CN101185658A - 一种液态中药制剂的中间体及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种液态中药制剂的中间体及其制备方法和用途，包括一种单味水蛭超微粉制剂的粉碎方法，特别是一种湿法超微粉碎技术制备水蛭超微粉制剂的粉碎方法。该方法是将水蛭药材常规粉碎后再加适量的聚乙二醇、丙二醇、甘油、吐温中任意一种或几种的组合物，一起超微粉碎后得到所需的制剂中间产物，再将此中间产物制成所需剂型。应用该方法可以提高粉碎效率，降低产品中的原料用量。
Description
技术领域
本发明涉及一种含水蛭单味药材制剂的中间体及其制备方法，属中药领域。
背景技术
一、水蛭研究进展
水蛭功效为破血、逐瘀、消癥。可用于癥瘕痞块，血瘀经闭，跌打损伤，血小板增多症，及脑出血。水蛭始载于《神农本草经》：“主逐恶血，瘀血，月闭，破血瘕积聚，无子，利水道。”《本草纲目》：“咸走血，苦胜血。水蛭之咸苦，以除蓄血，乃肝经血分药，故能通肝经聚血。”
水蛭属高度特化的环节动物，目前已知全世界共有300多种，我国分布有62种[2]。水蛭主含蛋白质，此外含有17种氨基酸，包括人体必需的8种氨基酸，还含有Zn、Mn、Fe、Co、Cr、Se、Mo、Ni等14种元素。不同种吸血习性不同。日本医蛭、菲牛蛭、欧洲医蛭属吸血蛭类；而宽体金线蛭、尖细金线蛭为非吸血蛭类。不同种水蛭中活性成分不同，大致可分为两类：一类直接作用于凝血系统成分，包括凝血酶抑制剂以及其它抑制血液凝固的物质，是水蛭活血化瘀的物质基础；二是其它蛋白酶抑制剂等活性成分，如胰蛋白酶抑制剂、糜蛋白酶抑制剂、粒细胞弹性蛋白酶和组织蛋白酶G抑制剂。
水蛭中的主要有效成分为蛋白、多肽类成分。由于蛋白多肽进入体内后可以被酶迅速代谢降解，生物半衰期短，一般具有较强的亲水性，不易透过生理屏障，表观分布容积小，加上胃肠道和肝脏的首过效应等原因，其生物利用度通常较低，特别是口服给药，其生物利用度更低，一般只有10％左右[5]。
水蛭水煎液的醇溶部分可直接阻断凝血反应的最后步骤——纤维蛋白原(Fbg)与凝血酶的相互作用；非醇溶部分可直接水解纤维蛋白(Fb)，并且对Fbg和Fb的水解有相对的选择性。这表现在：一方面，它们对Fbg和Fb的水解作用明显强于对牛血清白蛋白(BSA)的作用；另一方面，它们对Fbg和Fb的α链的水解作用强于对β链和γ链的作用。10％水蛭粉混悬液口服给予病理“血瘀”小鼠，能使其全血、血浆及全血还原粘度明显降低。水蛭的乙酸乙酯提取物能使大鼠的凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)和活化的部分凝血酶时间(APTT)显著延长；正己烷部分和水溶液部分能使大鼠的PT显著延长；而正丁醇部分能使大鼠的ATPP显著延长。由于水蛭的有效部位分布较广，以单独的提取溶剂提取，不能保证提取出所有的有效成分，而且提取后有效成分的提取率较低，大量的有效成分被水解、破坏，生物利用度低。故水蛭药材较适宜直接粉碎入制剂，既可保证有效成分不损失，又不会使某些成分水解、破坏，而且成品率高，中间过程无损失。
二、超微粉碎研究进展
1、超微粉碎原理及意义
超微粉碎技术是使物料微细及超细化的机械加工方法，是提供超微粉体的重要手段之一。近20年来，该项技术获得迅速发展，国外已广泛应用于冶金、陶瓷、纺织及航空航天等工业领域。中药行业引入微粉概念始于20世纪90年代末，虽然起步较晚，但由于粉碎是中药生产及应用中的基本加工技术，因此超微粉碎也愈来愈引起人们的关注，超微粉碎技术已显露出特有的优势和广阔的应用前景。
在中药材的粉碎过程中，药材受到强烈的正向挤压力和切向剪切力的作用，运用高速、高能量进行粉碎，细胞被挤压、剪切，细胞壁被撕裂、断开，细胞被破碎成碎片或被压破，所得到的粉末粒径一般达300目以上、中心粒径达10～25μm，细胞破壁率达95％以上，“破壁”的药粉其所含化学成分直接暴露出来，与传统的中药药粉(化学成分存在于完整的细胞壁内)相比，产生了“质”的变化，初步的药理实验已证实：细胞级超细微粉能明显提高药效，在中药现代化方面有广泛应用。其原理目前初步认为：细胞破壁后的超微粉末可以全部保留其中的各种成分，细胞级超细微粉易被小肠吸着、停留时间长，利于吸收，同时直接暴露的化学成分易于透膜吸收，大大提高了其生物利用度。
中药超微粉碎给中药剂型改革和中药现代化带来了一场革命，提高了细胞破壁率、比表面积、有效成分溶出度、生物利用度，能增强药理作用、减少用药量、节省药材和保护药材资源，同时还可改善气味、口感，提高药品质量，相对目前常规粉碎、水煎煮或有机溶剂提取等方法具有无可比拟的优势。尤其对于树脂类药材、动物药及贵重药材如血竭、水蛭、麝香、牛黄等，由于这些药材中成分不明确，不宜提取，大多经常规粉碎后入丸散应用，而引入超微粉碎技术后，使原有物料处于一种超微细粉末的“新的状态”，充分发挥超微细粉独特的理化性质，中药的有效成分不但不会丢失或减少，而且还会被人体充分吸收利用，中医药的特色将得到更大的发挥。超微粉碎技术可使药材中的有效成分直接暴露出来，而不是使有效成分从细胞壁(膜)释放，从而使药物起效更加迅速、充分，其粒度细腻、均匀，表面积增加，孔隙率增大，吸附性和溶解性增强，药物能较好地分散、溶解于胃液中，增大与胃黏膜的接触面积，从而更易被胃肠道吸收，大大提高了生物利用度。药材经过超微粉碎，没有新的物质生成，传统中药固有的药效学基础物质没有发生质的变化，从而保持了传统中药的性味和功能主治。因此，超微粉碎技术较好地处理了中药研发过程中继承与创新的关系问题，既发挥了现代科学技术的优势，又秉承了传统中药治病保健的固有特性。
