CN109556933A - 根结线虫会阴花纹快速制片方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种根结线虫会阴花纹快速制片方法，包括以下步骤：(1)挑取并转移雌虫；(2)用11号解剖刀，一刀斜切切下带有雌虫尾部完整会阴花纹的五分之一至二分之一虫体，之后将带有会阴花纹的部分虫体转移到质量分数60％乳酸溶液中；(3)清理：将切口向下或向侧面，用昆虫针按压上述虫体表皮1～5次，虫体中的内容物会快速释放，10～60秒即可清理干净内容物；(4)用11号解剖刀沿花纹边缘切割，得到含有完整会阴花纹的小块表皮；(5)制作根结线虫会阴花纹永久玻片。本发明使用优化的下刀方式，能一刀切取会阴花纹部分，斜切得到的剖面面积大，在大块表皮上直接进行内容物清理，操作比便捷方便。本发明方法用间短，成功率高，表皮不易在清理时破坏。

Description

根结线虫会阴花纹快速制片方法

技术领域

本发明涉及根结属线虫的会阴花纹永久玻片制作方法。

背景技术

随着全球经济一体化，国际贸易与日俱增，外来检疫性有害生物传入我国的风险日趋严重，我国已经成为世界上受外来检疫性有害生物威胁最为严重的国家之一。生物入侵由于其带来社会、经济和生态问题已经引起了世界各国政府的高度关注，这些入侵物种不仅严重威胁着生态系统，加速物种灭绝，而且还造成生物多样性的丧失。

目前，我国进境植物检疫性有害生物名录中共列入检疫性线虫20种(属)，其中根结属(非中国种)为检疫性线虫。根结属线虫种类最多、危害最大、入侵风险最高，Abad等估计全球农作物每年因根结属线虫危害造成的损失高达1570亿美元。目前全球已报道的根结属线虫约104种，其中约24种为中国种，80余种为非中国种。无论是口岸线虫检疫，还是国内线虫病害研究和防控，都要求对根结属线虫进行准确鉴定。长期以来，由于每种根结属线虫雌虫会阴花纹具有比较稳定的特征，其花纹整体形态、线纹粗细、背弓高度、侧线有无、侧尾腺间距等可用于种类鉴定。因此，根结线虫形态鉴定通常必须制作会阴花纹。

现有的根结线虫会阴花纹制片方法主要根据刘维志主编的《植物病原线虫学》(中国农业出版社2000年出版)，书中介绍了根结线虫雌虫会阴花纹的制片方法：

(一)会阴花纹的常规制作方法：

①选取被根结线虫危害的植物根部，用流水充分洗净根部土壤；

②在0.1％酸性品红乳酚油中浸泡根组织72h(本操作步骤可以忽略)；

③在体视显微镜下，用挑针、镊子或解剖刀等，从根部解剖出雌虫；

④将雌虫放在塑料培养皿玻片(或载破片，但易损伤解剖刀)一侧的水滴中，在体视显微镜下，用锋利的解剖刀按照图1B示切下第一刀；

⑤将切下后的雌虫后部角质膜移至玻片另一侧的45％乳酸中，按图1B切下第二、三刀；

⑥将剩余的后部角质膜移至另一洁净玻片上的45％乳酸中，用细毛笔轻轻剔除卵和其他黏附物；

注意：本步骤为关键，既要剔除干净附着物，不影响以后观察，又不能弄破角质膜。

⑦在乳酸浮载剂中用解剖刀修整后部角质膜小块，一般为长方形(图1C)，整理好的小块要包括会阴部分，也不过大为好；

⑧将合格的角质膜(图1D)若干块放在纯甘油内，用毛针整齐摆好位置，并压沉紧贴载玻片，加盖玻片，用封片剂封片，贴上标签。

该方法是现有通用的会阴花纹制片方法。其下刀方式如图1B所示，先横切一刀，再斜切一刀，最后反方向斜切一刀，得到包含会阴部位的小片角质膜，然后用细毛笔来剔除附着物。

从实验人员实际操作来看，该方法是先下刀切成小片，得到的小片角质膜在溶液中非常容易滑动，教材上说，步骤⑥清理附着物非常关键，可是实际应用中，用毛笔剔除小片角质膜上的附着物非常难操作，附着物难以剔除干净，如果为了剔除干净而用力清扫，就非常容易弄破角质膜。

