CN101182348A - 一种冷冻丝胶凝胶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种冷冻丝胶凝胶的制备方法，包括以下步骤：(1)将家蚕茧壳于煮沸的蒸馏水中脱胶；(2)脱胶后冷却，拧干，过滤；(3)将滤液放入旋转蒸发器内浓缩；(4)过滤后测定丝胶液浓度，稀释到所需浓度；(5)取丝胶液置于模具内，静置后冷冻；(6)完全冻结后解冻，浸洗数次，至凝胶呈白色；(7)冷冻干燥，得丝胶凝胶。本发明的方法，不添加任何化学物质，不受其它物质的污染，满足环保的要求；同时丝胶蛋白不需特殊纯化，大大降低了成本；凝胶制备工艺简单，制备时间短；所得凝胶湿态下弹性好，干燥后易保存，不易受微生物侵袭；该凝胶可用作药物或生物高分子的缓释载体及酶固定化载体等。
Description
技术领域
本发明涉及蚕丝蛋白的加工利用领域，特别涉及一种高弹性海绵状的丝胶蛋白水凝胶的制备方法.
背景技术
丝胶是由家蚕中部丝腺专一性合成的球状蛋白质，包围在丝素纤维的表层，起胶粘作用，占茧层含量的20～30％，含有大量亲水性氨基酸，具有较好的亲水性、反应活性及生物降解性，是一种天然可降解的生物高分子原料。近年来，有关丝胶蛋白应用的研究日趋增多，如细胞培养添加剂、固定化载体及纤维素修饰剂等，因此，丝胶蛋白材料有望在各个领域内得到深入研究。
丝胶蛋白溶液在室温放置，易形成热可逆性凝胶，但所形成的凝胶机械性能差、易碎，难以直接作为材料使用。目前，采用化学交联法及辐射法等改性方法可以提升丝胶凝胶的机械性能，或利用变异裸蛹蚕的丝胶经乙醇处理后可制得多孔弹性凝胶。但直接利用普通家蚕茧的丝胶蛋白来制备高弹性海绵状丝胶凝胶尚未有研究。
发明内容
针对现有技术中存在的不足之处，本发明提供一种机械性能较好的纯丝胶蛋白凝胶的制备方法。
本发明的冷冻丝胶凝胶的制备方法，包括以下步骤：
(1)将家蚕茧壳于煮沸的蒸馏水中脱胶30min，浴比1∶30；
(2)脱胶后于室温冷却，将脱胶丝拧干，所得脱胶液用四层纱布过滤；
(3)将滤液放入旋转蒸发器内浓缩至一定浓度，浓缩温度为45℃；
(4)将浓缩液用四层纱布过滤，然后用重量法测定丝胶液浓度，并用蒸馏水将丝胶液稀释到所需浓度；
(5)取一定量丝胶液置于模具内，于室温静置5分钟后放入冰箱冷冻；
(6)完全冻结后于室温解冻，取出凝胶，用蒸馏水反复浸洗数次，直至凝胶呈白色；
(7)浸洗干净的丝胶凝胶进行冷冻干燥，得丝胶凝胶。
所述步骤(1)中所用茧壳重量为10g/份。
所述步骤(3)中丝胶浓度浓缩至重量百分比浓度为2～10％。
所述步骤(4)中丝胶稀释液浓度为2～8％。
所述步骤(5)中所用模具为5ml离心管、24孔培养板。
所述步骤(5)中所用丝胶液体积为2ml/管。
所述步骤(5)中所用冷冻温度为-20℃～-80℃，冷冻时间为1h～3h。
所述步骤(6)中解冻时间为6h，浸洗次数为5次。
所述步骤(7)所得丝胶蛋白分子量主要为56ku～300ku。
本发明的优点：本发明采用纯丝胶蛋白制备凝胶，不添加任何化学物质，不受其它物质的污染，满足环保的要求；同时丝胶蛋白不需特殊纯化，大大降低了成本；凝胶制备工艺简单，制备时间短；所得凝胶湿态下弹性好，弹性回复达100％；干燥后易保存，不易受微生物侵袭，现有的干燥凝胶已经放置一年以上未发生变化，也未受到微生物侵袭；该凝胶可用作药物或生物高分子的缓释载体及酶固定化载体等。
附图说明
图1为本发明的实施例所制得凝胶的横截面的内部孔结构。
图2为本发明的实施例所制得凝胶的纵切面的内部孔结构。
具体实施方式
以下通过实例进一步对本发明进行描述：
实施例1：
取若干干燥茧壳，除去脏物并剪成小碎片，用天平称取一份10g茧片，放入一个盛有300ml煮沸蒸馏水的500ml烧杯中，电炉加热继续煮沸30min。然后放置室温冷却，戴上一次性手套，用手将脱胶丝取出并拧干，得100ml以上丝胶液，用四层纱布将其过滤除杂。取2ml丝胶液放入已称重的干净称量皿内，用可调温电炉慢慢将其烘至微黄后称重，计算丝胶浓度。将剩余丝胶液放入旋转蒸发器内，于45℃浓缩至3％以上，再将浓缩液用四层纱布过滤，取0.5ml丝胶液用重量法测定其浓度后，用蒸馏水调整浓度至2％。