在中医药发展中，限制中药临床应用的一个重要因素就是中药的味觉和口感较差，吞咽困难。中药超微细粉的平均粒度一般在20μm以下，其颗粒度已低于口腔颗粒感觉阈值，直接服用或煎煮后全服基本上没有口服颗粒感，无论是成人还是儿童均能适应。通过水蛭入药方式的比较研究，表明生水蛭经超微粉碎，90％的粒度为普通散的1/4，50％的粒度为普通散的1/15，且颜色变浅，腥味降低，质地细腻，利于吞服。
2、中药超微粉碎存在的问题
由于受传统常规粉碎方法的影响，目前所有超微粉碎方法都是将所需药材直接进行粉碎，得到粉碎物后再进行其他处理。在实践中，水蛭药材经普通的超微粉碎方法粉碎后，能提高粉碎度，粒度大大减小，比表面积较普通粉大大增大。但在制备、贮存过程中，由于微粉的表面能大，粒间存在范德华力、液桥力、静电力等，表面电荷数增多，微粉颗粒具有强烈的相互吸附、团聚倾向，使粒度增大，影响了超微粉碎的效果；同时，由于微粉与空气中水分的结合面积增大，因而极易吸潮，流动性变差，对环境的要求也相应提高，极不方便直接制剂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的超微粉碎方法，以提高水蛭的粉碎效率，并简化制剂过程。
本发明目的是这样实现的：
取水蛭药材，常规粉碎过20～80目筛，粉碎物加3～5倍量的聚乙二醇、丙二醇、甘油、吐温中任意一种或几种的组合物，一起超微粉碎20～60分钟，即得。
在以上技术方案中，粉碎物与液体分散介质的重量比优选为1∶3.5～4；聚乙二醇-丙二醇-甘油-吐温的重量比优选为4～8∶0.2～1∶0～0.5∶0～0.5。
最优方案为：取水蛭，常规粉碎过50目筛，加3.52倍的聚乙二醇-400和0.28倍的丙二醇，混匀，置振动式微粉机中，超微粉碎混合50分钟，出料，即得。
在上述方案中，振动式微粉机的工作温度可以为室温或通冷却水、液氮等低温下操作。
其研究过程如下：
(1)分散剂的种类
湿法超微粉碎常用到的分散剂为水、乙醇及聚乙二醇400，本品分别以此三种溶剂分散，优选最好的分散剂。
试验方法取水蛭药材粗粉(50目)250g，各取三份，分别加入水、乙醇、聚乙二醇400900g，各置振动式微粉机中，分别超微粉碎混合30分钟，观察各微粉的状态，测定粒度(D50)、多肽的含量，考察稳定性。粒度(D50)及稳定性的考察方法同前。结果见下表。
表 分散剂种类考察试验结果
| 分散剂 | 药液状况 | 粒度(D50) | 稳定性 |
| 水60％乙醇聚乙二醇 | 粉碎效果较差较为细腻粉碎效果好，细腻 | 12.3412.289.44 | 分层明显分层明显不分层 |
注：采用Winner JL9200便携式高分辨激光粒度分析仪测定微粉粒度。
以上试验结果表明，水、乙醇、聚乙二醇400为分散剂超微粉碎的粒度D50均能达到10um左右，达到细胞级破壁粉碎。但以水、60％乙醇作分散剂超微粉碎后，放置易分层沉降；而且水和60％乙醇均不能直接制成制剂，需要蒸去水、乙醇等溶剂，在蒸干过程中，微粉的颗粒易引起积聚，不便制剂。以聚乙二醇400为分散剂超微粉碎，聚乙二醇400的稠度适中，有表面活性剂作用，使得粉碎顺利，而且可直接制剂成型，省去了工艺操作。聚乙二醇400与药材在微粉机中高度混合，形成高度均质化的液态分散体系，能够明显改善微粉的表面性质，减少表面电荷数，增加微粉润湿性、制剂的稳定性；对多肽、蛋白质类成分具有物理的和化学的修饰作用，能够增加其溶解度和稳定性，消除机体的免疫破坏作用，明显提高药物的生物利用度。
故本品选择以聚乙二醇400作为分散剂。因聚乙二醇400吸水性较强，一般在以聚乙二醇400为基质的软胶囊制剂中通常加入聚乙二醇400量8％的丙二醇以保持内外水分平衡，试验对加入丙二醇的分散剂进行了考察。
试验方法取水蛭药材粗粉(50目)250g，加入聚乙二醇400 880g，丙二醇70g，置振动式微粉机中，超微粉碎混合30分钟，观察微粉的状态，测定粒度(D50)，考察稳定性。粒度(D50)及稳定性的考察方法同前。结果见下表。
表 聚乙二醇400中加入丙二醇试验考察结果
| 分散剂 | 药液状况 | 粒度(D50) | 稳定性 |
| 聚乙二醇400中加入8％的丙二醇 | 粉碎效果好，黏度适中，流动性好，细腻 | 9.50 | 不分层 |
经过试验筛选，以聚乙二醇400中加入8％的丙二醇为分散剂，和单独以聚乙二醇400为分散剂的效果基本相当，故本品选择以聚乙二醇400中加入8％的丙二醇的作为湿法超微粉碎的分散剂。
(2)微粉的方式对超微粉碎的方式进行了考察。
试验方法①样品1：取水蛭药材粗粉(50目)250g，置振动式微粉机中超微粉碎30分钟，即得；
②样品2：取水蛭药材粗粉(50目)250g，置振动式微粉机中超微粉碎30分钟，取出，再加聚乙二醇400 880g，丙二醇70g，混匀，胶体磨研磨5分钟，即得；
③样品3：取水蛭药材粗粉(50目)250g，加聚乙二醇400 880g，丙二醇70g，混匀，置振动式微粉机中超微粉碎混合30分钟，即得。
对各份样品分别测定其粒度(D50)，湿法微粉观察沉降情况，以此考察其稳定性。粒度(D50)测定方法同上。结果见下表。