书中也介绍了另外一种会阴花纹制片方法：Gerber.K与Taylor A.C.(1988)提供的一种能同时观察唇区侧面观特征及排泄孔位置及会阴花纹特征的制片方法：

(二)Gerber与Taylor的会阴花纹制作方法

①第一至三步同上①～③；

②在体视显微镜下，用解剖刀在虫体背部后半部分切下近1/4；

③用挑针将虫体转移至乳酸中，并用挑针清除虫体内的物质；

④将干净的虫体转移至另一洁净的乳酸滴中，重复清洗一次；

⑤将处理好的虫体放在纯甘油中，切口向下，轻轻盖上盖玻片即可，用封片剂封片，贴上标签。

Gerber与Taylor的方法发表在Journal of Nematology 20(3):502-503.1988上，如图2所示，按照该文献中的说法，是先用针去除虫体内容物，再切除虫体背部后半部分的1/4，切除的方向是虫体剖面的1/4。

如果按照文献中的说法，用针插进去来除去虫体内容物，这个操作难度非常大，很难清理干净内容物。并且，按照图2的下刀方法，这个切面也很小，不容易清理内容物，而且这种下刀方式也很难操作，一刀不能切断，中途要转向90度，操作难度很高。

因此，上述会阴花纹切片方法都存在缺陷，操作难度较大，不利于实验室鉴定人员操作。

发明内容

针对现有技术的缺陷，申请人通过对切割方法、解剖刀、挑针制作等环节的改进，提供了一种根结线虫会阴花纹的快速制片方法。

根结线虫会阴花纹快速制片方法，所述方法包括以下步骤：

(1)挑取并转移雌虫：用2号昆虫针从根结线虫受害根部挑取出根结线虫的雌虫，拨入水中，然后转移1个以上的雌虫至塑料培养皿中待用；

(2)在解剖镜下，用昆虫针或挑针将水滴中的雌虫拨到水滴外面，然后用11号解剖刀，一刀斜切切下带有雌虫尾部完整会阴花纹的五分之一至二分之一虫体，之后用昆虫针或挑针将带有会阴花纹的部分虫体转移到质量分数60％乳酸溶液中；

(3)清理：将切口向下或向侧面，用昆虫针按压上述带有会阴花纹的虫体表皮1～5次，虫体中的内容物会快速释放，10～60秒即可清理干净内容物；

(4)用昆虫针将上述已清理干净的带有会阴花纹的虫体表皮转移到甘油滴中，在放大30-40倍的解剖镜下，使带有会阴花纹的表皮表面朝上，用11号解剖刀沿花纹边缘切割，除去多余不含有花纹的表皮，保留完整会阴花纹部分，得到含有完整会阴花纹的小块表皮；

(5)取一干净载玻片，在中间加一小滴甘油，在解剖镜下用挑针将上述含有完整会阴花纹的小块表皮转移至甘油滴的中央，表皮表面向上，压沉紧贴载玻片，加盖玻片，用封片剂封片，制作得到根结线虫会阴花纹永久玻片。

所述步骤(1)优选按照以下步骤操作：将受害根放在带水的培养皿中，置解剖镜下，将根结表面用镊子或解剖针针尖轻轻拨开，剖面上乳白色的光滑球状物即为根结线虫的雌虫，用2号昆虫针将球状物轻轻拨入水中，用200微升移液器，将枪头用刀片切去少许，即可将1个以上的白色雌虫转移到7-10cm塑料培养皿中。