用移液枪将丝胶液加入到已称重5ml离心管内，2ml丝胶液/管，再放入-20℃冰箱冷冻3h后，取出置于室温下6h至完全解冻，用镊子小心将凝胶从离心管内取出，放入盛蒸馏水的烧杯中，用手挤压清洗5次，除去碳水化合物杂质及小分子丝胶蛋白，得干净海绵状长条形多孔丝胶凝胶。将凝胶冷冻干燥后称重，计算胶凝率。该浓度丝胶溶液的胶凝率为71.50％。用SDS-PAGE检测所制丝胶溶液分子量主要分布在56ku以上。
实施例2：
取若干干燥茧壳，除去脏物并剪成小碎片，用天平称取三份10g茧片，放入一个盛有300ml煮沸蒸馏水的500ml烧杯中，电炉加热继续煮沸30min。然后放置室温冷却，戴上一次性手套，用手将脱胶丝取出并拧干，得100ml以上丝胶液，用四层纱布将其过滤除杂。取2ml丝胶液放入已称重的干净称量皿内，用可调温电炉慢慢将其烘至微黄后称重，计算丝胶浓度。将剩余丝胶液放入旋转蒸发器内，于45℃浓缩至10％以上，再将浓缩液用四层纱布过滤，取0.5ml丝胶液用重量法测定其浓度后，用蒸馏水调整浓度至8％，若丝胶浓缩时，浓缩液发生胶凝，则加热煮沸半分钟后冷却使用。
用移液枪将丝胶液加入到已称重5ml离心管内，2ml丝胶液/管，再放入-20℃冰箱冷冻3h后，取出置于室温下6h至完全解冻，用镊子小心将凝胶从离心管内取出，放入盛蒸馏水的烧杯中，用手挤压清洗5次，除去碳水化合物杂质及小分子丝胶蛋白，得干净海绵状长条形多孔丝胶凝胶。将凝胶冷冻干燥后称重，计算胶凝率。该浓度丝胶溶液的胶凝率为69.61％。
实施例3：
取若干干燥茧壳，除去脏物并剪成小碎片，用天平称取两份10g茧片，放入一个盛有300ml煮沸蒸馏水的500ml烧杯中，电炉加热继续煮沸30min。然后放置室温冷却，戴上一次性手套，用手将脱胶丝取出并拧干，得100ml以上丝胶液，用四层纱布将其过滤除杂。取2ml丝胶液放入已称重的干净称量皿内，用可调温电炉慢慢将其烘至微黄后称重，计算丝胶浓度。将剩余丝胶液放入旋转蒸发器内，于45℃浓缩至6％以上，再将浓缩液用四层纱布过滤，取0.5ml丝胶液用重量法测定其浓度后，用蒸馏水调整浓度至5％。若丝胶浓缩液发生胶凝，则加热煮沸半分钟后冷却使用。
用移液枪将丝胶液加入到已称重5ml离心管内，2ml丝胶液/管，再放入-20℃冰箱冷冻3h后，取出置于室温下6h至完全解冻，用镊子小心将凝胶从离心管内取出，放入盛蒸馏水的烧杯中，用手挤压清洗5次，除去碳水化合物杂质及小分子丝胶蛋白，得干净海绵状长条形多孔丝胶凝胶。将凝胶冷冻干燥后称重，计算胶凝率。该浓度丝胶溶液的胶凝率为72.50％。
实施例4：
取若干干燥茧壳，除去脏物并剪成小碎片，用天平称取三份10g茧片，放入一个盛有300ml煮沸蒸馏水的500ml烧杯中，电炉加热继续煮沸30min。然后放置室温冷却，戴上一次性手套，用手将脱胶丝取出并拧干，得100ml以上丝胶液，用四层纱布将其过滤除杂。取2ml丝胶液放入已称重的干净称量皿内，用可调温电炉慢慢将其烘至微黄后称重，计算丝胶浓度。将剩余丝胶液放入旋转蒸发器内，于45℃浓缩至10％以上，再将浓缩液用四层纱布过滤，取0.5ml丝胶液用重量法测定其浓度后，用蒸馏水调整浓度至8％。若丝胶浓缩液发生胶凝，则加热煮沸半分钟后冷却使用。
用移液枪将丝胶液加入到加入到24孔细胞培养板内，2ml丝胶液/孔，再放入-80℃冰箱冷冻1h后，取出置于室温下6h至完全解冻，用镊子小心将凝胶从培养板内取出，放入盛蒸馏水的烧杯中，用手挤压清洗5次，除去碳水化合物杂质及小分子丝胶蛋白，得干净海绵状圆柱形多孔丝胶凝胶，并将凝胶冷冻干燥后置于干燥器内贮存待用。
取一干燥凝胶称重，放入盛有25ml蒸馏水的烧杯中，再将烧杯放入抽真空干燥器内抽真空至凝胶吸水平衡，取出完全溶胀凝胶并称重，计算该凝胶最大吸水倍数。该凝胶的最大吸水倍数为10.37倍。
实施例5：