表 超微粉碎方式考察结果
| 样品 | 样品1(粒度) | 样品2(粒度；稳定性) | 样品3(粒度；稳定性) |
| 0天1天4天7天 | 11.58um12.77um14.83um16.04um | 11.21um；未沉降11.86um；沉降分层11.35um；沉降分层12.58um；沉降分层 | 9.11um；均一未沉降9.19um；均一未沉降9.03um；均一未沉降9.22um；均一未沉降 |
以上试验结果表明，样品1——干法超微粉碎，在放置过程中，由于表面能较高，带的电荷多，易团聚，粒度变大；样品2——先干法超微粉碎再与分散剂胶体磨研磨，其粒度较小，在放置一天后发现沉降分层现象，其稳定性较差；样品3——药材与分散剂一起超微粉碎混合，稳定性较好，放置过程中一直为均一的混悬液，未出现沉降情况，而且粒度较小，变化不大，故本品选择将水蛭药材和基质一起超微粉碎。
(3)分散剂的比例对所优选的水蛭药粉与分散剂的比例进行了考察。
试验方法①取水蛭200g，以1∶2的比例加入分散剂(含8％丙二醇的聚乙二醇400)400g，置振动式微粉机中超微粉碎混合30分钟，出料，即得；
②取水蛭200g，以1∶3的比例加入分散剂(含8％丙二醇的聚乙二醇400)600g，置振动式微粉机中超微粉碎混合30分钟，出料，即得；
③取水蛭200g，以1∶3.8的比例加入分散剂(含8％丙二醇的聚乙二醇400)760g，置振动式微粉机中超微粉碎混合30分钟，出料，即得；
④取水蛭200g，以1∶4.6的比例加入分散剂(含8％丙二醇的聚乙二醇400)920g，置振动式微粉机中超微粉碎混合30分钟，出料，即得。
通过以不同的药粉和分散剂的比例进行湿法超微粉碎，考察药液的性状和粒度(D50)。结果见下表。
表 基质比例的选择试验结果
| 药粉∶基质 | 药液性状 | 粒度(D50) |
| 1∶21∶31∶3.81∶4.6 | 药液为半固体，粘壁严重，不流动药液均匀、粘稠，流动性极差，放置24小时不分层药液均匀、细腻，流动性好，放置24小时不分层药液均匀、较稀，流动性较好，放置24小时不分层 | 11.349.538.548.40 |
以上试验结果表明，当药粉和基质的比例为1∶3.8时，药液均匀、细腻，流动性好，放置24小时不分层；粒度较小；而药粉和基质比例为(1∶3)时药液较为粘稠，流动性差；比例为(1∶4.6)时药液较稀，用基质量大，浪费辅料，增加成本。故本品选择以药粉-基质(1∶3.8)的比例进行超微湿法粉碎，所得的液体分散体流动性好，稳定，能满足制剂成型的要求。
(4)超微粉碎的时间本品对湿法超微粉碎时间进行了考察。
试验方法取水蛭药材粗粉(50目)250g，加入聚乙二醇400 880g，丙二醇70g，置振动式微粉机中，超微粉碎混合，分别在第20分钟、第30分钟、第40分钟、第50分钟取样，观察不同时间微粉的状态，测定其粒度(D50)及多肽的含量。粒度(D50)的测定方法同上。结果见下表。
表 超微粉碎时间的考察试验结果
| 超微时间 | 微粉状态 | 粒度(D50) | 多肽含量(mg/g) |
| 20分钟30分钟40分钟50分钟 | 不细腻细腻细腻细腻 | 34.62um17.63um8.62um8.60um | 7.958.068.438.50 |
注：多肽的含量测定方法 照紫外-可见分光光度法(中国药典2005年版一部附录VA)测定。
对照品溶液的制备取牛血清白蛋白对照品适量，精密称定，加水制成每1ml含0.3mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备取待测样品2.0g，精密称定，置100ml量瓶中，加水80ml，超声处理30分钟，放冷，加水至刻度，摇匀，以微孔滤膜(0.45μm)滤过，即得。
标准曲线的制备精密量取对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，分别置具塞试管中，各加水至1.0ml，再分别加碱性铜试液1.0ml，摇匀，室温放置10分钟，各加入福林试液(取储备液(1→16))4.0ml，摇匀，于55℃水浴中保温5分钟，取出，冷至室温。以0管为空白，照分光光度法(中国药典2005年版一部附录V A)，在650nm波长处测定吸收度。以牛血清白蛋白的浓度与对应的吸收度计算回归方程。
测定法精密取供试品溶液1ml，照标准曲线制备项下自“分别加碱性铜试液1.0ml”起依法操作，测得样品的吸收度，从回归方程中计算多肽的含量。
以上试验结果表明，超微粉碎20分钟、30分钟的粒度D50偏大，多肽的含量稍低；粉碎40分钟、50分钟的粒度均较小，二者粒度测定结果及多肽的含量均相当，优选为50分钟。
上述方法制备的超微粉比水蛭常规粉可减量1/3～2/3的水蛭原料应用，而且疗效相当。
上述的水蛭的超微粉碎中间体可用于制备治疗癥瘕痞块，血瘀闭经，跌打损伤，高脂血症或心脑血管疾病的药物。
上述超微粉碎方法可用于制备软胶囊剂、液体硬胶囊剂。
有益效果
水蛭药材中含有大量的酶类、蛋白质、多肽类成分，提取过程中易水解，或遇热破坏，不适合提取，不耐热，而且有报道显示水、乙醇、乙酸乙酯等提取的部位均为有效部位，以单独的提取溶剂提取均不能保证提取出所有的有效成分，故水蛭药材较适宜直接粉碎入制剂，既可保证有效成分不损失，又不会使某些成分水解、破坏，而且成品率高，中间过程无损失。
