CN101182588A

CN101182588A - 快速鉴定新城疫病毒并能鉴别其强、弱毒株的pcr方法

Info

Publication number: CN101182588A
Application number: CNA2007101912175A
Authority: CN
Inventors: 焦新安; 潘志明; 耿士忠; 黄金林; 顾志强; 孙林; 张磊; 殷月兰
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2007-12-05
Filing date: 2007-12-05
Publication date: 2008-05-21

Abstract

快速鉴定新城疫病毒并能鉴别其强、弱毒株的PCR方法，涉及一种鉴定病毒，特别是鉴别新城疫病毒强、弱毒株的检测方法。先用Trizol kit提取样本基因RNA，再进行反转录合成cDNA，同时，采用热裂解法提取大肠杆菌DNA模板，然后对样本基因的cDNA和大肠杆菌DNA模板进行一次性PCR扩增特定的多个基因，最后经电泳鉴定。本发明形成大量的基因复制片段，比较方便，一次就能鉴定是否为新城疫病毒，以及属于强、弱毒株作出判断。本发明较经典的病毒分离、鉴定和毒力鉴别试验方法快速、准确。

Description

快速鉴定新城疫病毒并能鉴别其强、弱毒株的PCR方法

技术领域：

本发明公开了一种鉴定病毒，特别是鉴别新城疫病毒强、弱毒株的检测方法。

背景技术：

新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的一种禽的急性、高度接触性传染病，对养禽业危害严重。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定通报传染病，我国亦将其定为一类动物传染病。

随着高度集约化养禽业的发展，ND的防治备受关注。ND的现场诊断主要依靠发病史、临床症状、病理变化和流行病学调查综合判定，这给广大兽医工作人员带来了超负荷的工作，耗时费力费钱。现场诊断工作中急需快速准确的筛检诊断方法，以利于现场疫情的确认。因此，ND疫情现场快速确认，对于采取果断有效的扑灭和防控措施十分关键。另外，近年来ND的流行趋势发生了变化，以发病率低、临床症状不明显、病理变化不典型、死亡率低、蛋用鸡产蛋量下降为特征的非典型新城疫，使得ND的防治变得更加复杂和棘手，也为NDV的检测提出了更高的要求。随着新城疫弱毒疫苗的广泛应用，单纯对NDV检测已不能满足生产的需要。亟须建立一种快速区分NDV强毒株和弱毒株的检测技术，以便有针对性地采取相应的防治措施。OIE规定区分NDV毒力的经典方法主要有鸡胚平均致死时间(MDT)、脑内致病指数(ICPI)、静脉致病指数(IVPI)测定等方法。这些方法报告结果时间长，工作量大。所以，建立一种快速鉴定NDV并能鉴别其强、弱毒株的检测方法对于ND的防治具有重要的现实意义。

发明内容：

本发明目的在于为人们提供一种能快速鉴定出样本是否为新城疫病毒，及鉴别其强、弱毒株的多重PCR快速检测方法。

本发明技术方案是：先用Trizol kit提取样本基因RNA，再进行反转录合成cDNA，同时，采用热裂解法提取大肠杆菌DNA模板，然后对样本基因的cDNA和大肠杆菌DNA模板进行一次性PCR扩增特定的多个基因，最后经电泳鉴定。

由于单个疑似病例样本中的特征基因数量极少，本发明通过将样本的RNA反转录合成cDNA，再一次性同时对可能存在的新城疫病毒融合蛋白(F)基因和一定存在的大肠杆菌质粒进行扩增，形成大量的基因复制片段，比较方便，一次就能鉴定是否为新城疫病毒，以及属于强、弱毒株作出判断。本发明较经典的病毒分离、鉴定和毒力鉴别试验方法快速、准确。

该检测系统具有可监测性。扩增结果无任何条带时，表明检测系统无效；扩增结果出现750bp、570bp、200bp、395bp四条带中的任一条带时，表明检测系统有效。

扩增结果出现750bp、570bp、200bp、395bp或570bp、200bp、395bp或570bp、200bp或570bp、395bp时，表明结果为新城疫病毒。

扩增结果出现750bp、570bp、200bp或570bp、200bp时，表明结果为新城疫病毒强毒株。

扩增结果出现750bp、570bp、395bp或570bp、395bp时，表明结果为新城疫病毒弱毒株。

另外，本发明进行PCR扩增时，采用引物I、II，对新城疫病毒融合蛋白基因进行扩增，所述引物I：5’-[TA(C/T)ACCTC(A/G)TC(T/C)CAGAC(A/T)GG]-3’；引物II：5’-[CCACCAGC(T/C)A(G/A)ATT(G/A)TAAAG]-3’。

