花费更长的时间。另外，当大的骨或牙片段缺损或缺失时，可能无法再生。

在这种情况下，可以将根据本发明的植入物植入骨或牙齿中或上。这会影响身体部位的自然功能的恢复。优选地，对于骨植入物，植入物至少部分地植入皮质骨中。优选将牙齿植入物植入颌骨或牙齿组织中。本发明的植入物，通过其下面定义的特定形貌，刺激骨生成并随后通过组织向内生长将植入物固定到骨或牙齿上。

本文中的组织向内生长应理解为指在植入物上和/或中形成骨或牙齿的过程，优选在天然骨或牙齿组织与植入物连接的边界处。当将植入物植入天然骨或牙齿中或上时，在该边界处存在小间隙，其可以由天然形成这种组织的细胞形成的天然骨骼或牙齿组织及时填充，诸如存在于与植入物边界处的间隙中的天然骨或牙齿组织中的成骨细胞、成釉细胞、成牙本质细胞或成牙骨质细胞。因此，组织向内生长是天然骨或牙齿组织生长到植入物上或中，其将植入物固定到植入物植入的骨或牙齿组织上或中。

本发明的形貌刺激骨生成，优选地随之增加植入物在骨或牙齿组织中或上的固定。增加固定意味着间隙中骨形成过程的加速，和/或增加了植入物固定在骨或牙齿中或上的强度。而且，增加的固定可能意味着周围的骨或牙齿组织与由向内生长的天然组织提供的植入物之间的固定保持更久，从而避免或推迟植入物替换。

增加的骨形成可以通过各种方法测量，诸如通过分析存在于例如在体外形貌上生长的干细胞中的碱性磷酸酶(ALP)、骨钙蛋白(OC)、骨桥蛋白(OP)和/或骨唾液蛋白(BSP)的量。

固定强度可以通过进行体内试验然后确定从植入部位拉动植入物所需的力来测量。

本发明的形貌存在于物体上，诸如用于刺激骨生成的医疗装置，优选地植入物，其在需要组织向内生长的位置被植入骨或牙齿中或上。优选地，将受益于与天然骨或牙齿组织的增加的固定的植入物的所有位置覆盖有本发明的形貌。

在一个优选的实施方案中，将本发明的装置植入人或动物骨中或上，优选人骨。在这种情况下，植入物被称为整形外科植入物。

在另一个优选的实施方案中，本发明的装置植入人或动物颌骨或牙齿中或上，优选人颌骨或牙齿。在这种情况下，植入物被称为牙科植入物。

在该实施方案中，存在于本发明物体上的形貌可以由以下项定义：

a)相邻突起之间的平均距离为0-50μm，优选0.5-40μm，甚至更优选1-30μm，甚至更优选2-25μm。

b)突起的顶表面区域为1至6000μm²，优选10至3000μm²，更优选20至1500μm²，更优选25至1000μm²，甚至更优选30至750μm²；和

c)突起覆盖表面部分的3％至80％，优选表面部分的10％至75％，更优选20％至70％，更优选30％至65％。

另外，仅包括一个突起元件的突起的形貌中的突起的长可以为0.01-100μm，优选为0.5-50μm，更优选为1-40μm，而包括多个突起元件的突起的形貌中突起的长可以为0.01-100μm，优选为0.1-45μm，更优选为0.5-40μm，甚至更优选为1-30μm。

仅包括一个突起元件的突起的形貌中的突起的宽可以为0.01-100μm，优选为0.5-50μm，更优选为1-40μm，而包括多个突起元件的突起的形貌中突起的宽可以为0.01-100μm，优选为0.1-45μm，更优选为0.5-40μm，甚至更优选为1-30μm。

或者，整形外科或牙科植入物可以定义为具有以下至少一个形貌的物体，其中

a)凹壁高度为0.5-50μm，优选为1-40μm，更优选为2-35μm，更优选为4-30μm，且甚至更优选为5-28μm。

b)凹壁外廓为0至40μm，优选为0.1至30μm，更优选为0.5至15μm，甚至更优选为0.8至10μm。

c)凹壁截面的长为0.01-100μm，优选为0.05-50μm，更优选为0.1-40μm。

d)凹壁穿孔的长为0至50μm，优选为0.5至40μm，更优选为1至30μm，甚至更优选为2至25μm。

e)凹处的平均宽为0至50μm，优选为0.5至40μm，更优选为1至30μm，更优选为2至25μm。

根据本发明的整形外科或牙科植入物的一个优点是其改善了植入物对周围天然(骨和牙齿)组织的固定。

整形外科植入物是一种用于替换缺失的关节或骨或支撑受损的骨而制造的医疗装置。可以受益于包括如上所述的表面形貌的合适的整形外科植入物的实例，包括膝关节置换植入物、股骨部件和胫骨柄板、(总)髋置换植入物骨柄和髋臼壳、肘和手指植入物柄和转轴(hinges)、颌面植入物、颅骨植入物、肩部植入物，踝关节植入物、(外部)固定植入物，诸如钉子、螺丝、针、杆和板、用于注入脊柱修正的植入物包括脊柱笼、椎间盘、椎弓根钉和杆以及颈椎板。

优选地，整形外科植入物是膝关节置换植入物股骨部件和胫骨柄板、(总)髋关节置换植入物股骨柄和髋臼壳，以及用于注入脊柱修正的植入物包括脊柱笼，椎间盘，椎弓根钉和杆以及颈椎板。

牙科植入物是与颌骨或颅骨相连接以支撑假牙的外科手术部件，诸如牙冠、牙桥、托牙、面部假体或用作畸齿校正。可以受益于包括如上所述的形貌的合适牙科植入物的实例，包括下颌面和上颌面植入物、牙板和框架、牙基螺丝和后螺丝、牙冠植入物。优选地，牙科植入物是牙板和框架、牙基螺丝和后螺丝。

用于调节上述成骨生化功能、分化和附着的物体可以通过任何已知的用于制造植入物的方法来制作。这些方法一般在上面描述，并且是本领域已知的。

免疫调节

在另一个实施方案中，通过物理刺激调节细胞群的形态、增殖、生化功能、分化、附着、迁移、信号传导和/或细胞死亡包括免疫调节。本文中的免疫调节是指调节对植入或存在于体内的异物的免疫应答，即异物应答。免疫调节包括控制异物巨细胞(FBGC)的形成、炎症反应、巨噬细胞受累(macrophage involvement)、纤维化和异物的封装。因此，本发明还提供用于免疫细胞免疫调节的物体，其中形貌如上所定义。

免疫应答具有(早期)立即应答，随后是更恒定、稳定的末期。早期阶段，急性应答在控制异物接受(生物相容性)方面是非常重要的，并且在末期也是(慢性)免疫活动水平的重要驱动者。据信，初始响应需要具有适当但受控的水平，以允许适当但最小的封装和无活性(非炎性)末期。然而，确切的机制尚未完全理解。在优选的实施方案中，可以定义三类免疫调节形貌：(1)早期的低免疫应答与末期的低应答相结合，此后称为L/L；这也可以称为降低免疫应答。(2)早期的高免疫应答与末期的高应答相结合，此后称为H/H和；这也可以被称为增加免疫应答(3)在早期的高免疫应答与在末期的低应答相结合，从此在此称为H/L。