聚乙二醇是一种高吸水性大分子物质，蛋白质、多肽经聚乙二醇处理后，可携载大量的水分子，从而使其体积增大5～10倍，原来不溶于水的蛋白质、多肽类药物经聚乙二醇处理，不仅能提高溶解性，还可提高流动性，可保护蛋白质、多肽免遭体内免疫系统的破坏，大大延长了药物的作用时间，还可减少药物的毒副作用。如抗肿瘤药物喜树碱经聚乙二醇处理后，可大大降低毒性，并提高治疗效果；再如紫杉醇经聚乙二醇处理，可延长其在体内的作用时间。药物经聚乙二醇处理，可减少用药量、延长药效及降低用药成本。故本品拟在超微粉碎的基础上，药材中另加入聚乙二醇400，一起在振动式微粉机中超微粉碎，高度混合，通过聚乙二醇400的溶解和助表面活性作用，使药物粉碎的粒度更小，比表面积更大，大大改善微粉的表面性质——使表面电荷减少、气膜消失、药材微粉被充分的润湿，更利于药品的吸收利用，增加有效成分的生物利用度，更大限度的发挥疗效，以便使处方药量降低，节约药材，降低成本。
湿法超微粉碎特别适合树脂类药物、难溶性药物、动物类药物、贵细药物、矿物类药物等不宜提取药物的小处方制剂。通过湿法超微粉碎，使药物中的水溶性、脂溶性的成分与聚乙二醇400等基质一起高度混合，聚乙二醇400能帮助药物润湿，有助表面活性的作用，使药物表面改性，促进水溶性成分的溶解吸收，增加脂溶性成分的溶解性，使药物自乳化，高度混合成均一的混悬液或乳液，易于吸收利用，达到减量应用，降低成本，提高生物利用度的目的。超微湿法粉碎有以下特点：
(1)粉碎后形成高度均质化的液态分散体系(即广义的乳剂)，保证了亲脂性与亲水性药物的同步吸收，药物有效成分的利用度大大增加。
(2)加液湿法超微粉碎比正常干法粉碎的效率高，微粉的粒度更小，比表面积更大，微粉的表面性质大大改善(电荷减少，气膜消失，被聚乙二醇400充分润湿)，对肠壁的吸附作用增强，在胃肠内的停留时间延长，能进一步提高药物的生物利用度，利于节约药材，降低生产成本。
(3)经过超微粉碎机的高频振荡，与药物达到了高度混合的状态，药材微粒高度分散在聚乙二醇400等基质中，形成均一的混悬液或乳液，避免了颗粒间的吸附、聚集，增加了制剂的稳定性。
(4)所选用的基质聚乙二醇400，为水溶性，具有助表面活性的作用，经与药物高度混合，可以起到包覆、修饰药物的作用，对于半衰期短，体内易流失的肽类、蛋白类药物能起到缓释、控释的作用。
(5)以聚乙二醇400等为基质采用超微湿法粉碎工艺制备的样品，工艺操作简单，无繁琐的后续处理工作，可直接压制成软胶囊剂或液体硬胶囊剂。
(6)以植物油、聚乙二醇400等为基质制成的一般的软胶囊，其生物利用度均较低，粒度大(有砂粒感)，放置易析出沉淀。而采用药物与聚乙二醇400等基质一起在振动式微粉机中高度混合，即采用湿法超微粉碎，能大大减小颗粒的粒度，能够使药物成分和基质处于高度混合均一的乳化状态，达到表面改性的作用，能高度混合成均一的混悬液或乳液。由此可见，本发明取得了突出的技术效果，达到了发明目的。为进一步说明本发明所取得的有益效果，发明人从粉碎效果、超微混合物稳定性和药理试验三方面进行说明：
一、粉碎效果
试验方法：①取水蛭250g，按常规方法粉碎，过80目筛，即得；②取水蛭粗粉碎，过50目筛，称取250g，置振动式微粉机中，超微粉碎混合30分钟，出料，即得。③取水蛭粗粉碎，过50目筛，称取250g，加入分散剂(含8％丙二醇的聚乙二醇400)950g，混匀，置振动式微粉机(BFM-6型贝利微粉机)中，超微粉碎混合30分钟，出料，即得。以所得的样品的性状、显微结构、粒度(D50)、溶出度、稳定性进行考察。
试验结果：常规粉碎的中心粒径为150～180um(可过筛检查)，色泽不均一，有砂粒感；普通超微粉碎的粉末细腻均一，粒度D50为11.45um，但易结块；加液湿法超微粉碎中心粒径为8.70um，细腻均匀，流动性好，而且稳定性较好。结果见下表。
表 比较三种粉碎方法的考察结果
| 项目 | 常规粉碎 | 普通超微粉碎 | 湿法超微粉碎 |
| 性状显微粒度 | 粒度大，不均一有水蛭显微特征150～180um | 粒度小，均一，易结块经电镜观察，破壁情况良好，难以看到完整的细胞形态。D50为11.45um | 均匀细腻，流动性好经电镜观察，破壁情况良好，难以看到完整的细胞形态。D50为8.70um |
二、制剂稳定性
试验目的：考察加液湿法超微粉碎所得成品的稳定性
试验方法：将加液湿法超微粉碎所得的样品压制成软胶囊，采用室温留样观察法测定样品2个月内的稳定性，观察沉降情况及测定粒度。
试验结果：加液湿法超微粉碎所得混合物，稳定性好，无分层现象，粒度基本没有增大，可初步确定以该方法解决留粉药材制备软胶囊易分层、沉淀等长期困扰的难题，结果见下表。
表 加液超微粉碎软胶囊稳定性考察
| 时间 | 15天 | 30天 | 45天 | 60天 |
| 粒度沉降情况 | 8.73um均匀，不沉降 | 8.43um均匀，不沉降 | 8.72um均匀，不沉降 | 8.49um均匀，不沉降 |
三、药理试验验证
为进一步验证本发明在为了证明本发明药物制剂在提高生物利用度，节约药材、提高药效方面的贡献，发明人依据其功能主治，进行了动物对比药效学实验。
1、试验准备：
(1)药物：依本发明最优方案得到的水蛭微粉混合物(以下称：湿法水蛭微粉)；活血通脉胶囊(经常规粉碎后的水蛭)。