取若干干燥茧壳，除去脏物并剪成小碎片，用天平称取一份10g茧片，放入一个盛有300ml煮沸蒸馏水的500ml烧杯中，电炉加热继续煮沸30min。然后放置室温冷却，戴上一次性手套，用手将脱胶丝取出并拧干，得100ml以上丝胶液，用四层纱布将其过滤除杂。取2ml丝胶液放入已称重的干净称量皿内，用可调温电炉慢慢将其烘至微黄后称重，计算丝胶浓度。将剩余丝胶液放入旋转蒸发器内，于45℃浓缩至3％以上，再将浓缩液用四层纱布过滤，取0.5ml丝胶液用重量法测定其浓度后，用蒸馏水调整浓度至2％。
用移液枪将丝胶液加入到加入到24孔细胞培养板内，2ml丝胶液/孔，再放入-20℃冰箱冷冻3h后，取出置于室温下6h至完全解冻，用镊子小心将凝胶从培养板内取出，放入盛蒸馏水的烧杯中，用手挤压清洗5次，除去碳水化合物杂质及小分子丝胶蛋白，得干净海绵状圆柱形多孔丝胶凝胶，并将凝胶冷冻干燥后置于干燥器内贮存待用。取一干燥凝胶称重，放入盛有25ml蒸馏水的烧杯中，再将烧杯放入抽真空干燥器内抽真空至凝胶吸水平衡，取出完全溶胀凝胶并称重，计算该凝胶最大吸水倍数。该凝胶的最大吸水倍数为18.47倍。
实施例6：
取若干干燥茧壳，除去脏物并剪成小碎片，用天平称取三份10g茧片，放入一个盛有300ml煮沸蒸馏水的500ml烧杯中，电炉加热继续煮沸30min。然后放置室温冷却，戴上一次性手套，用手将脱胶丝取出并拧干，得100ml以上丝胶液，用四层纱布将其过滤除杂。取2ml丝胶液放入已称重的干净称量皿内，用可调温电炉慢慢将其烘至微黄后称重，计算丝胶浓度。将剩余丝胶液放入旋转蒸发器内，于45℃浓缩至10％以上，再将浓缩液用四层纱布过滤，取0.5ml丝胶液用重量法测定其浓度后，用蒸馏水调整浓度至8％。若丝胶浓缩液发生胶凝，则加热煮沸半分钟后冷却使用。
用移液枪将丝胶液加入到加入到24孔细胞培养板内，2ml丝胶液/孔，再放入-20℃冰箱冷冻3h后，取出置于室温下6h至完全解冻，用镊子小心将凝胶从培养板内取出，放入盛蒸馏水的烧杯中，用手挤压清洗5次，除去碳水化合物杂质及小分子丝胶蛋白，得干净海绵状圆柱形多孔丝胶凝胶，并将凝胶冷冻干燥后置于干燥器内贮存待用。
取一干燥凝胶称重，放入盛有25ml蒸馏水的烧杯中，再将烧杯放入抽真空干燥器内抽真空至凝胶吸水平衡，取出完全溶胀凝胶并称重，计算该凝胶最大吸水倍数。该凝胶的最大吸水倍数为13.16倍。SEM观察凝胶内部孔结构：丝胶凝胶的横截面(图1)与纵切面(图2)结构不同，内部孔为互相贯通的不规则孔，且以纵向分布为主。内部孔的横向孔径平均为150nm以上。
实施例7：
取若干干燥茧壳，除去脏物并剪成小碎片，用天平称取两份10g茧片，放入一个盛有300ml煮沸蒸馏水的500ml烧杯中，电炉加热继续煮沸30min。然后放置室温冷却，戴上一次性手套，用手将脱胶丝取出并拧干，得100ml以上丝胶液，用四层纱布将其过滤除杂。取2ml丝胶液放入已称重的干净称量皿内，用可调温电炉慢慢将其烘至微黄后称重，计算丝胶浓度。将剩余丝胶液放入旋转蒸发器内，于45℃浓缩至6％以上，再将浓缩液用四层纱布过滤，取0.5ml丝胶液用重量法测定其浓度后，用蒸馏水调整浓度至5％。若丝胶浓缩液发生胶凝，则加热煮沸半分钟后冷却使用。
用移液枪将丝胶液加入到加入到24孔细胞培养板内，2ml丝胶液/孔，再放入-20℃冰箱冷冻3h后，取出置于室温下6h至完全解冻，用镊子小心将凝胶从培养板内取出，放入盛蒸馏水的烧杯中，用手挤压清洗5次，除去碳水化合物杂质及小分子丝胶蛋白，得干净海绵状圆柱形多孔丝胶凝胶，并将凝胶冷冻干燥后置于干燥器内贮存待用。
取一干燥凝胶称重，放入盛有25ml蒸馏水的烧杯中，再将烧杯放入抽真空干燥器内抽真空至凝胶吸水平衡，取出完全溶胀凝胶并称重，计算该凝胶最大吸水倍数。该凝胶的最大吸水倍数为16.78倍。
实施例8：