在优选的实施方案中，用于调节免疫应答的L/L型形貌由以下项定义：

a)相邻突起之间的平均距离为0-50μm，优选为0.5-40μm，更优选为1-20μm，甚至更优选为2-12μm；和

b)突起的顶表面区域为1至6000μm²，优选为10至3000μm²，更优选为15至1500μm²，更优选为20至1000μm²，甚至更优选为20至200μm²之间，最优选为25-200μm²；和

c)突起覆盖表面部分的3％至90％，优选5％至80％，更优选10％至75％，甚至更优选26％至50％。

另外，仅包括一个突起元件的突起的形貌中的突起的长可以为0.01-100μm，优选为0.5-50μm，更优选为1-50μm，甚至更优选为2-40μm，而包括多个突起元件的突起的形貌中的突起的长可以为0.01-100μm，优选为0.1-45μm，更优选为0.5-40μm，甚至更优选为1-30μm。

仅包括一个突起元件的突起的形貌中的突起的宽可以为0.01-100μm，优选为0.5-50μm，更优选为1-50μm，甚至更优选为2-40μm，而包括多个突起元件的突起的形貌中的突起的宽可以为0.01-100μm，优选为0.1-45μm，更优选为0.5-40μm，甚至更优选为1-30μm。

或者，L/L型免疫调节植入物可以定义为具有至少一种形貌的物体，其中

a)凹壁高度为0.5-50μm，优选为1至40μm，更优选为2至35μm，更优选为4至30μm，甚至更优选为5至28μm。

b)凹壁外廓为0至40μm，优选为0.1至35μm，更优选为0.5至30μm，甚至更优选为1至20μm。

c)凹壁截面的长为0.01-100μm，优选为0.1-50μm，更优选为1-40μm，甚至更优选为2-32μm。

d)凹壁穿孔的长为0至50μm，优选为0.2至40μm，更优选为0.5至35μm。

e)凹处的平均宽为0-50μm，优选为0.5-40μm，更优选为1-20μm，甚至更优选为2-12μm。

这种形貌能够降低对异物的免疫应答，优选最小化异物周围的封装组织和炎症活动。

此外，本发明的物体可用于刺激对异物的免疫应答，优选地加强异物的受控封装。

用于该实施方案的调节免疫应答的H/H型形貌，可以由以下项定义：

a)相邻突起之间的平均距离为0-50μm，优选为0.5-40μm，更优选为2-20μm，甚至更优选为5-12μm；和

b)突起的顶表面区域为1至6000μm²，优选为10至3000μm²，更优选为20至1000μm²，更优选为25至250μm²，甚至更优选20至70μm²之间；和

c)突起覆盖表面部分的3％至90％，优选5％至50％，更优选10％至40％，甚至更优选15％至25％。

另外，仅包括一个突起元件的突起的形貌中的突起的长可以为0.01-100μm，优选为0.5-50μm，更优选为1-50μm，甚至更优选为2-40μm，而包括多个突起元件的突起的形貌中的突起的长可以为0.01-100μm，优选为0.1-45μm，更优选为0.5-40μm，甚至更优选为1-30μm。

仅包括一个突起元件的突起的形貌中的突起的宽可以为0.01-100μm，优选为0.5-50μm，更优选为1-50μm，甚至更优选为2-40μm，而包括更多个突起元件的突起的形貌中的突起的宽可以为0.01-100μm，优选为0.1-45μm，更优选为0.5-40μm，甚至更优选为1-30μm。

或者，H/H型免疫调节植入物可以定义为具有至少一种形貌的物体，其中

a)凹壁高度为0.5-50μm，优选为1至40μm，更优选为2至35μm，更优选为4至30μm，且甚至更优选5至28μm。

b)凹壁外廓为0至40μm，优选为0.1至35μm，更优选为0.5至30μm之间，甚至更优选为1至20μm。

c)凹壁截面的长为0.01-100μm，优选为0.1-50μm，更优选为1-40μm，甚至更优选为2-32μm。

d)凹壁穿孔的长为0至50μm，优选为0.5至40μm，更优选为1至30μm，甚至更优选为2至25μm。

e)凹处的平均宽为0-50μm，优选为0.5-40μm，更优选为2-20μm，甚至更优选为5-12μm。

此外，本发明的物体可用于刺激对异物的早期免疫应答，以允许降低的末期免疫应答，优选使末期异物周围的封装组织和炎症活动最小化。

用于该实施方案的调节免疫应答的H/L型形貌，且可以由以下项定义：

a)相邻突起之间的平均距离为0-50μm，优选为0.5-40μm，更优选为5-30μm，甚至更优选12.1-20μm；和

b)突起的顶表面区域为1至6000μm²，优选为10至3000μm²，更优选为20至1000μm²之间，更优选为25至250μm²，甚至更优选为20至65μm²之间；和

c)突起覆盖表面部分的3％至90％，优选4％至50％，更优选5％至30％，甚至更优选5％至10％。

另外，仅包括一个突起元件的突起的形貌中的突起的长可以为0.01-100μm，优选为0.5-50μm，更优选为1-50μm，甚至更优选为2-40μm，而包括多个突起元件的突起的形貌中的突起的长可以为0.01-100μm，优选为0.1-45μm，更优选为0.5-40μm，甚至更优选为1-30μm。

仅包括一个突起元件的突起的形貌中的突起的宽可以为0.01-100μm，优选为0.5-50μm，更优选为1-50μm，甚至更优选为2-40μm，而包括多个突起元件的突起的形貌中的突起的宽可以为0.01-100μm，优选为0.1-45μm，更优选为0.5-40μm，甚至更优选为1-30μm。

或者，H/L型免疫调节植入物可以定义为具有至少一种形貌的物体，其中

a)凹壁高度为0.5-50μm，优选为1至40μm，更优选为2至35μm，更优选为4至30μm，甚至更优选为5至28μm。

b)凹壁外廓为0至40μm，优选为0.1至35μm，更优选为0.5至30μm，甚至更优选为1至20μm。

c)凹壁截面的长为0.01-100μm，优选为0.1-50μm，更优选为1-40μm，甚至更优选为2-32μm。

d)凹壁穿孔的长为0至50μm，优选为0.5至40μm，更优选为1至30μm，甚至更优选为2至25μm。

e)凹处的平均宽为0-50μm，优选为0.5-40μm，更优选为5-30μm，甚至更优选12.1-20μm。

免疫细胞，也称为白细胞，是负责保护身体抵御异物的免疫系统的细胞，异物包括细菌、病毒和其他外部物体，诸如植入体内的生物材料。这些细胞包括巨噬细胞、单核细胞、B细胞、T细胞、巨核细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、树突细胞、淋巴细胞、肥大细胞、自然杀伤细胞、异物巨细胞(FBGC)和其他多核细胞。众所周知的，免疫细胞可以在血液或其他组织中发现，并且可以从包括人或动物在内的不同来源获得。