息隐(米非司酮)片，由上海华联制药有限公司提供，批号：050314。
总胆固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)测定试剂盒，批号分别为：011M042、010M050、012L028，均由上海名典生物工程有限公司提供。
ADP，批号：11003，TBO生物公司。
前列腺素F2α测定试剂盒(PGF2α)，美国Sigma公司。
羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，由北京化学试剂公司提供，批号：20060628。
戊巴比妥钠，北京化学试剂公司，批号：20061019。
肝素钠注射液，天津市生物化学制药厂，批号：20060506，规格：1.25万单位/2ml。
己烯雌酚，批号：0512071，天津金耀氨基酸有限公司，规格：0.5mg/mL。
(2)仪器：QX-200全血血小板聚集仪，上海医大仪器厂产品。
Spctmmlab 53 power紫外分光光度计，上海棱光技术有限公司产品。
WX-753B型多部位微循环显微镜。
(3)动物：Wistar大鼠和昆明种小鼠，均为SPF级，均由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供，许可证号均为：SCXK(鄂)2004-0007。
2、湿法水蛭微粉抗大鼠静脉血栓形成的作用
(1)方法：取Wistar大鼠50只，雄性，200～300g，按体重随机分为5组，每组10只。①湿法水蛭微粉低剂量组，0.10g水蛭/kg；②湿法水蛭微粉中剂量组，0.13g水蛭/kg；③湿法水蛭微粉高剂量组，0.17g水蛭/kg；④对照组，活血通脉胶囊0.2g水蛭/kg；⑤空白对照组，灌服等体积的0.5％CMC-Na溶液。灌胃每天1次，连续7天。末次给药后1h，各组动物腹腔注射3.5％戊巴比妥钠麻醉，剖腹分离下腔静脉，于左肾静脉下穿一丝线结扎下腔静脉管，造成淤血，关闭腹腔。6h后，用内径为1mm的玻璃毛细管插入鼠内眦静脉丛取血，至毛细管血柱达5mm，每隔30s折断毛细管一段，检查有无出现凝血丝，计算毛细管采血到出现血凝丝时间，即为凝血时间。再次打开腹腔，于结扎下方2cm处夹闭血管，纵行剖开，取出血栓，记录血栓有无并称重。
(2)结果：结果表明，微粉各剂量组均可明显延长凝血时间，降低血栓湿重，与空白对照组比较具有显著性差异；微粉的低剂量组与活血通脉胶囊组的效果相当，二者无显著性差异。因此，湿法水蛭微粉的作用明显强于活血通脉胶囊。结果见下表。
表 湿法水蛭微粉对大鼠静脉血栓形成的影响(
n＝10)
| 组别 | 剂量(g水蛭/kg) | 凝血时间(s) | 血栓湿重(mg) |
| 微粉低剂量组微粉中剂量组微粉高剂量组活血通脉胶囊组空白对照组 | 0.100.130.170.20- | 96.00±29.39*108.00±37.95**123.00±35.92***99.00±40.12*66.00±30.98 | 17.80±5.02***14.34±3.23***13.16±3.15***14.96±3.71***25.31±4.31 |
与空白对照组比较(t检验)，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
3、湿法水蛭微粉对大鼠创伤性瘀斑的治疗作用
(1)方法：取Wistar大鼠50只，雌雄各半，200±20g，背部脱毛5cm×4cm，24h后用老虎钳夹大鼠脱毛区皮肤，以造成大鼠皮下出血为度，面积4cm×3cm。12h后随机分为5组，每组10只：①湿法水蛭微粉低剂量组，0.10g水蛭/kg；②湿法水蛭微粉中剂量组，0.13g水蛭/kg；③湿法水蛭微粉高剂量组，0.17g水蛭/kg；④对照组，活血通脉胶囊0.2g水蛭kg；⑤空白对照组，灌服等体积的0.5％CMC-Na溶液。灌胃每天1次，连续5天。每天给药时用触摸和肉眼观察肿胀和瘀斑消退情况，并测量剩余面积，按下表进行记分。
表 创伤性瘀斑的评分标准
| 瘀斑变化 | 积分 |
| 水肿 | |
| 无勉强可见皮肤隆起，轮廓清楚水肿隆起约1cm | 0123 |
| 瘀斑色泽 | |
| 无轻度红斑中度红肿紫红色并有焦瘀形成 | 0123 |
| 瘀斑面积 | |
| 无＜3cm2＜9cm2≥9cm2 | 0123 |
(2)结果：结果表明，微粉各剂量组均可明显减轻大鼠创伤性瘀斑的严重程度，其瘀斑变化积分与空白对照组比较具有显著性差异。因此，微粉的作用明显强于活血通脉胶囊。结果见下表。
表 湿法水蛭微粉对大鼠创伤性瘀斑的影响(
n＝10)
| 组别 | 剂量(g水蛭/kg) | 积分 | ||||
| 1d | 2d | 3d | 4d | 5d | ||
| 微粉低剂量组微粉中剂量组微粉高剂量组活血通脉胶囊组空白对照组 | 0.100.130.170.20- | 7.0±1.86.9±1.86.5±1.66.6±1.67.6±1.3 | 4.5±1.8*4.4±1.77*4.4±1.6**4.9±1.4*6.2±1.2 | 3.1±2.3*3.1±1.6*2.7±1.7**3.1±1.4*4.7±1.5 | 1.7±1.8*1.6±1.3***1.4±1.6***1.4±1.1***3.6±1.6 | 0.7±1.1*0.8±0.9*0.7±1.1*0.6±0.8*2.1±1.7 |
