CN101187603B - 一种用于研究植物叶片全息结构而对叶片进行处理的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用大型精密仪器——透射电子显微镜全面研究植物叶片微观、超微观结构时对叶片进行处理的方法。包括对叶片前处理、叶片切片和叶片观察三个部分，其特征在于：顺应叶片组织结构组成形式，采用横向切片方法；等间隔连续捞片，获得一组叶片的切片，此组切片包含叶片以组织结构为单位的全部信息，在透射电子显微镜下，此组切片可获得一系列组织结构、细胞结构、细胞器结构的全息图。本发明的目的是提出一种全新的利用透射电子显微镜观察叶片结构的样品处理、切片、观察方法，此方法操作简单，获得信息量大、全面、系统，以断面切片观察方法和扫描电子显微镜观察方法作为辅助手段，就可以获得植物叶片微观、超微观的全息结构。

Description

一种用于研究植物叶片全息结构而对叶片进行处理的方法

技术领域

本发明涉及一种利用大型精密仪器——透射电子显微镜全面研究植物叶片微观、超微观结构时对叶片进行处理的方法。

背景技术

叶片是植物的重要器官，在植物研究中，对植物叶片的研究占有相当大的比重。利用透射电子显微镜研究叶片的微观、超微观结构，已经经历了几十年，到目前为止，国内、外研究者均是将叶片作常规前处理后，在断面方向作超薄切片(见附图1)，再经过对切片的常规处理，观察切片上的叶片微观结构。此种微观研究方法存在许多问题：

1、断面切片方法不适于叶片的结构研究；

叶片的多种组织，由上至下分层排列或横向穿插共存，各组织分别由单种或多种细胞构成，各种细胞内又含有多种细胞器。断面切片显现的是多种组织的多种细胞及细胞器，不能被确定位置的零乱结构信息，在处理样品和对照样品的切片中很难找到，既处以相同位置又被切到相同位置的细胞及细胞器。所以，难以遵循比较细胞学这一主要的研究方法进行研究。

2、断面切片观察方法，不能或极少量的获得表皮细胞、气孔和传导组织的信息，对叶片的表皮细胞、气孔、传导组织的微观结构研究基本是盲点。

3、叶片断面切片的方法，受叶片表面材质坚硬，叶片表面与树脂不浸润的影响很大，造成切片有刀痕、横纹、切片卷曲(见附图2)。

由于上述原因，许多研究的结论是推定而来，其中，也出现一些错误的结论。

发明内容

发明目的：本发明提供一种用于研究植物叶片全息结构而对叶片进行处理的方法，其目的是提出一种全新的利用透射电子显微镜观察叶片结构的样品处理、切片、观察方法，此方法操作简单，获得信息量大、全面、系统，以断面切片观察方法和扫描电子显微镜观察方法作为辅助手段，就可以获得植物叶片微观、超微观的全息结构。

技术方案：本发明是通过以下技术方案来实现的：

一种用于研究植物叶片全息结构而对叶片进行处理的方法，包括对叶片前处理、叶片切片和叶片观察三个部分，其特征在于：首先在叶片前处理部分中，样品的包埋方向与常规方向垂直；在叶片切片部分中，修理树脂包埋块时，保证样品块底面的两个以上的边含于树脂内，将叶片表面的树脂层掀去；超薄切片机在裸露的表皮上开始切片，首先利用表皮毛和毛基的突起对刀，在没有切到叶片表皮组织细胞之前，就要使刀刃的运动轨迹与样品表面基本平行；然后使刀刃同时切到叶片四个角的表皮组织细胞来进行叶片的横向切片；横向切片的过程中进行连续捞取等间隔的切片。

在叶片观察部分中，通过检验栅栏组织中部切片是否是标准横向切片，来再次确定此组切片是横向切片；

标准横向切片的确定方法为：

∑ΦX∶∑ΦY≈1

ΦX：叶片横向切片时，栅栏组织细胞X方向上的直径；

ΦY：叶片横向切片时，栅栏组织细胞Y方向上的直径。

优点及效果：本发明提供一种用于研究植物叶片全息结构而对叶片进行处理的方法，其目的在于提出一种全新的利用透射电子显微镜观察叶片结构的样品处理、切片、观察方法，此方法操作简单。本发明鄙弃常规断面切片方法，采用横向切片方法，以顺应叶片组织结构构成的形式，等间隔连续捞片，获取一组以叶片组织结构为单位的包含全部信息的切片，此组切片在透射电子显微镜下，可获得按植物叶片各种组织、细胞、细胞器的生理功能分类的结构图，是一套系统、全面、单一种结构信息量大、可被定位的植物叶片微观结构全息图。将植物叶片微观结构全息图与其它研究手段结合可对叶片生理功能进行深入研究。而且，还具有以下优点：