人体对异物，诸如植入的生物材料的(免疫)应答称为异物应答(FBR)。免疫细胞引导异物应答。异物应答可能导致在异物周围形成纤维组织的胶囊。这种称为封装的过程是对外来材料和周围受伤组织的炎症应答的末期的和慢性的应答。虽然这个过程自然地发生以保护身体并启动伤口愈合过程，但是其可能导致对植入的生物材料的不期望的影响并且可能损害其功能。因此，调节对植入的生物材料或体内另外使用的材料的异物应答是生物材料设计中的重要问题。

已经为此目的开发了几种方法，其主要集中在化学水平，包括生物材料设计和生物材料的物理化学性质的改变。这表明通过图案化具有特定形貌的生物材料的表面，可以调节(刺激或下调)免疫细胞对异物的应答，而不依赖于该生物材料的化学性质。

如上所述，任何材料都可用于制造本发明的物体。

免疫细胞的调节包括影响形态、刺激或抑制附着和增殖、刺激或抑制单核细胞融合成多核细胞、维持或改变免疫细胞表型(细胞分化)、影响免疫细胞的功能、影响免疫应答的激活，刺激或预防细胞死亡、控制细胞迁移、以及调节植入部位纤维囊的形成。

例如，合适的表面形貌能够通过刺激或防止巨噬细胞从血液到达围绕植入部位的组织来调节免疫细胞迁移。

作为另一个实例，形貌可以刺激巨噬细胞对异物的附着并诱导巨噬细胞的融合和FBGC的形成。相反，其他表面形貌禁止巨噬细胞融合并减少FBGC的形成。或者，可以刺激巨噬细胞附着，同时抑制FBGC形成，反之亦然。

可以通过标记附着于表面或迁移至植入部位的免疫细胞并进行免疫荧光染色，然后通过成像技术来跟踪免疫调节的调节。此外，诸如FACS的其他技术可用于检测免疫细胞中表面标志物的表达，即检测细胞的类型。此外，诸如免疫荧光染色、qPCR、ELISA、蛋白质印迹、微阵列、组织学、电子显微镜成像等技术可用于分析免疫细胞分化和生物功能。

还可以在各种动物模型诸如小鼠、大鼠、兔等中体内分析免疫应答的调节。可以通过(免疫)组织学技术(免疫荧光染色、比色染色)、电子显微镜成像、qPCR和RNA分析、细胞因子释放分析、机械测试等分析植入的材料和周围组织。

免疫细胞的调节可以如上所述在体外使用，使用培养器皿如烧瓶、平板、袋、培养皿、容器(vessels)，以及生物反应器、芯片、(药物)筛选平台和/或生物分子(疫苗/蛋白质/抗体)生产平台。

在优选的实施方案中，形貌对单核细胞/巨噬细胞对聚氨酯(PU)表面的响应具有强烈影响。表面形貌可以显著影响巨噬细胞的附着。对细胞的影响不仅限于附着细胞的数量，还包括细胞形态特性诸如细胞面积的变化。此外，这些表面影响巨噬细胞的融合并因此，强烈影响异物巨细胞的形成。在体外环境中具有选择表面形貌的PU基质上培养单核细胞10天后，观察到这些效果。这些免疫应答性形貌的体外应用包括，但不限于，体外培养模型以研究或分析细胞的免疫应答或相关生理学，或作为体外疾病模型。这种早期免疫应答对植入物的接受至关重要并促进植入物在免疫应答后期的接受。

然而，优选地，在体内应用免疫应答的调节。任何长期或慢性植入的装置，包括但不限于，生物传感器和生物电极、诸如乳房植入物的美容植入物、诸如小骨植入物的骨植入物、血管植入物(血管人工移植物、血管通路)、透析通路、人工耳蜗植入物和心血管植入物可以具有本发明的形貌以调节免疫应答。

在体内，形貌特征PU基质影响皮下小鼠模型中的早期和晚期FBR。不同的表面能够诱导从非常轻微到强烈的FBR。免疫细胞向周围组织的浸润(炎症活动水平的测量)、巨噬细胞的存在和FBGC的形成、植入物在界面处的封装以及植入物周围的纤维化囊的形成是一些受到不同表面形貌影响的FBR相关参数。

PU植入物周围的纤维囊的厚度根据植入物表面引入不同的表面形貌而变化。在FBR的晚(末)期阶段，与未图案化的对照基质和硅弹性体参考材料相比，一些表面形貌显示出低得多的纤维化封装，与没有实际植入外来材料的空的伤口(假手术组)相比，相当甚至更低。这些表面形貌明显降低了免疫应答并防止了植入物的封装，这可以改善植入物的功能并改善患者的结果。

出于清楚和简明描述的目的，在此将特征描述为相同或单独实施方案的一部分，然而，应当理解，本发明的范围可以包括具有所描述的全部或一些特征的组合的实施方案。特别地，在一般描述下描述的特征可以是特定实施方案的一部分。

现在通过以下非限制性实施例说明本发明。

实施例

所有实施例的材料和方法

样品制造

在实施例中，使用金属和聚合物基质。对于全金属样品，即具有单独形貌的钛(Ti)，应用以下程序制造10μm高的突起：

1.从经退火的Ti板(纯度99.6％)开始，抛光(粗糙度约为0-0.01μm)并清洁。

2.沉积900nm SiOx(等离子体增强化学气相沉积，Oxford Plasmalab系统80)，光刻(正性光致抗蚀剂OIR 906-12，Arch Chemical，Inc)并硬烘烤(T＝120℃，60秒)。

3.蚀刻SiOx层：定向反应离子蚀刻(Adixen AMS 100SE)4.5分钟，C4F8流速为20sccm，He流速为150sccm，CH₄流速为15sccm，电感耦合等离子体(2800W)，电容耦合等离子体(350W)(T＝-10℃，2分钟)。

4.用氧等离子体(Tepla 300E)剥离光刻胶。

5.蚀刻钛基质：交替蚀刻步骤(Cl2/BCl3/Ar等离子体的组合，45秒)和氧化步骤(O2等离子体，Oxford Plasmalab系统100，15秒；O2流速为30sccm，ICP为500W，CCP为15W，33mTorr的30压力(30pressure of 33mTorr))。

对于聚合物基质，对于包含各种不同形貌的基质和具有一个单独形貌的基质都遵循以下程序：

1.通过使用铬掩模的光刻法制造保持反向形貌设计的硅片(模具)。

2.用全氟癸基三氯硅烷(FOTS，ABCR)涂覆硅晶片。

3.可选地，将形貌设计复制到聚二甲基硅氧烷(PDMS SylgardDow Corning)和OrmoStamp(Micro Resist Technology GmbH)的中间模具中。

4.使用硅片或中间模具将所述形貌热压花到聚合物样品中(所有样品在78℃下脱模)。

5.可选的：感兴趣金属的溅镀的涂层。

6.O2气体等离子体(用于细胞培养基质的标准处理)。

表2.用于以形貌为特征的基质制造的材料和方法

细胞培养和分析

对于体外实施例，目标细胞在适于允许在各种形貌之间进行比较的基质上培养，以及在保持一个单独的形貌的基质上培养。遵循以下程序；

1.消毒(70％乙醇)并润湿基质(细胞培养基，最少24小时)