取若干干燥茧壳，除去脏物并剪成小碎片，用天平称取三份10g茧片，放入一个盛有300ml煮沸蒸馏水的500ml烧杯中，电炉加热继续煮沸30min。然后放置室温冷却，戴上一次性手套，用手将脱胶丝取出并拧干，得100ml以上丝胶液，用四层纱布将其过滤除杂。取2ml丝胶液放入已称重的干净称量皿内，用可调温电炉慢慢将其烘至微黄后称重，计算丝胶浓度。将剩余丝胶液放入旋转蒸发器内，于45℃浓缩至10％以上，再将浓缩液用四层纱布过滤，取0.5ml丝胶液用重量法测定其浓度后，用蒸馏水调整浓度至8％。若丝胶浓缩液发生胶凝，则加热煮沸半分钟后冷却使用。
用移液枪将丝胶液加入到加入到24孔细胞培养板内，2ml丝胶液/孔，再放入-50℃冰箱冷冻2h后，取出置于室温下6h至完全解冻，用镊子小心将凝胶从培养板内取出，放入盛蒸馏水的烧杯中，用手挤压清洗5次，除去碳水化合物杂质及小分子丝胶蛋白，得干净海绵状圆柱形多孔丝胶凝胶，并将凝胶冷冻干燥后置于干燥器内贮存待用。
取一干燥凝胶称重，放入盛有25ml蒸馏水的烧杯中，再将烧杯放入抽真空干燥器内抽真空至凝胶吸水平衡，取出完全溶胀凝胶并称重，计算该凝胶最大吸水倍数。该凝胶的最大吸水倍数为11.75倍。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种冷冻丝胶凝胶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将家蚕茧壳于煮沸的蒸馏水中脱胶30min，浴比1∶30；
(2)脱胶后于室温冷却，将脱胶丝拧干，所得脱胶液用四层纱布过滤；
(3)将滤液放入旋转蒸发器内浓缩至一定浓度，浓缩温度为45℃；
(4)将浓缩液用四层纱布过滤，然后用重量法测定丝胶液浓度，并用蒸馏水将丝胶液稀释到所需浓度；
(5)取一定量丝胶液置于模具内，于室温静置5分钟后放入冰箱冷冻；
(6)完全冻结后于室温解冻，取出凝胶，用蒸馏水反复浸洗数次，直至凝胶呈白色；
(7)浸洗干净的丝胶凝胶进行冷冻干燥，得丝胶凝胶。
2.根据权利要求1所述的一种冷冻丝胶凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中所用茧壳重量为10g/份。
3.根据权利要求1所述的一种冷冻丝胶凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中丝胶浓度浓缩至重量百分比浓度为2～10％。
4.根据权利要求1所述的一种冷冻丝胶凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中丝胶稀释液浓度为2～8％。
5.根据权利要求1所述的一种冷冻丝胶凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中所用模具为5ml离心管、24孔培养板。
6.根据权利要求1所述的一种冷冻丝胶凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中所用丝胶液体积为2ml/管。
7.根据权利要求1所述的一种冷冻丝胶凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中所用冷冻温度为-20℃～-80℃，冷冻时间为1h～3h。
8.根据权利要求1所述的一种冷冻丝胶凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤(6)中解冻时间为6h，浸洗次数为5次。
9.根据权利要求1所述的一种冷冻丝胶凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤(7)所得丝胶蛋白分子量为56ku～300ku。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| AD01 | Patent right deemed abandoned |
Effective date of abandoning: 20080521 |
|
| C20 | Patent right or utility model deemed to be abandoned or is abandoned |