CN101182522A - 拟南芥耐盐基因srat1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供公开了一种拟南芥耐盐基因SRAT1，具有序列表中SEQ ID NO.1所述的碱基序列。将拟南芥耐盐基因SRAT1转化模式植物拟南芥，可以提高拟南芥幼苗耐盐性。若将拟南芥耐盐基因SRAT1转化水稻或草莓等蔬菜、花卉等植物，有可能提高植物耐盐性，一方面，可以增加水稻或露地蔬菜、花卉在盐碱地上的产量，提高我国滨海地区的盐碱地的利用；另一方面，可以克服设施条件下因土壤返盐引起的连作障碍，提高蔬菜、花卉等植物的产量和品质，增加农民收入。

Description

拟南芥耐盐基因SRAT1及其应用

技术领域

本发明涉及功能基因组学领域，尤其涉及一种拟南芥耐盐基因SRAT1及其应用。

背景技术

土壤盐渍化对农业的威胁是一个全球性的问题。全世界共有10亿公顷的盐碱地，约占世界陆地面积7.6％，我国盐碱地近1亿多公顷，农业耕地因盐渍化引起的减产、弃耕地就近333.5万公顷。近年来，我国设施农业的快速发展，特别是蔬菜和花卉大棚生产面积不断扩大，据统计，2005年全国蔬菜、花卉、瓜果等作物设施栽培面积达210万公顷。设施农业的发展为农业生产结构调整和提高农业生产效益发挥了重要作用，但是随着设施栽培时间延长，土壤次生盐渍化的问题日益加剧，严重影响了设施栽培作物的产量和品质，效益也随之下降，从而影响设施农业的健康发展。解决设施栽培土壤盐渍化一般采取以下两种措施，一是用石膏和硫磺等化学方法或用排水和灌溉洗盐等物理方法改良土壤；二是通过常规育种或生物技术手段培育耐盐作物品种。前者投入成本高。通过培育适宜在盐碱地区栽培和设施栽培的农作物抗盐新品种将不仅能有效解决设施栽培土壤盐渍化问题，而且还能通过有效利用部分盐渍化土地而大大地缓解我国土地资源匮乏的问题。

功能基因的发掘与利用是当今世界生物资源竞争的制高点。一旦谁拥有更多的功能基因资源，谁就会在生物经济竞争中掌握主动权。在20世纪90年代，美国利用我国的野生大豆资源发掘出抗线虫功能基因，并申请国际专利。现在我国若利用该功能基因进行大豆育种和生产，就会受到其专利权限制。发掘新耐盐功能基因，不仅有利于我国抢占生物基因资源竞争的制高点，而且能够改变功能基因利用受制于国外垄断的被动局面。1983年转基因植物问世，1994年耐储藏番茄最先获准上市，1996～1999年全世界转基因作物生产面积由170万公顷增加到3990万公顷，四年间增长了23倍。2005年全球种植面积已达9000万公顷，占世界总耕地面积的6％。我国已批准转基因抗虫棉、转基因耐储藏番茄等6件转基因植物商品化，其中5件是我国自主开发的，现在已成为全球转基因作物推广面积最大的国家之一。我国利用Bt基因培育抗虫棉品种有效解决了因棉铃虫危害而带来的棉花严重减产问题。2006年我国石家庄农科院通过耐旱基因的发掘而培育出小麦耐旱新品种，整个生育期只浇一次水亩产可达500kg，有效解决了北方干旱而导致的小麦减产问题。近年来，国内外利用基因工程手段将参与合成渗透调节物质和离子区域化效应相关的基因导入水稻、玉米、草莓、烟草等作物，已获得高耐盐作物株系，但目前还没有商业化应用。