2.可选的：用新鲜的在0.02M乙酸中20μg/ml的胶原蛋白I(大鼠尾巴，VWR)，进行胶原蛋白包被，100μl/孔，在室温下孵育1小时并用PBS洗涤3次

3.接种期望细胞(详见表3)，并将培养物保持在37℃，5％CO₂中，培养基每2-3天更新一次：

表3.体外细胞培养实验的条件

FBS＝10％胎牛血清(Lonza)，l-glu＝2mM l-谷氨酰胺(Gibco)，AsAc＝0.2mM抗坏血酸(Sigma Aldrich)，青/链霉素＝100U ml^-1青霉素和100g ml^-1链霉素(Gibco)。

^*此处描述的方案：Repnik U et al.Journal of immunological methods 2003；278(1-2):283-292。

4.收获后，用4％多聚甲醛固定样品并荧光标记细胞(详见表4)；

表4.体外实验使用的荧光标记

5.(I)使用捕获每个单独的TopoUnit的图像的自动载玻片扫描仪，成像比较形貌，或者(II)对于以形貌为特征基质捕获10个随机选择的图像。出于适当培养质量(细胞数量、分布)和图像质量评估所获得的图像。

6.使用MATLAB脚本和CellProfiler分析图像[Carpenter AE et al.GenomeBiology 2006；7:R100,Hulsman M et al.Acta Biomaterialia 2015；5(15):29,UnadkatH et al.PNAS 2011,108:16565](分析参数详见表5)。

表5.分析参数

7.使用各种方法体外验证和二次筛选:

疟疾感染(实施例2)：在第2天添加50000个食蟹猴疟原虫(PlasmodiumCynomolgi)孢子/孔(130μl)并且在标记期间包括HSP70(热休克蛋白70)以使P.孢子可视化。手动量化感染细胞的数量并计算感染效率(感染细胞/细胞总数)。

qPCR(实施例3-4)：使用Trisol方案分离mRNA，即在Trisol中裂解细胞并纯化含有mRNA的裂解物。汇集2个重复的裂解物，每个汇集进行3次测量(6个生物学重复)。根据制造商方案，使用iScript试剂盒(Bio-Rad)将分离的RNA合成cDNA，并使用Sybr green Imaster mix(Invitrogen)和对于特定基因(表6)的引物(Sigma)在水中稀释进行定量实时PCR(qPCR，Bio-Rad)。将基因表达标准化为管家基因GAPDH水平(ΔCT方法)，且随后在第3天标准化胶原蛋白夹心中呈现倍数诱导的相同标志物的水平(ΔΔCT方法)。

表6.分析基因的详细信息

8.使用各种动物模型进行体内验证

用于验证骨整合的兔股骨模型(实施例5)

将全钛形貌特征样品(硬币形，直径6.25mm，厚1.95mm)与对照一起，植入24只新西兰白色雌兔以评估新骨形成和骨整合。首先将样品在丙酮中超声清洗1小时和在IPA中超声清洗1小时，并使用高压灭菌法灭菌。动物研究程序经当地伦理委员会批准。

在全身麻醉和无菌条件下进行植入。通过静脉内施用戊巴比妥钠(3.0mg/kg体重)镇静后，将动物在手术部位剃毛并用碘和70％乙醇(EtOH)消毒。在股骨的近端部分，切开5cm切口直至下面的骨膜暴露并且也穿过骨膜。从表面除去骨膜。钻两个孔并将植入物放入孔中并通过网板保持在适当位置。重新复位皮下层并用4-0丝线缝合。4或8周后处死动物并取出植入物的股骨。然后将移出的样品固定在10％中性缓冲福尔马林中并保持在70％EtOH下用于进一步分析/表征。

通过(1)使用机械拉伸台的拉拔拉伸试验：以1mm/min的速度对样品施加拉力，直到植入物从骨上脱离，同时记录施加的所有力；和(2)组织学：将固定的样品在乙醇系列中脱水并包埋在甲基丙烯酸甲酯(MMA)中。制备组织切片并用1％亚甲基蓝和0.3％碱性品红溶液染色。扫描每个样品的3个切片，测量骨与植入物的接触百分比(％BIC)(定义为与无间隙或纤维组织的植入物直接接触的所有区域)进行分析。

用于验证免疫调节的小鼠皮下模型(实施例7)

将聚氨酯(PU)植入物，与对照一起，植入64只雌性小鼠(Harlan，约9个月大，体重18-20g，每种条件下具有2个相同植入物(n＝8)的4只小鼠)以评估小鼠免疫应答。包括未图案化(NP)植入物、空伤(假手术组)和硅弹性体对照(SE，直径为2.5mm且厚度为0.6mm的一半导管，Medtronic Medical)作为对照。该研究是在荷兰法律合适和道德批准的方案下进行的。

在全身麻醉和无菌条件下进行植入。在层流柜中用在氧气中2％异氟醚(Pharmachemie)镇静后，在外科手术程序前15分钟皮下注射丁丙诺啡(Temgesic，RBPharmaceuticals Limited，0.05mg/kg)进行疼痛控制，将小鼠背面剃毛并用70％乙醇消毒。在动物背部的每一侧，在脊柱侧面1cm处切开0.4cm的切口。随后，使用无菌镊子将1cm长的植入物皮下放置，使组织损伤最小化。然后关闭切口。假手术组和SE对照植入类似。手术后，将小鼠单独圈养直至伤口愈合。随后，将动物成对饲养直至研究结束。在研究后9或60天，分别指示早期和晚期免疫应答，根据伦理批准的方案处死动物并且收获样品连同皮下组织和连接的皮肤。将每个活组织的一半固定在4％多聚甲醛中，接着用甲基丙烯酸甲酯/甲基丙烯酸丁酯(MMA/MBA，Merck)固定，切割3μm切片，在丙酮中去纤维化并在去矿物质水中洗涤。每个活组织，连续3个切片用苏木精和伊红(H&E)，苦天狼星红(PSR)或F4/80染色。

H&E染色(用于细胞核和细胞质染色)需要将载玻片在苏木精中孵育5分钟，然后在水中洗涤5分钟并通过伊红复染并再次洗涤。接下来，将载玻片在乙醇和二甲苯中孵育以进行脱水，并使用Vectamount(Vector Labs)将其固定在盖玻片上。

对于PSR(用于胶原蛋白和富含胶原蛋白的组织的可视化)，需要将载玻片在PSR溶液(Klinipath)中孵育20分钟，用0.1N HCl洗涤并在乙醇和二甲苯中脱水。如上所述进行固定。