(1)提供对叶片各种组织微观结构的研究方法(见附图3)；

(2)提供对叶片各种组织的单一种细胞微观结构的研究方法(见附图4)；

(3)提供对叶片单一种细胞，相同部位微观结构的研究方法(见附图5)；

(4)提供对叶片单一细胞器的定位微观结构研究方法(见附图6)；

(5)提供了对叶片表皮细胞、气孔、传导组织微观结构研究方法(见附图3-1，4-1，3-3，4-3)；

(6)本发明为获得叶片全部横向逐层微观、超微观结构图提供了简单、可行的方法；

(7)本发明中横向切片方法巧妙地回避了断面切片方法中一切问题，使刀刃受力均衡、切片质量优良、观察视野宽阔，这一方法为禾本科等叶片表面材质坚硬的植物研究开辟了途径；横向切片方法还利用原来树脂与叶片表面不能浸润的致命弱点，获得叶片气孔表面结构树脂模具图，得到一个功能器官的表面状态与内部超微观结构结研究的机会。(见附图7)

附图说明

附图1为标准断面切片示意图TEM×0.2K。

附图2为断面切片出现横纹和刀痕的示意图TEM×0.2K。

附图3为对叶片各种组织横向切片微观结构示意图。

3-1为表皮组织结构TEM×1.4K；

3-2为栅栏组织中部结构TEM×0.2K；

3-3为传导组织结构TEM×0.4K；

3-4为海绵组织上部结构TEM×0.4K。

附图4为对叶片各种组织的单一种细胞横向切片微观结构示意图；

4-1为气孔保卫细胞结构TEM×2.9K；

4-2为栅栏组织细胞结构TEM×1.9K；

4-3为传导组织筛分子与伴结构TEM×7.2K；

4-4为海绵组织细胞结构TEM×1.4K。

附图5为叶片单一种细胞相同部位横向切片微观结构示意图；

5-1为栅栏组织细胞上部结构TEM×0.6K；

5-2为栅栏组织细胞下部结构TEM×1.0K。

附图6为叶片单一种细胞器定位横向切片微观结构示意图；

6-1为横向切片时切片与栅栏组织细胞的叶绿体高重合(或与最大横径重合)时所获的叶绿体结构图TEM×10K(下称：叶绿体横向切片标准结构图)；

6-2为叶绿体横向切片标准结构中的类囊体、质体球结构TEM×48K。

附图7为叶片气孔、表面细胞结构树脂模具图SEM×0.3K。

附图8为其它辅助说明图；

8-1叶片断面实体图SEM×200；

8-2栅栏组织细胞纵剖面中叶绿体实体图SEM×3000；

8-3为断面切片时切片与栅栏组织细胞的叶绿体高重合时所获的叶绿体结构图(与最大纵径重合时也必须经过栅栏组织细胞的长径)TEM×10K(下称：叶绿体断面切片标准结构图)；

8-4断面切片时栅栏组织细胞的叶绿体被横切结构图TEM×14K；

8-5断面切片时栅栏组织细胞中叶绿体一般结构图；

图中左侧：切片与叶绿体底面成非垂直角时叶绿体构图；

图中右侧：切片与叶绿体中心线平行但不重合时叶绿体结构图。

具体实施方式

本发明主要是顺应叶片结构组成方式，提供了一种横向切片的理论对植物叶片进行处理的方法，通过本发明方法得到的横向连续切片，可获得透射电镜下植物叶片各种组织、各种组织中的细胞、各种细胞中的细胞器，定位的系列微观结构图-叶片全息结构图，以便于植物微观结构的研究。