进行PCR扩增时，采用引物I和IV，对新城疫病毒强毒株融合蛋白基因进行扩增，所述引物I：5’-[TA(C/T)ACCTC(A/G)TC(T/C)CAGAC(A/T)GG]-3’；引物IV：5’-[A(C/T)(A/G)GC(A/G)CCTATAAA(G/C)CGT(T/C)T]-3’。

进行PCR扩增时，采用引物III和II，对新城疫病毒弱毒株融合蛋白基因进行扩增，所述引物III：5’-[GG(G/A)GGGA(G/A)ACAGGG(G/A/T)CGACT]-3’；引物II：5’-[CCACCAGC(T/C)A(G/A)ATT(G/A)TAAAG]-3’。

进行PCR扩增时，采用引物I、II，对大肠杆菌(YZU DSL2)进行扩增，所述引物I：5’-[TA(C/T)ACCTC(A/G)TC(T/C)CAGAC(A/T)GG]-3’；引物II：5’-[CCACCAGC(T/C)A(G/A)ATT(G/A)TAAAG]-3’。

附图说明

图1为凝胶成像系统照片。

具体实施方式：

一、引物设计：

根据GenBank库中已发表的新城疫病毒融合蛋白(F)基因保守序列设计四条特异性引物(引物I、引物II、引物III、引物IV)，上述四条特异性引物由宝生物(大连)有限公司合成。

另，GenBank中已报道：新城疫病毒片段长度为：570bp；新城疫病毒强毒株片段长度为：200bp；新城疫病毒弱毒株片段长度为：395bp；指示带(大肠杆菌)片段长度为：750bp。

预期扩增出的目的片段大小分为新城疫病毒：570bp；新城疫病毒强毒株：200bp；新城疫病毒弱毒株：395bp；指示带(大肠杆菌)：750bp。

新城疫病毒：

引物I：5’-[TA(C/T)ACCTC(A/G)TC(T/C)CAGAC(A/T)GG]-3’

引物II：5’-[CCACCAGC(T/C)A(G/A)ATT(G/A)TAAAG]-3’

新城疫病毒强毒株：

引物I：5’-[TA(C/T)ACCTC(A/G)TC(T/C)CAGAC(A/T)GG]-3’

引物IV：5’-[A(C/T)(A/G)GC(A/G)CCTATAAA(G/C)CGT(T/C)T]-3’

新城疫病毒弱毒株：

引物III：5’-[GG(G/A)GGGA(G/A)ACAGGG(G/A/T)CGACT]-3’

引物II：5’-[CCACCAGC(T/C)A(G/A)ATT(G/A)TAAAG]-3’

大肠杆菌(指示菌)：

引物I：5’-[TA(C/T)ACCTC(A/G)TC(T/C)CAGAC(A/T)GG]-3’

引物II：5’-[CCACCAGC(T/C)A(G/A)ATT(G/A)TAAAG]-3’

二、多重RT-PCR：

1)病毒的扩增：将新城疫病毒接种于10日龄非免疫鸡胚的尿囊腔中，36-72小时后收集死亡鸡胚的尿囊液，并检测其血凝价。

2)病毒RNA的提取：按照Trizol kit说明书提取新城疫病毒的RNA(注：在RNA沉淀时要加入糖元8-10μg，它能够和RNA共沉淀，用DEPC处理的水进行溶解。

具体步骤如下：

①200μl被检测液加入1ml Trizol液后，剧烈摇匀，室温放置5-10分钟；

②然后加入200μl氯仿，剧烈摇匀，室温放置3-5分钟；

③12,000×g离心15分钟；

④吸取上清，加入糖元8-10μg混匀2分钟后加入异丙醇500μl，混匀，室温放置10分钟；

⑤12,000×g离心10分钟，去上清，可见沉淀，用75％乙醇洗涤，缓慢混匀后静置2分钟；

⑥7,500×g离心5分钟，完全去除乙醇，在超净台内用风吹5分钟后加入8μl DEPC处理水溶解。

3)病毒RNA的反转录(RT)：

A：RNA： 4μl(最低限量2ng)

+primer： 1μl(引物I)(15μmol/L)

总体积： 5μl

经70℃、5min后，冰浴5min。

B：RNA的反转录(RT)：(ImProm-II^TM Reverse TranscriptaseCatalog#A3801 from Promega)

①RT-buffer： 4.0μl

②dNTP(2.5μmol/L)： 4.0μl

③MgCl₂(25mM)： 2.4μl

④RNasin(40u/μl)： 1.0μl

⑤RT-E： 1.0μl

⑥DEPC water： 2.6μl

⑦A的混合液： 5.0μl

总体积： 20.0μl

然后25℃、5min，42℃1-1.5小时反转录，70℃、5min灭活反转录酶，得cDNA。

4)采用热裂解法提取大肠杆菌DNA模板

将大肠杆菌(YZU DSL2)接种于营养肉汤培养基，37℃培养18h，取细菌培养液0.5ml，置于Eppendorf管中，2000rpm离心20min，用灭菌蒸馏水洗涤两次，最后用1ml蒸馏水悬浮，隔水煮沸15min，8000rpm离心15min，取上清，即成DNA模板溶液。将DNA模板溶液用超纯水作100倍稀释后，即成大肠杆菌(YZU DSL2)DNA模板，备用。