F4/80(巨噬细胞群的蛋白质标志物)需要在具有0.3％H₂O₂的甲醇中在黑暗中孵育20分钟，用水洗涤，在50mM Tris、0.9％NaCl缓冲盐水(TBS)中孵育，再次用水洗涤，然后用Superblock(Klinipath)孵育10分钟，然后用大鼠抗小鼠单克隆F4/80抗体(Serotec，1:1000，在TBS中)孵育过夜，用兔抗大鼠igG抗体(SBA/ITK，TBS中1:3000和20％正常小鼠血清)30分钟。BrightVision抗兔AP抗体(Immunologic)30分钟并最后用Vector blue(VectorLabs)10分钟。然后用TBS洗涤切片，然后用自来水洗涤，用苏木精染色1分钟并再次用自来水洗涤。干燥后，固定切片，然后扫描、成像并分析(数字病理学软件，IntelliSite，Philips)。

对于免疫细胞的浸润、FBGC的形成、植入物的封装和植入物周围的纤维组织的形成，切片的评分为0至3(0＝无，1＝轻度，2＝中等，3＝严重)。在植入物周围的6个随机部位测量植入物周围的纤维结缔组织的厚度。纤维层厚度的评分和测量分别由两个人在不知情的情况下进行。

实施例#1：维持培养中原代恒河猴猕猴来源的肝细胞的表面形貌

表7显示了能够维持和增加培养中肝细胞的功能的形貌(H1-10)，几何形状和制成聚苯乙烯时分析参数的性能。作为对照，包括未图案化(NP)基质(也是聚苯乙烯)以及选择的更“基本”设计的形貌(三角形，B1-2)的性能。低细胞数表示低附着和/或低细胞存活，而高细胞数(>60)是不希望的，因为这些细胞不表达适当的肝细胞形态和表型。因此，中等数量的细胞水平表明最佳性能(40-60)，特别是当与适当的表面覆盖度和细胞形态相结合时(在选择命中形貌时通过眼睛判断)。

形貌H1-H10具有中等数量的附着细胞(44-60)，并且具有29-36％的细胞覆盖率。相反，NP基质具有中等数量的细胞附着，倾向于低端点(44)并且具有较低的细胞覆盖率(27％)。然而，NP基质上最突出的是细胞形态差和表型缺失，这与延长培养时间后的不良结果相关(参见图2c，培养31天)。基本形貌导致低细胞数和低细胞覆盖率(维持不适当的肝细胞培养)或高细胞数和/或细胞覆盖率(非功能性甚至非表型肝细胞)。B1，突起覆盖率为36％(高于最佳表现形貌的范围8-35％)，导致具有平均细胞覆盖率(35％)的高细胞数(73)，表明这些细胞很小，不能很好地扩散并且没有呈现正确的形态，且于是没有表型和功能。B2，突起覆盖率为7％(低于最佳表现形貌的范围)，导致具有细胞覆盖率低(22％)的低细胞数(35)，表明没有适当的肝细胞培养。

形貌的验证

验证证实了形貌在支持肝细胞体外培养中的功效。虽然常规组织培养聚苯乙烯(TCPS)支持肝细胞少于5天，具有胶原蛋白涂层的TCPS长达10-14天，最佳表现形貌(有和没有胶原蛋白涂层)支持肝细胞长达31天。

所有10个形貌都强烈促进肝细胞的体外培养。与未图案化的对照表面相比，以形貌为特征的基质在培养31天后附着于表面的细胞多2-6倍(图2a)，并且被证实是CD81阳性的，因此是肝细胞。此外，与未图案化的对照表面相比，以形貌为特征的基质表面的细胞覆盖的表面积多2-5倍(图2b)。最后，与在未图案化对照基质上看到的肝细胞形态强烈对比(图2c)，在以形貌为特征的基质上培养的肝细胞具有与体内(天然)组织和肝脏中肝细胞的形态更相似的细胞形态(H3，图2d)。

形貌的二次筛选

对实验1中表现最佳的形貌(H3、H4、H5、H6、H8)进行进一步验证。除了31天验证之外，还包括第8天，与培养最多8天的当前标准进行比较。此外，用疟疾寄生虫感染部分样本以证明肝细胞功能(疟疾寄生虫只能感染功能性肝细胞)。

再次，确认筛选和验证结果显示了高细胞数、高细胞覆盖(图3a、b、d和e)和CD81的合适表达。

在以形貌为特征的基质上的感染率在第8天高达0.5％，并且在第31天仍然高达0.15％(图3c，f)。这些感染水平与使用无图案胶原蛋白包被的表面(第8天)的常规水平一致。无法比较第31天的水平，因为肝细胞不能在未图案化(胶原蛋白包被)表面上培养超过10-14天。然而，事实上，在第31天仍然检测到疟原虫孢子是前所未有的，并且形貌的独特益处本身为抗疟疾药物研发带来了巨大的机会。

结论

所鉴定的表面形貌(不需要胶原蛋白)促进肝细胞附着并支持其体外培养31天，同时表达肝细胞表型，甚至在疟原虫存在下也是如此。与之形成鲜明对比的是，目前的标准方法仅允许体外培养长达8-11天并且需要胶原蛋白。用于支持培养中的肝细胞的表现最佳的表面形貌具有20-250μm²的顶表面区域，8-35％的表面覆盖率和3-25μm的突起之间的平均距离的突起。

实施例#2：在培养中维持原代人源肝细胞的表面形貌

具有和不具有胶原蛋白涂层的形貌被验证用于支持原代人源肝细胞(PHH)的体外培养的延长。黄金标准“胶原蛋白-夹心”(CS)，其中包括肝细胞在两层胶原蛋白之间培养作为基准(最多14天)和未图案化(NP)表面作为对照。

结果

无论是否含有胶原蛋白，并在两个时间点，所有以形貌为特征的基质均优于无图案对照。在第14天(图4a、b)和第30天(图4c、d)，在以形貌为特征的基质上，细胞总数和表面覆盖率高于CS(仅第14天)和未图案化对照，在第30天甚至更显著。然而，细胞形态观察到最显著的效果。在某些形貌上，细胞显示出与天然(体内)肝脏组织和形态的明显相似，而在其他形貌和未图案化对照中，细胞未显示出这种组织和细胞形状。用胶原蛋白涂覆形貌特征表面并不会对结果产生太大影响。

结论

本发明的形貌显示出延长PHH的适当体外培养一个月的优异性能，而目前的黄金标准CS仅允许最多2周，并且实际上仅可使用8天。用于支持肝细胞培养物的表现最佳的表面形貌具有20-250μm²的顶表面区域，8-35％的表面覆盖率和3-25μm的突起之间的平均距离的突起。

实施例#3：维持原代人源肝细胞功能的表面形貌

在体外培养的两周期间，分析实施例#1-2的最有希望的形貌(H3、H4和H8，有和没有胶原涂层)表达PHH肝细胞特异性表型，指示功能性。CS和NP表面作为对照包含在内。将第14天在形貌特征表面上的基因表达水平(所有标准化为CS第3天水平)与第14天和第3天的CS水平进行比较。

结果

HNF4α(图5a，涉及肝细胞特异性蛋白质的转录和调节肝细胞功能)在所有具有胶原蛋白涂层的以形貌为特征的基质上的表达更好，相比第14天时CS上，以及甚至在第3天CS上的水平。