其具体方法主要包括以下三部分：

样品前处理部分、样品切片部分、样品观察部分；

1、样品前处理技术：是按透射电子显微镜技术中常规处理样品方法处理叶片样品；常规处理方法：取1mm×10mm叶片样品，用2.5％戊二醛和1％锇酸双固定，乙醇30％→50％→70％丙酮70％→80％→90％→100％系列脱水，树脂Epon812渗透、包埋，包埋时将叶片平放在模具内，将叶片样品1mm宽的窄断面侧靠紧模具顶端，以便沿叶片断面方向切片。与常规方法不同的是，在包埋前用锋利刀片去掉样品边缘0.2mm左右；挑选无脉、平展切成小于0.4mm×0.4mm的样品，采用二次包埋技术使叶片上表面靠紧模具顶端，包埋聚合。

2、样品切片技术：修理树脂包埋块时，保证叶片样品下面的两个以上边含于树脂内，将叶片表面的树脂层掀去；超薄切片机在裸露的叶片表皮上开始切片，首先利用表皮毛和毛基的突起对刀，在没有切到叶片表皮组织细胞之前，就要使刀刃的运动轨迹与样品表面基本平行；在初切片时，根据前几刀是否能同时切到叶片四个角的表皮组织细胞，来推定能否得到横向切片，以便及时调整；用不同型号铜载网标记切片的位置，每间隔300nm厚的样品，捞取一次切片，用玻璃刀左侧2/3切掉不要的样品同时对刀，用1/3处获得切片，捞取切片后换刀；整个叶片可获得约25-50个载网的样品，采用超薄切片的常规染色法染色。

3、样品观察技术：在对切片样品结构观察研究之前，根据叶片断面实体图(见附图8-1)所获得的数据及切片的片数和厚度，计算找出栅栏组织中部切片，通过检验栅栏组织中部切片是否是标准横向切片，来再次确定此组切片是横向切片。

标准横向切片的确定方法：∑ΦX∶∑ΦY≈1；

Φx：叶片横向切片时，栅栏组织细胞x方向上的直径；

ΦY：叶片横向切片时，栅栏组细胞Y方向上的直径。

对横向切片进行观察研究，在100-5000倍率上，由上至下逐片观察、即可以得到叶片所有组织结构、不同部位的组织结构、部分细胞、细胞器的总的轮廓结构图；在5000-50000以及更高倍率上，可以得到叶片超微观所有细胞、细胞器的结构图，在更高倍率观察时还可以得到膜等更细微的结构。

下面通过图片研究植物叶片全息结构方法的具体特点(本发明以双子叶植物番茄叶片为例给出的微观结构图)；

第一部分、断面切片和横向切片叶片微观结构的特点；

1、叶片的构成：

叶片由多种组织组成，见附图8-1叶片断面实体图，由上至下有叶片上表皮、栅栏组织、传导组织(右、中下的一组圆孔)、海绵组织、下表皮组织组成，上、下表皮上还有表皮毛、气孔；叶片的各种组织由一种或多种细胞构成；细胞由多种细胞器构成；在叶片中叶绿体是完成叶片最主要功能-光作用的细胞器，叶片中叶绿体较大较多，在成熟叶片上叶绿体坐落在栅栏组织细胞内壁，见附图8-2栅栏组织细胞纵剖面中叶绿体实体图。

2、断面切片的特点：

从图1、2中我们能够明显的看出，采用断面切片的方法，获得所有切片的结构形式一致：由上至下，切片的上表皮与栅栏组织细胞的上端部分重叠、看不清其结构，切片上半部为栅栏组织细胞构成，切片下半部为海绵组织细胞构成，有的切片在海绵组织细胞的上、中部可见传导组织的断面结构，叶片的下表皮与海绵组织下端细胞切片重叠、也看不清楚其结构。整幅图片由多种组织结构、多种细胞结构、及细胞器结构构成，整体结构的信息十分凌乱。

3、横向切片的特点：

从附图3～6可见，横向切片获取一组以叶片组织结构为单位的包含全部信息的切片，在透射电子显微镜下，可获得按植物叶片各种组织、细胞、细胞器的生理功能分类的结构图，是一套系统、全面、单一种结构信息量大、可方便定位到细胞器的微观结构全息图。