近年来，随着模式植物拟南芥和水稻基因组测序完成，植物基因组学研究已转入到功能基因组学。目前一些研究功能基因组学的新方法和实验技术体系如cDNA微阵列、基因芯片、基因表达系统分析(serial analysisof gene expression，SAGE)、基因敲除(gene knockout)和RNAi分析均能有效分析大量基因的表达和功能模式，并在耐盐性相关功能基因资源发掘上取得了一定进展。一些与渗透调节相关基因已从不同植物种类中被成功克隆并转化应用，如脯氨酸合成相关基因P5CS和甜菜碱脱氢酶BADH基因。植物体内Na⁺离子平衡是植物自身耐盐调节的重要机制。朱健康研究小组发现拟南芥SOS基因系列的调控信号是植物自身调节Na⁺离子平衡的重要途径之一。2005年，林鸿宣研究小组与美国栾升教授合作，成功克隆了水稻耐盐相关的数量性状基因SKC1。该基因能控制水稻植株地上部钠离子和钾离子的含量，维持钠和钾离子平衡，使过量钠离子不在茎叶等部位积累，并使钠离子回流到根部，减轻钠离子毒害，同时增加营养元素钾离子，从而增加水稻耐盐性。

泛素连接酶是泛素与26S蛋白酶体系统的主要组分之一。在泛素与26S蛋白酶体系统中存在三种关键酶，分别是泛素活化酶E1、泛素偶联酶E2和泛素连接酶E3。E1在ATP存在条件下主要激活泛素，产生一个活化的泛素库供下游反应。在模式植物拟南芥中有2种E1同工型，其中一个可能是核定位。E2酶通过其活化座位的半胱氨酸与活化的泛素结合，然后将泛素转移到靶蛋白，与靶蛋白上的赖氨酸位共价结合。接着结合泛素的E2直接将泛素转移到第一个泛素上，它们通过各自的赖氨酸位共价结合。然后在靶蛋白分子上形成多泛素链。目前在拟南芥基因组中有37 E2酶基因，分为12个亚家族。泛素连接酶E3可以识别靶蛋白上的多泛素链信号，并与靶蛋白结合。另一方面，E3还可以识别26S蛋白酶体，然后将带多泛素链的靶蛋白引入26S蛋白酶体中，实现蛋白的快速降解。多泛素链被降解成单个泛素，可以在体内循环利用。目前在拟南芥基因组中有1300多个基因编码推测E3酶亚基，并具有一个700个成员的家族。因此，泛素连接酶E3种类和数量可以对应广泛的靶蛋白分子，实现植物体内的蛋白快速降解，完成植物生长发育的多种信号转导途径。根据亚基组成和作用机制，目前植物中E3酶包括与E6AP C末端同源物(HECT)、RING/U-Box、SCF复合体和后期促进复合体(APC)。目前在拟南芥基因组中含有7个HECT E3、约480个RING蛋白、64个U-Box蛋白、约700个F-Box蛋白和11个APC亚基。Stone等(2005)在拟南芥基因组中预测并鉴定了469个RING型蛋白。根据RING区的不同，将其划分成八大类，包括30个不同的组。以AtUBC8为通用E2酶，体外测定规范的或修饰的RING蛋白的E3活性，结果发现，大部分RING蛋白具有E3活性。

泛素连接酶E3在植物的生长发育过程中具有重要作用。大量研究结果表明不同类型的E3酶参与表皮毛的发育、花的发育、地上部分枝、蜡质合成、自交不亲和、细胞周期、多种激素信号如生长素、脱落酸、芸苔素内酯、乙烯、赤霉素和茉莉酸、非生物逆境胁迫响应如光、蓝光、热和冷休克和低温信号、生物逆境如NIM1途径和病毒蔓延和代谢途径如糖酵解、生物碱合成和N-末端规则途径等多种过程。不同的E3酶有各自特异的靶蛋白，但是一个E3酶可以有两个以上的靶蛋白，例如COP1下游是3个受其降解的靶蛋白。