所述步骤(1)和(2)中，解剖镜的放大倍数一般为10～20倍。

所述步骤(2)中，用昆虫针将水滴中的雌虫拨到水滴外面，有利于准确下刀。

所述步骤(2)中，一刀斜切切下带有雌虫尾部完整会阴花纹的五分之一至二分之一虫体，具体下刀的位置为：雌虫头端到尾端的中轴线上，尾端会阴花纹在中轴线上的靠近头端的边缘点为A点，中轴线的中点为B点，在A点和B点中任选一点为切割点O点，在O点处将中轴线向左或向右偏移30～90度，确保保留完整会阴花纹，作为切割线，沿切割线进行斜切，切下带有雌虫尾部完整会阴花纹的五分之一至二分之一虫体。

所述步骤(3)中，清理时优选将昆虫针针尖部分的1～1.5mm处弯曲45度，使针尖成135度角，可获得更好的清理效果。

所述步骤(4)中，切割成小块表皮时，一般切成近四边形或三角形都可以。

所述步骤(5)中，制片步骤优选为：取一干净载玻片，在中间加一小滴甘油，在解剖镜下用挑针将上述含有会阴花纹的小块表皮转移至甘油滴的中央，往下压沉紧贴载玻片，然后确认此表皮表面向上，在甘油滴两边对称放两块小蜡块，加盖玻片，置于64℃的加热板上加热20～40s(优选30s)，待蜡块融化后自然冷却，制作得到根结线虫会阴花纹永久玻片。

所述步骤(5)中，挑针为线虫挑针，可按以下方法制作：取尖毛尼龙牙刷毛一根和1000毫升移液器塑料枪头一个，将该枪头在酒精灯上烧约1～3秒，使得枪头略融化，立即将该牙刷毛的根部约3-5毫米插入已经烧软的枪头处，即可制成线虫挑针。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1.使用优化的下刀方式，能一刀切取会阴花纹部分，并且斜切得到的剖面面积大，在大块表皮上直接进行内容物清理，操作比在小块表皮上要容易的多。通常，用昆虫针按压数次即可快速释放内容物，比用毛笔剔除或者用针插进去进行清理等都要方便快捷。

2.用60％乳酸溶液，通过昆虫针按压数次，能快速完成雌虫内容物清理。

3.在甘油中切取会阴花纹，使得切取过程更轻松，避免传统在水中或乳酸溶液中切取过程中因表面张力原因，下刀时表皮容易滑动。

4.通过2号昆虫针、11号解剖刀、线虫挑针等的配合使用，使得切取过程大为改进。

通过本发明的改进方法，一般做一张会阴花纹玻片仅需5～10min，且成功率高，表皮不易在清理时破坏。该方法优点在于简单、快速，易学易会，在植物检疫和植物保护领域具有广泛应用前景。

附图说明

图1刘维志的《植物病原线虫学》中介绍的会阴花纹的常规制作方法中的雌虫会阴花纹切割过程图。

图2 Gerber与Taylor的会阴花纹制作方法过程图。

图3本发明会阴花纹制片方法的雌虫切割图示。图3中，上图为雌虫第一刀切割位置示意图，下图为将清理干净的表皮切割成小块表皮的示意图。

图4实施例1的切割雌虫第一刀切割位置图。

图5不同方法制作会阴花纹玻片制作时间对比曲线图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步详细描述，但本发明的保护范围不限于此。

实施例中的线虫挑针按以下方法制作：取尖毛尼龙牙刷毛一根和1000毫升移液器塑料枪头一个，将该枪头在酒精灯上烧约1～3秒，使得枪头略融化，立即将该牙刷毛的根部约3-5毫米插入已经烧软的枪头处，即可制成线虫挑针。

如图3所示，本上图为雌虫第一刀切割位置示意图，下图为将清理干净的虫体表皮切割成小块表皮的示意图。

图3上图中，1为雌虫虫体，2为雌虫头端到尾端的中轴线，尾端会阴花纹在中轴线上的靠近头端的边缘点为A点，中轴线的中点为B点，在A点和B点中任选一点为切割点O点，在O点处将中轴线向左或向右偏移30～90度，得到切割线3，切割线3要确保保留完整会阴花纹，不能切断会阴花纹。沿切割线进行斜切，切下带有雌虫尾部完整会阴花纹的五分之一至二分之一虫体。