与空白对照组比较(t检验)，*P＜0.05，**P＜0.01，****P＜0.001。
4、湿法水蛭微粉对小鼠急性高脂血症的影响
(1)方法：取雄性小鼠120只，20±2g，按体重性别随机分为6组，每组20只：①湿法水蛭微粉低剂量组，0.20g水蛭/kg；②湿法水蛭微粉中剂量组，0.27g水蛭/kg；③湿法水蛭微粉高剂量组，0.33g水蛭/kg；④对照组，活血通脉胶囊0.40g水蛭/kg；⑤空白对照组，灌服等体积的0.5％CMC-Na溶液。⑥正常组，同体积的生理盐水。灌胃每天1次，连续7天。末次给药后2h，除正常组外，其它各组动物腹腔注射75％新鲜蛋黄乳剂20ml/kg，禁食过夜。10h后各组给相应药物1次，再2h后每组取其中的10只动物检测血小板聚集功能，摘眼球取血，50ul肝素钠溶液抗凝，在全血血小板聚集仪上，测定给诱导剂ADP 5ul，1min和5min的血小板聚集率；另10只摘眼球取血，3000r/min离心10min，分离血清，检测总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白水平。
(2)结果：结果表明，微粉各剂量组均可明显降低总胆固醇、甘油三酯及低密度脂蛋白水平，与空白对照组比较具有显著性差异；微粉各剂量组能够明显抑制急性高脂血症小鼠血小板聚集功能，降低血小板聚集率，从而起到防治血栓形成的作用。因此，湿法水蛭微粉的作用明显强于活血通脉胶囊。结果见下表。
表 湿法水蛭微粉对小鼠急性高脂血症的影响(
n＝10)
| 组别 | 剂量(g水蛭/kg) | CHOL(mmol/l) | TG(mmol/l) | LDL-C(mmol/l) |
| 微粉低剂量组微粉中剂量组微粉高剂量组活血通脉胶囊组空白对照组正常组 | 0.200.270.330.40-- | 3.33±0.55***3.01±0.84***2.80±0.84***2.63±1.03***4.67±0.701.58±0.66*** | 1.76±0.61***1.90±0.65***1.62±0.21***1.64±0.43***3.36±0.830.77±0.55*** | 0.90±0.31*0.68±0.11***0.63±0.17***0.62±0.15***1.55±0.700.49±0.50*** |
与空白对照组比较(t检验)，*P＜0.05，***P＜0.001。
表 湿法水蛭微粉对急性高脂血症小鼠血小板聚集功能的影响(
n＝10)
| 组别 | 剂量(g水蛭/kg) | 血小板聚集率(％) | |
| 1min | 5min | ||
| 微粉低剂量组微粉中剂量组微粉高剂量组活血通脉胶囊组空白对照组正常组 | 0.200.270.330.40-- | 30.80±8.15***30.20±8.66***29.20±7.04***25.70±8.79***57.60±12.0821.90±6.66*** | 38.20±12.77***37.70±9.02***33.70±10.77***38.10±12.07***66.70±12.5331.20±7.15*** |
与空白对照组比较(t检验)，***P＜0.001。
5、湿法水蛭微粉对大鼠子宫微循环障碍的影响
(1)方法：取Wistar大鼠50只，雌性，200±20g，按体重随机分为5组，每组10只：①湿法水蛭微粉低剂量组(含水蛭1.00％)；②湿法水蛭微粉中剂量组(含水蛭1.33％)；③湿法水蛭微粉高剂量组(含水蛭1.67％)；④对照组，活血通脉胶囊(含水蛭2.00％)；⑤空白对照组，灌服等体积的0.5％CMC-Na溶液。各组动物腹腔注射3.5％戊巴比妥钠麻醉，仰卧固定于解剖台上，沿腹中线下腹壁切开2cm，拉出一侧子宫及其韧带，固定于盛有10ml生理盐水的微循环恒温浴槽中，制备完毕后稳定20min，然后用多部位微循环显微镜在内45度角反射光源照射下，选择并固定视野，用标尺测量一、二级微动脉(A)及微静脉(V)口径，按七级标准观察血液流态及毛细血管网交点数目，随即向浴槽内滴加0.25％的PGF2α，观察记录子宫韧带动脉及微静脉口径、血流速度及毛细血管网交点数目，然后分别向浴槽内滴入相应浓度的药品0.2ml，观察给药后的各项指标变化并记录。
(2)结果：结果表明，微粉各剂量组均能明显增加微动脉及微静脉口径、血流速度及毛细血管网交点数目，与给药前比较有显著性差异。因此，湿法水蛭微粉的作用明显强于活血通脉胶囊。结果见下表。
表 湿法水蛭微粉对大鼠子宫血管口径的影响(
n＝10)
| 组别 | 剂量(％) | 血管类别 | 血管口径(μn) | ||
| 正常 | 加PGF2α后 | 加药后 | |||
| 微粉低剂量组微粉中剂量组微粉高剂量组活血通脉胶囊组空白对照组 | 0.200.270.330.40- | AVAVAVAVAV | 22.1±2.457.9±7.723.7±3.258.1±7.823.8±3.359.7±7.623.1±4.061.6±7.422.1±3.662.1±7.8 | 15.1±1.843.7±5.814.8±8.842.4±4.015.0±1.944.2±7.315.1±3.046.8±7.615.0±1.748.9±9.0 | 21.2±1.6*54.9±7.2*21.9±9.3*53.6±7.5*23.0±2.9*57.2±7.9*22.1±13.2*59.3±7.6*15.8±1.550.5±8.9 |