横向切片能够获得叶片的各个组织清晰的结构图见图3；

3-1为表皮组织结构×1.4K，表皮细胞内部细胞器比较少，气孔保卫细胞结构与表皮细胞共存(上、下表皮结构略有差别)，观察时还可对其中任意一种细胞放大观察研究。

3-2为栅栏组织中部结构×0.2K，栅栏组织为单一种细胞组成，栅栏组织中部的细胞紧密排列，横向切片观察到的是栅栏组织细胞的横断面，其横断面外轮廓是圆形的，观察时还可对其中任意一个细胞放大观察研究。

3-3为传导组织结构×0.4K，传导组织由各种导管、筛分子和伴胞等组成，细胞较长、细胞纵深到其它组织细胞中间，在横向切片中才能看见此结构，放大后还可对其中任意一种细胞观察研究。

3-4为海绵组织上部结构×0.4K，海绵组织细胞形状不规整，细胞间隙大，大的传导组织细胞穿插在海绵组织细胞上层，略小的传导组织细胞伸向海绵组织中下层，经过放大还可对其中任意一个细胞观察研究。

横向切片能够获得各种组织的单一细胞微观结构见附图4。

4-1为气孔保卫细胞结构×2.9K，图中为一对肾状保卫细胞，保卫细胞内有各种细胞器，叶绿体(四个对称的)，细胞核(下胞中部)颜色略深，线粒体(核下侧及其它小深色圆点)等，在50000以上倍率，还可观察到更小的细胞器、亚细胞器和膜等结构，只有横向切片才能够获得气孔微观结构图。

4-2为栅栏组织细胞中间部位的结构×1.9K，在栅栏组织细胞中间部位，主要可见的细胞器结构有叶绿体结构，不多见细胞核和线粒体结构，叶绿体坐落在栅栏组织细胞内壁上，进一步放大还可对亚细胞器及膜结构观察研究。

4-3为传导组织筛分子与伴胞结构×7.2K。(还可观察到传导组织其它细胞，各种导管细胞等)图中间为筛分子，筛分子之间有筛板、筛板上可见筛孔及传导、通过的物质；在伴胞中可见叶绿体和大量的线粒体结构，进一步放大还可对亚细胞器及膜结构观察研究。

4-4为海绵组织细胞结构×1.4K。海绵组织细胞中有不规则排列的叶绿体、少量的线粒体和细胞核等，观察时进一步放大，还可对亚细胞器及膜结构观察研究。

其它细胞就不一一列举。

在横向切片中还可获得单一种组织及细胞的特定部位结构图见附图5，以栅栏组织细胞为例。

5-1为栅栏组织细胞上部结构×0.6K；5-2为栅栏组织细胞下部结构×1.0K；3-2和4-2为栅栏组织细胞的中部。栅栏组织上部细胞多数排列不十分紧密，在与气孔衔接的部位，6-8个细胞形成腔见图5-1；栅栏组织细胞中部细胞排列紧密，胞间隙很小；栅栏组织细胞下部，细胞之间间隔很大，且均匀，说明栅栏组织细胞上较中部略细、一个细胞的中间部位粗度基本一致，下部变细。

由于栅栏组织细胞的高(或长度)与栅栏组织高相同，栅栏组织某一特定的高度也是栅栏组织细胞的高度，研究栅栏组织细胞特定高度部位的结构时可选用相应高度的栅栏组织切片进行放大即可。栅栏组织细胞的各个部位结构构成也有所不同，细胞底部线粒体数量较多。

在切片中可获得许多的细胞器的结构图，以叶绿体为例见附图6；图6-1为栅栏组织细胞中叶绿体横向切片标准结构示意图，是横向切片经过叶绿体旋转中心轴的叶绿体结构图；图6-2为上图放大获得的叶绿体横向切片标准结构中的基粒片层、质体球结构，基粒片层进一步放大还可见类囊体断面结构(闭合的两各平行线)。

第二部分、在两种切片中叶片的组织结构、细胞结构和细胞器结构的定位条件；

在植物细胞的结构研究中，应严格遵循比较细胞学中的原则，应做到同一组织、细胞、细胞器之间以及相同的被切位置和相同的切片角度，的处理样品和对照样品之间的比较研究。

1、横向切片可直接为各种组织结构和细胞结构定位；

由断面切片的特点可知，断面切片整幅图片由多种组织结构、多种细胞结构、及细胞器结构构成，整体结构的信息十分凌乱，做到的组织、细胞、细胞器的定位和切片定位比较困难。

本发明是顺应叶片的结构形式进行的切片，每个切片均只有一种组织结构，一个组织结构的不同部位，或单一种细胞特定部位，各种组织之间、各种细胞之间、细胞的不同部位之间是由不同的切片来区分的，所以研究叶片的组织结构或单一种细胞结构通过选择相应的切片，就可容易的定位观察研究。