发明内容

本发明提供一种拟南芥耐盐基因SRAT1及其应用。

一种拟南芥耐盐基因SRAT1，具有序列表中SEQ ID NO.1所述的碱基序列。

所述的拟南芥耐盐基因SRAT1编码的蛋白质，具有序列表中SEQ IDNO.3所述的氨基酸序列。

本发明利用基因芯片技术，检测拟南芥盐响应基因表达，根据NCBI、TAIR等数据库查询结果，获得水稻耐盐相关基因序列信息，然后通过逆向遗传学方法证实基因功能。

基因来源：

以野生型拟南芥Col-0(Columbia ecotype)7天苗龄幼苗为材料，分别转移到MS或MS+150mM(毫摩尔浓度)NaCl培养基上处理24h，然后取地上部(包括茎和叶)分别转移到1.5ml离心管中，加液氮快速磨碎，再加入1ml Trizol颠倒混匀，经过一系列步骤分离纯化，获得高纯度的mRNA。通过反转录合成cDNA。再通过利用Affymetrix基因芯片(Affymetrix ATH1-25K)技术，检测在盐胁迫下拟南芥地上部基因表达差异，结果发现SRAT1基因在盐处理24小时后表达量比对照(未处理)高出2倍以上。根据Expasy和TAIR数据库查询结果，SRAT1基因是拟南芥ATL基因家族，编码一个E3泛素连接酶。基因SRAT1是Salt StressReponsiveness ATL genel的英文缩写，中文意指为一个盐胁迫响应ATL家族基因。

根据TAIR数据库查询，SRAT1基因号为At5g47610。该基因的ORF(开放阅读框)为501bp，mRNA长度为726bp。基因编码产物大小166个氨基酸，分子量17.96Kd，等电点5.84。

基因克隆与转化：

以野生型拟南芥Col-0(Columbia ecotype)7天苗龄幼苗总mRNA为模板，利用RT-PCR方法扩增到SRAT1基因的编码序列，然后将SRAT1基因装入PMD18-T载体中，经测序正确，用XbaI和KpnI酶切，回收基因片段，然后连入Super1300载体中，再转入EH105农杆菌，鉴定正确后，通过农杆菌介导花浸法转化模式植物拟南芥，在含潮霉素的MS固体培养基上筛选转基因拟南芥阳性植株，繁种并鉴定至T3代，获得纯合的转基因26个株系。

基因耐盐功能鉴定：

T3代纯合转基因株系和野生型((eeotype Columbia))拟南芥种子处理后培养7天，观察幼苗生长情况。待幼苗子叶完全展开后，将转基因株系和野生型的幼苗分别移入含NaCl和正常的MS培养基上，然后置于相同光温条件的培养箱中培养。培养12-15天后，观察转基因株系与野生型幼苗在高盐胁迫下的表型。结果发现在200mM NaCl下，野生型幼苗全部白化死亡，转SRAT1基因株系幼苗叶片仍保持绿色，说明SRAT1基因超量表达可以缓解拟南芥盐害。

本发明有益效果：将耐盐基因SRAT1转化模式植物拟南芥，可以提高拟南芥幼苗耐盐性。若将耐盐基因SRAT1转化水稻或草莓等蔬菜、花卉等植物，有可能提高植物耐盐性，一方面，可以增加水稻或露地蔬菜、花卉在盐碱地上的产量，提高我省滨海地区的盐碱地的利用；另一方面，可以克服设施条件下因土壤返盐引起的连作障碍，提高蔬菜、花卉等植物的产量和品质，增加农民收入。

具体实施方式

基因的获得

以野生型拟南芥Col-0(Columbia ecotype)7天苗龄幼苗为材料，分别转移到MS或MS+150mM NaCl培养基上处理24h，然后取地上部分别转移到1.5ml离心管中，加液氮快速磨碎，再加入1ml Trizol(Invitrogen)颠倒混匀，室温放置5min，在4℃ 12000rpm离心10min。取上清液转移至新1.5ml离心管中，然后加入200μl氯仿，用力震荡15s，室温放置2-3min，在4℃ 12000rpm离心15min。吸取上层水相，加入500μl异丙醇，在4℃下12000g离心10min。弃去上清液，加入1.2ml 75％乙醇，在4℃下10000g离心5min。弃去上清液，吸尽残液，室温干燥5-10min。加入200μl DEPC(焦碳酸二乙酯)水，用枪头吸吐混匀。取5μl RNA溶液进行定量，其余溶液用2.5-3倍体积无水乙醇(600μl无水乙醇中加入80μl 3M pH5.2乙酸钠)，-20℃冰箱中放置1-2h，在4℃下12000g离心30min。弃去上清液，加入1ml 70％乙醇，在4℃下10000g离心5min。弃去上清液，真空干燥。