白蛋白(图5b，肝细胞代谢的指标)，与两个时间点的CS相比，在所有具有胶原蛋白涂层的以形貌为特征的基质中表达显著更高(多达4倍以上)，揭示了表面形貌在长期体外培养中维持甚至可能增强代谢相关表型的功效。

Cyp3A4(图5c，一种重要的解毒标志物)，与两个时间点的CS相比，在所有具有和不含胶原蛋白的以形貌为特征的基质中表达得更高(多达4倍)，表明通过应用这些表面形貌改善该功能相关表型。

在形貌特征表面上的其他Cyp标志物(即参与解毒的Cyp2B6、Cyp1A2、Cyp2C9)的表达高于(Cyp2B6和Cyp1A2)或类似于(Cyp2C9)CS(在第14天)。

对于CD81和E-钙粘蛋白(参与细胞粘附，形成紧密连接和细胞-细胞通信)，在形貌特征表面上的表达水平与CS相当，并且在第14天时比NP更高。

结论

形貌能够长时间维持肝细胞表型，与早期时间点的当前黄金标准相当。在某些情况下，在体外培养14天期间功能甚至增加。支持肝细胞培养的表现最佳的表面形貌具有20-250μm²的顶表面区域，8-35％的表面覆盖率和3-25μm的突起之间的平均距离的突起。

实施例#4：在长期培养物中维持原代人源肝细胞功能的表面形貌

分析具有和不具有胶原蛋白的实施例#1-3的最有希望的形貌(H3)在24天培养期间对PHH维持或甚至恢复其表型的影响。基因分析类似于实施例3。包括CS(直到第14天)和NP对照。

结果

在具有和不具有胶原蛋白涂层的H3表面上，所有分析的基因(图6)在所有时间点(第8-24天之间)表达显著高于第3天的水平，这被认为是细胞需要恢复到正常的肝细胞状态的时间。与此形成鲜明对比的是，CS中所有生物标志物的表达最佳保持在与第3天相同的水平，或是随时间(最多14天)降到低(很多)的水平。直接比较CS和H3表面，相比在第8天(黄金标准)以及甚至第3天的CS，在第24天时所有基因在H3上仍然具有更相似或甚至(更高)的水平表达。

结论

与目前的黄金标准相比，具有表面形貌H3的PS基质不仅能够维持肝细胞表型和功能，而且其甚至增强了这些功能，包括代谢活性、信号传导、蛋白质分泌和解毒并能使体外培养延长至少24天(与目前黄金标准的8天相比)。在支持肝细胞培养物中表现最佳的表面形貌具有20-250μm²的顶表面区域，8-35％的表面覆盖率和3-25μm的突起之间的平均距离的突起。

表7：在长时间培养物中维持肝细胞功能的单元格和突起设计参数和形貌性能。突起形状：白色表示顶表面区域，黑色表示凹处表面。几何参数基于计算。包括未图案化(NP)样品和一系列“基本形貌”(圆形、三角形和矩形)作为对照。

实施例#5：增强骨整合和骨/牙科植入物的固定的表面形貌。

使用具有各种不同形貌的钛包被芯片来研究改善人间充质细胞(hMSC)的成骨分化以刺激新骨形成的表面形貌，目的是改善骨整合和整形外科和牙科植入物到骨中的固定。当hMSC分化成成骨谱系并形成新骨时，其表达成骨标志物ALP，因此用其作标志物。

形貌的体外验证

根据表5中描述的参数的组合，刺激ALP表达的形貌被选择为命中形貌(表8，O1-O10)。形貌O1-10上的ALP表达范围为整合ALP强度(iALP)从近600到超过1000，以及相对整合ALP强度(riALP)从36到58。与此形成强烈对比，未图案化(NP)对照基质值14(iALP)和212(riALP)以及基本形貌(三角形和矩形，B3-5)的值的范围在14-19(iALP)和近350到略高于500(riALP)之间。这些基本形貌的突起表面覆盖率远低于最佳性能形貌范围(4-25％对30-65％)，并且突起顶表面区域低于最佳性能形貌范围(25-29μm²对30-750μm²)。该数据表明表面形貌O1-O10在刺激ALP表达和因此成骨的优越性。

使用众所周知的体外技术验证这些命中表面，这些技术包括蛋白质表达(FACS)、基因表达(qPCR)和矿化(四环素染色)，证实了与NP表面相比，命中形貌的功效及其优越的性能。

形貌的体内验证

将体外实验中表现最佳的形貌制成通体钛，并在兔股骨模型中体内植入，评估其在4周和8周时的骨整合潜力。NP对照包括在本研究中用于比较。

机械和组织学分析(图7)都显示出形貌特征植入物刺激新的骨组织形成。拉拔试验(图8a)显示NP对照在4周和8周后具有最低水平的骨整合。在4周时，以命中形貌其中之一为特征的所有植入物需要2-4倍于NP对照的拉拔力，其中一个命中形貌特征植入物需要超过5倍。在8周时，与4周时的最佳评分形貌相比，NP对照仍然需要更少的力量来分离。命中形貌特征植入物需要约为NP对照2倍的力，其中一个形貌需要超过3倍。

组织学骨-植入物(BIC)接触分析(图8b)显示NP对照在4周和8周时具有约10％的低BIC。形貌特征植入物在两个时间点都显示出更高的BIC，甚至观察到高的动物间变异。结果显示，8周时命中形貌特征植入物的BIC高达80％。

这些结果提高了在相关的体内模型中命中形貌诱导骨整合的有效性的证明。

结论

与未图案化对照植入物相比，所鉴别的形貌具有高度增强的骨整合特性。结果还表明，具有突起/凹处的规则图案的本发明的形貌提供了比具有随机粗糙表面的临床应用基准更好的骨整合。因此，相对于已知的植入物，本发明的形貌展示出增加的固定和增加的骨形成。

刺激骨生成的表现最佳的表面形貌具有30-750μm²，优选150-450μm²的顶表面区域，30-65％，优选35-60％的表面覆盖率，2-25μm，优选5-15μm的突起之间的平均距离的突起。

表8：刺激骨生成的单元格和突起设计参数和形貌性能。突起形状：白色表示顶表面区域，黑色表示凹处表面。几何参数基于计算。包括未图案化(NP)样品和一系列“基本形貌”(圆形、三角形和矩形)作为对照。

实施例#6：体外调节免疫应答的表面形貌

使用由聚氨酯制成的形貌鉴定调节免疫细胞对生物材料的应答的表面形貌。在将生物材料植入体内后，触发身体试图愈合生物材料周围的受伤组织并去除/分离外来生物材料的免疫应答。这种应答称为异物应答(FBR)。首先，急性应答对于接受生物材料是重要的但可以继续进入慢性炎症过程，包括在植入物周围过量形成纤维化囊。因此，我们使用FBR，特别是异物巨细胞(FBGC，多核细胞)的相关形成作为标志物。