加药后与加PGF2α后比较(配对t检验)，*P＜0.05。
表湿法水蛭微粉对大鼠子宫血流速度和毛细血管网交点数的影响(
n＝10)
| 组别 | 剂量(％) | 毛细血管网交点数(个) | 血流速度(s/mm) | ||||
| 正常 | 加PGF2α后 | 加药后 | 正常 | 加PGF2α后 | 加药后 | ||
| 微粉低剂量组微粉中剂量组微粉高剂量组活血通脉胶囊组空白对照组 | 0.200.270.330.40- | 5.6±1.47.0±2.07.0±1.86.0±1.57.0±1.7 | 2.7±1.24.0±1.63.0±1.33.0±1.13.0±1.2 | 5.0±1.3*6.0±1.4*6.0±1.5*6.0±1.0*4.0±1.1 | 12.1±2.612.0±2.513.0±3.313.0±2.613.0±2.8 | 18.0±2.019.0±2.820.0±4.019.0±2.519.0±2.8 | 14.0±2.514.0±2.7*15.0±2.7*14.0±2.4*18.0±2.5 |
加药后与加PGF2α后比较(配对t检验)，*P＜0.05。
6、湿法水蛭微粉对大鼠子宫肌瘤的抑制作用
(1)方法：取Wistar大鼠240只，雌性，200-250g，按体重随机分为6组，每组40只：①湿法水蛭微粉低剂量组，0.10g水蛭/kg；②湿法水蛭微粉中剂量组，0.13g水蛭/kg；③湿法水蛭微粉高剂量组，0.17g水蛭/kg；④对照组，活血通脉胶囊0.2g水蛭/kg；⑤阳性药组，息隐片0.07g/kg；⑥空白对照组，灌服等体积的0.5％CMC-Na溶液。灌胃每天1次，连续7天。各组肌肉注射雌激素，次日在给激素的同时分5d、10d、15d、20d各组处死10只，用游标卡尺测量子宫长度和直径。
(2)结果：结果表明，微粉各剂量组均可明显减少子宫肌瘤模型大鼠的子宫长度及直径，与空白对照组比较具有显著性差异。因此，湿法水蛭微粉的作用明显强于活血通脉胶囊。结果见下表。
表 湿法水蛭微粉对大鼠子宫长度的影响(n＝10)
| 组别 | 剂量(g水蛭/kg) | 子宫长度(cm) | |||
| 5d | 10d | 15d | 20d | ||
| 微粉低剂量组微粉中剂量组微粉高剂量组活血通脉胶囊组息隐片组空白对照组 | 0.100.130.170.200.07- | 3.30±0.49***3.21±0.44***3.18±0.38***3.37±0.49***3.51±0.46***4.15±0.49 | 3.50±0.40***3.32±0.36***3.35±0.37***3.45±0.51***3.65±0.48***4.60±0.54 | 3.60±0.37***3.52±0.36***3.41±0.43***3.48±0.48***3.91±0.40***5.38±0.40 | 3.71±0.40***3.66±0.40***3.65±0.41***3.64±0.47***4.03±0.41***5.92±0.56 |
与空白对照组比较(t检验)，*P＜0.05，***P＜0.001。
表 湿法水蛭微粉对大鼠子宫直径的影响(
n＝10)
| 组别 | 剂量(g水蛭/kg) | 子宫直径(cm) | |||
| 5d | 10d | 15d | 20d | ||
| 微粉低剂量组微粉中剂量组微粉高剂量组活血通脉胶囊组息隐片组空白对照组 | 0.100.130.170.200.07- | 0.37±0.11***0.33±0.10***0.31±0.10***0.37±0.08***0.47±0.11***0.74±0.10 | 0.37±0.13***0.35±0.14***0.33±0.12***0.38±0.11***0.54±0.11***0.91±0.14 | 0.37±0.10***0.40±0.09***0.36±0.11***0.39±0.09***0.58±0.15***0.95±0.23 | 0.41±0.10***0.37±0.13***0.37±0.12***0.39±0.10***0.52±0.11***1.00±0.21 |
与空白对照组比较(t检验)，*P＜0.05，***P＜0.001。
结论：在剂量较低的情况下，湿法水蛭微粉依然可有效延长凝血时间、抗血栓形成、减轻创伤性瘀斑的严重程度，能降低高脂血症动物模型的胆固醇和甘油三酯的水平，抑制急性高脂血症小鼠血小板聚集功能，降低血小板聚率；可增加子宫微动脉静脉口径、血流速度及毛细血管网交点数目，改善子宫微循环，并能抑制子宫肌瘤，表明湿法水蛭微粉具有活血化瘀、通脉止痛、降血脂、防治血栓形成的作用；可用于治疗跌打损伤、治疗症瘕痞块及血瘀经闭。湿法水蛭微粉低剂量(大鼠0.10g水蛭/kg、小鼠0.20g水蛭/kg)与活血通脉胶囊(大鼠0.20g水蛭/kg、小鼠0.40g水蛭/kg)比较作用相当，剂量是活血通脉胶囊的1/2，两组比较无显著性差异。因此，湿法水蛭微粉的作用明显强于活血通脉胶囊。
具体实施方式
下面列举实施例，进一步说明本发明，各实施例仅用于说明本发明，并不限制本发明：
实施例1