5)多重PCR扩增：[Taq聚合酶为华美公司普通PCR扩增酶]

①10×PCR buffer(含1.5mmol/LMg²⁺)： 2.8μl

②dNTP(2.5umol/L)： 2.4μl

③四条引物(每种引物终浓度为10μmol/L)： 3.0μl

④Taq聚合酶： 0.5μl

⑤MgCl₂(25mM)： 0.5μl

⑥DMSO： 2.4μl

⑦cDNA模板： 2.0μl

⑧灭菌超纯水： 16.4μl

总体积： 30.0μl

注：加MgCl₂视Taq聚合酶的活性而定

以30μl灭菌石蜡液体覆盖。扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火45s，72℃延伸45s，共40个循环；72℃延伸5min后4℃保存。同时以水为阴性对照。

三、PCR扩增产物的鉴定：

取PCR扩增产物10μl，点样于15g/L琼脂糖凝胶(含0.5μg/mL溴化乙锭)，以1000bp Marker作为标准分子参照，以5V/cm的电场强度于1倍的TAE电泳缓冲液中电泳1.5小时，紫外线鉴定，凝胶成像系统拍照如图1所示。

图1中，M.125bp marker；1.新城疫病毒强毒株F48E8；2.新城疫病毒弱毒株Lasota；3.传染性支气管炎病毒；4.H5亚型禽流感病毒。

四、PCR产物的序列鉴定：

利用DNA回收试剂盒(宝生物(大连)有限公司)从琼脂糖凝胶中回收PCR产物进行克隆(pGEM-T vector)和DNA序列测定。DNA序列测定由宝生物(大连)有限公司完成。

五、总结：

本试验利用四条引物，通过4.5小时，采用优化的多重RT-PCR反应系统，成功地扩增出新城疫病毒及其强弱毒株的融合蛋白(F)基因特异性序列，大肠杆菌(YZU_DSL2)指示条带基因序列，PCR产物大小分别为新城疫病毒：570bp；新城疫病毒强毒株：200bp；新城疫病毒弱毒株：395bp；指示带(大肠杆菌)：750bp，DNA序列测定结果与GenBank中报道的基因序列一致。

Claims

1.快速鉴定新城疫病毒并能鉴别其强、弱毒株的PCR方法，其特征在于先用Trizol kit提取样本基因RNA，再进行反转录合成cDNA，同时，采用热裂解法提取大肠杆菌DNA模板，然后对样本基因的cDNA和大肠杆菌DNA模板进行一次性PCR扩增特定的多个基因，最后经电泳鉴定。

2.根据权利要求1所述快速鉴定新城疫病毒并能鉴别其强、弱毒株的PCR方法，其特征在于进行PCR扩增时，采用引物I、II，对新城疫病毒融合蛋白基因进行扩增，

所述引物I：5’-[TA(C/T)ACCTC(A/G)TC(T/C)CAGAC(A/T)GG]-3’；

引物II：5’-[CCACCAGC(T/C)A(G/A)ATT(G/A)TAAAG]-3’。

3.根据权利要求1所述快速鉴定新城疫病毒并能鉴别其强、弱毒株的PCR方法，其特征在于进行PCR扩增时，采用引物I和IV，对新城疫病毒强毒株融合蛋白基因进行扩增，

所述引物I：5’-[TA(C/T)ACCTC(A/G)TC(T/C)CAGAC(A/T)GG]-3’；

引物IV：5’-[A(C/T)(A/G)GC(A/G)CCTATAAA(G/C)CGT(T/C)T]-3’。

4.根据权利要求1所述快速鉴定新城疫病毒并能鉴别其强、弱毒株的PCR方法，其特征在于进行PCR扩增时，采用引物III和II，对新城疫病毒弱毒株融合蛋白基因进行扩增，

所述引物III：5’-[GG(G/A)GGGA(G/A)ACAGGG(G/A/T)CGACT]-3’；

引物II：5’-[CCACCAGC(T/C)A(G/A)ATT(G/A)TAAAG]-3’。

5.根据权利要求1所述快速鉴定新城疫病毒并能鉴别其强、弱毒株的PCR方法，其特征在于进行PCR扩增时，采用引物I、II，对大肠杆菌(YZU DSL2)进行扩增，

所述引物I：5’-[TA(C/T)ACCTC(A/G)TC(T/C)CAGAC(A/T)GG]-3’；

引物II：5’-[CCACCAGC(T/C)A(G/A)ATT(G/A)TAAAG]-3’。