切下来的部分虫体经过昆虫针按压，清理干净内容物后，要切割成小块表皮来制作玻片，如图3的下图所示，将清理干净的虫体表皮4的表面向上，沿花纹边缘的虚线切割，除去多余表皮，得到小块包含完整会阴花纹的表皮即可。

实施例1

切取并制作根结线虫雌虫会阴花纹永久玻片，具体步骤如下：

1.挑取并转移雌虫：将受害根放在带水的培养皿中，置解剖镜下，将根结表面用镊子或解剖针针尖轻轻拨开，剖面上乳白色的光滑球状物即为根结线虫的雌虫，用2号昆虫针将球状物轻轻拨入水中，用200微升移液器，将枪头用刀片切去少许，即可将1个以上的白色雌虫转移到7-10cm塑料培养皿中待用。

2.切割(第一次)：在放大10倍的解剖镜下，用昆虫针将上述水滴中的雌虫拨到水滴外面，然后用11号解剖刀，按照图4用11号解剖刀切下第一刀，之后用昆虫针将带有会阴花纹的部分转移到质量分数60％乳酸溶液中。

3.清理：将切口向下或向侧面，用昆虫针按压上述带有会阴花纹的虫体表皮1～5次，虫体中的内容物会快速释放，20～30秒后即可清理干净。将昆虫针针尖部分的1～1.5mm处弯曲45度，使针尖成135度角，可获得更好的清理效果。

4.转移(第二次)：用昆虫针将上述已清理干净的带有会阴花纹的虫体表皮转移到甘油滴中，在放大30-40倍的解剖镜下，可清晰看到目标表皮带有会阴花纹，使表皮表面朝上，用11号解剖刀沿花纹边缘切割，除去多余不含有花纹的表皮，保留完整会阴花纹部分，得到含有完整会阴花纹的小块表皮；

5永久玻片制片：取一干净载玻片，在中间加一小滴甘油，在解剖镜下用挑针将上述含有会阴花纹的小块表皮转移至甘油滴的中央，往下压沉紧贴载玻片，然后确认次表皮表面向上，在甘油滴两边对称放两块小蜡块，加盖玻片，置于64℃的加热板上加热30s，待蜡块融化后自然冷却，制作得到根结线虫会阴花纹永久玻片。

本发明用时较短，制作一张会阴花纹玻片仅需5～10min。

实施例2不同会阴花纹制片方法对比

按照实施例1、刘维志方法和Gerber与Taylor的方法分别进行根结线虫会阴花纹制作，选取3名实验人员，于10天内，每人每天用三种方法各制作5张根结线虫会阴花纹，统计制作时间，成功率，计算平均制作时间并绘制制作时间曲线图，所得结果见图5。成功率数据见表1。

其中的失败主要包括清理过程中表皮破损，或切割时切破花纹等等。

制作时间只计算制作成功的平均时间，失败的不予计算。

表1不同会阴花纹制片方法成功率数据对比

表1中，A、B、C代表不同的实验人员。

图5和表1的结果表明，对于同一实验人员和同一方法，平均制作时间均随时间增加，也就是练习次数增加而逐渐减少，成功率提高，但对于同一实验人员不同方法，成功率的排名是本申请方法大于刘维志方法大于G&T方法，制作时间排名是本申请方法小于刘维志方法小于G&T方法。

本申请方法的制作用时比现有其他两种方法都要明显降低，时间上的差异主要来源于在切割和清理步骤上用时的差别。本申请方法只需要1～2分钟即可完成第一步切割和清理内容物的步骤，而刘维志方法第一步切割要3刀，较为费时，后续小块表皮上清理内容物也很难操作，此处就需要5～10分钟。而G&T方法切割和清理步骤最复杂，因此用时最长，需要10～20分钟才能完成。