取水蛭，洗净，低温干燥，粉碎过50目筛；取聚乙二醇400 440g，丙二醇35g，混匀，制成基质，加入水蛭粉125g，置振动式微粉机中，超微粉碎混合50分钟，出料，制得中心粒径小于25μm的超微混合物，将其直接用于压制软胶囊。
实施例2
取水蛭，洗净，低温干燥，粉碎过50目筛；取聚乙二醇400 345g，丙二醇30g，吐温70g，混匀，制成基质，加入水蛭粉125g，置振动式微粉机中，超微粉碎混合60分钟，出料，制得中心粒径小于25μm的超微混合物，可直接用于灌制液体硬胶囊。
实施例3
取水蛭，洗净，低温干燥，粉碎过20目筛；取聚乙二醇400 400g，丙二醇100g，混匀，制成基质，加入水蛭粉125g，置振动式微粉机中，超微粉碎混合40分钟，出料，制得中心粒径小于25μm的超微混合物，即得。
实施例4
取水蛭，洗净，低温干燥，粉碎过80目筛；取聚乙二醇400 400g，丙二醇25g，甘油25g，吐温25g混匀，制成基质，加入水蛭粉125g，置振动式微粉机中，超微粉碎混合30分钟，出料，制得中心粒径小于25μm的超微混合物，即得。
实施例5
取水蛭，洗净，低温干燥，粉碎过20目筛；取聚乙二醇400 440g，丙二醇20g，吐温15g，混匀，制成基质，加入水蛭粉125g，置振动式微粉机中，超微粉碎混合50分钟，出料，制得中心粒径小于25μm的超微混合物，即得。
实施例6
取水蛭，洗净，低温干燥，粉碎过60目筛；取聚乙二醇400 430g，丙二醇25g，甘油10g，吐温10g，混匀，制成基质，加入水蛭粉125g，置振动式微粉机中，超微粉碎混合60分钟，出料，制得中心粒径小于25μm的超微混合物，即得。
实施例7
取水蛭，洗净，低温干燥，粉碎过30目筛；取聚乙二醇400 440g，丙二醇25g，甘油10g，混匀，制成基质，加入水蛭粉125g，置振动式微粉机中，超微粉碎混合40分钟，出料，制得中心粒径小于25μm的超微混合物，即得。
实施例8
取水蛭，洗净，低温干燥，粉碎过80目筛；取聚乙二醇400 440g，甘油25g，吐温10g，混匀，制成基质，加入水蛭粉125g，置振动式微粉机中，超微粉碎混合50分钟，出料，制得中心粒径小于25μm的超微混合物，即得。
Claims (10)
1.一种新的液态中药制剂的中间体，其特征在于该中间体是按如下方法制得的：取水蛭药材，常规粉碎过20～80目筛，粉碎物加3～5倍量的聚乙二醇、丙二醇、甘油、吐温中任意一种或几种的组合物，一起超微粉碎20～60分钟，即得。
2.根据权利要求1所述的制剂中间体，其特征在于粉碎物与液体分散介质的重量比为1∶3.5～4。
3.根据权利要求1所述的制剂中间体，其特征在于聚乙二醇-丙二醇-甘油-吐温的重量比为4～8∶0.2～1∶0～0.5∶0～0.5。
4.根据权利要求1、2或3所述的制剂中间体，其特征在于是按如下方法制得的：取水蛭，常规粉碎过50目筛，加3.52倍的聚乙二醇-400和0.28倍的丙二醇，混匀，置振动式微粉机中，超微粉碎混合50分钟，出料，即得。
5.一种制备如权利要求1所述液态中药制剂中间体的方法，其特征在于该方法为：取水蛭药材，常规粉碎过20～80目筛，粉碎物加3～5倍量的聚乙二醇、丙二醇、甘油、吐温中任意一种或几种的组合物，一起超微粉碎20～60分钟，即得。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于粉碎物与液体分散介质的重量比为1∶3.5～4。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于聚乙二醇-丙二醇-甘油-吐温的重量比为4～8∶0.2～1∶0～0.5∶0～0.5。
8.根据权利要求5、6或7所述的制备方法，其特征在于该方法为：取水蛭，常规粉碎过50目筛，加3.52倍的聚乙二醇-400和0.28倍的丙二醇，混匀，置振动式微粉机中，超微粉碎混合40～50分钟，出料，即得。
9.权利要求1至4中任一项在制备用于治疗癥瘕痞块、血瘀闭经、跌打损伤、高脂血症或心脑血管疾病的药物中的应用。
10.权利要求5至8中任一项方法在制备软胶囊剂、液体硬胶囊剂、口服乳剂及相关原料药中的应用。
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN105646702A (zh) * | 2016-04-13 | 2016-06-08 | 中国科学院昆明动物研究所 | 菲牛蛭Kazal型胰蛋白酶抑制剂Bdellin-HM及其编码基因和应用 |
| CN107361244A (zh) * | 2017-07-20 | 2017-11-21 | 通化师范学院 | 一种预防金鳟细菌性鳃炎的中草药饲料添加剂及其用途 |
-
2007
- 2007-09-30 CN CNA2007101755051A patent/CN101185658A/zh active Pending
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| CN107361244A (zh) * | 2017-07-20 | 2017-11-21 | 通化师范学院 | 一种预防金鳟细菌性鳃炎的中草药饲料添加剂及其用途 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20080528 |