用DEPC水稀释即获得高纯度的mRNA。通过反转录合成cDNA。再通过利用Affymetrix基因芯片(Affymetrix ATH1-25K)技术，检测在盐胁迫下拟南芥地上部基因表达差异，结果发现SRAT1基因在盐处理24后表达量比对照(未处理)高出2倍以上。根据Expasy和TAIR数据库查询结果，SRAT1基因是拟南芥ATL基因家族，编码一个E3泛素连接酶。基因SRAT1是Salt Stress Reponsiveness ATL genel的英文缩写，中文意指为一个盐胁迫响应ATL家族基因。

根据TAIR数据库查询，SRAT1基因号为At5g47610。该基因的ORF(开放阅读框)为501bp，mRNA长度为726bp。基因编码产物大小166个氨基酸，分子量17.96Kd，等电点5.84。

基因克隆与转化

以野生型拟南芥Col-0(Columbia ecotype)7天苗龄幼苗总mRNA为模板，利用RT-PCR方法扩增到SRAT1基因的编码序列。

具体操作如下：首先，将mRNA反转录成第一链cDNA，所用反转录试剂盒为GIBCOBRL公司的SUPERSCRIPTTM III，反应体系20μl，依次加入1μl oligo dT、1μl 10mM dNTP、5μg RNA和DEPC水至13μl，在65℃变性5分钟，迅速在冰上冷却至少1分钟，稍微离心，然后依次加入4μl 5×First-Strand buffer、1μl 0.1M DTT、1μl RNase OUT^TMRecombinant RNase inhibitor和1μl SuperScript^TM III RT。轻微混合均匀，50℃反应60分钟，70℃15分钟使酶失活。为了去掉与cDNA互补的RNA链，加入1μl RNase H在37℃温育20min，-20℃保存。然后以第一链cDNA为摸板扩增目的基因Cyp2，所用扩增配对引物：

SRAT1-F，5’-TCTAGAATGCGTTTGCTAGTAGCAGA-3’，

SRAT1-R，5’-GGTACCCTAAGCATTGATGTGGCTTG-3’，

PCR反应体系为50μl，依次加入10×PCR buffer 5μl、10mM dNTPs 1μl、反转录产物5μl、10μM正向引物(SRAT1-F)1μl、10μM反向引物(SRAT1-R)1μl、5U/μl Tag DNA聚合酶0.5μl，最后加水至50μl。PCR反应条件：预变性95℃，变性95℃30s，退火58℃30s，延伸72℃ 1min，30个循环，最后延伸72℃ 10min，4℃保存。

扩增后将SRAT1基因装入pMD18-T载体中：pMD18-T载体由TakaRa公司生产。将回收纯化的SRAT1基因的DNA与pMD18-T载体进行连接反应，连接体系10μl，各组分分别为0.5μl pMD18-T载体、4.5μl纯化的SRAT1基因的DNA、5μl Solution I。在14℃～16℃下连接8～12小时，然后将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。

将SRAT1基因装入pMD18-T载体后经测序正确，用TakaRa公司生产的XbaI和KpnI酶切，操作如下：酶切体系40μl，包括4μl 10×buffer、8μl已插入SRAT1基因的pMD18-T载体、1μl XbaI、1μl KpnI和26μl水，在37℃水浴中温育6h。

用北京博大泰克生物技术公司生产的Glassmilk kit回收基因片段，操作如下：从琼脂糖凝胶上切下所需DNA片段，放在1.5ml的Eppendorf管中。加入3倍体积的溶胶液，室温下放置5min，期间轻摇Eppendorf管几次使胶完全溶化。加入10μl玻璃奶，颠倒混匀，冰浴下放置10min。每隔2-3min混匀1次，12000rpm离心30s，吸弃上清。加入250μl漂洗液，用移液器吹打漂洗液，轻柔地将玻璃奶悬浮混匀，12000rpm离心30s，吸弃上清。重复漂洗1次。用枪头将剩余的漂洗液吸干净。然后，放置于37℃温箱干燥15-20min。加入20μl的无菌蒸馏水，混匀，60℃水浴5min，12000rpm离心1min，回收上清液。