2、细胞器的定位问题；

下面主要讨论细胞器的定位问题：细胞器的定位涉及到所在组织、所在细胞、细胞器被切的位置和切片方向的定位。

以栅栏组织细胞中的叶绿体定位来说明细胞器的定位问题。

叶绿体的标准结构图；

切片经过叶绿体的旋转中心轴(近似)(见附图8-2)获得的横向和纵向切片结构图为：叶绿体横向切片标准结构图(见附图6-1)，叶绿体断面切片标准结构图(见附图8-3)，两图结构特点基本一致：在5000-50000倍段的观察视野上，叶绿体外形轮廓近似弓形，内部亚细胞器结构非对称，可见到的亚细胞器-质体球显通体深色圆、基粒片层显平行线叠在一起(见附图6-2)，淀粉粒断面为闭合曲线结构(见附图6-1，8-3)；多数基粒片层的方向趋向平行于较近的叶绿体膜，在叶绿体上、下膜形成的角附近，基粒片层的方向趋向平行于角分线；淀粉粒较大、较多时，会影响基粒片层的方向，使其方向趋向平行附近的淀粉粒表面。两图不同点：在断面切片叶绿体标准结构图中，叶绿体的底边结构略平；在横向切片叶绿体标准结构图中，有时可见叶绿体的底边结构略向外凸，这可能于细胞壁弧线结构有关。

断面切片中细胞器的定位；

断面切片中栅栏组织细胞被切的位置有3种，叶绿体被切的位置和方向有4种：

①切片与栅栏组织细胞的直径重合，获得细胞最大纵向断面结构；

②切片在细胞壁内侧附近处，可获得细胞壁内侧的细胞器-叶绿体被横切结构图；

③绝大部分切片与栅栏组织细胞壁相交两次，相交的角非垂直。

断面切片中叶绿体被切的位置可分为四类：

①切片经过叶绿体旋转中心轴见附图8-3(同时经过叶绿体最大直径)，此切片只有在栅栏组织细胞被切的①种切片情况下才能获得。

②切片与叶绿体底面平行时所获叶绿体结构(见附图8-4)，此结构中叶绿体呈现圆形，叶绿体内的基粒呈现深色圆饼状，切片位置在叶绿体的不同高度时，淀粉粒呈不同大、小的闭合曲线，颜色略浅。此种叶绿体结构图，是在栅栏组织细胞被切的第②种切片时获得，获得机会很少。

③切片与叶绿体底面成非垂直角度所获的结构(见附图8-5左侧)，在此结构图中基粒结构随切片角度而变化最大，切片与叶绿体底面的夹角由0度变化到90度过程时，基粒的结构由圆饼状(见附图8-4)→半圆→模糊的深色块→一叠一叠平行线(参见附图6-2)变化。

④切片与叶绿体底面垂直但不与叶绿体高重合所获结构(见附图8-5右侧)，在高附近此种切片的结构与叶绿体断面切片标准结构基本相同。

叶绿体第③、④种切片结构，在栅栏组织细胞第③种切片时获得，机会很多。

在叶绿体的4种被切片所获得的结构中，仅第①种切片获得的叶绿体断面切片标准结构图有实际意义，但在断面切片中此结构图很少，且在切片上众多的叶绿体结构中确定哪一个是叶绿体断面切片标准结构图比较困难：需要同时满足两个条件：叶绿体结构的高和底边长(见附图8-3)与实物图叶绿体的高和直径(见附图8-2)分别相等。