选择具有调节FBR能力的表面形貌并将其嵌入比例增大的基质(2cm²表面积)中并使用1个供体进行验证。

通过在分离期间消除Ficoll梯度，具有2个供体的二次筛选包括更复杂的，混合单核细胞(包括单核细胞)群，以便更好地模拟免疫应答的短期阶段的体内环境。包括未图案化(NP)基质作为对照。

形貌的体外验证

通过表5中描述的参数组合评估的最强烈影响巨噬细胞附着和融合到FBGC中的形貌，被选择作为命中形貌(表9，I1-13)。所述形貌可以在体外刺激和抑制巨噬细胞附着和融合。刺激形貌(I1-4)导致大量具有高度多核化(12-16)的巨噬细胞(12-15)，而抑制形貌(I5-13)具有低巨噬细胞附着(3-6)以及低多核化(4-5)。与此相反，NP和基本形貌(圆形和三角形，B6-7)诱导巨噬细胞附着(NP：6，B6-7：8-10)和多核化中等作用(NP：5，B6-7：7-10)并且不允许控制免疫应答。B6的突起顶面面积低于所有表现最佳的三组形貌的范围(19μm²对20μm²及以上)，而B7的表面覆盖率范围超出所有表现最佳的三组形貌(13％对15-25％H/H，5-10％H/L以及26-50％L/L)。

这些表面形貌的验证证实了形貌大大调节免疫应答的功效。为了说明，图9显示了早期，与NP表面相比，在形貌特征表面(I1和I5)上体外巨噬细胞附着和FBGC形成；表面I5具有低巨噬细胞附着和融合，而表面I1具有高巨噬细胞附着和FBGC形成，表明强烈的FBR。与巨噬细胞相比，NP显示较少数量的附着细胞，但是，形成了几个多核细胞。

二次验证揭示了形貌在体外早期强烈影响巨噬细胞附着和FBGC形成(图10)。低附着形态和高附着形貌的巨噬细胞附着之间的差异高达5倍，并且低附着形貌与NP表面相比高达1.5倍。低附着比高附着形貌上，FBGC形成的减少甚至更强，在一些形貌上甚至超过了大幅下降，而低附着形貌与NP表面相比高达2倍。在每个细胞的平均细胞核数中也可以理解这种效应，其在高附着形貌比低附着形貌上显著更高。将NP表面与具有低附着形貌的表面进行比较，突出显示除了影响巨噬细胞附着本身之外，FBGC形成和融合成一个大细胞的细胞数量显著降低。

结论

所鉴定的形貌在体外条件下通过巨噬细胞附着和融合到FBGC中引导早期免疫调节是非常成功。在体外早期刺激巨噬细胞高附着和/或FBGC形成的表面形貌根据其末期效应被分成两组：I2和I4刺激末期免疫应答，并且该组具有20-70μm²的顶表面区域，15-25％的表面覆盖率，5-12μm的突起之间的平均距离的突起；I1和I3降低末期免疫应答，该组具有25-65μm²的顶表面区域，5-10％的表面覆盖率，12.1-20μm的突起之间的平均距离的突起。另一方面，在体外早期(I5-I13)诱导低巨噬细胞附着和FBGC形成并降低末期免疫应答的表面形貌具有25-200μm²的顶表面区域，26-50％的表面覆盖率，2-12μm的突起之间的平均距离的突起。所有三组形貌都能够影响早期和末期的免疫调节，并且可以根据最终应用使用，其中免疫应答应被下调或刺激。

表9：用于免疫调节的单元格和突起设计参数和形貌性能。突起形状：白色表示顶表面区域，黑色表示凹处表面。几何参数基于计算。包括未图案化(NP)样品和一系列“基本形貌”(圆形、三角形和矩形)作为对照

实施例#7：在体内调节免疫应答的表面形貌。

为了评估选择用于调节免疫应答的表面形貌的体内有效性，将具有这些形貌的植入物置于皮下小鼠模型中。

结果

与对照相比，表面形貌在两个时间点均显著影响小鼠的免疫系统应答(图11)。

与在早期(9d)和末期(60d)时间点的所有其他情况相比，正如预期的，假手术组情况(其中没有植入外来物质，仅对程序本身的响应)通常具有最轻度的免疫应答。与其他植入样本相比，SE参考材料显示出更强烈的免疫应答：与其他植入物相比，在第9天大部分已经在高端，但特别是在60天时，有更多的免疫应答活动和导致植入物周围形成更多较厚的结缔组织层的纤维化。由于其众所周知的“正常”炎症应答，可以预期包括硅弹性体的结果。对未图案化PU植入物的免疫应答，一种用于慢性植入和良好生物相容性的材料设计，最初(9d)更适中至强烈，并导致中度免疫活性和纤维囊形成。虽然通常低于SE参考材料，但是经过一段时间后对NP植入物的响应与对SE组的响应是最相似的。

对具有表面形貌I1(H/L型)的PU植入物的免疫应答开始为中度应答，与NP相比略微降低，但是在60天时免疫应答非常轻度。体内早期结果与体外模型早期相对高的巨噬细胞附着和FBGC形成一致(实施例6)。这种形貌在末期表现出最低的免疫活动水平的现象是非常有趣的，虽然尚未完全理解，但假设是由于最初的急性应答是适当和受控的。在该形貌上，末期的FBGC形成和纤维化是随之发生的(非常小的变化)和轻度的，如低免疫活性和薄纤维囊的形成。

形貌I2(H/H型)在两个时间点均诱导中度至重度免疫应答，在早期阶段与I1相当，但随时间仍保持在该水平。形貌I5(L/L型)在早期也具有中度至重度的免疫应答，并且在末期变得相当轻度，但是与其他形貌相比，囊厚度更高。

与具有表面形貌的生物材料、NP和SE组相比，形貌I6(L/L型)显示最轻度的FBR。这种最接近假手术组的应答开始于轻度至中度应答，并且在末期继续此方式导致最薄的纤维囊。在第9天，形貌I7(L/L型)首先显示类似的轻度至中度FBR，但是在稍后的时间点，FBR更轻度。

比较基于形成的结缔组织的所有植入物，最初(9d)形貌I6和I7诱导最薄的纤维囊，这与实施例#6中呈现的早期体外结果一致。在FBR的末期，与其他表面形貌和NP对照相比，表面形貌I1和I6诱导最低量的纤维化封装，甚至低于假手术组对照。

结论

表面形貌能够在早期(急性)和末期(慢性)调节异物(免疫)应答。形貌特征植入物的FBR从非常轻微到严重不等，并且影响炎症应答以及纤维囊形成及其厚度。本发明的表面形貌允许较低的早期和较低的末期免疫应答，导致在末期FBR(2个月)中纤维化封装减少，并且这些表面具有25-200μm²的顶表面区域，26-50％的表面覆盖率，2-12μm的突起之间的平均距离的突起。此外，本发明的表面形貌允许高的早期和高的末期免疫应答，导致在末期FBR(2个月)的受控纤维化封装的刺激，并且这些表面具有20-70μm²的顶表面积，15-25％的表面覆盖率，5-12μm的突起之间的平均距离的突起。此外，本发明的表面形貌允许高的早期和低的末期免疫应答，导致在末期FBR(2个月)中纤维化封装减少，并且这些表面具有25-65μm²的顶表面区域，5-10％的表面覆盖率，12.1-20μm的突起之间的平均距离的突起。