将回收的基因片段连入Super1300载体中，操作如下：连接体系10μl，包括2μlSuper1300载体、6μl纯化的SRAT1基因的DNA、1μl 10×T4连接酶buffer和1μl T4连接酶，在4-10℃下连接12 h，然后将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，提取质粒进行鉴定。

基因片段连入Super1300载体后再转入EH105农杆菌中，操作如下：取200μl农杆菌感受态细胞，加入5～10μl构建好的质粒DNA，30℃冰浴30min，液氮中速冻1min，37℃水浴5min，然后加入1ml YEB培养基(1升YEB培养基含1g酵母提取物、5g牛肉浸膏、5g蛋白胨、5g蔗糖和0.5g MgSO₄·7H₂O，pH7.0)，28℃恢复培养4h；10000g离心30s，弃上清，加入0.1ml YEB培养基重新悬浮细胞，涂布于含有100μg/ml卡那霉素和125μg/ml利福平的YEB平板(1升YEB培养基含1g酵母提取物、5g牛肉浸膏、5g蛋白胨、5g蔗糖、0.5g MgSO4·7H2O和12g琼脂，pH7.0)上，28℃培养约48h。

经鉴定正确后(挑取阳性克隆作为模板，用菌落PCR方法进行鉴定)，通过农杆菌介导浸花法转化模式植物拟南芥，操作如下：接种含有目的质粒的农杆菌菌落于10ml YEB培养基(含0.1％酵母提取物、0.5％牛肉浸膏、0.5％蛋白胨、0.5％蔗糖、0.05％ MgSO4·7H2O、1.2％琼脂、100μg/ml卡那霉素和125μg/ml利福平)中28℃、200rpm震荡培养过夜，转化前一天按1∶50接种于200ml含相同抗生素的YEB培养液中扩大培养至OD600为1.2～1.6，约6h，5000g离心15min集菌，重悬于渗透缓冲液，使OD600为0.8，200ml重悬液可使用3次。转化所用浸泡液含有0.5×MS大量元素、0.5×MS微量元素、0.5mg/L VB5、5％蔗糖、44nM 6-BA(Sigma公司，美国)和0.03％Silwet L-77(LEHLE SEEDS公司，美国)。将200ml含目的农杆菌的渗透转化液置于一容器中，翻转种有拟南芥的花盆，使植株浸入含有待转化农杆菌的渗透缓冲液中，浸5分钟，缓慢取出花盆，侧放于托盘中，盖上黑塑料布避光24小时，第二天取下塑料布，直立放置花盆。

制备MS筛选平板(MS培养基外加80g/ml潮霉素和50g/ml氨苄青霉素)，转化收获的T1代种子经消毒后播种于筛选平板，每15cm的平板上可以筛选100μg左右的拟南芥种子。4℃春化3天，平放在生长箱中培养(22℃恒温，24h光照)，7～10天后挑选在筛选培养基上根系和地上部生长正常的阳性植株，移入正常MS培养基缓苗3～5天后移植入土壤，单株收获T2代种子。繁种并鉴定至T3代，获得纯合的转基因12个株系。

基因耐盐功能鉴定

T3代纯合转基因株系和野生型((ecotype Columbia))拟南芥种子用1％次氯酸钠消毒，在4℃冰箱中春化3天，然后置于温度22℃、湿度50％、连续24h光照的培养箱中培养。培养7d后，观察幼苗生长情况。待幼苗子叶完全展开后，将转基因株系和野生型幼苗移入含200mM NaCl和正常的MS固体培养基(含1×大量元素、1×微量元素、1×铁盐、3％蔗糖和0.8％琼脂)上，然后置于相同光温条件(22℃、湿度50％、连续24h光照)的培养箱中培养。培养12-15d后，观察转基因株系与野生型幼苗在高盐胁迫下的表型。结果发现在200mM NaCl下，野生型幼苗全部白化死亡，转SRAT1基因株系幼苗叶片仍保持绿色，说明SRAT1基因超量表达可以缓解拟南芥盐害。