横向切片中细胞器的定位；

横向切片中栅栏组织细胞和叶绿体被切位置和方向问题；

本发明采用的横向切片方法，就是顺应叶片组织结构构成的形式进行切片，获得的切片均以其主要生理功能或按其主要结构分类。在横向切片中栅栏组织细胞被切的位置有多种，均能够被定位，按研究需要大体可分为4类，每一类都分别为单一个切片：它们是栅栏组织细胞①上端切片、②中部切片、③下部切片④和底端的切片，前三种切片前面已经分析过。栅栏组织细胞底端的切片叶绿体被切的位置类似附图8-5左侧图，但在栅栏组织细胞的底端有数量较多的线粒体结构。

在横向切片中我们研究叶绿体结构时(或研究其它细胞器时)，不用泛泛的研究叶绿体被切的可能性，直接选择可进行叶绿体定位的切片即可。我们可选择栅栏组织细胞的②类切片，在栅栏组织细胞②类切片中，切片与细胞壁垂直、切片也与叶绿体的底面垂直，叶绿体被切片的位置按上面分类只有两种：

①在此切片中所有的叶绿体底面均与切片成垂直结构参见附图8-5右侧图。

②切片与叶绿体旋转轴重合所得的叶绿体横向切片标准结构图。见附图6-1，由于整片切片均是细胞的同一部位，此种结构的数量很大。

在切片上可容易的，由一条标准来确定，叶绿体断面切片标准结构图，即：

叶绿体结构中的底边等于实物图中的叶绿体直径，选出所要找的结构图。

本发明的横向切片方法，在组织结构研究、细胞结构研究及细胞器结构研究中均能在定位的情况下获得广视野的观察切片，可遵循比较细胞学这一主要的研究方法进行全面研究。

第三部分、专有功能细胞的状态与其内部细胞器的微观结构结合深入研究植物叶片；

本发明还获得叶片气孔表面细胞结构树脂模具图(见附图7)，模具图真实显示出叶片的表面情况，将树脂膜结构图与其下面的叶片横向切片获得气孔微观结构结合研究，得到一个功能器官的表面状态与内部超微观结构结合研究的机会。

实施例：

在适应亚高温环境条件的番茄品种选育时，要通过对叶绿体微观结构的研究，了解叶片生理功能-光合作用的情况。

1、叶绿体在不同组织、不同细胞中其数量、形态、位置均不相同，遵循比较细胞学的原则应选择同样条件进行比较研究。按番茄叶片微观结构全息图来看，叶绿体在栅栏组织细胞中间部位排列紧密、数量多，坐落空间位置相同，被切片角度相同条件范围比较大(见附图8-2，4-2，3-2)，容易定位观察，处理与对照样品均选择标准横向切片中，叶绿体横向切片标准结构图(见附图6-1)，进行比较研究。

2、操作

第一步：按技术方案1操作；

第二步：总体按技术方案2操作，与技术方案2不同点：用超薄切片机去掉栅栏组织细胞三分之一以上部位样品，在栅栏组织细胞的三分之一处捞取几片超薄切片即可，(根据叶片断面实体图附图8-1，所获得的数据计算应去掉片数)。

第三步：按技术方案3操作，观察时电镜下，叶绿体结构底边(见附图6-1)，近似等于叶绿体直径(见附图8-2)的叶绿体结构图，就是叶绿体横向切片标准结构图，处理样品和对照样品均选择30个叶绿体横向切片标准结构图拍照，即可进行对比研究。

Claims (1)

1.一种用于研究植物叶片全息结构而对叶片进行处理的方法，包括对叶片前处理、叶片切片和叶片观察三个部分，其特征在于：首先在叶片前处理部分中，样品的包埋方向与常规方向垂直；在叶片切片部分中，修理树脂包埋块时，保证样品块底面的两个以上的边含于树脂内，将叶片表面的树脂层掀去；超薄切片机在裸露的表皮上开始切片，首先利用表皮毛和毛基的突起对刀，在没有切到叶片表皮组织细胞之前，就要使刀刃的运动轨迹与样品表面基本平行；然后使刀刃同时切到叶片四个角的表皮组织细胞来进行叶片的横向切片；横向切片的过程中进行连续捞取等间隔的切片；在叶片观察部分中，通过检验栅栏组织中部切片是否是标准横向切片，再次确定此组切片是横向切片；

标准横向切片的确定方法为：

∑ΦX∶∑ΦY≈1

ΦX：叶片横向切片时，栅栏组织细胞X方向上的直径；

ΦY：叶片横向切片时，栅栏组织细胞Y方向上的直径。

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