Claims (18)

1.一种物体，包括设置有一种或更多种形貌的表面部分，所述形貌能够通过物理刺激调节细胞群的形态、增殖、生化功能、分化、附着、迁移、信号传导和/或细胞死亡，并且其中所述形貌包括设置有突起的规则图案的表面，所述突起包括一个或更多个突起元件，所述突起元件被定义为高于具有顶表面区域和圆周侧面的所述表面的表面部分，所述圆周侧面连接所述顶表面与所述表面，其中每个突起元件在所述表面上方的最大高度为0.5至50μm，并且其中：

a)相邻突起之间的平均距离为0至50μm；

b)所述突起的顶表面区域为1至6000μm²；和

c)所述突起覆盖所述表面的3％至90％。

2.根据权利要求1所述的物体，其中

a)如果所述突起包括一个突起元件：

所述突起的长为0.01-100μm，定义为平行于所述表面的顶表面区域的圆周内拟合的最长直线的长度；

所述突起的宽为0.01-100μm，定义为垂直于所述长，平行于所述表面的顶表面区域的圆周内拟合的最长直线的长度；

b)如果所述突起包括多于一个的突起元件：

每个突起元件的长为0.01-100μm，定义为平行于所述表面的顶表面区域的圆周内拟合的最长直线的长度，

每个突起元件的宽为0.01-100μm，定义为垂直于所述长，平行于表面的顶表面区域的圆周内拟合的最长直线的长度的长度；

c)相同突起的相邻突起元件的两个圆周之间的平均距离为0-50μm。

3.根据权利要求1或2所述的物体，其中所述表面部分包括金属、聚合物、复合材料或陶瓷材料。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的物体，其中所述突起的规则图案由交叉网格线的网格定义，所述网格线能覆盖在所述表面上，所述网格线定义了单元格的图案，使得每个单元格包括最多一个突起。

5.根据权利要求1-4中任一项的物体，用于通过物理刺激调节细胞群的形态、增殖、生化功能、分化、附着、迁移、信号传导和/或细胞死亡，在所述物体表面部分上优选包括一种，但不超过10种，不同的形貌。

6.根据权利要求5所述的物体，用于刺激骨生成，用于调节对异物的免疫应答，或用于培养细胞。

7.根据权利要求5或6所述的物体，用于用作植入物。

8.根据权利要求7所述的用于所述用途的物体，所述物体刺激成骨分化，维持肝细胞表型和功能或者刺激和/或抑制免疫应答。

9.根据权利要求7或8所述的用于所述用途的物体，其中所述植入物是牙科植入物或整形外科植入物，其中所述形貌由以下项定义：

a)相邻突起之间的平均距离为2-25μm；和

b)所述突起的顶表面区域为30和750μm²；和

c)所述突起覆盖所述表面的30％至65％。

10.根据权利要求7或8所述的用于所述用途的物体，其中所述植入物是肝脏植入物，其中所述形貌由以下项定义：

a)相邻突起之间的平均距离为3-25μm；和

b)所述突起的顶表面区域为20和250μm²；和

c)所述突起覆盖所述表面的8％至35％。

11.根据权利要求7或8所述的用于所述用途的物体，其中所述物体通过抑制免疫应答来调节对异物的免疫应答，其中所述形貌由以下项定义：

a)相邻突起之间的平均距离为2-12μm；和

b)所述突起的顶表面区域为20和200μm²；和

c)所述突起覆盖所述表面的26％至50％。

12.根据权利要求7或8所述的用于所述用途的物体，其中所述物体通过刺激免疫应答来调节对异物的免疫应答，其中所述形貌由以下项定义：

a)相邻突起之间的平均距离为5-12μm；和

b)所述突起的顶表面区域为20和70μm²；和

c)所述突起覆盖所述表面的15％至25％。

13.根据权利要求7或8所述的用于所述用途的物体，其中所述物体通过刺激对异物的早期免疫应答以引起较低的末期免疫应答来调节对异物的免疫应答，其中所述形貌由以下项定义：

a)相邻突起之间的平均距离为12.1-20μm；和

b)所述突起的顶表面区域为25和65μm²；和

c)所述突起覆盖所述表面的5％至10％。

14.根据权利要求5或6所述的物体，用于在体外通过物理刺激调节细胞群的形态、增殖、生化功能、分化、附着、迁移、信号传导和/或细胞死亡。

15.根据权利要求14所述的物体，其中所述调节包括维持肝细胞表型和功能，其中每种形貌由下定义：

a)相邻突起之间的平均距离为3-25μm；

b)所述突起的顶表面区域为20和250μm²；和

c)所述突起覆盖所述表面部分的8％至35％。

16.根据权利要求1-15中所定义的物体，其中，所述形貌能被替代的定义为包含设置有凹处的规则图案的顶表面区域，所述凹处通过突起的规则图案定义，所述凹处包含凹底、第一凹壁和第二凹壁，所述第一凹壁包含第一凹壁截面和可选的第一凹壁穿孔，而所述第二凹壁包含第二凹壁截面和可选的第二凹壁穿孔，其中所述第一和第二凹壁截面通过与所述凹处相邻的突起的侧面所定义，而其中所述第一和第二凹壁穿孔被定义为所述凹壁的一部分，在该凹壁的部分处垂直于所述凹处且平行于所述凹底的线不接触与所述凹处相邻的突起，且其中：

a)凹壁的高度为0.5-50μm，定义为垂直于所述凹底从所述凹底到顶表面区域的距离；

b)所述第一和第二凹壁的凹壁外廓独立地为0-40μm；

c)所述第一和第二凹壁截面的长独立地为0.01-100μm；

d)如果有第一和第二凹壁穿孔，其长独立地为0至50μm；

e)所述凹处的平均宽度为0至50μm。

17.一种通过物理刺激调节细胞群的形态、增殖、生化功能、分化、附着、迁移、信号传导和/或细胞死亡的方法，包括：

1)使一种或更多种细胞在合适的介质中与表面部分接触，所述表面部分设置有突起的规则图案，所述突起的规则图案由交叉网格线的网格定义，所述网格线能覆盖在所述表面部分上，所述网格线定义了单元格的图案，使得每个单元格包括最多一个突起，所述突起包括一个或更多个突起元件，所述突起元件被定义为高于具有顶表面区域和圆周侧面的表面的部分，所述圆周侧面连接顶表面区域和所述表面，其中每个突起元件在所述表面上方的最大高度为0.5至50μm，并且其中：

a)相邻突起之间的平均距离为0到50μm；

b)所述突起的顶表面区域为1和6000μm²；和

c)突起覆盖所表面的3％至90％。

2)允许细胞对表面作出应答。

18.根据权利要求17所述的方法，其中活细胞是肝细胞，并且其中所述形貌由以下项定义：

a)相邻突起之间的平均距离为3-25μm；和

b)所述突起的顶表面区域为20和250μm²；和

c)所述突起覆盖所述表面部分的8％至35％。