而成功率数据的差异也主要来自于切割和清理步骤上的操作的难易差别，根据实验人员反映，G&T方法切割和清理难度很大，刘维志方法切割出来的小块表皮上清理内容物难度较大，容易导致破损，因此成功率都很难达到100％。本申请方法切割方法简单，剖面大，在大块表皮上清理内容物容易操作，清理只需要用昆虫针按压数次，快捷方便，用时短，成功率高，经2-3次练习后即可达到100％成功率。

Claims (7)

1.根结线虫会阴花纹快速制片方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

(1)挑取并转移雌虫：用2号昆虫针从根结线虫受害根部挑取出根结线虫的雌虫，拨入水中，然后转移1个以上的雌虫至塑料培养皿中待用；

(2)在解剖镜下，用昆虫针将水滴中的雌虫拨到水滴外面，然后用11号解剖刀，一刀斜切切下带有雌虫尾部完整会阴花纹的五分之一至二分之一虫体，之后用昆虫针或挑针将带有会阴花纹的部分虫体转移到质量分数60％乳酸溶液中；

(3)清理：将切口向下或向侧面，用昆虫针按压上述带有会阴花纹的虫体表皮1～5次，虫体中的内容物会快速释放，10～60秒即可清理干净内容物；

(4)用昆虫针或挑针将上述已清理干净的带有会阴花纹的虫体表皮转移到甘油滴中，在放大30-40倍的解剖镜下，使带有会阴花纹的表皮表面朝上，用11号解剖刀沿花纹边缘切割，除去多余不含有花纹的表皮，保留完整会阴花纹部分，得到含有完整会阴花纹的小块表皮；

(5)取一干净载玻片，在中间加一小滴甘油，在解剖镜下用挑针将上述含有完整会阴花纹的小块表皮转移至甘油滴的中央，表皮表面向上，压沉紧贴载玻片，加盖玻片，用封片剂封片，制作得到根结线虫会阴花纹永久玻片。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中，一刀斜切切下带有雌虫尾部完整会阴花纹的五分之一至二分之一虫体，所述斜切的位置为：雌虫头端到尾端的中轴线上，尾端会阴花纹在中轴线上的靠近头端的边缘点为A点，中轴线的中点为B点，在A点和B点中任选一点为切割点O点，在O点处将中轴线向左或向右偏移30～90度，确保保留完整会阴花纹，作为切割线，沿切割线进行斜切，切下带有雌虫尾部完整会阴花纹的五分之一至二分之一虫体。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)按照以下步骤操作：将受害根放在带水的培养皿中，置解剖镜下，将根结表面用镊子或解剖针针尖轻轻拨开，剖面上乳白色的光滑球状物即为根结线虫的雌虫，用2号昆虫针将球状物轻轻拨入水中，用200微升移液器，将枪头用刀片切去少许，即可将1个以上的白色雌虫转移到7-10cm塑料培养皿中。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中，解剖镜的放大倍数为10～20倍。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(3)中，清理时将昆虫针针尖部分的1～1.5mm处弯曲45度，使针尖成135度角，可获得更好的清理效果。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(5)中按以下步骤操作：取一干净载玻片，在中间加一小滴甘油，在解剖镜下用挑针将上述含有会阴花纹的小块表皮转移至甘油滴的中央，往下压沉紧贴载玻片，然后确认此表皮表面向上，在甘油滴两边对称放两块小蜡块，加盖玻片，置于64℃的加热板上加热20～40s，待蜡块融化后自然冷却，制作得到根结线虫会阴花纹永久玻片。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(5)中，挑针为线虫挑针，按以下方法制作：取尖毛尼龙牙刷毛一根和1000毫升移液器塑料枪头一个，将该枪头在酒精灯上烧约1～3秒，使得枪头略融化，立即将该牙刷毛的根部约3-5毫米插入已经烧软的枪头处，即可制成线虫挑针。