SEQUENCE LISTING

<110>杭州市农业科学研究院

<120>拟南芥耐盐基因SRAT1及其应用

<130>

<160>3

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>501

<212>DNA

<213>拟南芥

<400>1

atgcgtttgc tagtagcaga agcagcttca ccattgtcct ctgctgcaac tccaacatgt  60

aactctcata cttgcagatg gaagccttac tcaaactcta ctgacttcac agctaatgca 120

tcagtccttc tcatccttgt catctctgct ctcatttgtg ctctctctct ttacgctgca 180

attcgttgct ttctccgacc aaccctcgag actgaagacg accacaagcc tgaccctgaa 240

gcagctgctt catccactcc aacaactcct acacttgtct actcctccga ccttgaactc 300

gcaggagctg aagcagagtg tgccatttgc ttgtcggaat ttgaacaagg agaaagcatt 360

caagtgctgg agaaatgtca gcatggtttc catgttaagt gtatccacaa atggctctct 420

actcgctcct cctgtcccac ttgcagaact tctatcttct cacaacactc tgaaactcct 480

tcaagccaca tcaatgctta g                                          501

<210>2

<211>726

<212>mRNA

<213>拟南芥

<400>2

caaaccatta aaagatgcgt ttgctagtag cagaagcagc ttcaccattg tcctctgctg  60

caactccaac atgtaactct catacttgca gatggaagcc ttactcaaac tctactgact 120

tcacagctaa tgcatcagtc cttctcatcc ttgtcatctc tgctctcatt tgtgctctct 180

ctctttacgc tgcaattcgt tgctttctcc gaccaaccct cgagactgaa gacgaccaca 240

agcctgaccc tgaagcagct gcttcatcca ctccaacaac tcctacactt gtctactcct 300

ccgaccttga actcgcagga gctgaagcag agtgtgccat ttgcttgtcg gaatttgaac 360

aaggagaaag cattcaagtg ctggagaaat gtcagcatgg tttccatgtt aagtgtatcc 420

acaaatggct ctctactcgc tcctcctgtc ccacttgcag aacttctatc ttctcacaac 480

actctgaaac tccttcaagc cacatcaatg cttagcttct ttttttaatc ttgtttttcc 540

aaaagcttta gagttgtatc atgttttgct tgagattacc ctgtatctgc tctgtattat 600

taggtaacgt agaccaacca aagtatttac ttaagtactt gtattgtatc aatctaattc 660

tacatcgcca cacaatgaaa cagtgttttt ttttgttttg aaacaagagt tcattgtact 720

aggaaa                                                            726

<210>3

<211>166

<212>PRT

<213>拟南芥

<400>3

Met Arg Leu Leu Val Ala Glu Ala Ala Ser Pro Leu Ser Ser Ala Ala

1               5                   10                  15

Thr Pro Thr Cys Asn Ser His Thr Cys Arg Trp Lys Pro Tyr Ser Asn

            20                  25                  30

Ser Thr Asp Phe Thr Ala Asn Ala Ser Val Leu Leu Ile Leu Val Ile

        35                  40                  45

Ser Ala Leu Ile Cys Ala Leu Ser Leu Y Ala Ala Ile Arg Cys Phe

    50                  55                60

Leu Arg Pro Thr Leu Glu Thr Glu Asp Asp His Lys Pro Asp Pro Glu

65                  70                  75                  80

Ala Ala Ala Ser Ser Thr Pro Thr Thr Pro Thr Leu Val Tyr Ser Ser

                85                  90                  95

Asp Leu Glu Leu Ala Gly Ala Glu Ala Glu Cys Ala Ile Cys Leu Ser

            100                 105                 110

Glu Phe Glu Gln Gly Glu Ser Ile Gln Val Leu Glu Lys Cys Gln His

        115                 120                 125

Gly Phe His Val Lys Cys Ile His Lys Trp Leu Ser Thr Arg Ser Ser

    130                 135                 140

Cys Pro Thr Cys Arg Thr Ser Ile Phe Ser Gln His Ser Glu Thr Pro

145                 150                 155                 160

Ser Ser His Ile Asn Ala

                165

Claims (2)

1.一种拟南芥耐盐基因SRAT1，具有序列表中SEQ ID NO.1所述的碱基序列。

2.如权利要求1所述的拟南芥耐盐基因SRAT1编码的蛋白质，具有序列表中SEQ ID NO.3所述的氨基酸序列。